CN107064259A - 基于辅酶A‑Au（I）配位聚合物的电化学生物传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于可模拟过氧化物酶性质的类核酸CoA‑Au(I)配位聚合物的电化学生物传感器的制备方法及应用，具体步骤如下：(1)将石墨烯溶于醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散得到石墨烯分散液；(2)将辅酶A、氯金酸和磷酸缓冲溶液于PCR管中混合均匀，持续振荡使金离子被还原后，室温下得到CoA‑Au(I)配位聚合物；(3)将石墨烯电沉积到裸玻碳电极，再滴加CoA‑Au(I)配位聚合物溶液可用于检测过氧化氢和生物样品中过氧化氢浓度，优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快，结果准确可靠、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器，尤其是涉及一种模拟过氧化物酶性质的类核酸辅酶A-Au(I)配位聚合物信号放大技术催化双氧水还原的电化学生物传感器的制备方法及其在生物环境中的检测应用。
背景技术
自然界中的酶作为一种高效的生物催化剂，能够有效地参与绝大多数反应。由于它具有高效性、高度的专属性以及温和的反应条件，酶催化反应应用非常广泛。然而，储存和使用不便、提纯困难、成本高昂以及自身的不稳定性等特点，限制了酶在一些领域内的应用。所以近些年来，研究人员开始越来越多的关注和研究模拟酶的制备，使其具有与自然酶相似的功能。目前，众多纳米材料，诸如Co3O4、V2O5等过渡金属氧化物纳米粒子、Pt单金属纳米粒子和Au@Pt、Ag@Au、Ag@Pd、Ag@Pt等双惰性金属复合纳米材料、单、多壁碳纳米管以及氧化石墨烯等碳基纳米材料等均被发现具有模拟酶的特性。但这些纳米材料制备困难，操作复杂，耗时长，灵敏度较低，因此设计和构造人工模拟自然界中的酶已成为众多科研领域科学家们共同挑战的难题。在生物体中，许多催化氧化还原酶的中间物质和最终产物为过氧化氢；过氧化氢自身具有细胞毒性，对激活免疫细胞、细胞凋亡等生物过程会产生一定的影响。因此，开发一种快速、高效的过氧化物酶实现过氧化氢检测技术显得尤为重要，特别是复杂生物环境中对过氧化氢的检测。
一价币族巯基-金属配位聚合物是通过一价币族金属之间的金属-金属相互作用形成的一类纳米材料，早在60年前人们就已经将巯基-Au(I)配位聚合物作为治疗类风湿关节炎的药物。由于二元系统的巯基-Au(I)配位聚合物具有独特的链状结构和特殊的性质，使其得以被广泛研究，比如合成多用途的化合物、材料、功能化的薄片以及纳米结构粒子等。以往的报道中，含有巯基配体的物质如半胱氨酸、巯基丁氨酸、谷胱甘肽等可以 用于合成类蛋白结构的巯基-Au(I)配位聚合物。近年来研究者们对巯基-Au(I)配位聚合物的研究主要集中在结构特点的探究和影响因素上，而对巯基-Au(I)配位聚合物在电化学方面的性质研究十分有限。
CoA作为一种含有巯基的生物小分子，在生物体的新陈代谢中起到重要的作用，它是生物体中一种重要的辅酶，同时也是一些生物酶如乙酰转移酶、柠檬酸合成酶的重要反应产物。CoA作为一种重要的生物小分子，其结构早在1950年就由Lister Institute协同Harvard Medical和Massachusetts General Hospital的一些工作者研究得到。CoA结构主要由三部分构成，3’-磷酸腺嘌呤结构以及类半胱氨酸结构，中间由泛酸基团连接。我们发现CoA的结构中两端的重要功能基团：一个是腺嘌呤结构，另一个是巯基基团。这种特殊的结构使得CoA有可能成为生物化学相关研究领域的重要物质，如果能够同时利用CoA两端的两个功能基团进行生物化学检测，势必会增加其检测的特异性以及选择性，然而目前对于CoA用于生化检测的研究大多只利用了CoA一端的巯基基团，而对CoA结构中的腺嘌呤结构的研究几乎没有，这大大浪费了CoA结构上的优势。因此，可采用其作为配体，利用CoA相比于其它巯基小分子物质的独特的结构和优势，与币族金属离子形成类核酸配位聚合物，进一步用于新型电化学生物传感器的开发。
石墨烯(graphene oxide，GO)是至今发现的最薄二维材料，具有比表面积大、边缘位点多、表面能高、催化性能好、生物相容性好等优点，在电化学免疫分析领域中广泛应用。首先，石墨烯可以加快电极表面的电子传递速度、有效增大电化学信号，使传感器的灵敏度大大提高。其次，石墨烯骨架中的离域大π共轭体系通过非共价结合的作用与含有π电子的化合物π-π共轭，可以有效地固定生物分子。
电化学生物传感器结合了电化学的强大分析功能、特异性识别生物性能，将生物反应的化学信号转换为与被分析物质浓度有关的电信号，从而达到检测目的。电化学生物传感器以其具备快速、稳定、选择性强、重现性好、易于操作、步骤简单等优点被广泛运用。以CoA为配体，利用氯金酸与其形成类核酸CoA-Au(I)配位聚合物，大量腺嘌呤的存在使其能够牢牢吸附到石墨烯表面，并由于一价金离子Au(I)的存在，使得该配位聚合物能够模拟过氧化物酶性质，该配位聚合物具有良好的催化性能及生物兼容性，非常适合用于开发电化学生物传感器。
目前，国内外还没有公开任何关于CoA-Au(I)配位聚合物的模拟过氧化物酶性质的报道，基于石墨烯和CoA-Au(I)配位聚合物修饰电极的电化学传感器研究及通过电化学方法检测双氧水以及生物样本中极微量双氧水的相关报道也未见。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快，结果准确可靠、成本低的基于模拟过氧化物酶性质的类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的电化学生物传感器的制备方法及其用于检测双氧水以及生物样本中极微量双氧水的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于可模拟过氧化物酶性质的类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)石墨烯的分散
将5.0～10.0mg石墨烯溶于5.0～10.0mL浓度为0.1～0.3M的pH＝5.0～6.0的醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散2～5h，得到石墨烯分散液；
(2)类核酸CoA-Au(I)配位聚合物(CP)的制备
依次移取5.0～15.0μL浓度为30～80μM的HAuCl4·3H2O，5.0～15.0μL浓度为80～100μM的CoA溶液，70.0～90.0μL浓度为5～15mM pH为5.0～8.0的磷酸缓冲溶液于PCR管中，在20～30℃恒温磁力搅拌机上震荡反应约5～10min。反应液颜色由黄色变成无色，便得到类核酸CoA-Au(I)配位聚合物(CP)。
(3)电化学生物传感器的制备
a.首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光2～5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～5min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极；
b.利用循环伏安法将氧化石墨烯电沉积到裸玻碳电极得到GO/GCE；在GO/GCE上滴加5.0～10.0μL CoA-Au(I)配位聚合物溶液，组装10～20min后，用二次蒸馏水缓缓冲洗电极，得到基于模拟过氧化物酶性质的CoA-Au(I)配位聚合物信号放大技术的电化学生物传感器(CP/GO/GCE)。
步骤(3)循环伏安法中电位控制在-1.5～0.5V，扫速为10mV/s。
利用上述基于类核酸CoA-Au(I)配位聚合物信号放大技术模拟过氧化物酶性质的电化学生物传感器检测过氧化氢的方法，利用循环伏安法，设置电位范围为-1.2～0V，扫速为50mV/s，检测CP/GO/GCE在浓度为100.0mM、pH＝7.4的PBS缓冲液中对H2O2的电化学响应，获得一系列不同浓度的H2O2对应的还原峰电流大小，建立电流响应与H2O2之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中H2O2的含量。
发明原理：本发明是一种电化学生物传感器，利用一种一端含有巯基，另一端有类腺嘌呤结构的化合物辅酶A作为合成巯基-Au(I)配位聚合物的配体，辅酶A上的巯基与Au(III)通过Au-S键连接，被拉近的相邻两个Au(I)之间发生金属与金属间的“aurophilic”作用而形成CoA-Au(I)配位聚合物。由于腺嘌呤基团位于该聚合物骨架侧面，致使该配位聚合物类似于一条poly A RNA。石墨烯是一种二维片状结构，具有较大的比表面积、良好的导电性和生物相容性，能与类核酸CoA-Au(I)配位聚合物通过π-π共轭效应稳定结合，牢固修饰于玻碳电极表面，从而增强传感器的稳定性，具有模拟过氧化物酶性质，制备了一种简单、高效的用于检测过氧化氢电化学生物传感器。利用石墨烯(GO)和CoA-Au(I)配位聚合物的协同作用，构建了一种简单快速、高灵敏、高选择性、免标记的“turn-on”过氧化氢及复杂生物环境中过氧化氢的分析方法。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明构建了一种基于类核酸CoA-Au(I)配位聚合物信号放大技术的电化学生物传感器。首先，利用低扫速的循环伏安法，将石墨烯均匀修饰于裸玻碳电极表面，且通过设置扫描圈数以控制电极上的石墨烯厚度，得GO/GCE。其次，将CoA-Au(I)配位聚合物在室温下组装于GO/GCE上，利用CoA-Au(I)配位聚合物与石墨烯的π-π共轭作用，使CoA-Au(I)配位聚合物稳定修饰于电极表面，成功制备传感器。随后利用循环伏安法和计时电流法检测传感器对不同浓度过氧化氢电化学响应，并实现血清、尿液中以及活体细胞释放的过氧化氢的检测。显然，在浓度一定范围内，目标物浓度越大，电流响应越明显。实验结果表明，电流的大小与目标物的浓度在一定范围内呈线性关系，实现对目标物的检测。其优点在于：
(1)高灵敏度。本发明是先将石墨烯利用循环伏安法扫描，使石墨烯均匀沉积到电极表面，且因为静电吸附作用，石墨烯可稳定吸附在电极表面，大大加快了电子传递。同时CoA-Au(I)配位聚合物中的腺嘌呤碱基和石墨烯π-π键合，使得传感器更为稳定，提高检测灵敏度。实验得出传感器的电流响应对过氧化氢浓度的线性相关方程为y＝-5.307-0.224x，R2＝0.9918，检测限为0.02μM，由此说明传感器对过氧化氢可实现高灵敏度检测。
(2)高特异性。其他常见的还原性物质如葡萄糖、柠檬酸、抗坏血酸和多巴胺等对本检测体系均无干扰。
(3)结果准确。回收率均在90％～110％之间。
(4)制备与检测方法无需用酶、试剂用量少、检测速度快、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对过氧化氢的高灵敏检测。
综上所述，本发明是基于石墨烯和模拟过氧化物酶性质的类核酸CoA-Au(I)配位聚 合物制备无酶电化学生物传感器，用于对过氧化氢的检测，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度过氧化氢的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的可行性实验图；
图2为本发明传感器对有无过氧化氢的电化学响应图；
图3为本发明传感器对不同浓度过氧化氢的电流响应图；
图4为本发明传感器对不同浓度过氧化氢的电流响应对浓度的校准曲线图；
图5为本发明传感器对过氧化氢的特异性实验图；
图6为本发明传感器对癌症细胞释放的过氧化氢检测实验图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
实施例1
一种基于模拟过氧化物酶活性类核酸CoA-Au(I)配位聚合物信号放大技术的电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)石墨烯的分散
将8.0mg石墨烯溶于8.0mL浓度为0.2M的pH＝5.0的醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散3.5h，得到石墨烯分散液；
(2)类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的制备
依次移取5.0μL浓度为30μM的HAuCl4·3H2O，15.0μL浓度为80μM的CoA溶液，70.0μL浓度为5mM pH为5.0的磷酸缓冲溶液于PCR管中，在30℃恒温磁力搅拌机上震荡反应约10min。反应液颜色由黄色变成无色，便得到类核酸CoA-Au(I)配位聚合物。
(3)电化学生物传感器的制备
a.首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光3.5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗3.5min，然后 用N2吹干，得到裸玻碳电极；
b.利用循环伏安法将氧化石墨烯电沉积到裸玻碳电极，电位控制在-1.5～0.5V，扫速为10mV/s，得到GO/GCE；在GO/GCE上滴加5.0μL CoA-Au(I)配位聚合物溶液，组装15min后，用二次蒸馏水缓缓冲洗电极，得到基于模拟过氧化物酶活性类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的电化学生物传感器(CP/GO/GCE)。
实施例2
一种基于模拟过氧化物酶活性类核酸CoA-Au(I)配位聚合物信号放大技术的电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)石墨烯的分散
将5.0mg石墨烯溶于5.0mL浓度为0.1M的pH＝5.5的醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散2h，得到石墨烯分散液；
(2)类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的制备
依次移取8.0μL浓度为40μM的HAuCl4·3H2O，10.0μL浓度为90μM的CoA溶液，80.0μL浓度为10mM pH为7.0的磷酸缓冲溶液于PCR管中，在30℃恒温磁力搅拌机上震荡反应约8min。反应液颜色由黄色变成无色，便得到类核酸CoA-Au(I)配位聚合物。
(3)电化学生物传感器的制备
a.首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光2.5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2.5min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极；
b.利用循环伏安法将氧化石墨烯电沉积到裸玻碳电极，电位控制在-1.5～0.5V，扫速为10mV/s，得到GO/GCE；在GO/GCE上滴加8.0μL CoA-Au(I)配位聚合物溶液，组装10min后，用二次蒸馏水缓缓冲洗电极，得到基于模拟过氧化物酶活性类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的电化学生物传感器(CP/GO/GCE)。
实施例3
一种基于模拟过氧化物酶活性类核酸CoA-Au(I)配位聚合物信号放大技术的电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)石墨烯的分散
将7.0mg石墨烯溶于8.0mL浓度为0.1M的pH＝6.0的醋酸缓冲液中，于超声清洗器中 超声分散4h，得到石墨烯分散液；
(2)类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的制备
依次移取15.0μL浓度为60μM的HAuCl4·3H2O，15.0μL浓度为100μM的CoA溶液，90.0μL浓度为15mM pH为8.0的磷酸缓冲溶液于PCR管中，在30℃恒温磁力搅拌机上震荡反应约10min。反应液颜色由黄色变成无色，便得到类核酸CoA-Au(I)配位聚合物。
(3)电化学生物传感器的制备
a.首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗5min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极；
b.利用循环伏安法将氧化石墨烯电沉积到裸玻碳电极，电位控制在-1.5～0.5V，扫速为10mV/s，得到GO/GCE；在GO/GCE上滴加10.0μL CoA-Au(I)配位聚合物溶液，组装20min后，用二次蒸馏水缓缓冲洗电极，得到基于模拟过氧化物酶活性类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的电化学生物传感器(CP/GO/GCE)。
二、可行性实验
在合成CoA-Au(I)配位聚合物过程中(具体合成过程同上述实施例1所述)同时研究了在缺少CoA、Au(III)其中一种试剂时，是否修饰CoA-Au(I)配位聚合物时，对电流强度的影响，保持合成条件不变，控制溶液中各个试剂浓度相等，比较四种修饰电极对5mM过氧化氢的电化学响应。
结果如图1，在合成CoA-Au(I)配位聚合物过程中同时研究了在缺少CoA、Au(III)其中一种试剂时，是否修饰CoA-Au(I)配位聚合物时，对电流强度的影响，保持合成条件不变，控制溶液中各个试剂浓度相等，比较四种溶液修饰电极的电化学性能。实验现象表明仅CP/GO/GCE对含5mM过氧化氢的PBS溶液有明显的响应信号，其它修饰电极的响应信号可以忽略。证明了在缺少任一反应物的条件下，CoA-Au(I)配位聚合物无法合成，也证明了CoA-Au(I)配位聚合物的催化作用。由此证明该实验在理论上和技术上是可行的。
三、过氧化氢检测应用
1、利用上述具体实施例1制备的电化学生物传感器检测过氧化氢的方法
利用循环伏安法，设置电位范围为-1.2～0V，扫速为50mV/s，检测CP/GO/GCE在浓度为100.0mM、pH＝7.4的PBS缓冲液中有无H2O2的电化学响应，如图2所示，根据两者之间的对比，确定CoA-Au(I)配位聚合物对H2O2的催化作用，肯定该配位聚合物模拟过氧化物酶的性质。
2、灵敏度试验
采用计时电流法，检测时间0～4300s，每隔100s加样一次，检测电位-0.3V，上述具体实施例1制备的CP/GO/GCE对含H2O2的PBS溶液的检测，H2O2浓度的范围为0.1～300μM。试验结果说明，如图3所示，说明随着不断加入过氧化氢，CP/GO/GCE对H2O2产生连续电流响应；图4所示，传感器对过氧化氢的电流响应对浓度的线性相关方程为y＝-5.307-0.224x，R2＝0.9918，根据S/N计算得知，检测限为0.02μM。说明传感器对过氧化氢可实现高灵敏度检测。
3、特异性试验
选择性与抗干扰实验中过氧化氢及其他还原性物质的浓度均为0.2mM，所用到的其他还原性物质的缩写如下：多巴胺(DA)，抗坏血酸(AA)，柠檬酸(CA)，葡萄糖(Glucose)，对乙酰氨基酚(AP)，尿酸(UA)。
采用计时电流法，检测时间0～1000s，每隔50s加样一次，检测电位-0.3V，上述具体实施例1制备的CP/GO/GCE依次加入浓度为0.1mM的H2O2、0.2mM抗坏血酸(AA)，0.1mM的H2O2、0.2mM尿酸(UA)，0.1mM的H2O2、0.2mM多巴胺(DA)，0.1mM的H2O2、0.2mM对乙酰氨基酚(AP)，0.1mM的H2O2、0.2mM柠檬酸(Citricacid)，0.1mM的H2O2、0.2mM葡萄糖(Glucose)。结果如图5所示，与过氧化氢对比，传感器对其他还原性物质的电化学响应非常小，基本接近空白信号，且不影响再次添加H2O2时的信号，说明传感器对于过氧化氢的检测有很好的选择性及抗干扰性。
4、生物样本中过氧化氢试验
采用计时电流法，检测时间0～700s，每隔100s加样一次，检测电位-0.3V，在不含H2O2的PBS溶液中，通过加入CdTe量子点的毒性，刺激Hela细胞产生双氧水，然后加入过氧化氢酶分解产生的双氧水，检测CP/GO/GCE的电化学响应。比较传感器对加入CdTe量子点和过氧化氢酶时的电流响应，结果如图6，观察到加入CdTe量子点时，有还原峰电流响应，加入过氧化氢酶时，基本没有电流响应，可以检测到Hela细胞释放的H2O2浓度大概为0.65μM。说明该传感器可以实现了实际生物样本中过氧化氢的特异性灵敏检测。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。
Claims (4)
1.一种基于可模拟过氧化物酶性质的类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)石墨烯的分散
将5.0～10.0mg石墨烯溶于5.0～10.0mL浓度为0.1～0.3M的pH＝5.0～6.0的醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散2～5h，得到石墨烯分散液；
(2)类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的制备
依次移取5.0～15.0μL浓度为30～80μM的HAuCl4·3H2O，5.0～15.0μL浓度为80～100μM的CoA溶液，70.0～90.0μL浓度为5～15mM pH为5.0～8.0的磷酸缓冲溶液于PCR管中，在20～30℃恒温磁力搅拌机上震荡反应约5～10min。反应液颜色由黄色变成无色，便得到类核酸CoA-Au(I)配位聚合物。
(3)电化学生物传感器的制备
a.首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光2～5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～5min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极；
b.利用循环伏安法将氧化石墨烯电沉积到裸玻碳电极得到GO/GCE；在GO/GCE上滴加5.0～10.0μL CoA-Au(I)配位聚合物溶液，组装10～20min后，用二次蒸馏水缓缓冲洗电极，得到基于模拟过氧化物酶性质的CoA-Au(I)配位聚合物信号放大技术的电化学生物传感器(CP/GO/GCE)。
2.根据权利要求1所述的一种基于可模拟过氧化物酶性质的类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤1-(3)循环伏安法中电位控制在-1.5～0.5V，扫速为10mV/s。
3.一种利用权利要求1-(3)中所述的基于可模拟过氧化物酶性质的类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的电化学生物传感器检测过氧化氢的方法，其特征在于：利用循环伏安法，设置电位范围为-1.2～0V，扫速为50mV/s，检测CP/GO/GCE在浓度为100.0mM、pH＝7.4的PBS缓冲液中对H2O2的电化学响应，根据还原峰电流的大小确定其类核酸性质及过氧化物酶性质。
4.一种利用上述基于1-(3)中所述的基于可模拟过氧化物酶性质的类核酸CoA-Au(I)配位聚合物的电化学生物传感器检测过氧化氢的方法，其特征在于：利用计时电流法，检测时间0～4300s，每隔100s加样一次，检测电位-0.3V，检测CP/GO/GCE对不同浓度H2O2的电化学响应，获得一系列不同浓度的H2O2对应的还原峰电流大小，建立电流响应与H2O2浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测生物样品中H2O2的含量。
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Application publication date: 20170818 Assignee: Ningbo Science and Technology Innovation Association Assignor: Ningbo University Contract record no.: X2023980033633 Denomination of invention: Preparation and Application of Electrochemical Biosensors Based on Coenzyme A-Au (I) Coordination Polymers Granted publication date: 20200114 License type: Common License Record date: 20230317 |