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CN107064092B - 一种双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法及其应用 - Google Patents

一种双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法及其应用 Download PDF

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CN107064092B
CN107064092B CN201710316873.7A CN201710316873A CN107064092B CN 107064092 B CN107064092 B CN 107064092B CN 201710316873 A CN201710316873 A CN 201710316873A CN 107064092 B CN107064092 B CN 107064092B
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Abstract

本发明公开一种双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法，该方法同时检测双特异性抗体的两个抗原结合位点，根据荧光的比值与标准品的浓度进行四参数拟合，得到标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度。该方法能够更有效地筛选出完整的抗体分子和高双特异性结合活性，高表达的细胞株；具有低反应体积的特点，能最大化节约了实验试剂成本；可大范围地推广应用在CLD克隆的高通量筛选。

Description

一种双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法，具体是涉及一种利用改进的均质性时间分辨荧光技术(HTRF)评价和筛选双特异性抗体的生物学活性与滴度检测的方法。
背景技术
双特异性抗体是一类含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，除了Fc端，两价抗体中的Fab段具有不同特异性。现有技术中，双特异抗体生物学活性(结合活性)主要通过ELISA的方法，但ELISA方法的实验过程中需要反复的清洗，多步骤，比较繁琐耗时，而且不能用一个试验说明两种特异性结合活性。
均质性时间分辨荧光技术(Homogeneous Time Resolved Fluorescence，HTRF)能够对荧光共振能量转移进行时间延迟测量，从而能够用于均质化样品的定量检测。FRET技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为(能量)供体和(能量)受体，将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将受体和供体拉到足够近的距离，产生能量转移。受体受到激发，发出特定波长的发射光。由于受体分子的发射光来自于能量转移，所以在实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。如果与供体和受体结合的生物分子不存在相互作用，供体和受体距离较远，不能产生能量转移。
现阶段，生物制药与生物工艺行业，多有使用均质性时间分辨荧光技术筛选高产细胞株的报道，但其局限于应用在使用哺乳动物工程细胞株表达生产单抗或融合蛋白。该方法主要是利用单抗或融合蛋白的Fc端来进行检测筛选，而该方法不能筛选出完整的双特异性抗体，对于双特异性抗体是不适用的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种改进的HTRF技术用于双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法，能够从多个角度筛选和评价了双特异性抗体，为筛选高产量、高双特异性活性的稳定细胞株提供一种适用范围更广、更准确和有效的方法。
为解决上述技术问题，本发明的一种双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法，所述双特异性抗体能与两种抗原特异性结合，所述两种抗原分别是A抗原及B抗原，定义结合A抗原的轻链为Lambda链，结合B抗原的轻链为Kappa链，所述方法包括以下步骤：
步骤1.在微孔板中加入细胞上清液或待测物；
步骤2.加入供体和受体，其中，供体和受体的加入方式可以按以下六种方案中的一种或多种进行：
方案一：加入的供体为Anti-his-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗抗His抗体)，或Anti-his-Tb2+ cryptate(铽穴状物偶联的抗His抗体)，或Streptavidin-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的亲和链霉素)，或Streptavidin-Tb2+ cryptate(铽穴状物偶联的亲和链霉素)；加入的受体为Anti-Kappa-d2(d2连接的抗人Kappa轻链的抗体)；还加入A抗原(带有his标签或biotin标签)，混匀；
方案二：加入的供体为Anti-Lambda-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗人Lambda轻链的抗体)；加入的受体为Anti-his-XL665(XL665连接的抗His抗体)，或Anti-his-d2(d2连接的抗His抗体)，或Streptavidin-d2(d2连接的亲和链霉素)，或Streptavidin-XL665(XL665连接的亲和链霉素)；还加入B抗原(带有his标签或biotin标签)，混匀；
方案三：加入的供体为Anti-his-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗抗His抗体)，或Anti-his-Tb2+ cryptate(铽穴状物偶联的抗His抗体)，或Streptavidin-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的亲和链霉素)，或Streptavidin-Tb2+ cryptate(铽穴状物偶联的亲和链霉素)；加入的受体为Streptavidin-d2(d2连接的亲和链霉素)，或Streptavidin-XL665(XL665连接的亲和链霉素)，或Anti-his-XL665(XL665连接的抗His抗体)，或Anti-his-d2(d2连接的抗His抗体)；Streptavidin仅与his标签配对；还加入A抗原和B抗原(分别带有his标签和biotin标签)，混匀；
方案四：加入的供体为Anti-his-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗His抗体)，或Anti-his-Tb2+ cryptate(铽穴状物偶联的抗His抗体)，或Streptavidin-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的亲和链霉素)，或Streptavidin-Tb2+ cryptate(铽穴状物偶联的亲和链霉素)；加入的受体为Anti-(h)Fc-d2(d2连接的抗人lgG Fc的抗体)；还加入A抗原(带有his标签或biotin标签)，混匀；
方案五：加入的供体为Anti-his-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗His抗体)，或Anti-his-Tb2+ cryptate(铽穴状物偶联的抗His抗体)，或Streptavidin-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的亲和链霉素)，或Streptavidin-Tb(铽穴状物偶联的亲和链霉素)；加入的受体为Anti-(h)Fc-d2(d2连接的抗人lgG Fc的抗体)；还加入B抗原(带有his标签或biotin标签)，混匀；
方案六：加入的供体为Anti-Lambda-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗人Lambda轻链的抗体)；加入的受体为Anti-Kappa-d2(d2连接的抗人Kappa抗体)，混匀；
步骤3.以目标双特异性抗体作为标准品，在室温孵育；
步骤4.设置荧光波长，读取荧光值，根据Em650/Em620(Em665/Em620*104)荧光的比值与标准品的浓度进行四参数拟合，得到标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度以及生物学结合活性。
本发明的方法与现有的HTRF的区别在于，本发明的方法1)既能检测滴度又能检测生物学活性，2)既能检测轻链完整性又能检测重链完整性。而现有的HTFR仅限于滴度和重链完整性，所以本发明的方法能够适用于检测完整的双特异性抗体。
其中，在本发明的步骤2中，所述方案一中的供体和受体分别间接或直接地结合A抗原和待测物的Kappa链；所述方案二中的受体和供体分别间接或直接地结合B抗原和待测物的Lambda链；所述方案三中的供体和受体分别结合A抗原和B抗原；所述方案四中的供体和受体分别间接或直接地结合A抗原和Fc；所述方案五中的供体和受体分别间接或直接地结合B抗原和Fc，或反之；所述方案六种的供体和受体分别结合待测物的Lambda链和Kappa链，或反之。
其中，在步骤2中，加入的A抗原及B抗原带有his标签或biotin标签。
其中，在步骤3中，室温孵育时间为2小时以上。
其中，在步骤1～3中的细胞上清液或待测物、供体、受体、A抗原和/或B抗原、以及标准品的用量均为2.5μL/孔。
其中，在步骤4中，所述荧光波长包括Excitation 313nm，Emission 665nm/620nm，cutoff630nm/590nm。
本发明的方法中，当待测物(双特异性抗体或多交叉抗体)同时被HTRF荧光团供体或受体直接或间接结合后，有两个激发光620nm和650nm，否则只有620nm一个激发光。Em650/Em620(Em665/Em620*104)荧光的比值与标准品的浓度成线性关系。
本发明的方法，可以用于双特异性治疗性抗体高表达细胞株的筛选。
本发明的方法，可以用于双特异性治疗性抗体生物学结合活性的测定，可以同时检测双特异性抗体的两种结合活性，也可以同时检测双特异性抗体两种轻链的完整性，还可以同时检测双特异性抗体轻链和重链的完整性。
采用本发明的方法，具有以下有益效果：
1)本发明的方法能够更有效地筛选出完整的抗体分子和高双特异性结合活性、高表达的细胞株。
2)本发明的方法具有低反应体积的特点，能最大化节约了实验试剂成本。
3)本发明的方法可大范围地推广应用在CLD克隆的高通量筛选。
4)本发明的方法用一个方法同时检测，大大降低了人力、物力成本。
5)在表达双特异性抗体的细胞株的建立和筛选阶段,本发明可以更高效地筛选出完整的抗体分子和高双特异性结合活性高表达的细胞株。
6)在原料药和成品临床实验申报或商业化生产申报阶段，提供可以用于双特异性抗体药物产品放行和稳定性研究的生物学活性检测方案。
附图说明
图1为实施例一中检测方法得到的标准曲线图；
图2为实施例一中检测方法得到的线性相关图；
图3为实施例二中检测方法得到的标准曲线图一；
图4为实施例二中检测方法得到的标准曲线图二；
图5为实施例二中检测方法得到的线性相关图一；
图6为实施例二中检测方法得到的线性相关图二。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中使用的各试剂均为商品化试剂，或将商品化试剂按常规实验操作处理得到。
本发明建立了双特异性抗体活性评价与筛选的平台，优化了两种创新的HTRF技术，以抗A抗原和抗B抗原的双特异性抗体为例，结合A抗原的轻链为Lambda链，结合B抗原的轻链为Kappa链，有以下六种方案：
方案一：HTRF供体和受体分别间接或直接地结合A抗原和待测物的Kappa链
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入Anti-Kappa-d2(d2连接的抗人Kappa轻链的抗体)；
3)加入Anti-his-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗抗His抗体)，或Anti-his-Tb2 + cryptate(铽穴状物偶联的抗His抗体)，或Streptavidin-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的亲和链霉素)或Streptavidin-Tb2+ cryptate(铽穴状物偶联的亲和链霉素)；
4)加入A抗原(带有his标签或biotin标签)，混匀；
5)以目标双特异性抗体作为标准品，在室温孵育约2小时或以上或过夜。
所述步骤1～4中的用量均为2.5μL/孔。
方案二：HTRF受体和供体分别间接或直接地结合B抗原和产品的Lambda链
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入Anti-Lambda-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗人Lambda轻链的抗体)；
3)加入Anti-his-XL665(XL665连接的抗His抗体)或Anti-his-d2(d2连接的抗His抗体)，或Streptavidin-d2(d2连接的亲和链霉素)或Streptavidin-XL665(XL665连接的亲和链霉素)；
4)加入B抗原(带有his标签或biotin标签)，混匀；
5)以目标双特异性抗体作为标准品，在室温孵育2小时或以上或过夜。
所述步骤1～4中的用量均为2.5μL/孔。
方案三：HTRF供体和受体分别结合A抗原和B抗原
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入Anti-his-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗抗His抗体)，或Anti-his-Tb2 + cryptate(铽穴状物偶联的抗His抗体)，或Streptavidin-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的亲和链霉素)或Streptavidin-Tb2+ cryptate(铽穴状物偶联的亲和链霉素)；
3)加入供体相对应的受体Streptavidin-d2(d2连接的亲和链霉素)或Streptavidin-XL665(XL665连接的亲和链霉素)，或Anti-his-XL665(XL665连接的抗His抗体)或Anti-his-d2(d2连接的抗His抗体)；Streptavidin仅与His tag配对；
4)加入A和B抗原(分别带有his标签和biotin标签)，混匀；
5)以目标双特异性抗体作为标准品，在室温孵育2小时或以上或过夜。
所述步骤1～4中的用量均为2μL/孔。
方案四：HTRF供体和受体分别间接或直接地结合A抗原和Fc
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入Anti-his-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗His抗体)或Anti-his-Tb2+cryptate(铽穴状物偶联的抗His抗体)，或Streptavidin-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的亲和链霉素)或Streptavidin-Tb2+ cryptate(铽穴状物偶联的亲和链霉素)；
3)加入Anti-(h)Fc-d2(d2连接的抗人lgG Fc的抗体)；
4)加入A抗原(带有his标签或biotin标签)，混匀；
5)以目标双特异性抗体作为标准品，在室温孵育2小时或以上或过夜。
所述步骤1～4中的用量均为2.5μL/孔。
方案五：HTRF供体和受体(或反之，根据实际情况)分别间接或直接地结合B抗原和Fc
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入Anti-his-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗His抗体)或Anti-his-Tb2+cryptate(铽穴状物偶联的抗His抗体)，或Streptavidin-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的亲和链霉素)或Streptavidin-Tb(铽穴状物偶联的亲和链霉素)；
3)加入Anti-(h)Fc-d2(d2连接的抗人lgG Fc的抗体)；
4)加入B抗原(带有his标签或biotin标签)，混匀；
5)以目标双特异性抗体作为标准品，在室温孵育2小时或以上或过夜。
所述步骤1～4中的用量均为2.5μL/孔。
方案六：HTRF供体和受体(或反之，根据实际情况)分别结合产品的Lambda和Kappa链
1)在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；
2)加入Anti-Lambda-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗人Lambda轻链的抗体)；
3)加入Anti-Kappa-d2(d2连接的抗人Kappa抗体)，混匀；
4)以目标双特异性抗体作为标准品，在室温孵育2小时或以上或过夜。
所述步骤1中的用量为5μL/孔，2和3中的用量均为2.5μL/孔。
设置荧光波长：Excitation 313nm，Emission 665nm/620nm，cutoff 630nm/590nm，读取荧光值。根据Em650/Em620(Em665/Em620*104)荧光的比值与标准品的浓度进行四参数拟合，得到标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度。
用四参数对待测物和标准品的浓度和荧光比值进行拟合，根据参考品和待测物四参数拟合计算得到C值，即EC50值，利用下列公式计算得到待测物的生物学结合活性。
本发明中，当待测物(双特异性抗体或多交叉抗体)同时被HTRF荧光团供体或受体直接或间接结合后，有两个激发光620nm和650nm，否则只有620nm一个激发光。Em650/Em620(Em665/Em620*104)荧光的比值与标准品的浓度成线性关系。
本发明中，按照产品完整性分为：a)完整轻链，可以选择方案一、二和六；b)完整重链，可选择方案四和五；c)同时检测完整双特异性，可选择方案三。
下面以抗A抗原双特异性抗体为例，来具体说明本发明的方法的应用。
实施例一，用于检测轻链的完整性以及生物学活性：
1)在384微孔板中加入细胞上清液，Anti-Lambda-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗Lambda轻链的抗体)，Anti-his-XL665(XL665连接的抗His抗体)，带有his标签的重组人CD4蛋白(即A抗原)，混匀。以抗CD4和抗ENV的双特异性抗体作为标准品(终浓度为0～250ng/mL)，在室温孵育2小时或以上或过夜。
2)设置荧光波长：Excitation 313nm，Emission 665nm/620nm，cutoff 630nm/590nm，读取荧光值。
3)根据Em650/Em620(Em665/Em620*104)荧光的比值与标准品的浓度进行四参数拟合，得到标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度。标准曲线如图1所示。图1中横坐标为双特异性抗体的浓度，纵坐标为相对荧光单位。
4)用不同纯度的待测双特异性抗体对方法进行了确认，样品均呈现良好的稀释线性(RSD<15％)，HTRF的结果与Caliper的产品完整性结果成良好的正相关关系，相关性图如图2所示，r＝0.9529，这说明本方法可以有效地检测轻链的完整性及其生物化学活性。
实施例二，用于检测轻链和重链的完整性以及生物学活性：
1)在384微孔板#1中加入细胞上清液，Anti-Lambda-Eu3+ cryptate(穴状物偶联的抗Lambda轻链的抗体)，Anti-(h)Fc-d2(d2连接的抗人lgG Fc的抗体)，混匀。以目标双特异性抗体作为标准品，在室温孵育2小时或以上或过夜。
2)在384微孔板中加入细胞上清液，Anti-(h)Fc-d2(d2连接的抗人lgG Fc的抗体)，Anti-his-Eu3+ cryptate(铕穴状物偶联的抗His抗体)，CD4蛋白(his标签)，混匀。以目标双特异性抗体作为标准品，在室温孵育2小时或以上或过夜。
3)设置荧光波长：Excitation 313nm,Emission 665nm/620nm,cutoff 630nm/590nm，读取荧光值。
4)根据Em650/Em620(Em665/Em620*104)荧光的比值与标准品的浓度进行四参数拟合，得到标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度。其中，轻链的标准曲线和不同纯度样品的浓度结果如图3所示，图3中横坐标为双特异性抗体的浓度，纵坐标为相对荧光单位；重链和CD4的标准曲线和不同纯度样品的浓度结果如图4所示，图4中横坐标为双特异性抗体的浓度，纵坐标为相对荧光单位。
5)用不同纯度的待测双特异性抗体对方法进行了确认，样品均呈现良好的稀释线性，HTRF的结果与Caliper的结果成良好的正相关关系，相关性图分别如图5(r＝0.9697)和图6(r＝0.9734)所示。这说明本方法可以有效检出轻链和重链的完整性以及生物学活性。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种双特异性抗体生物学活性与滴度检测方法，其特征在于，所述双特异性抗体能与两种抗原特异性结合，所述两种抗原分别是A抗原及B抗原，定义结合A抗原的轻链为Lambda链，结合B抗原的轻链为Kappa链，所述方法包括以下步骤：
步骤1.在微孔板中加入细胞上清液或待测物；
步骤2.加入供体和受体，其中，供体和受体的加入方式包括以下六种方案：
方案一：加入的供体为Anti-his-Eu3+cryptate，或Anti-his-Tb2+cryptate，或Streptavidin-Eu3+cryptate，或Streptavidin-Tb2+cryptate；加入的受体为Anti-Kappa-d2；还加入A抗原，混匀；
方案二：加入的供体为Anti-Lambda-Eu3+cryptate；加入的受体为Anti-his-XL665，或Anti-his-d2，或Streptavidin-d2，或Streptavidin-XL665；还加入B抗原，混匀；
方案三：加入的供体为Anti-his-Eu3+cryptate，或Anti-his-Tb2+cryptate，或Streptavidin-Eu3+cryptate，或Streptavidin-Tb2+cryptate；加入的受体为Streptavidin-d2，或Streptavidin-XL665，或Anti-his-XL665，或Anti-his-d2；还加入A抗原和B抗原，混匀；
方案四：加入的供体为Anti-his-Eu3+cryptate，或Anti-his-Tb2+cryptate，或Streptavidin-Eu3+cryptate，或Streptavidin-Tb2+cryptate；加入的受体为Anti-(h)Fc-d2；还加入A抗原，混匀；
方案五：加入的供体为Anti-his-Eu3+cryptate，或Anti-his-Tb2+cryptate，或Streptavidin-Eu3+cryptate，或Streptavidin-Tb；加入的受体为Anti-(h)Fc-d2；还加入B抗原；
方案六：加入的供体为Anti-Lambda-Eu3+cryptate；加入的受体为Anti-Kappa-d2，混匀；
在步骤2中，加入的A抗原及B抗原带有his标签或biotin标签；
步骤3.以目标双特异性抗体作为标准品，在室温孵育；
步骤4.设置荧光波长，读取荧光值，根据荧光的比值与标准品的浓度进行四参数拟合，得到标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度以及生物学结合活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3中，室温孵育时间为2小时以上。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1～3中的细胞上清液或待测物、供体、受体、A抗原和/或B抗原、以及标准品的用量均为2.5μL/孔。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4中，所述荧光波长包括Excitation313nm，Emission 665nm/620nm，cutoff 630nm/590nm。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法用于双特异性治疗性抗体高表达细胞株的筛选的应用。
6.如权利要求1-4任一项所述的方法用于双特异性治疗性抗体生物学结合活性的测定的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，用于同时检测双特异性抗体的两种结合活性。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，用于同时检测双特异性抗体两种轻链的完整性。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，用于同时检测双特异性抗体轻链和重链的完整性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109696461B (zh) * 2017-10-24 2023-05-26 上海药明生物技术有限公司 一种治疗性抗体的放行检测方法
CN108519486A (zh) * 2018-04-19 2018-09-11 浠思（上海）生物技术有限公司 利用htrf高通量筛选lag3/mhcii抑制剂的方法
CN108645828B (zh) * 2018-05-14 2022-02-11 上海药明生物技术有限公司 基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法
CN111044720B (zh) * 2019-11-29 2023-03-14 上海药明生物技术有限公司 针对WuXiBody进行特异性细胞株筛选的HTRF方法
CN114264808B (zh) * 2021-12-28 2022-09-30 南京岚煜生物科技有限公司 基于抗原检测试剂的抗原中和当量的确定方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104833797A (zh) * 2015-06-04 2015-08-12 武汉友芝友生物制药有限公司 检测双特异性抗体msbody的elisa方法及应用
CN105367660A (zh) * 2015-12-22 2016-03-02 深圳市北科生物科技有限公司 一种抗cd16a抗原和抗muc1抗原的双特异性抗体
CN105820251A (zh) * 2015-01-08 2016-08-03 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物
CN106459220A (zh) * 2014-05-29 2017-02-22 Ucb生物制药私人有限公司 适用于高通量筛选的新的双特异性形式

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106459220A (zh) * 2014-05-29 2017-02-22 Ucb生物制药私人有限公司 适用于高通量筛选的新的双特异性形式
CN105820251A (zh) * 2015-01-08 2016-08-03 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物
CN104833797A (zh) * 2015-06-04 2015-08-12 武汉友芝友生物制药有限公司 检测双特异性抗体msbody的elisa方法及应用
CN105367660A (zh) * 2015-12-22 2016-03-02 深圳市北科生物科技有限公司 一种抗cd16a抗原和抗muc1抗原的双特异性抗体

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