CN107075480A - γδT细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

制备γδT细胞和使用其同种异体或自体治疗患有病毒感染、真菌感染、原生动物感染和癌症的受试者的方法。

Description

γδT细胞及其用途

技术领域

本申请涉及制备和使用γδT细胞的方法，特别是使用γδT细胞在同种异体的或自体的受体受试者中治疗包括病毒感染、真菌感染、原生动物感染和癌症的病症。

背景技术

关于血液恶性肿瘤，已经建议并试验了同种异体干细胞移植(allo-SCT)。然而，这种同种异体治疗的主要缺点是移植失败和移植物抗宿主病(GVHD)的高发生率。已经利用HLA-单倍体相同的供体以尝试改善这类移植的结果。另外，已经尝试T细胞耗尽HLA匹配的基因干细胞移植(SCT)，使用移植物T细胞的离体耗尽以减少移植物抗宿主病；然而，有人认为这导致了增加的移植失败的风险。

如果接受者被严格的调节以降低移植失败的风险并且接受T细胞耗尽的移植物，有人认为免疫重建是不可接受的并且太多的患者将死于机会性感染。

γδT淋巴细胞代表人类外周血中次要的细胞亚群(小于10％)。表达Vγ9Vδ2(γ9δ2)T细胞受体的γδT细胞识别内源异戊烯焦磷酸(IPP)，所述内源异戊烯焦磷酸是作为甲羟戊酸途径失调的结果而在癌症细胞中过度产生的。γδT淋巴细胞能够产生丰富的促炎性细胞因子如IFN-γ，它们强效的细胞毒性有效功能和MHC-非依赖性的抗原识别使它们成为癌症免疫治疗的重要层级。已经表明γδT细胞能够在体外杀死许多不同类型的肿瘤细胞系和肿瘤，包括白血病、神经母细胞瘤和各种癌。此外，已经证明γδT细胞可以自发地或在用不同的双膦酸盐(包括唑来膦酸盐)治疗之后识别和杀死许多不同的分化的肿瘤细胞。人肿瘤细胞可以有效地呈递焦磷酸单酯化合物至γδT细胞诱导其增殖和IFN-γ生成。

目前，两种策略已经被用于γδT细胞肿瘤免疫治疗。第一种方法涉及在体外扩增的γδT细胞的过继细胞转移回患者(即自体治疗)。第二种方法涉及刺激γδT细胞的磷酸抗原(phosphoantigen)或氨基二膦酸与低剂量重组IL-2的一起在体内的治疗应用。

γδT细胞的自体移植策略已经用来克服上述同种异体干细胞移植的缺陷。作为这类自体移植技术的一部分，诱导和培养足够数量的γδT细胞以自体产生治疗效果的方法在先前已经被公开了，例如US 2002/0107392。然而，自体治疗策略具有许多缺点。

因此，需要替代的和/或改进的自体和同种异体治疗策略。

发明概述

虽然已经就自体应用讨论了与癌症治疗相关的γδT细胞治疗，迄今为止还没有考虑到同种异体提供这种γδT细胞治疗。考虑到由于与免疫系统介导的排斥相关的潜在问题，通常没有考虑γδT细胞治疗的这种同种异体应用。出人意料地，本发明人认为γδT细胞通常不会引起移植物抗宿主病，并且选择用于同种异体移植的γδT细胞可以允许将T细胞以最小的移植物抗宿主病风险提供给接受者。γδT细胞不是MHC限制性的(Tanaka Y等人，1995)。本发明人认为这将允许γδT细胞被应用于同种异体移植以提供可行的治疗，其中γδT细胞能够靶向细胞进行MHC单倍型非依赖性的细胞溶解。由于缺乏通过γδT细胞识别MHC呈递抗原，本发明人认为在从包括B细胞和αβT细胞受体(TCR)的T细胞的其它白细胞充分纯化的γδT细胞的高纯度同种异体转移物中，GVHD的风险将被最小化。另外，认为移植物排斥的机会低，所述移植物排斥是由于接受者在某些疾病状态中的免疫受损状态，包括但不限于具有严重病毒感染的患者(例如埃博拉、HIV和流感以及PTLD-EBV患者)和具有其它癌症类型的患者。

如上所述，先前的治疗策略包括在同种异体干细胞移植之前，使用阴性选择或阳性选择方法从供体血液，特别是外周血液中去除T细胞。

本发明人确定了一种允许从供体受试者中收集细胞并且处理这类供体细胞以允许向受体受试者同种异体地提供足够数量的γδT细胞的方法，使得γδT细胞可以对受体受试者发挥治疗效果。

例如，本发明人的γδT细胞扩增方法可以包括使用密度梯度离心从血液或白细胞分离术材料中分离外周血单个核细胞(PBMCs)。分离的外周血单个核细胞可以在于培养物中扩增之前冷冻保存，同时共提取并且保留血浆作为自体的赋形剂，用于随后的γδT细胞培养步骤。在实施方案中，新鲜分离的PBMC(或从冷冻保存中复苏的那些)被接种到含有人重组IL-2(例如浓度高达1000U/ml)和唑来膦酸(例如5μM)的生长培养基中。在14天的培养期间，通过添加唑来膦酸(第0天)和持续添加(continuous inclusion of)IL-2，可以从PBMC激活和选择性增殖γδT淋巴细胞群体。在这个时间段内可以连续扩增细胞悬浮液(通常以1∶2的分流比)。培养开始后14天，细胞可以被收获并且在转移到含有100ml盐水溶液的输注瓶之前悬浮在乳酸林格氏液和HSA中。

在扩增之后，在实施方案中，γδT细胞产物满足以下最低规格：大于80％的总细胞是T淋巴细胞(CD3阳性)，γδT淋巴细胞包含总T淋巴细胞群体的60％或更多(Vγ9阳性)，NK细胞少于总T淋巴细胞群体的25％(CD3阴性/CD56阳性)，细胞毒性T细胞低于总T淋巴细胞群的10％(CD3/CD8阳性)，并且T辅助细胞低于总T淋巴细胞群的5％(CD3/CD4阳性)。在实施方案中，满足这些规格的细胞群可以用作高纯度同种异体细胞库生成的起始材料，其目的是具有大于99％的γδT细胞。

根据本发明的第一个方面，提供用于同种异体提供γδT细胞至第二受试者的方法，其包括以下步骤：

-提供包含来自第一受试者的γδT细胞的样品；

-培养所述γδT细胞以允许给第二受试者施用。

在实施方案中，提供的步骤可以包括从第一受试者收集γδT细胞的步骤。所述收集可以是从供体受试者或来自脐带血材料收集，其中所述供体受试者没有立即感知到的健康状况。适当地，受体受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物，例如人，或商业上有价值的牲畜，研究动物、马、牛、山羊、大鼠、小鼠、兔子、猪等。在实施方案中，第一和第二受试者可以是人。应理解，在本发明的上下文中，第一受试者是从其收集γδT细胞的供体受试者，并且所述细胞用于不同的第二(受体)受试者的同种异体治疗。适当地，第一受试者具有疾病前状态。如本文所使用的术语“疾病前”状态覆盖了绝对术语“健康”、“无疾病”和相对术语“疾病潜在进展中的分级”，比疾病后状态“更健康”或“更少疾病”。由于“疾病前”可以由第一受试者被诊断患有疾病之前的时间所定义，第一受试者可以是在绝对术语中的健康，或者可能已经具有尚未表现出来或已经被诊断或检测的疾病。在实施方案中，本发明的第一个方面包括培养从第一受试者获得的γδT细胞以允许γδT细胞被提供给第二受试者的步骤。

在实施方案中，γδT细胞可以从外周血收集或从在单采(apheresis)或白细胞分离术后获得的外周血单个核细胞收集或从脐带血收集。当用磷酸抗原或氨基二膦酸激活时，来自外周血的γδT细胞的离体扩增将优先产生Vγ9Vδ2表型的γδT细胞。脐带血用作离体扩增的起始材料允许依赖于活化抗原的几种T细胞受体(TCR)亚型的选择性扩增。这些TCR同种型可以包括与Vγ1-9和Vδ1-8配对的任何γδTCR，例如但不限于Vδ1、Vδ2和Vδ3 TCR变体。不同亚型的γδT细胞识别不同的抗原，并且因此将显示出依赖于靶细胞所呈递的抗原的不同水平的细胞毒性。每种δTCR亚型的相对丰度很大程度上依赖于培养条件和呈递的特异性抗原。培养条件可以调整以优先从脐带血扩增所需的TCR同种型。例如，表达单一TCR同种型的γδT细胞在特定癌症类型的治疗或特定病毒感染的治疗中可能更有效。

在实施方案中，收集步骤可以包括在从第一受试者收集γδT细胞之前给第一受试者施用γδT细胞增强剂的步骤。

在实施方案中，收集γδT细胞的方法可以包括给第一受试者施用增强剂如诱导白细胞从骨髓迁移的生长因子的步骤，所述生长因子如G-CSF、氨基二膦酸(特别是帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、伊卡膦酸、其盐和/或其水合物)、TNFα或白细胞介素2(Meraviglia S等人，2010)。

在一个实施方案中，所述方法可以包括任何一个或多个以下步骤：-

-从第一受试者(供体)提供血液，例如脐带血或单采/白细胞分离术衍生的细胞，

-从血液中分离外周血单个核细胞(PBMC)或脐带血单个核细胞(CBMC)，

-添加氨基二膦酸和靶抗原到PBMCs或CBMCs中，和

-培养PBMC或CBMC以增殖/诱导靶抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)和γδT细胞，以及任选地

-将PBMC或CBMC或T细胞与人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养以增殖/诱导靶抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)和γδT细胞。

本发明人认为当给第二受试者同种异体施用那些基本上分离的γδT细胞时，提供基本上从全血的其它组分分离的γδT细胞将减少移植失败。同种异体提供γδT细胞的方法可以包括主动纯化(active purification)的步骤，例如使用抗-γδT细胞受体抗体从混合的细胞群体中分离γδT细胞。因此，本发明的方法可以包括从全血或其组分中纯化γδT细胞的步骤。由于γδT细胞少于的外周血总细胞数的10％，认为纯化全血样品或其组分，从而γδT细胞超过样品质量的10％增强同种异体治疗受体受试者的有效性。因此，本发明的方法可以包括纯化或扩增全血样品或其组分的步骤，以实现在纯化样品中γδT细胞大于细胞总数的10、25、50、75、85、90、95或98％。认为纯化或扩增全血或其组分的样品以实现纯化样品中γδT细胞大于细胞总数的10、25、50、75、85、90、95或98％，并且同时减少样品中导致免疫应答和/或移植失败的细胞，将允许γδT细胞的同种异体转移。

本领域技术人员已知的能够从全血、脐带血或其组分中纯化γδT细胞的任何方法可以构成本发明的一部分。显然，纯化步骤不应影响或最小地影响γδT细胞的活力。例如，以下步骤可以被组合或单独应用，以实现上述γδT细胞的纯化：-透析(例如单采和/或白细胞分离术)；差速离心；培养物中的γδT细胞的生长(例如培养物中的优先生长)过程。

纯化步骤可以，至少部分地，在培养步骤期间实施。例如，在培养步骤期间，至少一种特定组分(如氨基二膦酸，特别是帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、伊卡膦酸、其盐和/其水合物)中的或其组合的添加，允许在培养物中选择性扩增γδT细胞。在细胞培养期间纯化也可以通过合成抗原的添加或与人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养而实现，所述合成抗原如phosphostim/溴卤代醇焦磷酸盐(BrHPP)、合成的异戊烯焦磷酸盐(IPP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(HMB-PP)(Wang等人，2011)。这类组分的添加提供了培养环境，其允许在纯化样品中以总细胞数目计70％或更高的γδT细胞的阳性选择。

氨基二膦酸盐可以在培养γδT细胞的第一天的任何时间添加。氨基二膦酸可以以0.05至100微摩尔的浓度，优选0.1至30微摩尔的浓度添加到外周血单个核细胞中。适当地，所述二膦酸是焦磷酸的类似物，并且是其中焦磷酸骨架P-O-P的O(氧原子)被C(碳原子)取代(P-C-P)的化合物。它通常被用作骨质疏松症的治疗药物。所述氨基二膦酸是指在双膦酸中具有N(氮原子)的化合物。例如，本发明中使用的氨基二膦酸是没有特别限制的；可以使用如在WO 2006/006720和WO 2007/029689中公开的氨基二膦酸等。其具体的实例包括帕米膦酸、其盐和/或它们的水合物，阿仑膦酸、其盐和/或它们的水合物，以及唑来膦酸、其盐和/或它们的水合物(Thompson K.等人，2010)。对于帕米膦酸、其盐和/或它们的水合物，氨基二膦酸的浓度优选为1至30μM，对于阿仑膦酸、其盐和/或它们的水合物，氨基二膦酸盐的浓度优选为1至30μM，对于唑来膦酸、其盐和/或它们的水合物，氨基二膦酸盐的浓度优选为0.1至10μM。在本文，5μM唑来膦酸被添加作为实施例。

适当地，当培养期是7天或更长时，可以获得高纯度的包含γδT细胞的细胞群；然而，培养是优选进行约14天以进一步增加γδT细胞的数量。

在实施方案中，培养的时间可以是约7天或更长。适当地，培养时间可以进行约14天或更长以获得大量基本上纯化的γδT细胞群。

培养通常进行14天，之后γδT细胞停止持续的指数增殖。然而，某些实施方案提供γδT细胞的延长培养和选择性扩增至更大数量。这类实施方案包括向培养物提供合成抗原(例如合成的IPP、DMAPP、Br-HPP、HMB-PP)，循环暴露于人工或经放射的抗原呈递细胞，提供固定化的抗原或抗体或使用脐带血液作为细胞培养的起始材料。

适当地，细胞可以在这种环境中被培养至少7天的时间以在最少至少两次群体倍增之后重置(reset)其细胞表面受体谱。

任选地，培养γδT细胞的步骤可以包括改变γδT细胞表面受体谱的步骤(IwasakiM.等人，2011)。

例如，培养步骤可以涉及一个或多个子步骤，其减少或消除来自第一受试者的样品提供的γδT细胞中存在的一种或多种γδT细胞表面受体类型。这类步骤可以被看作将γδT细胞的受体谱“重置”或“部分重置”回到未经处理的(naive)或部分未经处理的形式。预期这类重置增强了γδT细胞治疗癌症和病毒感染的能力。已知一些T细胞受体可以通过T细胞来源的受试者中癌症或病毒的存在而诱导，并且已经发现这些受体在一些情况下可以抑制T细胞对肿瘤或病毒感染的反应性。因此，去除这类受体可以增加本发明γδT细胞的有效性。

一种或多种γδT细胞受体类型的减少或消除可以通过本发明的方法而获得，通过培养源自第一受试者的γδT超过一些天数，其中细胞群体在大小上增加多倍。例如，细胞可以培养至少7天的时间以在至少两次群体倍增的最小值之后重置其细胞表面受体谱。

在γδT细胞表面受体谱被重置的情况下，包括例如存在于原代未培养的γδ细胞上的免疫检查点抑制剂的细胞表面受体，如肿瘤特异性细胞表面受体B7-H1/PD-L1、B7-DC/PD-L2、PD-1和CTLA-4在培养扩增期间，可以不存在或数量大大减少。

培养步骤可以进一步包括监测γδT细胞的表面受体谱以确定为了显著减少或去除所选择的γδT细胞表面受体(例如，上述讨论的受体(B7-H1/PD-L1、B7-DC/PD-L2、PD-1和CTLA-4)的任何一种或任何组合)所需的培养步骤的适当持续时间。监测γδT细胞受体的方法可以例如使用流式细胞术的技术进行，如Chan D.等人，2014所描绘的那些。简要地，特异于免疫检查点抑制剂(checkpoint inhibitor)受体和/或配体的抗体将用于鉴定在其细胞表面上表达免疫检查点抑制剂的γδT细胞亚群(例如与抗-Vgamma9共染色)。

另外，或任选地，本发明的培养步骤可以包括当从第一受试者提取时，诱导在未培养的γδ细胞表面上不存在的γδT细胞表面受体类型在γδT细胞中表达的步骤，或者当从第一受试者提取时，诱导在未培养的γδ细胞表面上存在的细胞表面受体类型的表达量增加的步骤。这可以通过用源自癌症、细菌、真菌、原生动物或病毒的抗原处理(challenge)γδT细胞而实现。此抗原可以添加到培养扩增培养基中以增加扩增的γδT细胞的功效、抗原呈递潜力和细胞毒性。适当地，抗原可以以各种形式提供，包括但不限于固定化的抗原或抗体、经放射的肿瘤细胞系、人工抗原呈递细胞和添加合成的可溶性抗原。抗原可以在培养的第一天添加到培养扩增培养基中。在实施方案中，病毒可以选自流感、HIV、丙型肝炎、乙型肝炎、疱疹变体、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒、水痘、乳头瘤病毒、埃博拉病毒、水痘带状疱疹病毒或天花。可选择地，抗原可以是在细胞感染、细菌感染、真菌感染或原生动物感染中发现的抗原。特别地，靶抗原可以来自流感、HIV、丙型肝炎、乙型肝炎、疱疹变体、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒、EB病毒、水痘、乳头瘤病毒、水痘带状疱疹病毒或天花。

适当地，抗原可以包括来自此病毒有机体的有活性的或灭活的病毒片段、肽、蛋白质、抗原性片段等。

适当地，抗原可以包括肿瘤特异性抗原，其仅存在于肿瘤细胞上而不存在于任何其它细胞上和/或肿瘤相关抗原，其存在于一些肿瘤细胞和一些正常细胞上。这类肿瘤特异性抗原可以包括但不限于癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原和MAGE类抗原(包括MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA12、MAGEC2、BAGE、GAGE、XAGE1B、CTAG2、CTAG1、SSX2或LAGE1或其组合)。

适当地，可以使用感染细胞、坏死细胞或癌症细胞的裂解物以提供合适的抗原。在实施方案中，抗原可以是合成抗原，例如合成肽。可选择地，抗原可以从受试者获得。适当地，在培养步骤期间可以向细胞提供约0.02-2微克/ml的抗原。

在实施方案中，可以在培养血液单个核细胞的步骤中提供促进γδT细胞增殖和细胞表型维持的因子如IL-2、IL-15或IL-18(Garcia V.等人，1998，Nussbaumer O.等人，2013)。适当地，在这类实施方案中IL-2、IL-15或IL-18或其组合可以以50-2000U/ml，更优选400-1000U/ml的范围提供至培养基。培养通常是在34至38℃，更优选37℃，在2至10％，更优选5％CO₂的存在下进行的。培养基可以根据培养细胞的数量添加。适当地，血清可以以0.1至20％的量添加到培养液中。对于血清，例如可以使用胎牛血清、AB血清或自体血浆。

在实施方案中，可以将促进耗竭的(exhausted)或无反应性的γδT细胞复苏的因子被添加到培养基中。适当地，这些因子可以包括细胞因子如IL-15或IL-18或靶向特异性免疫检查点抑制剂受体或配体的抗体例如抗-PD-L1抗体(Chang K.等人，2014)，但也可以包括针对CTLA-4、PD-1、PD-2、LAG3、CD80、CD86、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、TIM3或A2aR的抗体。

在实施方案中，提供步骤可以包括来自供体受试者的血液或脐带血的收集。这类血液收集可以是约15至25ml的血液。在实施方案中，提供步骤可以包括收集步骤，其中收集步骤是在单个收集过程中从第一受试者收集至少γδT细胞。在实施方案中，收集步骤可以跨多个收集期。

在本发明的一个实施方案中，提供γδT细胞的方法可以包括测定从第一受试者收集的细胞的至少一种特征的分析步骤。在实施方案中，细胞的至少一个特征可以是细胞的DNA或RNA序列或氨基酸序列、细胞的蛋白质组或细胞的细胞表面标记。在实施方案中，该方法可以包括组织分型γδT细胞的步骤。γδ细胞表面标志物特征可以包括(但是不限于)CD3、CD4、CD8、CD69、CD56、CD27、CD45RA、CD45、TCR-Vg9、TCR-Vd2、TCR-Vd1、TCR-Vd3、TCR-pan g/d、NKG2D，单克隆趋化因子受体抗体CCR5、CCR7、CXCR3或CXCR5或其组合。这种分型可以包括基因型或表型信息。表型信息可以包括在微观、细胞或分子水平上的可观察或可测量的特征。基因型信息可以涉及特定遗传变异或突变，例如人白细胞抗原(供体的HLA类型)。适当地，γδT细胞可以提供临床级细胞系库，其可以被扩增和分化以用于大量的患者。在实施方案中，γδT细胞可以从脐带血起始材料离体扩增并且从多个供体组合以产生足够数量的γδT细胞以构成细胞库。在实施方案中，这个库将用从血型O的健康志愿者供体获得的γδT细胞适当地构建，选择所述志愿者是为了最大化人白细胞抗原(HLA)匹配的机会和因此最小化同种异体移植排斥的风险或使用免疫抑制药物实质性的需求。例如，用于UK/EU患者的这类库可以包括如下，其将允许对显著百分比的UK/EU人群的治疗，具有降低的排斥风险：

在实施方案中，所收集和处理的γδT细胞可以储存在细胞库或储存库中以备将来使用。因此，细胞可以储存在冷冻保护剂如DMSO或CryoStor^TM中，并且在液氮中经受受控的冷冻速率和储存。γδT细胞可以储存在根据单个或多个治疗步骤的需求所限定的单位或剂量的单元化存储器中。

在一个实施方案中，该方法可以包括用试剂处理从第一受试者收集的细胞群的步骤以增强收集的样品中γδT细胞的储存、活力或治疗能力。在一个实施方案中，该方法可以包括保存步骤，其中将冷冻保护剂提供给γδT细胞样品中的γδT细胞。

在实施方案中，γδT细胞可以是磷酸抗原异戊烯焦磷酸(IPP)扩增的人Vγ9Vδ2T细胞。

在实施方案中，γδT细胞可以是扩增的人Vδ1 T或Vδ3 T细胞。

根据本发明的第二个方面，提供了一种在个体中治疗感染或癌症的方法，包括向所述个体提供从不同个体获得的γδT细胞的步骤。因此，供体γδT细胞用于治疗感染，例如病毒、真菌或原生动物的感染，或用于治疗受体受试者的癌症，其中供体和受体不是相同的个体。

提供γδT细胞给受体受试者的施用方法可以包括静脉内、皮内或皮下注射。施用可以是进入到受影响区域或对个体全身施用。

在实施方案中，提供来自第一受试者的γδT细胞在用于被病毒、真菌或原生动物感染的第二不同受试者治疗中的应用，其中所述受试者的治疗是同种异体的。

在实施方案中，提供来自第一受试者的γδT细胞用于被病毒感染的第二不同受试者的治疗，其中所述病毒是选自HIV、流感或肝炎，其中所述治疗是同种异体的。在一个实施方案中，病毒可以是乙型肝炎或丙型肝炎、流感、疱疹变体、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒、水痘、乳头瘤病毒、水痘带状疱疹病毒或天花。

在实施方案中，流感病毒可以是甲型流感(FluA)病毒。在实施方案中，流感病毒可以是禽或猪源性流行性流感病毒，例如H5N1、H7N3、H7N7、H7N9和H9N2(禽类亚型)或H1N1、H1N2、H2N1、H3N1、H3N2、H2N3(猪亚型)。

在实施方案中，提供了γδT细胞用于患有癌症的受试者治疗，其中所述治疗是同种异体的。

在实施方案中，提供来自第一受试者的γδT细胞在用于第二受试者治疗中的应用，其中第二受试者患有病毒、真菌或原生动物感染中的至少一种。在实施方案中，正被提供γδT细胞的受试者可以同时、顺序或分开施用免疫抑制药物。免疫抑制药物的施用可以帮助减轻对γδT细胞的任何有害的免疫系统反应。

在实施方案中，提供了γδT细胞用于患有EB病毒诱导的淋巴增殖性疾病(EBV-LPD)的受试者治疗。EB病毒(EBV)是γ疱疹病毒家族的成员，并且在西方人群中是普遍的(＞90％的成年人血清阳性)。EBV是作为潜伏感染由宿主的细胞毒性T细胞(CTL)维持的，其预防病毒再激活，从而允许EBV无症状地持续作为在宿主B细胞中的潜伏感染。

EBV是与B细胞起源的许多恶性肿瘤相关，如Burkitt′s淋巴瘤(BL)，霍奇金氏病(HD)和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)以及上皮起源的癌症如鼻咽癌(NPC)和胃癌。

PTLD是与实体器官移植和造血干细胞移植相关的常规风险。

在实施方案中，提供来自第一受试者的γδT细胞在用于患有与EBV相关的恶性肿瘤的第二受试者治疗。

在实施方案中，提供一种或多种特异性γδTCR同种型的γδT细胞用于不同的病毒适应症的治疗。例如，Vδ2^pos亚型在HIV和流感感染的治疗中可能是最有效的(Wallace M.等人，1996，Tu W.等人，2011)，同时存在证据表明至少两种γδT细胞亚型在受控的EBV感染细胞中的作用；Vδ1^pos(Farnault L，等人，2013)和Vδ2^pos细胞(Xiang Z.等人，2014)。适当地，可以选择γδT细胞亚型的组合和施用于患者以增加γδT细胞治疗的有效性。适当地，这些可以包括使用不同培养条件产生的单一同种型γδT细胞群或使用限定的单一系列的细胞培养参数产生的多价γδT细胞群。

在本发明的第二个方面中使用的γδT细胞可以是在本发明第一个方面中所述的任何一种，即在如上所述的提供和培养步骤之后。

在本发明的第三个方面，提供用于向受试者自体提供γδT细胞的方法，包括步骤：

-提供来自受试者的γδT细胞的样品；

-培养γδT细胞以允许将它们施用回该受试者。

用于本发明的第一个方面的上述提供和培养的任何步骤可以应用于本发明的第三个方面。例如，培养γδT细胞的步骤可以包括用于改变γδT细胞表面受体谱的步骤，如上所述。

在本发明的第四个方面，提供了在个体中治疗感染或癌症的方法，包括向所述个体提供从该个体获得的γδT细胞的步骤，其中γδT细胞是已经通过本发明第三个方面中所述的方法提供的。

在实施方案中，癌症可以是骨髓瘤或黑色素瘤。在实施方案中，癌症可以包括但不限于包括胃癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胰腺癌、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、非小细胞肺癌、EBV-LPD、Burkitt′s淋巴瘤和霍奇金氏病的肿瘤类型。

根据本发明的另一个方面，提供了包含本发明任何方法的γδT细胞的药物组合物。

在实施方案中，该组合物包含统一剂量的γδT细胞，其适于提供给个体以提供治疗效果。

在实施方案中，药物组合物可以包括每人超过25×10⁹个γδT细胞的总剂量。

在实施方案中，提供了包含γδT细胞和抗体免疫治疗的药物组合物，用于癌症治疗。

在实施方案中，抗体免疫治疗可以是免疫级阻断闭剂，如PD-1、PDL-1和/或CTLA-4抑制剂，例如由Roche和Bristol Myers Squibb开发的PD-1、PDL-1和CTLA-4抑制剂。

在实施方案中，药物组合物可以包括能够阻断CTLA-4抑制信号的抗体。CTLA-4信号的阻断允许T淋巴细胞识别和破坏细胞。在实施方案中，这种抗体可以是伊匹单抗(ipolimumab)(MDX-010、MDX-101)。

在实施方案中，抗体可以抑制程序性死亡配体1(PDL-1)。在实施方案中，这种抗体可以是选自MPDL3280A(Roche)或MDX-1105。

在实施方案中，药物组合物可以与细胞因子组合，所述细胞因子例如IL-2或IL-12。在实施方案中，药物组合物可以包括干扰素γ。

在实施方案中，提供了包含γδT细胞和化疗剂的药物组合物，用于癌症治疗。

在实施方案中，提供了包含γδT细胞和治疗剂的药物组合物，用于病毒治疗。

在实施方案中，药物组合物可以用作癌症或感染的治疗剂或预防剂。

在本发明的实施方案中，γδT细胞可以是Vγ9Vδ2T细胞。

除非上下文另有要求，本发明每个方面的优选特征和实施方案对于每个其它方面可作必要的小更改。

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在整个说明书中，除非上下文另有要求，术语“包括”或“包括”或如“包括”或“包含”、“包括”或“包括”的变体将被理解为暗示包括所述整数或整数组，但是不排除任何其它整数或整数组的扩展。

现在将仅通过实施例的方式参考附图描述本发明的实施方案，其中

图1说明了起始培养物PBMC的免疫表型分型，和随后在培养物中扩增14天后以选择性激活和增殖γδT细胞群(Vgamma9 Vδ2)，其中在培养过程开始时(第0天)使用细胞群的流式细胞术免疫分型，使用从人血液分离的PBMC作为起始材料，和在选择性扩增过程(第14天)结束时：-A-在第0天用抗-Vgamma9-FITC抗体染色的分离的PBMC的柱状图，以检测在PBMC起始群体中γδT细胞的百分比(1.3％的PBMC是γδT细胞)：B-在选择性培养14天后，用抗-CD3(T细胞)和抗-Vgamma9(γδT细胞)细胞染色的细胞群的点图分析(77.5％的T细胞是γδT细胞)：C、D-在培养物中扩增14天后分离的PBMC(C)和细胞群(D)的明亮视野图像：E-指示在每个细胞培养群体内存在的γδT细胞百分比的表格；

图2说明了指数生长细胞在培养物中选择性扩增以激活和增殖γδT细胞群体(Vgamma9 Vδ2)，其中在第12天产生显著数量的高纯度γδT细胞，其被证明是癌细胞细胞溶解的有效效应物，使用一组EBV-体外阳性淋巴瘤细胞系-细胞群的流式细胞术免疫表型在培养过程开始时(第0天)应用，使用从人血液分离的PBMC作为起始材料和随后在选择性扩增过程(第12天)：-A-生长图，其显示在第12天达到总共4×10⁹个细胞的扩增在整个前12天期间在培养物中活细胞的总数；B、C-在培养物中选择性扩增12天后，起始PBMC(B)和细胞群(C)的流式细胞术分析分别显示3.1％(第0天)和87.1％(第12天)γδT细胞(抗-Vgamma9)：D-γδT细胞与5种EBV阳性靶细胞系(BL2 B95-8、BL30 B95-8、BL74 B95-8、Raji和IB4)以5∶1的效应细胞：靶细胞的比例培养16小时-γδT细胞引发的细胞溶解是使用非放射性Cytotox96测定法测量，并且表示为最大靶细胞裂解的百分比；和

图3说明了用于从异质细胞群体中分离离散的细胞表型的抗体介导的纯化方法，其中在这个实施例中，用全抗-γδT细胞受体抗体选择细胞以获得极高纯度的γδT细胞群体-在纯化(A)和随后纯化(B)之后，使用抗-γδT细胞受体-FITC缀合的抗体的细胞群体的流式细胞术免疫分型分析证明了从45％γδT细胞的起始材料获得了99.7％纯度的γδT细胞。

γδT细胞可以使用Nicol A.J.等人，2011描述的技术进行培养扩增。通过使用Ficoll-Paque(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)的密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)，并通过在补充有10％人AB血浆(Lonza)、L-谷氨酰胺(2mM；Lonza)和庆大霉素(40g；Pfizer，Bentley，WA，Australia)的RPMI 1640培养基(Lonza，Walkersville，MD，USA)中培养PBMC选择性增殖Vγ9Vδ2 T细胞。在第0天添加重组人IL-2(700IU ml-1；Novartis，Basel，Switzerland)和唑来膦酸(1μM；Novartis)，并且在培养期间每2-3天添加额外的IL-2。在7-14天培养后，使用miniMACS(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)，通过耗尽CD4+、CD8+和CD56+细胞获得用于体外功能评估的含有70-95％Vγ9Vδ2 T细胞的纯化的效应细胞群。

已经证明用离体扩增的Vγ9Vδ2 T细胞自体治疗实体瘤患者提供了临床益处(Noguchi等人，2011)。此外，用HLA匹配的离体扩增的αβTCR-阳性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)同种异体治疗已经证明在EBV-PTLD的治疗中是有效的(Haque T等人，2007)。因此本发明人认为用同种异体γδT细胞治疗癌症和病毒感染是可行的并且可能提供给患者可以证明的治疗益处。

尽管已经参考特定的实施例具体显示和描述了本发明，本领域技术人员可以理解在该形式和细节内的各种变化可以在没有脱离本发明的范围内在本文实施。

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Claims (15)

1.从第一受试者提供γδT细胞至第二同种异体受试者的方法，其中该方法包括：

-提供包含来自第一受试者的γδT细胞的样品；和

-培养存在于所述样品中的γδT细胞以允许所述γδT细胞施用于第二受试者。

2.如权利要求1中所述的方法，其中培养γδT细胞的步骤使相对于样品中的其它细胞类型，样品中的γδT细胞的数量增加。

3.如权利要求1或2中所述的方法，其中培养步骤包括从样品中的其它细胞类型纯化样品中的γδT细胞的步骤。

4.如权利要求3中所述的方法，其中纯化步骤使用抗-γδT细胞抗体以从样品中的其它细胞类型纯化和分离γδT细胞。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中培养或纯化γδT细胞以提供在样品中存在的细胞总数的超过10％。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中培养步骤包括一个或多个子步骤以减少或消除在来自第一受试者的样品中的γδT细胞上存在的一种或多种γδT细胞表面受体类型。

7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中培养步骤包括在γδT细胞中诱导来自第一受试者的未培养的γδT细胞的表面上不存在的表面受体类型的表达的步骤或诱导在来自第一受试者的γδT细胞的表面上存在的细胞表面受体类型的表达量增加的步骤。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括监测样品中的γδT细胞的细胞表面受体谱的步骤。

9.治疗个体中感染或癌症的方法，包括给所述个体提供从不同的同种异体个体获得的γδT细胞的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述γδT细胞由权利要求1至8中任一项的方法提供。

11.来自第一受试者的γδT细胞，用于治疗患有癌症或感染的第二同种异体受试者。

12.来自第一受试者的γδT细胞，用于治疗第二同种异体受试者，其中所述γδT细胞与免疫抑制药物同时、分别或依次施用。

13.权利要求9的治疗方法或权利要求11或12的用于治疗第二同种异体受试者的γδT细胞，其中所述感染是病毒、真菌或原生动物感染中的至少一种。

14.包含γδT细胞的药物组合物，用于治疗癌症或感染。

15.包含γδT细胞和抗体免疫治疗的药物组合物，所述抗体免疫治疗同时、分别或依次用于治疗癌症或病毒、真菌或原生动物感染。