CN107075466A - 细胞重编程的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于将第一细胞类型重编程为第二细胞类型的中间细胞的方法，其包括以下步骤：使第一细胞与第一试剂接触以调节第一细胞类型中的整联蛋白谱从而提供第二细胞类型的中间细胞。本发明还涉及通过本发明的方法获得的重编程细胞、用于将第一细胞类型重编程为第二细胞类型的试剂盒以及用于治疗需要基于细胞的治疗、组织替换和癌症治疗的患者的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年4月23日提交的新加坡申请第10201401734X号的优先权权益，其内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及细胞的重编程。特别地，本发明涉及整联蛋白调节的细胞的重编程。
背景技术
表型稳定性是已分化细胞的标志。这种表型稳定性通过称为动态互惠的过程中细胞与其环境之间的交互作用来维持，其中细胞微环境(例如细胞外基质(extracellularmatrix，ECM))和细胞之间的信号相互作用以在其生态龛环境内影响细胞表型并使细胞表型稳定。
细胞与其微环境之间的联系涉及跨膜细胞粘附蛋白，其中整联蛋白形成一个超家族。因此，整联蛋白在与ECM的细胞粘附中起关键作用，进而调节粘附、增殖、迁移和分化的细胞过程。
然而，迄今为止，关于通过操纵细胞与ECM的相互作用来将已分化的细胞重编程为干细胞样细胞或者将已分化的细胞重编程为其他已分化的细胞类型的报道很少。关于整联蛋白在重编程已分化的细胞的命运中的作用的报道也很少。
因此，需要了解细胞与ECM在重编程细胞命运中的相互作用以及整联蛋白在该过程中所发挥的作用。
发明概述
在一个方面，提供了用于将第一细胞类型重编程为第二细胞类型的中间细胞的方法，包括以下步骤：使所述细胞与第一试剂接触以调节第一细胞类型中的整联蛋白谱从而提供所述第二细胞类型的所述中间细胞。
在另一个方面，提供了根据本文中公开的方法获得的重编程的细胞。
在另一个方面，提供了用于将第一细胞类型重编程为第二细胞类型的试剂盒，包括以下一种或多种组分，任选地包括使用说明书：(i)包含至少一种第一试剂的组合物，以实现第一细胞类型至中间细胞类型的重编程；(ii)包含至少一种第二试剂的组合物，以实现中间细胞类型至第二细胞类型的重编程。
在另一个方面，提供了用于治疗需要基于细胞的治疗或组织替换的患者的方法，包括向所述患者施用根据本文中公开的方法获得的重编程的细胞。
在另一个方面，提供了根据本文中公开的方法获得的重编程的细胞，所述重编程的细胞用于治疗需要基于细胞的治疗或组织替换的患者，其中将向所述患者施用所述重编程的细胞。
在另一个方面，提供了根据本文中公开的方法获得的重编程的细胞在制备用于治疗需要基于细胞的治疗或组织替换的患者的药物中的用途，其中将向所述患者施用所述药物。
在另一个方面，提供了用于治疗需要癌症治疗的患者的方法，包括使用根据本文中公开的方法获得的重编程的细胞作为载体向所述患者递送生物活性物。
在另一个方面，提供了根据本文中公开的方法获得的重编程的细胞，所述重编程的细胞作为用于递送生物活性物的载体用于治疗需要癌症治疗的患者。
在另一个方面，提供了根据本文中公开的方法获得的重编程的细胞作为用于递送生物活性物的载体在制备用于治疗需要癌症治疗的患者的药物中的用途。
在另一个方面，提供了确定癌症治疗对癌症患者的适用性的方法，包括根据本文中公开的方法制备重编程的细胞并向所述重编程的细胞施用一种或多种癌症治疗以评估所述癌症治疗对所述重编程的细胞的效力。
在另一个方面，提供了根据本文中公开的方法制备的重编程的细胞，所述重编程的细胞用于确定癌症治疗对癌症患者的适用性，其中将向所述重编程的细胞施用一种或多种癌症治疗以评估所述癌症治疗对所述重编程的细胞的效力。
附图简述
参照详细描述同时结合非限制性实例和附图一起考虑时，将更好地理解本发明，在附图中：
图1.通过选择性的整联蛋白抑制和连接诱导的时间轴
图2.导致中间表型的选择性整联蛋白抑制。(A)在诱导3天时球形细胞簇(SCC)形式的中间表型；(B)MET标志物和(C)干细胞标志物相对于同种型对照的变化；(D)：显示整联蛋α2和α6表达上调以及整联蛋白α3和CXCR4在较低程度上表达上调的Western印迹。
图3.与(B)对照成纤维细胞相比的经DAPI-染色的(A)诱导的IMR90成纤维细胞(中间表型)的共聚焦显微图，其示出了染色质和细胞核结构的差异。蓝色：DAPI染色；绿色：鬼笔环肽染色；下面的对应图示出了通过细胞核的共聚焦截面的3D重建。
图4.(A)将SCC与ECM一起培养过夜；将培养基更换成包含FGF和EGF的B27；(i)更换培养基之前的细胞外观；更换培养基后(ii)1天、(iii)3天、(iv)4天之后的细胞外观；(B)将SCC与ECM一起培养过夜；将培养基更换成无生长因子的DMEM。更换培养基后(ii)1天、(iii)3天、(iv)4天之后的细胞外观；(C)培养4天之后的基因表达。(C)：在具有和不具有生长因子(GF)下在ECM(Geltrex/层粘连蛋白332)培养物中4天之后的整联蛋白谱。(D)在具有和不具有GF下在ECM(Geltrex/层粘连蛋白332)培养物中4天之后的上皮标志物和间充质标志物。(E)在具有和不具有GF下在ECM(Geltrex/层粘连蛋白332)培养物中4天之后的多能和干细胞性标志物。
图5.重编程的细胞的表型。(i)geltrex诱导的细胞和(ii)层粘连蛋白诱导的细胞(具有生长因子)的基因表达(A)和细胞形态(B)。在(B)中，细胞传代培养6天。
图6.向神经元表型的重编程。(A,B)针对βIII微管蛋白染色的在Rin5f条件培养基存在下于Geltrex上诱导的成纤维细胞。24小时之后，将细胞重铺板在TCP上并用(A)DMEM或(B)SKP培养基进行培养。嵌图：用DAPI进行的细胞核染色，其示出了针对βIII微管蛋白染色的神经元形态的细胞；(C,D)较高放大倍数下的表现出神经元形态的重编程的成纤维细胞。
图7.施用于胶质瘤细胞系U251 2天的3-抗体组合，其包含整联蛋白αv、αvβ5和αvβ6。(A)经抗体处理的细胞和(B)同种型对照的形态。针对对应的同种型对照归一化的多种(C)干细胞性标志物和(D)MET标志物的表达变化。
图8.经3-抗体组合处理2天的胶质瘤细胞系U251的免疫印迹，所述3-抗体组合包含整联蛋白αv、αvβ5和αvβ6。
图9.经在层粘连蛋白包被的培养孔上培养的经抗体处理细胞。(A)经抗体处理的细胞。(B)同种型对照。(C)经3-抗体组合处理2天，然后重铺板到层粘连蛋白511上并再培养4天的胶质瘤细胞系U251的免疫印迹，所述3-抗体组合包含整联蛋白αv、αvβ5和αvβ6。
图10.单独的整联蛋白(整联蛋白α2、α3、α6、β1和β4)的过表达与上皮标志物和干细胞性标志物的表达增高以及间充质标志物的表达降低相关。与(a)玻璃盖玻片上相比，当在(b)500nm二氧化硅纳米地形支架上培养细胞时变化更显著。
图11.(A)诱导后3天人皮肤成纤维细胞(HDF)的基因表达谱。(B)诱导后2天真皮乳头细胞(DP)的基因表达谱。
图12.(A)整联蛋白表达谱。(B)上皮标志物和间充质标志物。(C)在诱导后4天IMR90的多能性标志物和干细胞性标志物，其中在第3天时暴露于ECM(层粘连蛋白511和层粘连蛋白521)。(D)重编程时间轴的示意图。
图13.(A)整联蛋白表达谱。(B)上皮标志物和间充质标志物。(C)在诱导后10天IMR90的多能性标志物和干细胞性标志物，其中分别在第3天时暴露于层粘连蛋白521，在第4天时暴露于KGF。(D)重编程时间轴的示意图。
图14.(A)整联蛋白表达谱。(B)上皮标志物和间充质标志物。(C)在诱导后4天IMR90的多能性标志物和干细胞性标志物，其中在第1天时暴露于E层粘连蛋白521(KGF)。(D)重编程时间轴的示意图。
图15.(A)整联蛋白表达谱。(B)上皮标志物和间充质标志物。(C)在诱导后8天IMR90的多能性标志物和干细胞性标志物，其中在第2天时暴露于E层粘连蛋白511(+/-HGF)。(D)重编程时间轴的示意图。
图16.(A)整联蛋白表达谱。(B)上皮标志物和间充质标志物。(C)在诱导后3天肉瘤系的多能性标志物和干细胞性标志物。
图17.(A)整联蛋白表达谱。(B)上皮标志物和间充质标志物。(C)在诱导后3天hMSC的多能性标志物和干细胞性标志物。(D)重编程时间轴的示意图。
定义
本文中使用的以下词语和术语应具有所指示的含义：
本文中使用的术语“重编程”及其语法上的变化形式指改变或者逆转未分化的、部分分化的或终末分化的细胞的分化状态。本文中使用的重编程可以是细胞的分化状态的部分或完全转化。
本文中使用的术语“调节”及其语法上的变化形式在提及整联蛋白时指改变一种或多种整联蛋白的基因表达和/或蛋白质活性。可通过以下中的一种或多种来调节整联蛋白的基因表达和/或蛋白质活性：整联蛋白抑制剂、拮抗剂、激活剂、激动剂、整联蛋白的选择性表达、整联蛋白的过表达、整联蛋白的沉默表达、降低整联蛋白的表达水平、额外的整联蛋白的表达、整联蛋白的选择性抑制、选择性整联蛋白连接和选定的微RNA(miRNA)的抑制。还可通过改变细胞微环境中整联蛋白配体的表达、水平和类型来调节整联蛋白的基因表达和/或活性。
本文中使用的术语“整联蛋白”指细胞粘附受体整联蛋白超家族中的一个或多个成员。术语“整联蛋白选择物”指一组一种或多种整联蛋白，其表达或过表达引发细胞向一种细胞类型重编程。
本文中使用的术语“整联蛋白谱”指细胞中一种或多种整联蛋白的基因表达和基因表达水平。术语“整联蛋白谱”还可指细胞中一种或多种整联蛋白的活性。
本文中使用的术语“整联蛋白配体”指能够与细胞中的一种或多种整联蛋白亚基或者整联蛋白分子或者一种或多种整联蛋白基因结合的任何分子和物质。整联蛋白配体包括但不限于RGD配体、LDV配体、抗整联蛋白抗体或其片段、细胞外基质蛋白或细胞表面粘附蛋白。
本文中使用的术语“核酸分子”指任何单链或双链的RNA或DNA分子，例如mRNA、cDNA、基因组DNA、质粒DNA和异种DNA。
本文中使用的术语“中间细胞”在提及将第一细胞类型重编程为第二细胞类型时指呈现出第一和第二细胞类型二者的表型特征和/或基因型特征和/或第一细胞类型或第二细胞类型中不存在的另外特征的细胞。表型特征包括但不限于增殖速率、形态、生长速率、发育特性和生化特性。例如，可基于干细胞标志物的表达来鉴定中间细胞。在另一个实例中，可基于与间质上皮细胞转化态(MET)相关的标志物的表达来鉴定中间细胞。一般应理解，相对于第一细胞类型，中间细胞表现出特定的基因表达趋势。例如，中间细胞可上调第二细胞类型的至少三种标志物的表达和/或下调第一细胞类型的至少三种标志物的表达。在一个实例中，与第一细胞类型相比，中间细胞可上调至少三种上皮标志物和/或下调至少三种间充质标志物。在另一个实例中，与第一细胞类型相比，中间细胞可上调至少三种干细胞标志物并下调至少三种上皮标志物。在另一个实例中，中间细胞可展现出中间表型，例如球形细胞簇。在又一个实例中，中间细胞可上调至少一种整联蛋白的表达。例如，中间细胞可上调整联蛋白β4和整联蛋白β6。中间细胞还可上调整联蛋白α2、α3、α6、αv、β4或β6中一种或多种的表达。一般应理解，表达的上调或下调可在基因和/或蛋白质水平。一般还应理解，上调或下调是相对于第一细胞类型和/或第二细胞类型而言。
本文中使用的术语“抑制剂”在提及整联蛋白时指干预一种或多种整联蛋白与其底物相互作用的能力的物质。抑制剂可以是抗体、替代底物或拮抗剂。抑制剂或整联蛋白可通过与底物竞争地结合、改变整联蛋白对底物的结合亲和力或者诱导整联蛋白分子发生构象改变来发挥功能从而改变一种或多种整联蛋白与其底物的相互作用。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，指具有免疫球蛋白样结构域的分子，包括单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和缀合抗体；单可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、单链Fv、双抗体、TandabsTM等(有关替代“抗体”形式的总结参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology,2005,第23卷,第9期,1126-1136)。抗原结合片段或免疫有效片段可包含部分的重链或轻链可变序列。片段的长度为至少5、6、8或10个氨基酸。或者，片段的长度为至少15、至少20、至少50、至少75或至少100个氨基酸。
本文中使用的术语“干细胞”指未分化的或部分分化的细胞。干细胞可以是多潜能的或多能的，可分离自终末分化的组织或器官(成体干细胞)、来源于胚胎组织(胚胎干细胞)或者可通过诱导由体细胞或终末分化的细胞得到(诱导的多能干细胞)。本领域技术人员可容易理解，干细胞具有特定的基因型特征和表型特征。例如，干细胞可表达包括但不限于以下的基因：OCT4A、NANOG、SOX2、LIN28A、Nestin、CXCR4、TERT、TP63和CSPG4。
因此，术语“干细胞样细胞”指具有与干细胞的特征相似的特征的细胞。应理解，干细胞样细胞与干细胞的相似性可以是部分的或完全的。
本文中使用的术语“上皮细胞”指上皮的细胞，包括但不限于单层鳞状上皮细胞、单层立方形上皮细胞、单层柱状上皮细胞、纤毛柱状上皮细胞、腺上皮细胞、复层上皮细胞和假复层上皮细胞。应容易理解，上皮细胞具有特定的基因型特征和/或表型特征。
因此，术语“上皮样细胞”指具有与一种或多种上皮细胞的特征相似的特征的细胞。应理解，上皮样细胞与上皮细胞的相似性可以是部分的或完全的。
本文中使用的术语“间充质细胞”指间质的细胞。因此，术语“间充质样细胞”指具有与一种或多种间充质细胞相似的基因型特征和/或表型特征的细胞。应理解，间充质样细胞与间充质细胞的相似性可以是部分的或完全的。
本领域技术人员可容易地基于细胞的特征来识别具有上皮或上皮样特征、间充质或间充质样特征的细胞。例如，特定基因的表达、形态和增殖。上皮和间充质的基因或标志物的实例包括但不限于CDH1、DAG1、EPCAM、KRT18、LAMA3、LAMB3、LAMC2、PRRX1、ZEB1、CDH2、VIM、FN1、Snail、Slug和MMP9。
本文中使用的术语“改变”细胞类型指改变细胞的表型和/或基因型特征。
本文中使用的术语“连接”在提及整联蛋白时指一种或多种试剂或底物与一种或多种整联蛋白的结合以实现整联蛋白活性。
本文中使用的术语“细胞外基质”(ECM)指细胞分泌的蛋白质和多糖的网络。ECM提供了结构支持并且影响其微环境中细胞的生理过程、生化过程和发育过程。
本文中使用的术语“试剂”指任何类型的分子，例如多核苷酸、肽、肽模拟物、类肽、化学化合物，例如小分子、有机分子等。
本文中使用的术语“治疗”或其语法上的变化形式指减轻与病症相关的症状。因此，本文中使用的术语“癌症治疗”指减轻与癌症相关的症状。
本文中使用的术语“基于细胞的治疗”、“细胞治疗”或“细胞疗法”指涉及使用细胞材料的治疗。细胞材料可包括完整细胞或细胞碎片、来源于供体的同种异体细胞或来源于患者的细胞。细胞材料还可包括异种细胞。
本文中使用的术语“组织替换”指替换或修复患者中的全部或部分组织或器官的过程。替换组织或器官在施用于患者之前在支架上两维或三维地合成。
本文中使用的术语“支架”指提供细胞附着的支持物的结构。支架可以是模拟组织(例如细胞外基质)的三维结构或者模拟基膜的细胞支持物。支架的一个实例可以是包被有细胞外基质蛋白的三维支持物。支架的另一个实例可以是过滤器，例如Transwell膜。支架的又一个实例是纳米地形支架。支架可以是未经包被的或者包被有天然存在的或合成的分子或化合物。例如，支架可包被有胶原、糖胺聚糖、肽、肽模拟物或聚-L-赖氨酸。
本文中使用的术语“生物活性物”指具有生物活性的物质。
本文中使用的术语“生长因子”指能够刺激细胞生长、增殖或细胞分化的物质。生长因子通常充当细胞间的信号分子。
本文中使用的术语“载体”指将生物活性物递送至患者的工具。
本文中使用的术语“癌症治疗的适用性”指患者是否是某种类型癌症的候选者。
本文中使用的“组合物”或“药物组合物”指本文中所述的一种或多种化合物或者其生理学上/药学上可接受的盐或前药与其他化学成分(例如生理学上/药学上可接受的载体和赋形剂)的混合物。药物组合物的目的是为了便于将化合物施用于生物体。
本发明的组合物可通过本领域中公知的工艺，例如通过常规的混合、溶解、造粒、制糖衣、细磨、乳化、包封、包埋或冻干工艺来制备。
根据本发明使用的药物组合物可使用一种或多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和辅料)以常规方式来配制，所述载体有利于将活性化合物加工成可药用的制剂。适宜的配制依赖于所选择的给药途径。
本文中使用的术语“施用”或“给药”指出于伤口愈合、药物递送和治疗的目的而向生物体递送经修饰的胶原分子或其药学上可接受的盐或者包含经修饰的胶原分子或其药学上可接受的盐的药物组合物。
合适的给药途径包括但不限于经口、经直肠、透黏膜或经肠给药或者肌内、皮下、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、玻璃体内、腹膜内、鼻内或眼内注射。或者，可以以局部方式而非全身方式来施用胶原分子，例如通过直接向组织中注射化合物。
本文中所举例说明的发明可适当地在不存在本文中未具体公开的任何要素、限制的情况下实施。因此，例如术语“包含/包括”等应理解为开放式的且没有限制。另外，本文中采用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且并非旨在使用排除所示出且描述的特征或其部分的任何等同特征的此类术语和表达，但是应认识到，在本发明所要求保护的范围内可进行多种修改。因此，应理解，尽管已通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可采用本文中公开的其中体现发明的修改方案和变化方案，并且这样的修改方案和变化方案被认为在本发明的范围之内。
已在本文中对本发明进行了广泛且一般性的描述。落入一般性公开内容内的较窄类别和亚属分组各自也形成本发明的一部分。这包括具有从该属中除去任何主题的条件或负面限制的本发明的一般性描述，不管所删除内容是否在本文中具体详述。
其他实施方案在下述权利要求书和非限制性实例内。另外，当按照马库什组对本发明的特征或方面进行描述时，本领域技术人员应认识到由此还可按照马库什组中的任意单个成员或成员亚组来对本发明进行描述。
具体实施方式
现在将公开用于将体细胞重编程为干细胞样表型的方法的示例性的非限制性实施方案：
用于将第一细胞类型重编程为第二细胞类型的中间细胞的方法，其包括以下步骤：使所述细胞与第一试剂接触以调节第一细胞类型中的整联蛋白谱从而提供所述第二细胞类型的所述中间细胞。
在一个实施方案中，将细胞由分化状态部分重编程为较不分化的状态。在另一个实施方案中，将细胞由未分化状态部分重编程为部分分化状态。在又一个实施方案中，细胞的转化是完全的，例如将终末分化细胞转化成未分化细胞，或者反之亦然。在另一个实施方案中，将一个细胞谱系的终末分化细胞重编程为另一谱系的分化细胞。应理解，重编程可以是单向的，即从一种细胞类型到另一细胞类型，或者可以是双向的，即从一种细胞类型到另一种细胞类型，并且反之亦然。细胞重编程可在体外、体内或离体发生。
在一个实施方案中，第一试剂是至少一种整联蛋白配体。在一个实施方案中，使细胞与至少一种整联蛋白配体接触可涉及使细胞与一种或多种细胞外基质或基质蛋白接触。细胞外基质或基质蛋白的实例包括但不限于层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、明胶、胶原I、胶原IV、AlgiMatrixTM、CTSTM CELLstartTM、鸟氨酸、玻连蛋白、巢蛋白、骨桥蛋白(ostepontin)、骨粘连蛋白、腱生蛋白C、ECM模拟物或其组合。在一个实施方案中，所述细胞外基质蛋白是一种或多种层粘连蛋白同种型。在一个优选实施方案中，所述细胞外基质是层粘连蛋白511、层粘连蛋白521或层粘连蛋白332。在另一个实施方案中，所述细胞外基质来源于基膜。在又一个实施方案中，所述细胞外基质是层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白411或层粘连蛋白421。
在一个实施方案中，使细胞与至少一种整联蛋白配体接触还可涉及使细胞类型与一种或多种整联蛋白抑制剂、整联蛋白拮抗剂、肽、环肽、分解素类、肽模拟物和小分子拮抗剂接触。在一个实施方案中，所述整联蛋白抑制剂是抗整联蛋白抗体或其片段。抗整联蛋白抗体或其片段的实例包括但不限于抗整联蛋白αV、抗整联蛋白α5、抗整联蛋白β3、抗整联蛋白αV/β5、抗整联蛋白αVβ6。本领域技术人员应理解，可使用针对不同克隆的抗体。例如，抗整联蛋白αV[272-17E6]、抗整联蛋白αV(克隆JBS5)、抗整联蛋白α5(克隆H96)、抗整联蛋白α5[P1D6]、抗整联蛋β3[25E11]、抗整联蛋白αV/β5(P1F6)L、抗整联蛋白αV/β6 10D5、抗整联蛋白β6(克隆H-110)。
在一个实施方案中，整联蛋白抑制剂与选自以下的一种或多种整联蛋白亚基结合：α1、α2、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αv、αD、αL、αM、αX、αE、αIIb、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8及其组合。
在一个实施方案中，整联蛋白抑制剂与αv、α5、β1、β3、αvβ5、αvβ6、β5、αvβ3和β6中的一种或多种结合。
在本文中公开的方法中，细胞与一种或多种整联蛋白配体的接触改变基因表达以将所述第一细胞类型转化成所述中间细胞类型。在另一个实施方案中，细胞与一种或多种整联蛋白配体的接触选择整联蛋白的选择物。
在一个实施方案中，使整联蛋白配体与第一细胞类型接触足以改变基因表达的时间。例如，使整联蛋白配体与第一细胞类型接触约1分钟、约3分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约60分钟、约90分钟、约2小时、约24小时、约2天、约3天和约5天的一段时间。在一个实施方案中，使第一细胞类型与整联蛋白配体接触的持续时间为约24小时。在另一个实施方案中，使第一细胞类型与整联蛋白配体接触的持续时间为约2天。
在另一个实施方案中，调节第一细胞类型中的整联蛋白谱的第一试剂是核酸分子，其中所述细胞与所述核酸分子的接触改变至少一种整联蛋白基因的表达，从而调节所述细胞中的整联蛋白谱。
核酸分子的一个实例是表达载体。表达载体可包含一个或多个基因，每个基因与启动子可操作地连接。在另一个实例中，表达载体可包含可操作地与一个启动子连接的一个或多个基因。基因可通过连接序列来连接，所述连接序列包括但不限于2A和内部核糖体进入位点(IRES)。一般应理解，表达载体可包含一种或多种选择标记。表达载体可以是整合型载体或非整合型载体。表达载体的一个实例是病毒表达载体。病毒载体的实例包括但不限于慢病毒表达载体或质粒、逆转录病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、杆状病毒(baculoviral)载体和仙台病毒载体。在一个实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。
在一个实例中，核酸分子可以是包含至少一个与启动子可操作地连接的整联蛋白基因的表达载体。在一个实例中，核酸分子是包含至少一个与启动子可操作地连接的整联蛋白基因的表达载体以在所述细胞中过表达所述整联蛋白基因。
在一个实例中，所述表达表达载体包含单独的或组合的整联蛋白α2、α3、α6、β1和β4中的至少一个。
核酸分子的另一些实例包括但不限于寡核苷酸，例如干扰核糖核酸(iRNA)。iRNA的实例包括但不限于小干扰核糖核酸(siRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)。
一般应理解，“siRNA”指能够指导或介导RNA干扰途径的包含约10至50个核苷酸(或核苷酸类似物)的小干扰核糖核酸(RNA)或RNA类似物。这些分子的长度可不同并且可与其靶信使RNA(mRNA)具有不同程度的互补性。术语“siRNA”包括两条单独链的双链体，即双链RNA；以及可形成包含双链体区的发夹结构的单链体。
还一般应理解，本文中使用的术语“shRNA”指能够进行RNAi并且具有随从链、环和引导链的单分子RNA。随从链和引导链可基本上彼此互补。术语“shRNA”还可包括这样的核酸：包含除核糖核苷酸部分之外的部分，所述除核糖核苷酸部分之外的部分包括但不限于经修饰的核苷酸、经修饰的核苷酸间连接、非核苷酸、脱氧核苷酸及其所提及核苷酸的类似物。
一般应理解，miRNA一般为平均约20个核酸的单链分子。
可使核酸分子与细胞接触。使核酸分子与细胞接触可包括本领域中公知的方法。例如，所述方法包括但不限于化学转染、电穿孔、热冲击、病毒感染或微注射。
在一个实例中，第一细胞类型与核酸分子的接触改变至少一种整联蛋白基因的表达，其中该至少一种整联蛋白基因过表达。例如，整联蛋白α2、α3、α6、β1和β4中的一种或多种过表达。
在一个实例中，第一细胞类型与核酸分子的接触改变至少一种整联蛋白基因的表达，其中该至少一种整联蛋白基因选择性地表达。在另一个实例中，使用核酸分子可使细胞类型中的一种或多种整联蛋白沉默。在又一个实例中，可使用核酸分子来降低一种或多种整联蛋白的表达水平。整联蛋白过表达、整联蛋白的选择性表达、整联蛋白基因沉默和/或整联蛋白表达水平的降低可使用PCR(例如，半定量PCR或定量PCR)来进行测试。
在本文中公开的方法中，所述方法还包括以下步骤：检测指示中间细胞类型的标志物的表达以确定所述第一细胞类型已转变为所述中间细胞类型。一般应理解，检测标志物的表达包括测试标志物的存在或不存在或者测量标志物的表达水平或表达水平变化。例如，所述方法还包括以下步骤：检测一种或多种干细胞标志物和/或间质上皮细胞转化态(MET)相关标志物的表达以确定所述第一细胞类型已转变为所述中间细胞类型。可用于确定所述第一细胞类型已转变为中间细胞类型的标志物的实例包括但不限于OCT4A、NANOG、SOX2、LIN28A、Nestin、CXCR4、TERT、TP63、CSPG4、TGF B1、FGF2、H1F1A、CDH1、DAG1、EPCAM、KRT18、CDH2、VIM、FN1、ZEB1和PRRX1。
在另一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：检测与第一细胞类型相关的标志物的下调以确定所述第一细胞类型已转化为所述中间细胞类型。例如，所述方法包括以下步骤：检测一种或多种上皮标志物的下调以确定所述第一细胞类型已转化为所述中间细胞类型。上皮标志物的实例包括但不限于CDH1、DAG1、EPCAM和KRT18。
在一个实施方案中，所述方法还包括检测一个或多个整联蛋白基因的上调或下调的步骤。例如，相对于第一细胞类型整联蛋白β4和整联蛋白β6上调指示中间细胞。在另一个实例中，相对于第一细胞类型整联蛋白α2、α3、α6、αv、β4或β6中的一个或多个上调可指示中间细胞。在另一个实例中，相对于第二细胞类型整联蛋白β4和整联蛋白β6上调指示中间细胞。在又一个实例中，相对于第二细胞类型整联蛋白α2、α3、α6、αv、β4或β6中的一个或多个上调可指示中间细胞。
在一个实施方案中，检测多能性标志物、上皮标志物、MET标志物的表达和/或整联蛋白表达通过聚合酶链反应(PCR)来进行。PCR可以是实时定量PCR或半定量PCR。检测干细胞标志物的表达还可通过免疫组织化学、免疫荧光、流式细胞术、DNA测序或微阵列来进行。
在一个实施方案中，本文中提供的方法还包括使中间细胞类型与包含第二试剂的组合物接触以实现中间细胞类型至第二细胞类型的重编程。例如，第二试剂可以是与以下一种或多种结合的配体：整联蛋白亚基α1、α2、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αv、αD、αL、αM、αX、αE、αIIb、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8。在一个实施方案中，第二试剂连接整联蛋白亚基α2、α3、α6、αv、α5、β1、β3、β4、β5、β6中的一种或多种和/或亚基αvβ3、αvβ5、αvβ6、α6β1、α6β4、α2β1、α3β1和α5β1的组合中的一种或多种。
在一个实施方案中，第二试剂包含与一种或多种整联蛋白亚基和/或其组合结合的配体以导致所述整联蛋白的连接。
实现中间细胞类型至第二细胞类型的重编程的第二试剂的实例包括但不限于细胞外基质和基膜的组分。在一个实施方案中，使细胞与至少一种整联蛋白配体接触可涉及使细胞与一种或多种细胞外基质或基质蛋白接触，所述细胞外基质或基质蛋白例如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、明胶、胶原I、胶原IV、AlgiMatrixTM、CTSTM CELLstartTM、鸟氨酸、玻连蛋白、巢蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、腱生蛋白C、ECM模拟物或其组合。在一个实施方案中，所述细胞外基质蛋白是一种或多种层粘连蛋白同种型。在另一个实施方案中，所述细胞外基质是层粘连蛋白511、层粘连蛋白521或层粘连蛋白332。在另一个实施方案中，所述细胞外基质来源于基膜。在又一个实施方案中，所述细胞外基质是层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白411或层粘连蛋白421。
在一个实施方案中，所述一种或多种细胞外基质组分来源于基膜。
在一个实施方案中，使实现中间细胞类型至第二细胞类型的重编程的第二试剂与中间细胞类型接触足以实现重编程为第二细胞类型的持续时间。
例如，接触持续时间为至少约12小时、至少约18小时、至少约24小时、至少约30小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约2.5天、至少约3天、至少约3.5天、至少约4天、至少约4.5天、至少约5天、至少约5.5天、至少约6天、至少约6.5天或至少约7天。
在本文中公开的方法中，第一细胞类型至第二细胞类型的重编程提供了介于第一和第二细胞类型之间的中间细胞类型。中间细胞类型可具有第一细胞类型和第二细胞类型的表型特征和/或基因型特征。例如，中间细胞类型相对于第一细胞类型可具有增强的干细胞样特性。在另一个实例中，中间细胞类型相对于第一细胞类型可具有增强的上皮样特征。中间细胞类型还可具有在第一细胞类型或第二细胞类型中未观察到的特征。一般应理解，相对于另一细胞类型而言中间细胞类型中的干细胞样特性增强意味着中间细胞类型与另一细胞类型相比具有更多的干细胞特征。例如，中间细胞类型可表达更多的干细胞标志物、更高水平的干细胞标志物或者倾向于形成细胞簇。类似地，与另一细胞相比上皮特性增强的细胞应理解为与所述另一细胞相比展现出更多的上皮基因型特征或表型特征。
细胞类型的实例包括但不限于间充质细胞、上皮细胞、多潜能细胞、多能细胞、癌症干细胞和/或具有上述细胞类型的部分特征的细胞。在一个实施方案中，第一细胞类型或第二细胞类型是成纤维细胞，例如胎儿肺成纤维细胞、IMR90成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、成体皮肤成纤维细胞。在另一个实施方案中，第一细胞类型或第二细胞类型是间充质细胞，例如人间充质干细胞、毛囊真皮乳头细胞。在另一个实施方案中，第一细胞类型是癌细胞，例如原发性癌细胞、癌症干细胞或癌细胞系。癌症的实例包括但不限于脂肪肉瘤、纤维肉瘤、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤和黑素瘤。
在另一个实施方案中，第一细胞类型或第二细胞类型是干细胞样细胞或干细胞。在另一个实施方案中，第一细胞类型或第二细胞类型是神经元细胞、星形胶质细胞或黑素细胞。在又一个实施方案中，第一细胞是干细胞或干细胞样细胞，第二细胞类型是上皮细胞或上皮样细胞、神经元细胞或癌症干细胞。
在另一个实施方案中，第一细胞类型或第二细胞类型是具有干细胞样特性和/或上皮特性的细胞。
在一个实施方案中，可将成纤维细胞重编程为神经细胞。
在一个实施方案中，可将成纤维细胞重编程为不同的体细胞。
本发明还提供了用于将第一细胞类型重编程为第二细胞类型的方法，其包括以下步骤：
(b)使存在的和/或已诱导在第一细胞类型中表达并且与至第二细胞类型的重编程相关的整联蛋白选择物与包含能够实现重编程为第二细胞类型的试剂的组合物接触。
在一个实施方案中，所述整联蛋白选择物可包含α2、α3、α6、αv、β4和β6整联蛋白中的一种或多种。
在另一个实施方案中，本文中公开的方法还包括使已与提供所述第二细胞类型的所述中间细胞的所述第一试剂接触并且已与实现所述中间细胞类型至所述第二细胞类型的重编程的所述第二试剂接触的所述第一细胞类型与能够实现进一步重编程和/或改变所述第一细胞类型的生长特性和/或增殖特性的另一试剂接触。
所述另一试剂的实例包括但不限于生长因子、条件培养基或补充细胞培养基。在一个实施方案中，所述生长因子可以是成纤维细胞生长因子2(FGF2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)和角质形成细胞生长因子(KGF)中的一种或多种。在另一个实施方案中，所述条件培养基受第二细胞类型的细胞的条件限制。在又一个实施方案中，所述条件培养基受不同于第一细胞类型和第二细胞类型的细胞类型的条件限制。在一个实例中，所述条件培养基受大鼠胰岛素瘤(Rin5f)细胞系的条件限制。在一个实施方案中，细胞培养基可补充有补充物(包含BSA、转铁蛋白、胰岛素、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、生物素、L-肉碱、皮质酮、乙醇胺、d(+)-半乳糖、谷胱甘肽(还原的)、亚麻酸、亚油酸、视黄醇乙酸酯、硒、t3(三碘-1-甲状腺原氨酸)、dl-α-生育酚(维生素e)、dl-α-生育酚乙酸酯、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶)。在另一个实施方案中，细胞培养基是TeSRTM2(包含DMEM/F12(液体)、L-抗坏血酸、硒、转铁蛋白、NaHCO3、谷胱甘肽、L-谷氨酰胺、确定的脂质、硫胺素、β-巯基乙醇、白蛋白、胰岛素、FGF2、TGFβ1、哌可酸、LiCl、GABA)。
在一个实施方案中，所述另一试剂的接触持续时间为足以实现进一步重编程为第二细胞类型和/或改变其生长特性和/或增殖特性的一段时间。
在一个实施方案中，与所述另一试剂的接触持续时间为至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天和至少约7天。
可在支架上培养通过本文中公开的方法重编程的细胞。支架可从天然来源获得或者可以是合成的，并且可以是陶瓷制品、合成聚合物或天然聚合物。支架还可以是由不同类型的生物材料构成的复合材料。支架的实例包括但不限于聚苯乙烯、聚-L-乳酸、聚乙醇酸、胶原和胶原复合材料。
在一个实施方案中，支架是纳米地形支架。在另一个实施方案中，支架是包含纳米颗粒(例如二氧化硅)的阵列的纳米地形支架。例如，纳米地形支架可由一种或多种尺寸(例如两种尺寸)的二氧化硅纳米颗粒的均匀阵列构成。纳米颗粒的直径可为约1nm、5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm.190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm 320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm 480nm、490nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm或1000nm。合适的纳米颗粒尺寸的实例包括但不限于66±6nm和414±37nm。
一般应理解，第一试剂、第二试剂和另一试剂可顺序使用或同时使用。例如，可将第一试剂、第二试剂和另一试剂同时添加至细胞。在另一个实例中，可添加第一试剂，接着添加第二试剂，之后添加另一试剂。在另一个实例中，可将第一试剂和第二试剂同时添加，之后添加另一试剂。在另一个实例中，可添加第一试剂，之后同时添加第二试剂和另一试剂。
一般还应理解，当将一种或多种试剂顺序使用时，可在添加后续剂之前除去在前的试剂。一般还应理解，将一种或多种试剂顺序使用时，在添加后续试剂之前可不除去在前的试剂。
例如，可向第一细胞类型添加第一试剂以将所述第一细胞类型重编程为中间细胞类型。然后，可除去第一试剂，并添加第二试剂。在另一个实例中，可向第一细胞类型添加第一试剂以将所述第一细胞类型重编程为中间细胞类型。然后，无需除去第一试剂即可添加第二试剂。在又一个实例中，可添加第一试剂以实现第一细胞类型至中间细胞类型的重编程，然后无需预先除去第一试剂即可添加第二试剂和另一试剂。在又一个实例中，可添加第一试剂以实现第一细胞类型至中间细胞类型的重编程，之后无需预先除去第一试剂即可添加第二试剂，接着无需预先除去第一试剂或第二试剂即可添加另一试剂。
本文中公开的方法可在体内、体外或离体进行。
本文中还提供了根据本文中公开的方法获得的重编程的细胞。
本文中还提供了用于将第一细胞类型重编程为第二细胞类型的试剂盒，其包含以下一种或多种组分，任选地包含使用说明书：(i)包含至少一种第一试剂的组合物以实现第一细胞类型至中间细胞类型的重编程；(ii)包含至少一种第二试剂的组合物以实现中间细胞类型至第二细胞类型的重编程。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含(a)选自由如下所组成的组的生长因子：成纤维细胞生长因子2(FGF2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)和角质形成细胞生长因子(KGF)；和/或(b)条件培养基，例如来自于大鼠胰岛素瘤(Rin5f)细胞系的条件培养基；和/或(c)选自补充物(包含BSA、转铁蛋白、胰岛素、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、生物素、L-肉碱、皮质酮、乙醇胺、d(+)-半乳糖、谷胱甘肽(还原的)、亚麻酸、亚油酸、视黄醇乙酸酯、硒、t3(三碘-1-甲状腺原氨酸)、dl-α-生育酚(维生素e)、dl-α-生育酚乙酸酯、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶)和TeSRTM2(包含DMEM/F12(液体)、L-抗坏血酸、硒、转铁蛋白、NaHCO3、谷胱甘肽、L-谷氨酰胺、确定的脂质、硫胺素、β-巯基乙醇、白蛋白、胰岛素、FGF2、TGFβ1、哌可酸、LiCl、GABA)的培养基；以及用于支持被重编程的细胞生长的支架，其中任选地，所述支架包括纳米地形支架，并且其中任选地所述纳米地形支架包含二氧化硅纳米颗粒的均匀阵列。
本文中还提供了用于治疗需要基于细胞的治疗或组织替换的患者的方法，其包括向所述患者施用根据本文中公开的方法获得的重编程的细胞。
本文中还提供了用于治疗需要癌症治疗的患者的方法，其包括使用根据本文中公开的方法获得的重编程的细胞作为载体向所述患者递送生物活性物。
本文中还提供了确定癌症治疗对癌症患者的适用性的方法，其包括根据本文中公开的方法制备重编程的细胞(例如癌症干细胞)并向所述重编程的细胞施用一种或多种癌症治疗以评估所述癌症治疗对所述重编程的细胞的效力。
应理解，重编程的细胞可从供体或者从患者获得。
本文中所举例说明的发明可适当地在不存在本文中未具体公开的任何要素、限制的情况下实施。因此，例如术语“包含/包括”等应理解为开放式的且没有限制。另外，本文中采用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且并非旨在使用排除所示出且描述的特征或其部分的任何等同特征的此类术语和表达，但是应认识到，在本发明所要求保护的范围内可进行多种修改。因此，应理解，尽管已通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可采用本文中公开的其中体现发明的修改方案和变化方案，并且这样的修改方案和变化方案被认为在本发明的范围之内。
已在本文中对本发明进行了广泛且一般性的描述。落入一般性公开内容内的较窄类别和亚属分组各自也形成本发明的一部分。这包括具有从该属中除去任何主题的条件或负面限制的本发明的一般性描述，不管所删除内容是否在本文中具体详述。
其他实施方案在下述权利要求书和非限制性实例内。另外，当按照马库什组对本发明的特征或方面进行描述时，本领域技术人员应认识到由此还可按照马库什组中的任意单个成员或成员亚组来对本发明进行描述。
实验部分
通过参照具体实施例将进一步对本发明的非限制性实例(包括最佳实施方式)和比较例进行更详细的描述，所述实施例不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
材料和方法
细胞培养和重编程为干细胞表型
本研究中使用的细胞是来自于美国模式培养物保藏所(Manassas,VA)的IMR90成纤维细胞、成人皮肤成纤维细胞HDFa(Life Technologies,USA)、毛囊真皮乳头细胞(Promocell,USA)和胶质瘤细胞系U251。将IMR90细胞维持在补充有10％胎牛血清、谷氨酰胺(glutamax)和青霉素-链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基中。将HDFa维持在补充有来自于美国模式培养物保藏所(Manassas,VA)的低血清-成纤维细胞生长试剂盒的成纤维细胞基础培养基中。将毛囊真皮乳头细胞维持在毛囊真皮乳头细胞生长培养基(Promocell,USA)中。将所有的细胞在具有5％二氧化碳的37℃培养箱中进行培养。
使用常规的细胞培养技术来使细胞脱离，并将100μL培养基中的60000个悬浮细胞与2μg以下每种抗体一起在37℃培养箱中孵育30分钟：抗整联蛋白αV[272-17E6](Abcam,USA)、无叠氮化物-抗整联蛋白α5[P1D6](Abcam,USA)、抗整联蛋白β3抗体[25E11]、抗整联蛋白αV/β5(P1F6)L(Santa Cruz Biotechnology,USA)、克隆10D5的抗整联蛋白αVβ6(Merck,USA)。所使用的对照抗体是常规的小鼠IgG1抗体(Santa Cruz Biotechnology,USA)。将细胞悬液的体积调节至250μL以用于后续接种在48孔组织培养板中。在抗体处理后两天，向培养基中添加细胞外基质。U251细胞的重编程遵循经改进的操作，其中使用包含抗整联蛋白αv、αvβ5和αvβ6的3-抗体组合。在抗体处理后两天，将细胞转移至已预先包被到培养孔上的ECM。所使用的细胞外基质是基膜基质：Geltrex(LifeTechnologies,USA)、层粘连蛋白332和层粘连蛋白511(Biolamina,Sweden)。在添加细胞外基质后1天，将培养基更换成以下补充有生长因子的培养基之一：1)SKP培养基，其由补充有1X B27补充物(LifeTechnologies,USA)、40ng/mL bFGF、20ng/mL EGF(Life Technologies,USA)的DMEM/F12(Life Technologies,USA)制成；2)mTESR2(Stemcell Technologies,USA)。
重编程为神经元表型
使用常规的细胞培养技术来使细胞脱离，并将其重悬于Rin5f条件培养基中。将300μL培养基中的约450000个悬浮细胞与30μL以下每种抗体一起在37℃培养箱中孵育5分钟：抗整联蛋白αV、抗整联蛋白α5、抗整联蛋白β5抗体、抗整联蛋白β6。用条件培养基将细胞悬液的体积调节至3mL，并通过向包被有Geltrex的24孔组织培养板的6个孔中分别添加500μL悬液来接种细胞(约75000细胞/孔)。在培养24小时之后，将细胞用胰蛋白酶处理并重铺板在SKP培养基或DMEM中的TCP上。72小时之后，观察到神经元形态的细胞生长在板上的成纤维细胞中。将细胞固定，用抗βIII微管蛋白(Promega)和Hoeschst 33342染色，并在荧光显微镜下进行观察。
具体地，在摇动下将细胞与PBST中的1％BSA一起孵育1小时以封闭非特异性结合。然后，使细胞在PBST中的1％BSA中的一抗(抗βIII微管蛋白，Promega)1:1000中孵育过夜。随后，在PBS中清洗细胞5分钟。重复这一操作两次。然后，使细胞在1μg/mL二抗中在室温下孵育1小时，并在暗处在PBS中清洗细胞三次。最后，用Hoechst 33342(1:5000)染色细胞核。
RNA分离和cDNA合成
使用试剂(Invitrogen,USA)根据生产商的说明针对RNA来裂解细胞。使用iScriptTM cDNA合成试剂盒(Bio-Rad,USA)使经纯化的RNA逆转录成cDNA。该反应在包含4μL 5X iScript反应混合物、1μLiScript逆转录酶、RNA模板(≤1000ng总RNA)和无核酸酶水(变量)的20μL体积中进行。完全反应混合物在25℃下孵育5分钟，42℃下孵育30分钟，85℃下孵育5分钟，然后保持在4℃(任选)。
实时逆转录酶聚合酶链反应分析
使用iTaqTM UniversalGreen超混合物(Bio-Rad,USA)在iQ5多色实时PCR检测系统(Bio-Rad,USA)上进行反应。20μL体积的反应组分包括10μL iTaqTM UniversalGreen超混合物、1μL引物混合物(5μM正向引物、5μM反向引物)、1ng至100ng模板和无核酸酶水(变量)。
反应条件如下：95℃30秒；之后是95℃15秒和60℃30秒，40个循环。解链曲线分析从70℃开始以0.5℃/循环的温度增量进行51个循环，每个循环6秒。经相对于内源对照归一化且相对于校准物的靶mRNA表达的相对定量使用倍数变化的数学表达式2-ΔΔCt(倍数变化)来计算。
引物设计
PCR引物被设计用于人基因表达检测并且特别地不包括人基因组中可见的假基因。引物序列列于表1中。DNA寡核苷酸由新加坡Integrated DNA Technologies(IDT)合成。
表1实时PCR引物序列
GAPDH：甘油醛3-磷酸脱氢酶；ITG：整联蛋白；CDH1：E-钙粘蛋白；DAG1：肌萎缩蛋白相关糖蛋白1；EpCAM：上皮细胞粘附分子；KRT18：角蛋白18；LAMA3：层粘连蛋白α3；LAMB3：层粘连蛋白β3；LAMC2：层粘连蛋白γ2；OCT4A：八聚体结合转录因子4A；NANOG：同源框转录因子Nanog；SOX2：SRY(性别决定区Y)-盒2；NES：巢蛋白；CXCR4：趋化因子(C-X-C基序)受体4；hTERT：人端粒酶逆转录酶；CSPG4：硫酸软骨素蛋白聚糖4；HIF1A：缺氧诱导因子1α亚基；PRRX1：配对相关同源框1；ZEB1：锌指E盒结合同源框1；CDH2：N-钙粘蛋白；VIM：波形蛋白；FN1：纤维粘连蛋白1；TGF-B1：转化生长因子β1；FGF2：成纤维细胞生长因子2(碱性)；MMP9：基质金属肽酶9。
通过慢病毒方法的整联蛋白的强制性表达
从人基因组DNA扩增编码人整联蛋白的DNA，并将其克隆到第三代慢病毒表达质粒(Life Technologies)中。使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)通过慢病毒表达质粒与第三代包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG(Life Technologies)的共转染将慢病毒包装到14cm平板的293FT细胞中。24小时之后更换培养基，并在初始转染后72小时收获上清液，在1000g下短暂地离心5分钟以除去细胞碎片，并在4℃下以32,000rpm超速离心1小时以将病毒浓缩成颗粒状物。将颗粒状物重悬于Optimem(Gibco)中并使用HT1080细胞用感染力测定法来确定滴度。
用编码相应整联蛋白的慢病毒感染以感染复数为5感染IMR90肺成纤维细胞，并用药物稳定地选择(Blasticidin,Zeocin)。用定量PCR来确定转染后IMR90肺成纤维细胞中整联蛋白的过表达。
纳米地形支架
由两种尺寸((66±6)nm和(414±37)nm)的二氧化硅纳米颗粒的均匀阵列构成的纳米地形支架通过将颗粒装配到玻璃盖玻片上，然后烧结而获得。二氧化硅纳米颗粒使用乙醇作为介质在原硅酸四乙酯(TEOS)的典型碱催化水解中制备而成。
为了获得不同最终尺寸的二氧化硅纳米颗粒，改变氨的终浓度。对于414nm颗粒的合成，首先向4ml无水乙醇(Fisher Chemical)中添加1mlTEOS(98％,Aldrich)，并用搅拌棒混合成均相溶液。然后，将该溶液逐滴添加至9ml 25％氨溶液(Merck)和46ml无水乙醇的混合物中。反应液搅拌过夜以进行TEOS的完全碱催化水解。
对于66nm颗粒的合成，首先向4ml无水乙醇中添加1ml TEOS，并用搅拌棒均匀混合。然后，将该溶液逐滴添加至3ml 25％氨溶液(Merck)和52ml无水乙醇的混合物中。将反应液搅拌过夜以进行TEOS的完全碱催化水解。
纳米地形基材通过将上面获得的纳米颗粒悬液热蒸发在玻璃盖玻片上导致其自装配成紧密包装阵列而制备。将该基材烧结以确保颗粒完全附着至玻璃盖玻片。
Western印迹
使用常规的细胞培养技术来使经同种型处理的细胞和经抗体处理的细胞脱离，并用PBS清洗获得的细胞团。将经清洗的细胞团重悬于80μL冰冷的RIPA裂解缓冲液(SantaCruz,USA)中，混合。细胞裂解液在4℃以15000×g离心10分钟至15分钟以使细胞碎片沉淀。然后。收集细胞裂解液(上清液)并放置在冰上。使用Bio-Rad Dc蛋白质定量法(Bio-Rad,USA)根据生产商的说明来确定蛋白质浓度。
细胞裂解液的Western印迹根据标准方案来进行。将等量的蛋白质(20μg)上样到4％至12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen,USA)上，并在200伏特下运行35分钟。然后，将凝胶印迹到硝基纤维素膜上，随后用经修饰的抗体探测目的蛋白。
在摇动下，用0.1％Tween20(Promega,USA)Tris缓冲盐水(1st Base,新加坡)(TBST)中的5％脱脂奶粉(Bio-Rad,USA)在室温下封闭膜20分钟。在温和摇动下，将膜与5％脱脂奶粉TBST中的一抗(1:200稀释度)一起在4℃下孵育过夜，之后用TBST缓冲液清洗膜三次，每次5分钟。接下来，膜与1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合二抗(Santa Cruz,USA)一起在室温下孵育2小时至3小时。用TBST缓冲液清洗印迹3次，每次5分钟。随后，膜与500μLECLTM Prime试剂(GE Healthcare,UK)一起孵育5分钟，之后成像。
实施例1
通过整联蛋白抑制而重编程为干细胞表型
成纤维细胞
通过选择性整联蛋白抑制和连接(selective integrin inhibition andligation，SIIL)将成纤维细胞重编程为干细胞样表型的方法的时间轴示于图1中。
在设计通过控制成纤维细胞与ECM的相互作用来对其进行重编程的方法中，将上皮细胞表型和间充质细胞表型之间发生的转变(EMT/MET)以及ECM在控制这些相互作用中的可能作用考虑在内。上皮细胞形成器官的外覆盖物、腺和导管的内壁，并且由于其屏障作用而展现出紧密连接和顶端-基底侧极性。另一方面，间充质细胞是结缔组织的主要细胞类型、展现出两极形态并且更具活性。假设：在将间充质表型转化为上皮表型的过程(MET)中，可产生具有较高分化潜能的中间亚稳定表型。因此，在用于重编程成纤维细胞(间充质细胞类型)的策略中第一步骤是实现MET。
在该研究中，成纤维细胞的MET通过应用针对参与EMT的反向过程的整联蛋白的抗体来实现。这些一般是与ECM中存在的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)配体(例如纤维粘连蛋白和玻连蛋白)结合的整联蛋白。这些抗体的置换导致指示MET的基因表达变化。当应用最佳抗体组合(抗整联蛋白αv、α5、β5、β6和β3)时，在培养的两天内细胞大部分从基质分离形成球形细胞簇(SCC)并且展现出指示MET的基因表达变化(图2A和2B)。同时，一组多能和干细胞相关标志物也上调(图2C)。这支持以下观点：抑制胎儿肺成纤维细胞中的选定的一组整联蛋白导致产生具有MET和干细胞性特征的中间表型。
有趣的是，还在蛋白质水平观察到整联蛋白的表达变化(图2D)。尽管原始成纤维细胞主要表达充当RGD配体的受体的整联蛋白(αV整联蛋白)，但是在中间表型中表达了其他充当胶原配体和层粘连蛋白配体的受体的整联蛋白(α6、β4和α2)。后者还显示出整联蛋白α3和CXCR4的较高表达，尽管在较低程度上。高分辨率共聚焦显微图像(图3)示出了胎儿肺成纤维细胞被诱导为中间表型之后的染色质结构差异。诱导的IMR90成纤维细胞(中间表型)显示出较大的凝聚异染色质结构域，而对照成纤维细胞显示包含细的异染色质。与对照成纤维细胞的规则卵形形状相比，诱导的成纤维细胞还显示出纵横比较小的较不规则细胞核形状。
在培养两天之后，向SCC培养物添加两种ECM类型-基膜基质：溶液形式的Geltrex和层粘连蛋白332。该步骤的目的是提供选定的配体组以连接由诱导的中间表型表达的整联蛋白(包括新表达的α2和α6整联蛋白)。在过夜培养之后，大多数簇已附着至板上(图4Ai)。在此点，将培养基更换成具有ECM但不包含抗体的新鲜培养基。对一组培养物使用B27培养基和生长因子(FGF2、EGF)，而对第二组使用新鲜的DMEM培养基。
对于在具有生长因子的培养基中培养的细胞，紧凑的细胞致密SCC形态逐渐变成具有逐渐生长的半透明的外环和变得模糊的细胞致密核的细胞簇(图4Aii)。到更换培养基的第4天时，对于大多数簇细胞致密核几乎已消失。收获一些细胞用于基因表达分析(图4C至4E)，而剩余的细胞用于细胞扩增和分化实验。
重编程方法的第一步骤依赖于以下能力：通过选择性的整联蛋白抑制来诱导成纤维细胞的MET，从而产生中间表型(其采用球形细胞簇的形式)并且导致除成纤维细胞中已表达的RGD结合整联蛋白之外还表达了能够连接基膜(层粘连蛋白、胶原)配体的另外的整联蛋白。在诱导之上，细胞显示出细胞-ECM相互作用降低、细胞-细胞相互作用增强并且与基质分离。与原始成纤维细胞相比表达更广泛范围的整联蛋白的中间表型表明它是被“引发”向重编程的表型。
重编程方法的第二步骤提供了第二级的整联蛋白选择，即选择性的整联蛋白连接。不同的ECM类型提供与所选整联蛋白结合的不同类型的配体。例如，据报道层粘连蛋白332与整联蛋白α2和α6结合。商业化基膜基质Geltrex除包含与整联蛋白α2和α6结合的层粘连蛋白之外还包含与其他整联蛋白结合的其他ECM组分，例如胶原和巢蛋白。用层粘连蛋白332和Geltrex进行实验，发现所得的诱导的干细胞表型取决于所使用的具体ECM(图5)。
除将成纤维细胞重编程为干细胞样表型之外，还可使用本发明的方法将成纤维细胞直接重编程为其他体细胞类型，例如神经元。使用类似的抗整联蛋白抗体组合在来自于大鼠胰岛素瘤(Rin5f)细胞系的条件培养基存在下将成纤维细胞诱导成中间表型。(胰腺β细胞分泌生长因子，例如神经生长因子)。在包被有Geltrex的平板上培养经抗体处理的成纤维细胞。培养24小时之后，使用胰蛋白酶来使细胞从平板上脱离，并重新接种在组织培养板上的SKP培养基或DMEM中。在所有情况下，培养72小时之后，大量细胞已采用针对神经元标志物βIII微管蛋白染色呈阳性的神经元表型(图6)。
胶质瘤细胞系
在癌症的情况下，肿瘤细胞至较不分化的更干细胞样的表型的重编程赋予它们获得干细胞特性例如自我更新和分化成实质细胞的能力、可支持癌症转移的特性的机制。
向胶质瘤细胞系U251施用包含整联蛋白αv、αvβ5和αvβ6的3-抗体组合，持续两天。图7示出了经抗体处理的细胞(A)和同种型对照(B)的各自形态以及多种干细胞性标志物(C)和MET标志物(D)针对对应同种型对照归一化的表达变化。免疫印迹显示，干细胞性标志物在蛋白质水平上调(图8)另外，通过抗体处理似乎增强了整联蛋白表达谱(图8)。
两天后，将细胞转移至已预先包被有层粘连蛋白511的培养孔。经重铺板的细胞附着并散布在层粘连蛋白511上，如图9中针对经AB处理的细胞(A)和同种型对照(B)所描绘的。经抗体处理且经重铺板的细胞与对应的同种型对照(C)相比显示出数种干细胞性标志物(CXCR4、ABCG2、Lin28和OLIG2)上调。
实施例2
通过整联蛋白过表达的重编程
作为通过整联蛋白抑制来重编程细胞的可替代方法，还可使合适的整联蛋白过表达以获得中间表型，任选地与纳米地形支架联合。整联蛋白α2、α3、α6、β1和β4的过表达导致上皮标志物和干细胞性标志物二者的表达均提高，并且间充质细胞标志物的表达降低。与包被有geltrex的盖玻片相比，当将细胞在包被有geltrex的纳米地形基材上进行培养时，这一效果更为显著(图10)。
实施例3
通过整联蛋白抑制而重编程为其他细胞类型
使用抗体的整联蛋白抑制还可用来诱导其他细胞类型中的中间表型。这在人皮肤成纤维细胞和真皮乳头细胞的情况下得到证实，其中抗体的施用同样导致MET的诱导(上皮标志物的表达增高且间充质细胞标志物的表达降低)以及干细胞标志物的上调(图11)。
实施例4
在整联蛋白连接期间其他细胞外基质和生长因子的添加
进行另外的实验以研究在整联蛋白连接步骤期间其他细胞外基质(层粘连蛋白511和521)和生长因子(角质形成细胞生长因子，KGF；和肝细胞生长因子，HGF)的用途。结果表明，通过呈现两种层粘连蛋白整联蛋白连接对MET标志物和干细胞性标志物的表达产生有利影响，只要层粘连蛋白呈现足够长的时间即可(图12至图15)。KGF的引入未显示对所分析标志物的水平具有显著影响。然而，HGF的引入降低了MET标志物和干细胞性标志物的表达，这被假定是EMT的结果(图15)。
当向一组软组织肉瘤(TCP-1019TM)施加诱导过程(通过抗体封闭的整联蛋白抑制)时，结果与针对胎儿肺成纤维细胞IMR90细胞系所获得的那些结果相当，即MET标志物和干细胞性标志物的表达增高且整联蛋白β4和β6的基因表达上调(图16)。干细胞性的诱导表明，本发明的方法学可用于由癌细胞系或原发性癌细胞获得癌症干细胞(CSC)。如此诱导的CSC对癌症药物筛选/鉴定是有价值的。
当向人间充质干细胞hMSC(骨髓，DV Biologics)施加相同的通过抗体封闭的整联蛋白抑制过程时，结果与针对IMR90细胞所获得的那些结果相当，即MET标志物和干细胞性标志物的表达增高且整联蛋白β4和β6的基因表达上调(图17)。
168134PCT-CN-ELLA序列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 细胞重编程的方法
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<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 72
ttggaaccac gacgcccttg 20
Claims (46)
1.一种用于将第一细胞类型重编程为第二细胞类型的中间细胞的方法，包括以下步骤：
使所述细胞与第一试剂接触以调节所述第一细胞类型中的整联蛋白谱从而提供所述第二细胞类型的所述中间细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一试剂是提供所述第二细胞类型的所述中间细胞的至少一种整联蛋白配体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一种整联蛋白配体是细胞外基质(ECM)蛋白或抗整联蛋白抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述配体是抗整联蛋白抗体或其片段。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗整联蛋白抗体或其片段是整联蛋白抑制剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述整联蛋白抑制剂抑制一种或多种整联蛋白亚基，所述一种或多种整联蛋白亚基选自由以下所组成的组：α1、α2、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αv、αD、αL、αM、αX、αE、αIIb、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述整联蛋白抑制剂与选自由以下所组成的组的整联蛋白亚基结合：αv、α5、β1、β3、β5、β6及其组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述亚基的组合是αvβ5或αvβ6。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中使所述第一细胞类型与所述至少一种整联蛋白配体接触足以改变基因表达的一段时间。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述一段时间选自由如下所组成的组：至少约1分钟、至少约3分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约30分钟、至少约60分钟、至少约90分钟、至少约2小时、至少约24小时、至少约2天或至少约5天。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一试剂是核酸分子，其中所述细胞与所述核酸分子的接触改变至少一种整联蛋白基因的表达，从而调节所述细胞中的整联蛋白谱。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸分子是包含至少一个与启动子可操作地连接的整联蛋白基因的表达载体以在所述细胞中过表达所述整联蛋白基因。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述表达载体是病毒载体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述中间细胞类型是与所述第一细胞类型相比具有增高的干细胞样特性水平和/或上皮特性水平的细胞。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，还包括以下步骤：检测整联蛋白、多能性标志物和/或干细胞标志物的表达以确定所述第一细胞类型已转变为所述中间细胞类型。
17.根据权利要求16所述的方法，其中相对于所述第一细胞类型，整联蛋白β4和整联蛋白β6的表达增高指示中间细胞。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，还包括使所述中间细胞类型与包含第二试剂的组合物接触以实现所述中间细胞类型至所述第二细胞类型的重编程。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二试剂连接一种或多种整联蛋白亚基，所述一种或多种整联蛋白亚基选自由以下所组成的组：α1、α2、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αv、αD、αL、αM、αX、αE、αIIb、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第二试剂连接选自由以下所组成的组的整联蛋白亚基：α2、α3、α6、αv、α5、β1、β3、β4、β5、β6及其组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述亚基的组合选自αvβ3、αvβ5、αvβ6、α6β1、α6β4、α2β1、α3β1和α5β1。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二试剂包含与所述至少一种整联蛋白结合以引起所述整联蛋白连接的一种或多种配体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述一种或多种配体包含一种或多种细胞外基质组分。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述一种或多种细胞外基质组分来源于基膜。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞外基质组分选自由层粘连蛋白、胶原、巢蛋白和Geltrex所组成的组。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的方法，其中进行所述中间细胞类型与包含所述第二试剂的组合物的接触足以实现重编程为所述第二细胞类型的持续时间。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述接触的持续时间选自至少约12小时、至少约18小时、至少约24小时、至少约30小时、至少约36小时、至少约48小时、至少约2.5天、至少约3天、至少约3.5天、至少约4天、至少约4.5天、至少约5天、至少约5.5天、至少约6天、至少约6.5天或至少约7天。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使已经与用于提供所述第二细胞类型的所述中间细胞的所述第一试剂接触并且已经与用于实现所述中间细胞类型至所述第二细胞类型的重编程的所述第二试剂接触的所述第一细胞类型与能够实现进一步重编程和/或改变所述第一细胞类型的生长特性和/或增殖特性的另一试剂接触。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述另一试剂是：(a)生长因子，所述生长因子选自由如下所组成的组：成纤维细胞生长因子2(FGF2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)和角质形成细胞生长因子(KGF)；和/或(b)条件培养基，例如来自于大鼠胰岛素瘤(Rin5f)细胞系的条件培养基；和/或(c)选自补充物(包含BSA、转铁蛋白、胰岛素、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、生物素、L-肉碱、皮质酮、乙醇胺、d(+)-半乳糖、谷胱甘肽(还原的)、亚麻酸、亚油酸、视黄醇乙酸酯、硒、t3(三碘-1-甲状腺原氨酸)、dl-α-生育酚(维生素e)、dl-α-生育酚乙酸酯、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶)和TeSRTM2(包含DMEM/F12(液体)、L-抗坏血酸、硒、转铁蛋白、NaHCO3、谷胱甘肽、L-谷氨酰胺、确定的脂质、硫胺素、β-巯基乙醇、白蛋白、胰岛素、FGF2、TGFβ1、哌可酸、LiCl、GABA)的培养基。
30.根据权利要求28或29所述的方法，所述方法包括提供所述另一试剂足以实现进一步重编程为所述第二细胞类型和/或改变所述细胞的生长特性和/或增殖特性的持续时间。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述持续时间选自由如下所组成的组：至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天和至少约7天。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括提供细胞支持物以支持被重编程的细胞生长。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞支持物包括纳米地形支架。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述纳米地形支架包含二氧化硅纳米颗粒的均匀阵列。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型选自由间充质细胞、原发性癌细胞和癌细胞系所组成的组。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述间充质细胞是成纤维细胞。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述第二细胞类型选自由以下所组成的组：上皮细胞、具有上皮特性的细胞、神经元细胞、干细胞、具有干细胞样特性的细胞和癌症干细胞。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述方法在体内进行。
39.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
40.一种重编程的细胞，所述重编程的细胞根据权利要求1至39中任一项所述的方法获得。
41.一种用于将第一细胞类型重编程为第二细胞类型的试剂盒，包括以下一种或多种组分，任选地包含使用说明书：
(i)以实现第一细胞类型至中间细胞类型的重编程的包含至少一种第一试剂的组合物；
(ii)以实现中间细胞类型至第二细胞类型的重编程的包含至少一种第二试剂的组合物。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，还包含：(a)生长因子，所述生长因子选自由如下所组成的组：成纤维细胞生长因子2(FGF2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)和角质形成细胞生长因子(KGF)；和/或(b)条件培养基，例如来自大鼠胰岛素瘤(Rin5f)细胞系的条件培养基；和/或(c)选自补充物(包含BSA、转铁蛋白、胰岛素、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、生物素、L-肉碱、皮质酮、乙醇胺、d(+)-半乳糖、谷胱甘肽(还原的)、亚麻酸、亚油酸、视黄醇乙酸酯、硒、t3(三碘-1-甲状腺原氨酸)、dl-α-生育酚(维生素e)、dl-α-生育酚乙酸酯、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶)和TeSRTM2(包含DMEM/F12(液体)、L-抗坏血酸、硒、转铁蛋白、NaHCO3、谷胱甘肽、L-谷氨酰胺、确定的脂质、硫胺素、β-巯基乙醇、白蛋白、胰岛素、FGF2、TGFβ1、哌可酸、LiCl、GABA)的培养基；以及
用于支持被编程的细胞生长的支架，其中任选地，所述支架包括纳米地形支架，并且其中任选地所述纳米地形支架包含二氧化硅纳米颗粒的均匀阵列。
43.一种用于治疗需要基于细胞的治疗或组织替换的患者的方法，包括向所述患者施用根据权利要求1至39中任一项所述的方法获得的重编程的细胞。
44.一种用于治疗需要癌症治疗的患者的方法，包括使用根据权利要求1至39中任一项所述的方法获得的重编程的细胞作为载体向所述患者递送生物活性物。
45.一种确定癌症治疗对癌症患者的适用性的方法，包括根据权利要求1至39中任一项所述的方法制备重编程的细胞，并向所述重编程的细胞施用一种或多种癌症治疗以评估所述癌症治疗对所述重编程的细胞的效力。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述重编程的细胞是来源于所述患者的细胞。
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