CN107056868A

CN107056868A - 思茅藤孕甾烷糖苷类化合物及其应用

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Publication number: CN107056868A
Application number: CN201710180951.5A
Authority: CN
Inventors: 程桂广; 曹建新; 赵天瑞; 樊建
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明公开了一类思茅藤孕甾烷糖苷类化合物及其在制备免疫抑制药物中的应用，实验结果显示，该类化合物具有很强的抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的活性；本发明为研制新的免疫抑制剂提供了先导化合物，有利于开发利用植物药用资源。

Description

思茅藤孕甾烷糖苷类化合物及其应用

技术领域

本发明涉及一类思茅藤孕甾烷糖苷类化合物及其在制备免疫抑制药物中的应用，特别是在制备治疗器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病的免疫药物中的应用。

背景技术

近年来，随着工业化程度的逐步提高，自身免疫性疾病、超敏反应性疾病等由免疫反应过度而引起的疾病也在不断增加，寻找高效低毒的免疫抑制剂已成为当前一个研究热点

免疫药物是20世纪70年代后发展起来的一类新的治疗药物。免疫治疗通过调节机体免疫功能,纠正免疫反应异常,达到治病目的。多数作用于免疫系统的药物有正、反两方面的作用,即免疫增强与免疫抑制。免疫抑制剂

(immunosuppressant)在临床为自身免疫病和器官移植后的排斥反应提供了有效的治疗药物，受到广泛的重视。

免疫应答反应本是机体自我保护、自身稳定的一种防御反应，长期抑制这种反应会带来感染和诱发肿瘤等一些严重的后果,这也是目前免疫抑制剂所遇到的一些问题。免疫抑制剂在临床为自身免疫病和器官移植后的排斥反应提供了有效的治疗药物，通常用来抑制器官移植后出现的排异反应，治疗骨髓移植后出现的移植物抗宿主病，或治疗类风湿性关节炎、克隆氏症等自身免疫性疾病，一般会通过药物进行免疫抑制。自身免疫性疾病大多为慢性或进行性疾病需要长期用药，而现有的糖皮质激素(如地塞米松)和免疫抑制剂长期用药普遍存在毒副作用大、使用不方便等缺点，如地塞米松等糖皮质激素类药物、氯霉素类药物、四环素类药物和磺胺类药物等常可导致机体免疫抑制。因此，迫切需要研制一类高效低毒的新型免疫抑制剂，相比于化学治疗，中药作为一种天然产物，具有与人组织相容性质好、副作用小等优点，在免疫抑制剂的研究中越来越受到人们的重视。

思茅藤(Epigynum auritum)是夹竹桃科思茅藤族思茅藤属的一个种，产于云南南部，根据我们前期的研究结果，思茅藤中含有较多结构新颖雄甾烷、C₂₁甾体及其糖苷类化合物。在发现新药先导化合物的兴趣驱动下，我们对这些新化合物进行了大量的生物活性筛选实验，本发明提供的孕甾烷糖苷类化合物及其作为免疫抑制药物目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一类思茅藤孕甾烷糖苷类化合物，其结构式如式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ所示：

式Ⅰ：(3β,17α,20S)pregn-5-ene-3,17,20-triol 2,3-dimethoxy-6-deoxy-β-D-idopyranose；Epigynoside E，中文名为3β,17α,20α-孕甾烷-5(6)-烯-3,17,20-三醇3-O-2′,3′-二甲氧基-6′-去氧-β-D-艾杜糖苷，俗名为思茅藤苷戊。

式Ⅱ：(3β,17α,20S)pregn-5-ene-3,15,17,20-tetraol 2,3-dimethoxy-6-deoxy-β-D-idopyranose；Epigynoside F，中文名为3β,17α,20α-孕甾烷-5(6)-烯-3,15,17,20-四醇3-O-2′-甲氧基-6′-去氧-β-D-艾杜糖苷，俗名为思茅藤苷己。

式Ⅲ(3β,17α,20S)pregn-5-ene-3,17,20-triol 2-methoxy-6-deoxy-β-D-idopyranose；Epigynoside G，中文名为3β,17α,20α-孕甾烷-5(6)-烯-3,17,20-三醇3-O-2,6-2′,3′-二甲氧基-6′-去氧-β-D-艾杜糖苷，俗名为思茅藤苷庚。

本发明中三个孕甾烷糖苷化合物的制备步骤具体如下：取思茅藤植物样品叶部分干粉4.5kg，用75％乙醇回流提取3次，每次48h，过滤除去滤渣后合并三次提取的滤液，减压浓缩后再用乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯萃取层；将乙酸乙酯层萃取物用大孔吸附树脂D101进行粗分，分别用体积百分比20％、40％、60％、80％、100％的甲醇水溶液进行洗脱总共得到5个部分(Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E)。Fr.B通过制备液相以体积百分比30％-70％的甲醇水溶液进行梯度洗脱得到六个部分Fr.B1-B6。再将其中的Fr.B2部分通过200-300目的硅胶柱，以氯仿-丙酮(体积比10:1-3:1)为洗脱液进行洗脱，总共得到四个部分Fr.B2a-Fr.B2d。将Fr.B2b部分通过凝胶柱Sephadex LH-20(流动相为氯仿：甲醇＝1:1)制备得到式Ⅱ中的2号化合物。Fr.D部分通过凝胶柱Sephadex LH-20(流动相为甲醇：水＝1:1)分离得到四个部分Fr.D1-D4。Fr.D2部分先通过中压C18柱(甲醇-水，40:60-80:20)梯度洗脱，然后通过半制备高效液相(乙腈-水，50:50)纯化得到式Ⅰ中的1号化合物。Fr.D3部分以氯仿-丙酮(4:1)为洗脱液通过硅胶柱进行洗脱，然后再通过凝胶柱Sephadex LH-20(流动相为氯仿：甲醇＝1:1)洗脱，制备得到式Ⅲ中的3号化合物。经鉴定，式Ⅰ中的三个化合物均为新化合物。

本发明的另一目的是将上述思茅藤孕甾烷糖苷类化合物应用在制备免疫抑制药物中。

具体是免疫抑制药物应用在制备自身免疫性疾病的治疗药物中，或应用在制备器官移植抗排斥反应的治疗药物中。

本发明所述应用中还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。

本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。

本发明中用健康的Balb/c小鼠来制备脾细胞用于试验。脾细胞制备完成后，通过ConA或者LPS进行诱导，同时在试验组加入不同浓度供试化合物，培养72h后，通过CCK-8试剂法分别测定试验组、诱导对照组和未诱导对照组的吸光值，从而评价化合物刺激T细胞或者B细胞增殖的能力。实验结果表明本发明中涉及的三个孕甾烷糖苷类化合物，思茅藤苷戊、思茅藤苷己、思茅藤苷庚(epigynoside E-G)对ConA(伴刀豆蛋白)刺激的Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，与不加该化合物的对照组相比有显著性差异(p<0.05)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：孕甾烷糖苷类化合物的制备

取思茅藤叶部分干粉4.5kg，用75％乙醇回流提取3次，每次48h，过滤除去滤渣后合并三次提取的滤液，减压浓缩后再用乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯萃取层称重得57g；将乙酸乙酯层萃取物用大孔吸附树脂D101进行粗分，分别用体积百分比20％、40％、60％、80％、100％的甲醇水进行洗脱总共得到5个部分(Fr.A-E)。Fr.B(4.6g)通过制备液相以甲醇水30％-70％进行梯度洗脱得到六个部分Fr.B1-B6。再将其中的Fr.B2(2.5g)通过200-300目的硅胶柱，以氯仿-丙酮(10:1-3:1)为洗脱液进行洗脱，总共得到四个部分Fr.B2a-Fr.B2d。将Fr.B2b(298mg)通过凝胶柱Sephadex LH-20(流动相为氯仿：甲醇＝1:1)制备得到式Ⅱ中的思茅藤苷己(5.5mg)。Fr.D(6.4g)通过凝胶柱Sephadex LH-20(流动相为甲醇：水＝1:1)分离得到四个部分Fr.D1-D4。Fr.D2先通过中压C18柱(甲醇-水，40:60-80:20)梯度洗脱，然后通过半制备高效液相(乙腈-水，50:50)纯化得到式Ⅰ中的思茅藤苷戊(23mg)。Fr.D3以氯仿-丙酮(4:1)为洗脱液通过硅胶柱进行洗脱，然后再通过凝胶柱Sephadex LH-20(流动相为氯仿：甲醇＝1:1)洗脱，制备得到式Ⅲ中的思茅藤苷庚(5.7mg)。经鉴定，式Ⅰ中的三个化合物均为新化合物。

鉴定结果如下：

思茅藤苷戊(epigynoside E)为透明晶体，溶于氯仿甲醇混合液(氯仿：甲醇＝1:1)、吡啶等。-98.5(c 0.04,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε):203nm(3.5)；IR(KBr)ν_max 34732902,2831,1733,1717,1458,1375,1329,1047,962cm^–1；HR-ESI-MS m/z 531.3298[M+Na]⁺(calcd.for C₂₉H₄₈O₇Na⁺,531.3298).¹HNMR(CDCl₃,500Mz)和¹³C NMR(CDCl₃,125Mz)见表1；以上数据结合2D NMR分析证实了思茅藤苷戊(epigynoside E)的化学结构式为式Ⅰ所示。

思茅藤苷己(epigynoside F)为白色粉末，溶于氯仿甲醇混合液(氯仿：甲醇＝1:1)、吡啶等。-205.9(c 0.01,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε):203nm(3.8)；IR(KBr)ν_max3429,2933,1632,1517,1379,1179,1097,1036cm^–1；positive-ion HR-ESI-MS m/z547.3245[M+Na]⁺(calcd.for C₂₉H₄₈O₈Na⁺,547.3247)¹H NMR(CDCl₃,500Mz)和¹³C NMR(CDCl₃,125Mz)见表1；以上数据结合2DNMR分析证实了思茅藤苷己(epigynoside F)的化学结构式为式Ⅱ所示。

思茅藤苷庚(epigynoside G)为透明晶体，溶于氯仿甲醇混合液(氯仿：甲醇＝1:1)、吡啶等。-177.7(c 0.05,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε):203nm(3.6)；IR(KBr)ν_max3419,2931,1713,1633,1457,1376,1255,1104,1041,884cm^–1；positive-ion HR-ESI-MS m/z 517.3143[M+Na]⁺(calcd.for C₂₈H₄₆O₇Na⁺,517.3141)¹H NMR(methanol-d₄,600Mz)和¹³CNMR(methanol-d₄,150Mz)见表1；以上数据结合2D NMR分析证实了思茅藤苷己(epigynoside F)的化学结构式为式Ⅲ所示。

以上所述三个孕甾烷糖苷类化合物均为新的天然有机化合物。

表1：孕甾烷糖苷类化合物的¹H NMR和¹³C NMR数据

实施例2：免疫抑制检测试验

(1)脾淋巴细胞悬液的制备

取18～22g的健康BABL/c小鼠放血处死，置于75％酒精中浸泡消毒5分钟，取出，置于无菌托盘中，左侧朝上，在超净台中，用消毒过的镊子夹起腹中部皮毛，作一切口，用另外一套器械剪开腹壁各层，用第三套器械将脾取出，去除脂肪和结缔组织，放入PBS(磷酸盐缓冲液)中，洗去浮血。然后将脾组织移至盛有RPMI 1640不完全培养液的平皿中，用剪刀剪成小块，用无菌注射器芯在200目不锈钢筛网中将脾研碎，用PBS少量多次冲洗，将悬液用移液器转移至15mL离心管中。1000r/min转速离心5min。吸弃上清液，加入3mL红细胞裂解液(Tris-NH₄Cl)混匀，静置2min后加入10mL PBS终止反应，离心(1200rpm,5min)，去上清，沉淀用5mL PBS洗涤两次，同样条件下离心。沉淀用5mL含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养液悬浮；以0.8％台盼兰活细胞拒染法计数，活细胞数不少于95％，加RPMI 1640完全培养液稀释，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL左右。

(2)供试液的制备

精密称取单体化合物2mg，加入DMSO溶解，上样前用PBS稀释至所需浓度，并使得上样后的DMSO终浓度不超过0.1％。

(3)实验分组

正常对照组：100μL脾细胞悬液+10μL RPMI 1640完全培养基+10μLPBS

模型组：100μL脾细胞悬液+10μLConA(终浓度为10μg/mL)+10μLPBS

样品组：100μL脾细胞悬液+10μLConA(终浓度为10μg/mL)+10μL样品

96孔板中，每孔加入淋巴细胞悬液(1×10⁶个/mL)100μL，ConA10μL(终浓度为10μg/mL)，不同浓度试药化合物稀释液10μL(终浓度分别为12.5、25、50μg/mL)，地塞米松也做三个对应的浓度组，正常对照组孔分别用10μL的1640完全培养液(含10％胎牛血清)和10μL的PBS补齐，每个浓度组设4个平行。

(4)培养：置于37℃，5％CO₂培养箱内培养72小时。

(5)CCK-8法测定细胞OD值

培养72小时后，每孔中加入10μL的CCK-8试剂(碧云天)，置于37℃，5％CO₂培养箱内继续培养4小时后，在450nm处测定每孔的吸光值以计算细胞增殖情况，并按下式计算刺激指数(SI)：

SI(刺激指数)＝加有丝分裂原培养物的OD值/不加有丝分裂原培养物的OD值。

(6)数据处理

实验数据OD值采用“平均数±标准差”来表示，数理统计及方差分析工作采用Origin软件完成。

(7)实验结果

表2：思茅藤苷戊对ConA刺激的Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数

本发明式Ⅰ中思茅藤苷戊(epigynoside E)在浓度为12.5、25、50μM时的刺激指数分别为2.56，1.96，1.69；显著性分析表明，中浓度和高浓度组与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。

表3：思茅藤苷己对ConA刺激的Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数

本发明式Ⅱ中思茅藤苷己(epigynoside F)在浓度为12.5、25、50μM时的刺激指数分别为3.37，2.97，1.92；显著性分析表明，高浓度组与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。

表4：思茅藤苷庚对ConA刺激的Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数

本发明式Ⅲ中思茅藤苷庚(epigynoside G)在浓度为12.5、25、50μM时的刺激指数分别为3.23，3.01，1.94；显著性分析表明，高浓度组与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。

阳性对照结果为：

表5：地塞米松对ConA刺激的Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数

地塞米松在浓度为12.5、25、50μM时的刺激指数分别为1.62，1.41，1.21；显著性分析表明，各浓度组与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。

实验结果表明，思茅藤苷戊(epigynoside E)在浓度为25μM时具有免疫抑制活性，思茅藤苷己(epigynosides F)、思茅藤苷庚(epigynosides G)在浓度为50μM时具有免疫抑制活性。

Claims

1.结构式如式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ所示的思茅藤孕甾烷糖苷类化合物：

式Ⅰ：3β,17α,20α-孕甾烷-5(6)-烯-3,17,20-三醇3-O-2′,3′-二甲氧基-6′-去氧-β-D-艾杜糖苷；

式Ⅱ：3β,17α,20α-孕甾烷-5(6)-烯-3,15,17,20-四醇3-O-2′-甲氧基-6′-去氧-β-D-艾杜糖苷；

式Ⅲ：3β,17α,20α-孕甾烷-5(6)-烯-3,17,20-三醇3-O-2,6-2′,3′-二甲氧基-6′-去氧-β-D-艾杜糖苷。

2.权利要求1中所述的思茅藤孕甾烷糖苷类化合物在制备免疫抑制药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：免疫抑制药物为自身免疫性疾病的治疗药物。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：免疫抑制药物为器官移植抗排斥反应的治疗药物。