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CN107072199A - 通过研磨农药和疏水蛋白的预混物而制备具有降低毒性的农化组合物的方法 - Google Patents

通过研磨农药和疏水蛋白的预混物而制备具有降低毒性的农化组合物的方法 Download PDF

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CN107072199A
CN107072199A CN201580059639.XA CN201580059639A CN107072199A CN 107072199 A CN107072199 A CN 107072199A CN 201580059639 A CN201580059639 A CN 201580059639A CN 107072199 A CN107072199 A CN 107072199A
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S·库恩
T·欧蒂灵格
E·威特默
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BASF SE
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Abstract

本发明涉及一种制备农化组合物的方法，该方法包括通过使固体水不溶性农药与疏水蛋白接触而制备预混物以及通过研磨预混物而制备粗悬浮液的步骤；一种可通过所述方法获得的农化组合物；疏水蛋白在降低固体水不溶性农药的毒性中的用途和施用方法；一种防治植物病原真菌和/或不希望的植物生长和/或不希望的昆虫或螨虫侵袭和/或调节植物生长的方法；以及包含所述悬浮液的种子。

Description

通过研磨农药和疏水蛋白的预混物而制备具有降低毒性的农 化组合物的方法
本发明涉及一种制备农化组合物的方法，其包括以下步骤：通过使固体水不溶性农药和疏水蛋白接触而制备预混物，以及通过研磨预混物而制备粗悬浮液。此外，本发明涉及一种包含固体水不溶性农药和疏水蛋白的农化组合物，其中组合物可通过所述方法获得。此外，本发明涉及疏水蛋白在降低固体水不溶性农药的毒性中的用途。另外的主题是防治植物病原真菌和/或不希望的植物生长和/或不希望的昆虫或螨虫侵袭和/或调节植物生长的方法，其中使组合物作用于相应有害物、其环境或待保护以防相应有害物的作物植物，作用于土壤和/或作用于不希望的植物和/或作用于作物植物和/或作用于其环境；一种降低固体水不溶性农药的毒性的方法，其包括使水不溶性农药与疏水蛋白接触的步骤；以及包含所述悬浮液的种子。
例如为了处理农化组合物的农民，开发了各种方法以降低农药的毒性。建议减少暴露时间，使用安全手套或安全眼镜。可使配制剂中的农药浓度降低，或可使农药包封在聚(甲基)丙烯酸酯或聚脲胶囊中。
本发明的目的是找到降低农化组合物中的农药的毒性的方法。
该目的通过一种制备农化组合物的方法而实现，所述方法包括以下步骤：
a)通过使固体水不溶性农药和疏水蛋白接触而制备预混物，和
b)通过研磨预混物而制备粗悬浮液。
本申请在其范围内还包括实施方案的组合，优选实施方案的组合，以及优选形式的组合，各自与优选程度无关。
在步骤a)中，接触可以通过混合(例如通过搅拌、振荡、倾入)农药、疏水蛋白以及任选地水和分散剂而进行。步骤a)中的组分可以以任何顺序混合。通常，疏水蛋白最后且正好在农药后加入。步骤a)中的接触可在-20至100℃，优选5-80℃，特别是10-50℃的温度下进行。
优选地，步骤a)包括通过使农药、疏水蛋白和水接触而制备预混物。
在另一优选形式中，步骤a)包括通过使农药、疏水蛋白和分散剂接触而制备预混物。
更优选步骤a)包括通过使农药、疏水蛋白、水和分散剂接触而制备预混物。
预混物或粗悬浮液可包含至少100g/l，优选至少200g/l，更优选至少300g/l的农药。预混物可以包含至多999g/l，优选至多950g/l，特别是至多900g/l的农药。
预混物或粗悬浮液可以包含至少0.1g/l，优选至少0.5g/l的疏水蛋白。预混物可以包含至多50g/l，优选至多20g/l，特别是至多10g/l的疏水蛋白。
预混物或粗悬浮液可以包含至少10重量％，优选至少20重量％，特别是至少30重量％的水。预混物可以包含至多90重量％，优选至多70重量％，特别是至多60重量％的水。
预混物或粗悬浮液可以包含至少1g/l，优选至少5g/l，特别是至少10g/l的分散剂。预混物可以包含至多250g/l，优选至多100g/l，特别是至多50g/l的分散剂。
在一个优选实施方案中，预混物包含至少100g/l的至少一种农药，至少1g/l的疏水蛋白，至少20％的水和至少5g/l的分散剂。
在一个更优选的实施方案中，预混物包含至少300g/l的至少一种农药，至少1g/l的疏水蛋白，至少20％的水和至少5g/l的分散剂。
同样在一个优选实施方案中，预混物包含至多900g/l的至少一种农药，至多20g/l的疏水蛋白，至多90重量％的水和至多100g/l的分散剂。
同样在一个更优选的实施方案中，预混物包含至多900g/l的至少一种农药，至多20g/l的疏水蛋白，至多90重量％的水和至多50g/l的分散剂。
在步骤b)中，可以在典型的研磨装置中进行研磨，例如球磨机、珠磨机、棒磨机、半自动磨机和自动磨机、卵石球磨机、研磨辊磨机、石磨、塔式粉碎机、锤磨机、行星式磨机、立轴冲击磨、胶体磨、锥形磨、盘磨机、轮碾机、喷磨机、粒磨机、搅拌磨机、三辊磨机、振动磨机、Wiley磨机或本领域技术人员已知的类似碾磨和研磨装置。
农药可以以颗粒形式存在于预混物中。预混物中农药的粒度可以大于100μm，优选大于50μm，最优选为50-100μm。
农药可以以颗粒形式存在于粗悬浮液中。粗悬浮液中农药的粒度可以小于100μm，优选小于50μm，更优选小于10μm，尤其优选小于5μm。特别地，农药的粒度小于3μm。在此，农药颗粒通常具有粒度分布，并且以上给出的值是指随机d50值，其为本技术人员已知的典型表征单位。
粒径分布可以通过包含颗粒的含水悬浮液的激光衍射测定。在该测量方法中，样品制备，例如稀释到测量浓度将尤其取决于悬浮液样品中的活性物质的细度和浓度以及所用装置(例如Malvern Mastersizer)上。程序应为所述体系开发，并且对本领域技术人员是已知的。
术语农药是指至少一种选自杀真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、除草剂、安全剂、生物农药和/或生长调节剂的活性物质。优选的农药为杀真菌剂、杀虫剂、除草剂和生长调节剂。尤其优选农药为杀虫剂。也可使用两种或更多种上述类别的农药的混合物。该类农药是本领域技术人员所熟知的，它们例如可参见Pesticide Manual，第16版(2013)，The BritishCrop Protection Council，London。合适的杀虫剂为选自如下类别的杀虫剂：氨基甲酸酯类、有机磷酸酯类、有机氯杀虫剂、苯基吡唑类、拟除虫菊酯类、新烟碱类、斯皮诺素类(spinosins)、阿维菌素类(avermectins)、米尔霉素类(milbemycins)、保幼激素类似物、烷基卤、有机锡化合物、沙蚕毒素类似物、苯甲酰脲类、二酰基肼类、METI杀螨剂以及诸如如下的杀虫剂：氯化苦(chloropicrin)、拒嗪酮(pymetrozin)、氟啶虫酰胺(flonicamid)、四螨嗪(clofentezin)、噻螨酮(hexythiazox)、特苯唑(etoxazole)、杀螨硫隆(diafenthiuron)、克螨特(propargite)、三氯杀螨砜(tetradifon)、氟唑虫清(chlorfenapyr)、二硝酚(DNOC)、噻嗪酮(buprofezine)、灭蝇胺(cyromazine)、双甲脒(amitraz)、灭蚁腙(hydramethylnon)、灭螨醌(acequinocyl)、嘧螨酯(fluacrypyrim)、鱼藤酮(rotenone)或其衍生物。合适的杀真菌剂为如下类别的杀真菌剂：二硝基苯胺类、烯丙基胺类、苯胺基嘧啶类、抗生素、芳族烃、苯磺酰胺类、苯并咪唑类、苯并异噻唑类、二苯甲酮类、苯并噻二唑类、苯并三嗪类、苄基氨基甲酸酯类、氨基甲酸酯类、羧酰胺类、羧酸二酰胺类、氯代腈类、氰基乙酰胺肟类、氰基咪唑类、环丙烷羧酰胺类、二羧酰亚胺类、二氢二嗪类、二硝基苯基巴豆酸酯类、二硫代氨基甲酸酯类、二硫戊环类、乙基膦酸酯类、乙基氨基噻唑羧酰胺类、胍类、羟基-(2-氨基)嘧啶类、羟基酰替苯胺类、咪唑类、咪唑啉酮类、无机物质、异苯并呋喃酮类、甲氧基丙烯酸酯类、甲氧基氨基甲酸酯类、吗啉类、N-苯基氨基甲酸酯类、唑烷二酮类、肟基乙酸酯类、肟基乙酰胺类、肽基嘧啶核苷、苯基乙酰胺类、苯基酰胺类、苯基吡咯类、苯基脲类、膦酸酯类、硫代磷酸酯类、邻氨甲酰苯甲酸类、苯邻二甲酰亚胺类、哌嗪类、哌啶类、丙酰胺类、哒嗪酮类、吡啶类、吡啶基甲基苯甲酰胺类、嘧啶胺类、嘧啶类、嘧啶酮腙类、吡咯并喹啉酮类、喹唑啉酮类、喹啉类、醌类、磺酰胺类、氨磺酰三唑类、噻唑羧酰胺类、硫代氨基甲酸酯类、托布津类(thiophanates)、噻吩羧酰胺类、甲苯甲酰胺类、三苯基锡化合物、三嗪类、三唑类。合适的除草剂为如下类别的除草剂：乙酰胺类、酰胺类、芳氧基苯氧基丙酸酯类、苯甲酰胺类、苯并呋喃、苯甲酸类、苯并噻二嗪酮类、联吡啶、氨基甲酸酯类、氯代乙酰胺类、氯代羧酸类、环己烷二酮类、二硝基苯胺类、二硝基苯酚类、二苯基醚类、甘氨酸类、咪唑啉酮类、异唑类、异唑烷二酮类、腈类、N-苯基苯邻二甲酰亚胺类、二唑类、唑烷二酮类、氧乙酰胺类、苯氧基羧酸类、苯基氨基甲酸酯类、苯基吡唑类、苯基吡唑啉类、苯基哒嗪类、次膦酸类、氨基磷酸酯类、二硫代磷酸酯类、邻氨甲酰苯甲酸酯类、吡唑类、哒嗪酮类、吡啶类、吡啶羧酸类、吡啶羧酰胺类、嘧啶二酮类、嘧啶基(硫代)苯甲酸酯类、喹啉羧酸类、缩氨基脲类、磺酰氨基羰基三唑啉酮类、磺酰脲类、四唑啉酮类、噻二唑类、硫代氨基甲酸酯类、三嗪类、三嗪酮类、三唑类、三唑啉酮类、三唑羧酰胺类、三唑并嘧啶类、三酮类、尿嘧啶类、脲类。
优选地，农药选自杀真菌剂，更优选选自带有卤素原子的杀真菌剂。尤其优选地，农药选自百菌清(chlorothalonil)和氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)。在一个实施方案中，农药是百菌清。在另一实施方案中，农药是氟唑菌酰胺。
农药可以包含至少一种水不溶性农药。在20℃下，水不溶性农药在水中可具有至多10 g/l，优选至多1 g/l，特别是至多0.5 g/l的溶解度。
农药如水不溶性农药通常具有30℃以上，优选50℃以上，特别是70℃以上的熔点。
合适的农药通常是多卤化农药。
农药通常带有至少2个共价连接的卤素原子，优选氯或氟，更优选氯。
优选地，农药带有至少3个共价连接的卤素原子，优选氯或氟，更优选氯。
更优选地，农药带有至少4个共价连接的卤素原子，优选氯或氟，更优选氯。
本发明的疏水蛋白可以由通式(I)描述：
Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I)其中X表示任意20种天然存在的氨基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)，并且其中所指定的指数表示氨基酸数。在此，指数n和m表示0-500，优选15-300的数，C表示半胱氨酸，并且至少一个多肽序列Xm或Xn表示具有至少20个氨基酸的肽序列，其并非天然连接到疏水蛋白。在此，疏水蛋白导致涂覆玻璃表面后接触角偏移至少20°。
本发明的半胱氨酸C1-C8可以以还原或氧化形式存在或者形成二硫键。尤其优选的是分子内形成二硫键，特别是那些具有1个，优选2个，更优选3个，尤其优选4个选自以下组的分子内二硫键的那些：C1与C2；C3与C4；C5与C6；C7与C8。
在Cys用于位置X的情况下，通式中不同半胱氨酸位置的所指定数相应地变化。
优选的多肽是通式(II)的那些，
Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (II)其中X表示任意20种天然存在的氨基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)，并且其中所指定的指数表示氨基酸数。在此，指数n和m表示2-300的数，C表示半胱氨酸，并且多肽序列Xm或Xn中的至少一个表示具有至少35个氨基酸的肽序列，其并非天然连接到疏水蛋白。在此，疏水蛋白导致涂覆玻璃表面后接触角偏移至少20°。
尤其优选的多肽是通式(III)的那些，
Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm (III)
其中X表示任意20种天然存在的氨基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)，并且其中所指定的指数表示氨基酸数。在此，指数n和m表示0-200的数，C表示半胱氨酸，并且多肽序列Xm或Xn中的至少一个表示具有至少40个氨基酸的肽序列，其并非天然连接到疏水蛋白。在此，疏水蛋白导致涂覆玻璃表面后接触角偏移至少20°。
特别优选式(I)、(II)或(III)的多肽，其中各式包含至少一种选自dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basf1、basf2及其部分和衍生物；优选dewA、rodA、basf1、basf2及其衍生物；最优选选自dewA、rodA及其衍生物的疏水蛋白。在一个实施方案中，疏水蛋白是dewA或其衍生物。在另一实施方案中，疏水蛋白是rodA或其衍生物。在另一实施方案中，疏水蛋白是hypA或其衍生物。在另一实施方案中，疏水蛋白是hypB或其衍生物。在另一实施方案中，疏水蛋白是sc3或其衍生物。在另一实施方案中，疏水蛋白是basf1或其衍生物。在另一实施方案中，疏水蛋白是basf2或其衍生物。所述疏水蛋白的序列公开在WO 2006/082251，SEQID NO 1-14中。
本发明的蛋白质至少在一个位置Xn或Xm处带有至少20个，优选35个，尤其优选50个，特别是100个氨基酸(以下称为融合配对)的聚合物序列，其并非天然连接到疏水蛋白。因此，应指出蛋白质由疏水蛋白部分和融合配对组成，并且因此不是天然存在的。
融合配对结构部分可以选自多种蛋白质。还可以将几种融合配对连接到疏水蛋白，例如在疏水蛋白结构部分的氨基末端(Xn)和羧基末端(Xm)处。两种融合配对也可连接到本发明的蛋白质的一个位置(Xn或Xm)。
优选的融合配对是多肽，其天然存在于微生物中，特别是在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中。该融合配对的实例是序列yaad、yaae和硫氧还蛋白，它们在WO 2006/082251，SEQID NO 15-18中公开。在一个实施方案中，融合配对是yaad。在另一实施方案中，融合配对是yaae。在另一实施方案中，融合配对是硫氧还蛋白。
合适的融合配对也是所述序列的片段或衍生物，其仅包含这些序列的一部分，优选70-99％，更优选80-98％，或者其中单个氨基酸或核苷酸被改变的序列。实例将是在序列yaad和yaae的C末端处的其他氨基酸，特别是两个氨基酸，优选氨基酸Arg和Ser。此外，可以将其他氨基酸插入yaae的序列，例如根据WO 2006/131564，SEQ ID NO 17-18的氨基酸No2(Gly)。
疏水蛋白的制备可以通过肽合成的化学方法，例如通过本领域技术人员已知的固相合成而实现。
然而，尤其优选涉及基因修饰生物或细胞系作为生产体系的方法，其中将融合配对和疏水蛋白部分编码的基因序列在表达构建体中组合。然后在将表达构建体转移进入所述生产体系中作为组合的基因序列的基因表达产物后，在生产体系中产生所需的蛋白质。
合适的基因表达构建体在文献(例如WO 2006/082251)中是已知的，并且是本领域技术人员容易设计的。相应的多肽构建体可以作为基因构建体的结果在两个末端带有另外的氨基酸，以及融合蛋白和疏水蛋白之间的另外的氨基酸。
疏水蛋白分子的可能修饰可涉及糖基化、乙酰化或化学交联(例如用戊二醛)。
本发明的疏水蛋白的一个特征是表面特征的改变，如果这些表面用蛋白质涂覆的话。这个变化可以在实验上通过测量表面用蛋白质涂覆前后的水滴的接触角以及计算两个值之间的差异而测定。
通过以下程序描述用于测量接触角的实验条件：
疏水蛋白或疏水蛋白融合蛋白的涂覆性能优选在玻璃或特氟隆(作为用于疏水和亲水表面的模型)上而测量。
如果它们在玻璃上进行，则将玻璃片在80℃下在1-100μg/ml疏水蛋白的50mM乙酸钠pH4和0.1％Tween 20的溶液中温育过夜，然后用H2Odd冲洗，在80℃下在1％SDS中温育10分钟，并用H2Odd洗涤。
如果使它们在特氟隆上进行，则将特氟隆片在80℃下在1-100μg/ml疏水蛋白的10mM Tris pH8的溶液中培养过夜，然后用H2Odd冲洗，在80℃下在1％SDS中培养10分钟，并用H2Odd洗涤。
然后将样品风干，并在Dataphysics Contact Angle System OCA 15+,SoftwareSCA 20.2.0(2002年11月)上测量5μl水滴的接触角。根据制造商的说明进行测量。
在这些条件下，本发明的蛋白质将接触角增加至少20°，优选25°，尤其是30°。
合适的生产体系可以是原核生物(包括古细菌)或真核生物，优选包括嗜盐杆菌(halobacteria)和甲烷球菌(methanococcae)的细菌、真菌、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、尤其优选大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、米曲霉(Aspergillus oryzea)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、假单胞菌属(Pseudomonas spec.)、乳杆菌属(Lactobacillus)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或SF9细胞(以及相似的细胞系)。
优选的生产体系是基因修饰生物或细胞系，优选大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和SF9细胞，尤其优选大肠杆菌。
取决于根据本发明使用的生产体系，它们以本领域技术人员已知的方式生长或培养。微生物通常在包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有机氮源的形式如酵母提取物或盐如硫酸铵、痕量元素如铁-、锰-、镁盐)和任选的维生素的液体介质中生长。它们通常在0-100℃，优选10-60℃的温度下在补充氧气进气下生长。在此，营养液的pH可以保持在不同的值，即可以在发酵过程中调节或不调节。发酵可以作为间歇方法，作为半间歇方法或连续进行。营养物质可在发酵开始时提供；它可以半连续或连续加入。根据本发明，蛋白质可以与生物体分离或用作用于所述目的的粗提取物。
疏水蛋白的产生可以通过培养产生多肽的微生物，任选地诱导多肽的表达并由液体培养物分离而蛋白质实现。
可以培养和发酵基因修饰生物体或细胞系。细菌可以例如在TB-或LB-介质中或在20-40℃的温度和6-9的pH下生长。合适的培养条件可以在T.Maniatis，EF Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中找到。
如果多肽不分泌至介质中，则细胞被破坏，并且产物通过本领域技术人员已知的方法从溶菌产物中分离。细胞可能被高频超声，被高压(例如在French-Press中)，通过Osmolysis，通过使用洗涤剂、裂解酶或有机溶剂，通过均化或通过上述所列方法的组合而破坏。因此，蛋白质是以天然形式还是作为包涵体产生无关紧要。目标蛋白质连同其他可溶性蛋白质一起从细胞中释放出来。
多肽的纯化可以通过本领域技术人员已知的方法而实现。在第一步中，产物可以例如通过在离心机中沉降，通过过滤或通过分级沉降而由细胞碎片分离。如果目标蛋白质作为包涵体产生，则这尤其适用。在这种情况下，它们可以通过选择性地在分离器或喷嘴分离器中离心分离而由细胞碎片分离。蛋白质复性后(例如通过WO 2008/019964中描述的方法)，蛋白质的纯化可以通过已知的色谱方法如通过凝胶过滤、离子交换色谱和疏水相互作用色谱以及采用所有其他常用方法如超滤、结晶、盐析、透析或天然凝胶电泳而实现。合适的方法描述于Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden，Verlag Water de Gruyter，Berlin，New York或Scopes R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin中。
此后，蛋白质的配制剂可以通过干燥蛋白质溶液，例如通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾造粒或水分蒸发以及使用蛋白质作为粉末或颗粒而制备。
作为实例，如WO 2008/019964所述，可以实现喷雾干燥和喷雾造粒。
将载体体系或寡核苷酸用于分离重组蛋白可能是有利的，其延伸了用于融合蛋白的改变多肽编码的特定核苷酸序列的cDNA，这有助于分离。适当的修饰是例如可被抗体识别为抗原的所谓的标记物如六组氨酸标记(His6)或表位(描述于Harlow E.和Lane D.，1988，Antibodies：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中)。
其他合适的标记物是例如HA标记物、钙调蛋白-BD、GST、MBD、甲壳素-GD、链霉亲和素-BD-Avi标记物、Flag标记物、T7等。这些标记物可用于将蛋白质锚定到固体表面，例如可以插入色谱柱中的聚合物基质或微量滴定板或任何其他表面。相应的纯化方案可由商业亲和标记物供应商获得。
在一个实施方案中，标记物是His6标记物。在另一实施方案中，标记物是HA标记物。在另一实施方案中，标记物是钙调蛋白BD标记物。在另一实施方案中，标记物是GST标记物。在另一实施方案中，标记物是MBD标记物。在另一实施方案中，标记物是甲壳素-BD标记物。在另一实施方案中，标记物是链霉亲和素-BD-Avi标记物。在另一实施方案中，标记物是Flag标记物。
本发明的疏水蛋白蛋白质具有其作为融合蛋白的形式和其分离形式的疏水蛋白所希望的特征。因此，它们可以直接或在融合配对作为“纯”疏水蛋白断裂和分离之后应用。
如果意欲分离融合配对，则将合适的断裂位点(蛋白酶的特异性识别位点)引入到疏水蛋白蛋白质和融合配对之间的融合蛋白中。合适的断裂位点优选是在由生物信息学工具可以容易地确定的疏水蛋白结构部分和融合蛋白部分都不出现的那些。尤其合适的是例如在蛋氨酸上的BrCN断裂，或借助因子Xa-、肠激酶、凝血酶、TEV断裂(烟草蚀纹病毒蛋白酶)的蛋白酶介导的断裂。
本发明还涉及包含固体水不溶性农药和疏水蛋白的农化组合物，其中组合物可通过本发明的方法获得(优选通过本发明的方法获得)。在一种形式中，包含农药和疏水蛋白的农化组合物可通过包括以下步骤的方法获得：a)通过使农药与疏水蛋白接触而制备预混物，和b)通过研磨预混物而制备粗悬浮液。
农化组合物可以以各种配制剂类型，例如悬浮液(如SC、OD、FS、ZC)、可湿性粉末或粉剂(如WP、SP、WS、DP、DS)、颗粒(如WG、SG、GR、FG、GG、MG)存在。这些和其他组合物类型在“Catalogue of pesticide formulation types and international coding system”，Technical Monograph No.2，第6版，2008年5月，CropLife International，CropLifeInternational中定义。
在一种形式中，农化组合物是含水悬浮液。悬浮液包含农药颗粒形式的农药，其通常悬浮在连续水相中。农药颗粒可以以20℃下是固体的结晶或无定形颗粒的形式存在。
悬浮液浓缩物形式的农化组合物可包含0.1-50g/l的疏水蛋白，优选0.1-10g/l，更优选0.5-10g/l的疏水蛋白，特别是1-10g/l的疏水蛋白。
在本发明的一种形式中，悬浮液形式的农化组合物可以包含至少100g/l的农药，0.1-10g/l的疏水蛋白，和至少1g/l的分散剂。
优选地，悬浮液浓缩物形式的农化组合物可以包含至少100g/l的农药，0.5-10g/l的疏水蛋白和至少5g/l的分散剂。
更优选地，悬浮液浓缩物形式的农化组合物可以包含至少200g/l的农药，0.5-5g/l的疏水蛋白，和至少10g/l的分散剂。
悬浮液浓缩物形式的农化组合物可以包含至多900g/l的农药，至多10g/l的疏水蛋白，和至多100g/l的分散剂。
优选地，悬浮液浓缩物形式的农化组合物可以包含至多900g/l的农药，至多10g/l的疏水蛋白，和至多50g/l的分散剂。
除了农药颗粒形式的农药之外，悬浮液还可以包含另外的农药，其中另外的农药溶解在悬浮液的水相中。
农化组合物优选为含水悬浮液，这意指悬浮液包含水。基于悬浮液的总重量，悬浮液可包含至少15重量％，优选至少30重量％，尤其优选至少40重量％的水。基于悬浮液的总重量，悬浮液可以包含20-85重量％，优选30-75重量％，特别优选35-70重量％的水。
在另一形式中，农化组合物是固体配制剂类型，例如可湿性粉末或粉剂(如WP、SP、WS、DP、DS)或颗粒(如WG、SG、GR、FG、GG、MG)。固体配制剂类型可以通过本发明方法而制备，该方法除了步骤a)和b)之外还包括步骤c)干燥粗悬浮液。该干燥可以通过常规方法，例如通过施加高温和/或真空而蒸发任何液体如水来实现。
在另一形式中，农化组合物是选自水分散性颗粒或水溶性颗粒的固体配制剂类型，其可以包含50-80重量％的农药和至多100重量％的分散剂和润湿剂(例如木质素磺酸钠和醇乙氧基化物)。
在另一形式中，农化组合物是选自水分散性粉末和水溶性粉末的固体配制剂类型，其可以包含50-80重量％的农药，1-5重量％的分散剂(例如木质素磺酸钠)，1-3重量％的润湿剂(例如醇乙氧基化物)和至多100重量％的固体载体如硅胶。
农化组合物可包含用于农化配制剂的辅助剂。合适辅助剂的实例为固体载体或填料，表面活性剂，分散剂，乳化剂，润湿剂，助剂，加溶剂，渗透促进剂，保护性胶体，粘附剂，增稠剂，保湿剂，驱除剂，引诱剂，进食刺激剂，相容剂，杀菌剂，防冻剂，消泡剂，着色剂，增粘剂和粘合剂。
合适的固体载体或填料为矿土，例如硅酸盐、硅胶、滑石、高岭土、石灰石、石灰、白垩、粘土、白云石、硅藻土、膨润土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁；多糖粉末，例如纤维素、淀粉；肥料，例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、脲类；植物来源的产品，例如谷粉、树皮粉、木粉、坚果壳粉，及其混合物。
合适的分散剂为表面活性化合物，如阴离子、阳离子、非离子和两性表面活性剂，嵌段聚合物，聚电解质，及其混合物。该类表面活性剂可用作乳化剂、加溶剂、润湿剂、渗透促进剂、保护性胶体或助剂。表面活性剂的实例列于McCutcheon’s，第1卷：Emulsifiers&Detergents，McCutcheon’s Directories，Glen Rock，USA，2008(国际版或北美版)中。
合适的阴离子表面活性剂为磺酸、硫酸、磷酸、羧酸的碱金属、碱土金属或铵盐及其混合物。磺酸盐的实例为烷基芳基磺酸盐、二苯基磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、木素磺酸盐、脂肪酸和油的磺酸盐、乙氧基化烷基酚的磺酸盐、烷氧基化芳基酚的磺酸盐、缩合萘的磺酸盐、十二烷基-和十三烷基苯的磺酸盐、萘和烷基萘的磺酸盐、磺基琥珀酸盐或磺基琥珀酰胺酸盐。硫酸盐的实例为脂肪酸和油的硫酸盐、乙氧基化烷基酚的硫酸盐、醇的硫酸酯盐、乙氧基化醇的硫酸酯盐或脂肪酸酯的硫酸盐。磷酸盐的实例是磷酸酯盐。羧酸盐的实例是烷基羧酸盐以及羧化醇或烷基酚乙氧基化物。
悬浮液优选包含阴离子表面活性剂。优选的阴离子表面活性剂为磺酸盐，其中更优选缩合萘的磺酸盐。悬浮液可包含0.1-12重量％，优选0.5-7重量％，尤其是1-4重量％的阴离子表面活性剂(例如磺酸盐)。
合适的非离子表面活性剂为烷氧基化物，N-取代的脂肪酸酰胺，胺氧化物，酯，糖基表面活性剂，聚合物表面活性剂及其混合物。烷氧基化物的实例为诸如已经被1-50当量烷氧基化的醇、烷基酚、胺、酰胺、芳基酚、脂肪酸或脂肪酸酯的化合物。可将氧化乙烯和/或氧化丙烯用于烷氧基化，优选氧化乙烯。N-取代的脂肪酸酰胺的实例是脂肪酸葡糖酰胺或脂肪酸链烷醇酰胺。酯的实例为脂肪酸酯，甘油酯或甘油单酯。糖基表面活性剂的实例为脱水山梨醇、乙氧基化脱水山梨醇、蔗糖和葡萄糖酯或烷基聚葡糖苷。聚合物表面活性剂的实例为乙烯基吡咯烷酮、乙烯醇或乙酸乙烯酯的均聚物或共聚物。
合适的阳离子表面活性剂为季型表面活性剂，例如具有1或2个疏水性基团的季铵化合物，或长链伯胺的盐。合适的两性表面活性剂为烷基甜菜碱和咪唑啉类。合适的嵌段聚合物为包含聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段的A-B或A-B-A型嵌段聚合物，或包含链烷醇、聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的A-B-C型嵌段聚合物。
合适的助剂是它们自身具有可忽略的或甚至没有农药活性，并且改进了化合物I在目标上的生物学性能的化合物。实例是表面活性剂、矿物油或植物油以及其他辅助剂。另外的实例列于Knowles，Adjuvants and additives，Agrow Reports DS256，T&F InformaUK，2006，第5章。
合适的增稠剂为多糖(例如黄原胶、羧甲基纤维素)、无机粘土(有机改性或未改性的)、聚羧酸盐和硅酸盐。
合适的杀菌剂为拌棉醇(bronopol)和异噻唑啉酮衍生物如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮。
合适的防冻剂为乙二醇、丙二醇、尿素和甘油。
合适的消泡剂为聚硅氧烷、长链醇和脂肪酸盐。
合适的着色剂(例如着红色、蓝色或绿色)为低水溶性颜料和水溶性染料。实例为无机着色剂(例如氧化铁、氧化钛、六氰合铁酸铁)和有机着色剂(例如茜素着色剂、偶氮着色剂和酞菁着色剂)。
合适的增粘剂或粘合剂为聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、生物蜡或合成蜡以及纤维素醚。
该农化组合物可用于处理植物繁殖材料，尤其是种子。所述组合物在稀释2-10倍后在即用制剂中给出0.01-60重量％，优选0.1-40重量％的活性物质浓度。施用可在播种之前或期间进行。农化组合物在植物繁殖材料，尤其是种子上的施用或处理方法包括繁殖材料的拌种、包衣、造粒、撒粉、浸泡和犁沟内施用方法。优选通过不诱发萌发的方法，例如通过拌种、造粒、包衣和撒粉将农化组合物施用于植物繁殖材料上。
当用于植物保护中时，活性物质的施用量取决于所需的效果类型为0.001-2kg/ha，优选为0.005-2kg/ha，更优选为0.05-0.9kg/ha，特别为0.1-0.75kg/ha。在植物繁殖材料如种子例如通过撒粉、包衣或浸透种子的处理中，通常要求活性物质的量为0.1-1000g/100kg，优选为1-1000g/100kg，更优选为1-100g/100kg，最优选为5-100g/100kg植物繁殖材料(优选种子)。当用于保护材料或储存产品中时，活性物质的施用量取决于施用区域的类型和所需的效果。在材料保护中常用的施用量为0.001g-2kg，优选为0.005g-1kg活性物质/立方米被处理材料。
可向悬浮液中作为预混物加入或者合适的话在紧临使用前加入(桶混合)各种类型的油、润湿剂、助剂、肥料或微量营养素和其他农药(例如除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、生长调节剂、安全剂)。这些试剂可以以1:100-100:1，优选1:10-10:1的重量比与本发明的悬浮液混合。
用户通常从预剂量装置、背包式喷雾器、喷雾罐、喷雾飞机或灌溉系统施用农化组合物或由农化组合物制备的桶混物。通常将该农化组合物用水、缓冲剂和/或其他助剂配制至所需的施用浓度，由此得到即用喷雾液或农化组合物。每公顷农业利用区通常施用20-2000升，优选50-400升即用喷雾液。
此外，本发明涉及一种防治植物病原性真菌和/或不希望的植物生长和/或不希望的昆虫或螨虫侵袭和/或调节植物生长的方法，其中使农化组合物作用于相应有害物、其环境或待保护以防相应有害物的作物植物、土壤和/或不希望的植物和/或作物植物和/或其环境。
合适作物植物的实例为禾谷类，例如小麦、黑麦、大麦、小黑麦、燕麦或稻；甜菜，例如糖用甜菜或饲用甜菜；仁果、核果和浆果，例如苹果、梨、李、桃、杏仁、樱桃、草莓、悬钩子、醋栗或鹅莓；豆科植物，例如菜豆、扁豆、豌豆、苜蓿或大豆；油料作物，例如油菜籽油菜、芥菜、橄榄、向日葵、椰子、可可豆、蓖麻豆、油棕、花生或大豆；葫芦科植物，例如南瓜/西葫芦、黄瓜或甜瓜；纤维作物，例如棉花、亚麻、大麻或黄麻；柑桔类水果，例如橙、柠檬、葡萄柚或橘；蔬菜植物，例如菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、西红柿、土豆、南瓜/西葫芦或柿子椒；月桂类植物，例如鳄梨、肉桂或樟脑；能源作物和工业原料作物，例如玉米、大豆、小麦、油菜籽油菜、甘蔗或油棕；玉米；烟草；坚果；咖啡；茶；香蕉；葡萄酒(食用葡萄和酿酒用葡萄)；啤酒花；禾草，例如草坪；甜叶菊(Stevia rebaudania)；橡胶植物和森林植物，例如花卉、灌木、落叶树和针叶树；以及繁殖材料，例如种子以及这些植物的收获产物。
术语作物植物还包括已通过育种、诱变或重组方法修饰的那些植物，包括市场销售或开发方法中的生物技术农业产品。基因修饰植物是其遗传物质以无法在自然条件下由杂交、诱变或自然重组(即遗传物质的重组)产生的方式修饰的植物。此处，通常将一个或多个基因整合到所述植物的遗传物质中以改善所述植物的性能。这类重组修饰还包括蛋白质、寡肽或多肽的翻译后修饰，例如通过糖基化或粘结聚合物如异戊二烯化、乙酰化或法呢基化残基或PEG残基。
本发明还涉及包含农化组合物的种子。
本发明还涉及疏水蛋白在降低固体水不溶性农药的毒性(优选吸入毒理学)中的用途和施用方法。
组合物的毒性可以根据化学品检验的OECD指南第403号和相应的指导文件GD39测试，二者均为针对急性吸入毒性的评估。
本发明的优点在于农化组合物具有降低毒性，尤其是降低的吸入毒性；其他优点是减少用于组合物的表面活性剂及其增强的储存稳定性。
下面的实施例说明本发明，而不加以任何限制。
实施例
消泡剂：硅消泡剂。
润湿剂：羟基苯磺酸、甲醛、苯酚和脲的聚合物。
离子表面活性剂A：烷基萘磺酸甲醛缩合物的钠盐。
非离子表面活性剂A：三苯乙烯基苯基乙氧基化磷酸酯的三乙胺盐，pH(5％，水溶液)7.5，沸点大于100℃。
杀菌剂：2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和1,2-苯并异噻唑啉-3-酮的含水混合物。疏水蛋白A：喷雾造粒的yaad-疏水蛋白DewA-His6蛋白质。根据WO 2006/131564，实施例1、2、7和8进行无性繁殖、发酵和纯化。
实施例1：氟唑菌酰胺和百菌清悬浮液浓缩物的制备
通过混合水、助剂A、离子表面活性剂A、润湿剂、农药、疏水蛋白A和消泡剂而制备氟唑菌酰胺和百菌清悬浮液浓缩物。使用珠磨机将该混合物湿磨至2μm的粒度。
加入并混合丙二醇、杀菌剂、黄原胶和水，得到pH 7.5-8.5的均匀悬浮液。组分的最终浓度在表1中给出。
表1
实施例2：急性吸入毒性评估
根据实施例1制备两种悬浮液浓缩物，其中在它们中的一个中省略了疏水蛋白A的混合物。随后将其根据以下的化学品检验OECD指南第403号(2009年9月7日采用的版本)和相应的指导文件GD 39(生效日期：2009年7月21日)测定急性吸入毒性。根据指南67/548/EWG(修订版，2009年1月20日生效)，该研究的结果得到不含疏水蛋白A的悬浮液浓缩物的分类为T/T+，而疏水蛋白A混合物形式的悬浮液浓缩物分类为Xn。
因此，加入疏水蛋白A明显降低农化组合物的毒性。

Claims (16)

1.一种制备农化组合物的方法，包括以下步骤：
a)通过使固体水不溶性农药和疏水蛋白接触而制备预混物，和
b)通过研磨预混物而制备粗悬浮液；
其中水不溶性农药是包含至少两个卤素原子的多卤化农药。
2.根据权利要求1的方法，其中在步骤a)中额外接触水。
3.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤a)中额外接触分散剂。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中粗悬浮液中的农药具有10μm以下的平均粒度。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中预混物包含至少200g/l农药。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中疏水蛋白是通式(III)的多肽，
Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm (III)
其中X表示任意20种天然存在的氨基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)，并且其中指定的指数表示氨基酸数，其中指数n和m表示0-200的数，C表示半胱氨酸且至少一个多肽序列Xm或Xn表示具有至少40个氨基酸的肽序列，其并非天然连接到疏水蛋白，并且其中疏水蛋白导致涂覆玻璃表面后接触角偏移至少20°。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中式(III)的疏水蛋白包含至少一种选自dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basf1、basf2或其部分或衍生物的疏水蛋白。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中水不溶性农药选自百菌清和氟唑菌酰胺。
9.一种农化组合物，包含固体水不溶性农药和疏水蛋白，其中组合物可通过如权利要求1-8中任一项所定义的方法获得。
10.根据权利要求9的组合物，其中组合物包含0.1-10g/l的疏水蛋白。
11.根据权利要求9-10的组合物，其呈含水悬浮液浓缩物的形式，其包含30-75重量％的水。
12.根据权利要求11的组合物，其中悬浮液浓缩物包含至少100g/l的农药、0.5-10g/l的疏水蛋白和至少5g/l的分散剂。
13.疏水蛋白在降低固体水不溶性农药的毒性中的用途。
14.防治植物病原真菌和/或不希望的植物生长和/或不希望的昆虫或螨虫侵袭和/或调节植物生长的方法，其中使如权利要求9-12中任一项所定义的组合物作用于相应有害物、其环境或待保护以防相应有害物的作物植物，作用于土壤和/或作用于不希望的植物和/或作用于作物植物和/或作用于其环境。
15.降低固体水不溶性农药的毒性的方法，包括使水不溶性农药与疏水蛋白接触的步骤。
16.包含如权利要求9-12中任一项所定义的组合物的种子。
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