CN107029249A - 载小檗碱的羧甲基β‑环糊精功能化蒙脱石释药系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种羧甲基β‑环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料，该材料产生的红外光谱在3421cm^‑1,2934cm^‑1,1637cm^‑1,1414cm^‑1,1159cm^‑1,1087cm^‑1,1039cm^‑1,745cm^‑1,613cm^‑1,587cm^‑1左右显示出吸收峰。使用本发明CMCD‑APTES‑MMT超分子网络作为盐酸小檗碱的载体制备的释药系统，盐酸小檗碱在水中分散性和溶解性明显增加，有效提高了盐酸小檗碱的生物利用度，相对于蒙脱石作为载体的载药系统，载药量明显提高，局部释药量大大提高，具有更强的抗菌效果。本发明使CMCD‑APTES‑MMT超分子网络作为盐酸小檗碱的载体制备的释药系统，对细菌具有很强的捕获能力，同时CMCD‑APTES‑MMT超分子网络也能对细菌菌体进行包裹，以加强装载于其中的盐酸小檗碱跟细菌的接触，从而提升盐酸小檗碱的抗菌性能。

Description

载小檗碱的羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石释药系统

技术领域

本发明涉及植物活性成分小檗碱，具体涉及载小檗碱的羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石释药系统。

背景技术

细菌造成的感染是危害人类健康的重要因素之一。在全球范围内，5岁以下因病致死的儿童中，就有15％是由细菌感染引起的腹泻致死，紧随肺炎(18％)之后高居致死率第二位。近一个世纪以来，抗生素药物已经被广泛应用于临床细菌感染的预防和治疗，然而使用抗生素治疗的细菌感染患者中，约有5-25％的患者会出现腹泻、炎症等副作用。除此之外，抗生素滥用使得细菌耐药问题变得日益严重，同时也造成抗生素疗效的大幅降低。现有的抗菌药物已经不能充分满足临床应用的需求，因此开发新的抗菌药物成为大势所趋。

在这个大背景下，开发植物来源的天然抗菌化合物成为了解决现存问题的一大策略。从黄连、刺檗、白毛茛、海胆亚目、黄柏、古山龙等中草药中提取得到的植物活性成分小檗碱，具有较强的抗菌活性，近年来备受药物学家关注。小檗碱属于异喹啉类生物碱，在水中难溶，同时其是细菌多药耐药泵(MDRs)的底物，因此极易被MDRs排出，以致难以进入细胞，所以直接用小檗碱杀菌，生物利用度较低。小檗碱结构式如下：

蒙脱石(MMT)，是具有层状结构的硅酸盐，化学式为[(Na,Ca)_0.33(Al,Mg)₂(Si₄O₁₀)(OH)₂·nH₂O]，由一个八面体构和两个四面体片层所组成。蒙脱石具有较大的表面积，较强的吸附能力，较高的阳离子交换容量以及更大的层空间以容纳有机药物分子。经查，目前未有蒙脱石装载小檗碱的抗菌研究报道。在研究蒙脱石载小檗碱释药系统过程中，发明人发现载药系统中的蒙脱石微粒容易聚集沉淀，从而影响活性成分小檗碱的释放与吸收。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明的目的在于提供一种羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石(CMCD-APTES-MMT)超分子网络材料。

除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。

本发明的目的是这样实现的：

一种羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料，其特征在于：产生的红外光谱在3421cm^-1,2934cm^-1,1637cm^-1,1414cm^-1,1159cm^-1,1087cm^-1,1039cm^-1,745cm^-1,613cm^-1,587cm^-1左右显示出吸收峰。

上述羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料，其特征在于：在衍射角度2θ为5.39±0.2°、8.72±0.2°处有衍射峰。

上述羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料，其特征在于：在热重分析过程中，90±2℃失去水分子，在411±2℃受热分解。

根据本发明的第二方面，本发明的目的在于提供上述羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料的制备方法。

本发明羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料的制备方法，其特征在于：采用β-环糊精在碱性条件下(如氢氧化钠)与一氯乙酸反应合成羧甲基环糊精；对蒙脱石进行硅烷化，得到三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脱石；在室温条件下通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺催化，使羧甲基环糊精与三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脱石反应，得到羧甲基环糊精功能化的蒙脱石材料。

超分子是指由两种或两种以上分子通过分子间相互作用结合在一起的一类复杂的、有组织的聚集体，它们显示明确的微观结构并保持其完整性，并具有独特的理化特征。分子间作用力通常包括氢键，配位键，静电作用，疏水键等。本发明合成CMCD-APTES-MMT作为自组装单元。CMCD-APTES-MMT超分子网状自组装体的形成，主要依赖于两种分子间氢键：一种是一分子组装单元中蒙脱石表面硅氧四面体中的氧原子与另一组装单元中环糊精的羟基之间形成的氢键；另一种是一分子组装单元中的羰基氧与另一组装单元中酰胺键上的氢形成的氢键。两种氢键的协同作用促使CMCD-APTES-MMT发生自组装形成超分子网状结构，并以此作为装载药物的新型载体材料。与蒙脱石或者环糊精相比，该材料是一个多宿主系统，蒙脱石和环糊精的特性兼而有之，因此具有有机-无机杂化材料的优势。

根据本发明的第三方面，本发明的目的在于提供一种载小檗碱的羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石释药系统的制备方法，该方法使用上述羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料装载小檗碱制备的释药系统，对革兰阴性菌及革兰阳性菌的抑制作用远高于游离药物。

本发明载小檗碱的羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石释药系统的制备方法，其特征在于，采用以下步骤：

将盐酸小檗碱用超纯水溶解得到浓度为50μg/mL～350μg/mL的小檗碱水溶液，按照小檗碱与羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料质量比为5～35：100加入羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料，在温度为30-80℃、pH为2-11的条件下，反应0.5-6小时，将得到的混悬液离心、微孔滤膜过滤，收集上清液，用紫外分光光度计于345nm波长处测定未被装载的游离盐酸小檗碱的含量；然后按以下公式计算载药量

优选的，上述小檗碱水溶液的浓度为250μg/mL～350μg/mL。

优选的，上述反应时间为3-6小时。

优选的，上述反应pH为9-11。

优选的，上述反应温度为50-80℃。

本发明载小檗碱的羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石释药系统的制备方法，其特征在于，采用以下步骤：

(1)、羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料的制备；

采用β-环糊精在碱性条件下(如氢氧化钠)与一氯乙酸反应合成羧甲基环糊精；对蒙脱石进行硅烷化，得到三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脱石；在室温条件下通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺催化，使羧甲基环糊精与三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脱石反应，得到羧甲基环糊精功能化的蒙脱石材料；

(2)、载小檗碱的羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石释药系统的制备

将盐酸小檗碱用超纯水溶解得到浓度为250μg/mL～350μg/mL的小檗碱水溶液，按照小檗碱与羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料质量比为25～35：100加入羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料，在温度为50-80℃、pH为9-11的条件下，反应3-6小时，将得到的混悬液离心、用0.45μm的微孔滤膜过滤，收集上清液，用紫外分光光度计于345nm波长处测定未被装载的游离盐酸小檗碱的含量；然后按以下公式计算载药量

有益效果：

本发明提供一种羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石(CMCD-APTES-MMT)超分子网络材料，该材料产生的红外光谱在3421cm^-1,2934cm^-1,1637cm^-1,1414cm^-1,1159cm^-1,1087cm^-1,1039cm^-1,745cm^-1,613cm^-1,587cm^-1左右显示出吸收峰；相较蒙脱石(MMT)和硅烷化蒙脱石(APTES-MMT)，本发明CMCD-APTES-MMT在2934cm^-1附近均出现了新的吸收峰，该峰是属于-CH₂的伸缩振动峰，这说明APTES成功嫁接于MMT。热重分析曲线显示，本发明CMCD-APTES-MMT超分子网络材料分别在90℃和411℃出现两次明显失重，90℃时发生的失重是由于残存在材料上的水分的蒸发，而411℃时的失重则是由嫁接于其上的APTES和CMCD基团的热分解所致。粉末衍射显示，本发明CMCD-APTES-MMT超分子网络材料在2θ＝8.67°处出现新的衍射峰，而27.57°、28.43°(2θ)处的衍射峰消失，说明相比MMT和APTES-MMT，本发明CMCD-APTES-MMT超分子网络材料的晶体结构发生了变化；并且，MMT d₀₀₁特征峰的2θ＝6.97°、d＝1.26nm，APTES-MMT的d₀₀₁峰2θ＝6.11°、d＝1.47nm，而CMCD-APTES-MMT的d₀₀₁峰2θ＝5.39°，d＝1.64nm，d₀₀₁峰左移以及层空间的扩大，都说明CMCD基团不仅嫁接于MMT的表面，还同时层插于MMT的层间。本发明CMCD-APTES-MMT超分子网络材料经扫描电镜显示，材料呈现不规则的网络状，网络密度随材料浓度递增，当材料浓度达到1.2mg/mL时，呈现单层疏松的网络初始形态；当材料浓度达到1.8mg/mL时致密网络结构形成，其平均孔径小于1μm。

游离盐酸小檗碱抗菌活性弱的主要原因是其水溶性差以及细菌多药耐药泵对其的外排作用，使其难以进入细菌细胞内发挥抗菌作用。本发明使用CMCD-APTES-MMT超分子网络作为盐酸小檗碱的载体制备的释药系统，盐酸小檗碱在水中分散性和溶解性明显增加，有效提高了盐酸小檗碱的生物利用度；相对于蒙脱石作为载体的载药系统，载药量明显提高，局部释药量大大提高，具有更强的抗菌效果。本发明使CMCD-APTES-MMT超分子网络作为盐酸小檗碱的载体制备的释药系统，对细菌具有很强的捕获能力，同时CMCD-APTES-MMT超分子网络也能对细菌菌体进行包裹，以加强装载于其中的盐酸小檗碱跟细菌的接触，从而提升盐酸小檗碱的抗菌性能。体外抑菌试验结果表明，本发明使用CMCD-APTES-MMT超分子网络作为盐酸小檗碱的载体制备的释药系统对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的抑制作用远高于游离药物小檗碱，并且抑菌性能呈现浓度依赖性和长效性，本发明使用CMCD-APTES-MMT超分子网络材料作为盐酸小檗碱的载体制备的释药系统对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别可达到98.45％和97.81％。

附图说明

图1是实施例1制备的CMCD-APTES-MMT超分子网络材料红外分析图谱图；

图2是实施例1制备的CMCD-APTES-MMT超分子网络材料热重分析图；

图3是实施例1制备的CMCD-APTES-MMT超分子网络材料X射线粉末衍射图谱；

图4是实施例1制备的CMCD-APTES-MMT超分子网络材料场发射扫描电镜图，其中A为低浓度稀疏形态的CMCD–APTES–MMT超分子网络材料，B为A图的局部放大，C为高浓度致密形态的CMCD–APTES–MMT超分子网络材料，D为C图的局部放大；

图5是实施例3中反应时间对CMCD-APTES-MMT超分子网络材料载药率的影响图；

图6是实施例3中BBH初始浓度对CMCD-APTES-MMT超分子网络材料载药率的影响图；

图7是实施例3中温度对CMCD-APTES-MMT超分子网络材料载药率的影响图；

图8是实施例3中pH对CMCD-APTES-MMT超分子网络材料载药率的影响图；

图9是实施例3中模拟生理条件(pH 7.4,37℃)下盐酸小檗碱的释放曲线图；

图10是实施例3CMCD-APTES-MMT超分子网络材料在水溶性介质中的溶胀行为图，其中a为第1天，b为第3天，c为第5天；

图11是实施例4场发射扫描电镜图，其中(a)金葡菌原菌，(b)大肠杆菌原菌，(c)载药CMCD-APTES-MMT超分子网络材料与金葡菌接触12小时，(d)载药CMCD-APTES-MMT超分子网络材料与大肠杆菌接触12小时(e)，载药CMCD-APTES-MMT超分子网络材料与金葡菌接触24小时，(f)载药

CMCD-APTES-MMT超分子网络材料与大肠杆菌接触24小时。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

原料与试剂

本发明所有原料及试剂均为市售产品。其中盐酸小檗碱标准品(阿拉丁试剂)；钠基蒙脱石(浙江丰虹新材料股份有限公司，型号为CEC 80mmol/100g)；β-环糊精(国药集团化学试剂有限公司)；三氨丙基三乙氧基硅烷(Sigma)；EDC(上海麦克林生化科技有限公司)；monochloroacetic acid(上海麦克林生化科技有限公司)；N-Hydroxysuccinimide(上海麦克林生化科技有限公司)；十六烷基溴化铵(Sigma)；大肠杆菌冻干菌粉(苏州北纳创联生物技术有限公司，编号CMCC(B)44102)；金黄色葡萄球菌冻干菌粉(苏州北纳创联生物技术有限公司，编号CMCC(B)26003)；LB肉汤培养基(青岛日水生物技术有限公司)；LB琼脂培养基(青岛日水生物技术有限公司)。

实施例1羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石材料的制备

羧甲基环糊精(CMCD)的制备

称取9.3g氢氧化钠于圆底烧瓶中，加入37mL去离子水置于冰水浴中搅拌至完全溶解。再加入10gβ-环糊精搅拌溶解。配制27mL 16.3％的一氯乙酸水溶液，备用。将上述圆底烧瓶置于60℃的恒温水浴锅中，缓慢滴加入一氯乙酸水溶液(20分钟内加完)，待反应5小时之后，将反应溶液倒入大烧杯中，冷却后边搅拌边滴加入浓盐酸至ph试纸检测为中性。加入大量无水甲醇于烧杯中，快速搅拌，可见白色沉淀析出。抽滤，收集白色沉淀于烧杯中，加入少量去离子水(约5mL)使沉淀完全溶解于水中即可，复加入无水甲醇(约800mL)，使白色沉淀再次析出，抽滤用甲醇洗涤5次，收集白色沉淀，此白色沉淀即为羧甲基环糊精。

硅烷化蒙脱石(APTES-MMT)的制备

配制200mL乙醇-水溶液(体积比：75/25)于圆底烧瓶中，称取2.5g蒙脱石，分散于200mL乙醇-水溶液中，磁力搅拌30分钟至分散均匀。最后加入2.1mL三氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，水浴加热至80℃，回流反应8小时。反应结束后，冷却至室温，过滤，用水醇混合溶液洗涤过滤5次，清除未反应完的APTES，至滤液茚三酮检测不显色为止(茚三酮可与伯胺基反应显粉色)。

CMCD-APTES-MMT超分子网络材料的制备

称取0.7g APTES-MMT分散于10mL pH5.8的PBS(磷酸缓冲液)中，备用。称取1.193gCMCD和0.115g NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)于40mL PBS(pH＝5.8)中，磁力搅拌30分钟，再加入0.192g EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)活化羧基，活化持续30分钟。活化完毕后，然后加入10mL APTES-MMT混悬液。室温下，磁力搅拌24小时。反应完后，用去离子水洗涤、抽滤，收集产物，置于真空干燥箱中50℃干燥过夜，即得。

红外光谱分析

取适量MMT、CMCD、APTES-MMT、CMCD-APTES-MMT样品以及光谱纯KBr，置于80℃烘箱中干燥24小时，备用。采用干燥充分的KBr压片制备待测样品，于波数4000-400cm^-1范围内进行红外扫描。红外光谱如图1所示，本发明CMCD-APTES-MMT超分子网络材料，产生的红外光谱在3421cm^-1,2934cm^-1,1637cm^-1,1414cm^-1,1159cm^-1,1087cm^-1,1039cm^-1,745cm^-1,613cm^-1,587cm^-1左右显示出吸收峰。相较MMT，APTES-MMT和CMCD-APTES-MMT在2934cm^-1附近均出现了新的吸收峰，该峰是属于-CH₂的伸缩振动峰，这说明APTES成功嫁接于MMT。同时，本发明CMCD-APTES-MMT在587、613、745cm^–1处出现了典型的β-环糊精环结构的振动吸收峰，以及在1159cm^–1出现C–O–C伸缩振动和O–H弯曲振动峰；1039和1037cm^–1的吸收峰均是由C–O、C–C伸缩振动和O–H弯曲振动引起的；1414cm^–1的吸收峰是C–H和O–H的弯曲振动峰；3421cm^-1是来自于MMT表面以及环糊精上-OH的伸缩振动峰；而1637cm^–1的酰胺键伸缩振动峰则确证了CMCD和APTES-MMT之间缩合反应的发生，CMCD通过酰胺键成功嫁接于APTE-MMT之上。

热重分析

分别称取约8mg MMT、CMCD、APTES-MMT、CMCD-APTES-MMT样品，在氩气环境下，均以15℃/min的加热速率，由30℃升温至800℃。热重分析曲线如图2所示，在30-800℃范围内，MMT发生两次明显失重，第一次是在89℃时失重4.5％，这一部分的重量损失是由于样品中残留水分的蒸发。第二次在622℃失重3.4％。则是由于MMT本身的解离。而APTES-MMT则分别在111、494℃失重明显，111℃的失重同样是因为残留水分的蒸发，而494℃的失重则源自于嫁接在MMT上的APTES基团的分解，失重比率约为6.3％。本发明CMCD-APTES-MMT超分子网络材料的TGA曲线显示，其分别在90℃和411℃出现两次明显失重，90℃时发生的失重是由于残存在材料上的水分的蒸发，而411℃时的失重则是由嫁接于其上的APTES和CMCD基团的热分解所致；其在128-411℃高达16.6％的质量损失。从以上数据可以计算出，CMCD-APTES-MMT中CMCD基团的质量占比约为6.9％。

X射线粉末衍射分析

采用Cu K_α辐射功率40kV×200mA，分别测定MMT、APTES-MMT和CMCD-APTES-MMT样品的晶体结构。如图3所示，比较三个样品的衍射图谱，CMCD-APTES-MMT在2θ＝8.67°处出现新的衍射峰，而27.57°、28.43°(2θ)处的衍射峰消失，说明CMCD-APTES-MMT的晶体结构相比MMT和APTES-MMT发生了变化。并且，MMT d₀₀₁特征峰的2θ＝6.97°、d＝1.26nm，APTES-MMT的d₀₀₁峰2θ＝6.11°、d＝1.47nm，而CMCD-APTES-MMT的d₀₀₁峰2θ＝5.39°，d＝1.64nm，d₀₀₁峰左移以及层空间的扩大，都说明CMCD基团不仅嫁接于MMT的表面，还同时层插于MMT的层间。

场发射扫描电镜分析

称取18mg CMCD-APTES-MMT于圆底烧瓶中，加入10mL去离子水，磁力搅拌30分钟得到均一的CMCD-APTES-MMT混悬液。用滴管取一滴混悬液样品，置于单晶硅片上，密封好后室温干燥24小时，对干燥后样品进行喷金，已备观察。场发射扫描电镜分析如图4所示，A为低浓度(1.2mg/mL)CMCD-APTES-MMT形成的结构松散的网络材料，从A图的局部放大(图B)可看出，在致密的超分子网络形成前，自组装体刚开始形成网络的最初形态，随着CMCD-APTES-MMT浓度提高(1.8mg/mL)，CMCD-APTES-MMT超分子网络最终形成(图C、D)。根据场发射扫描电镜观察得知，本发明CMCD-APTES-MMT超分子材料呈现不规则的网络状，网络密度随材料浓度递增，当材料浓度达到1.2mg/mL时，呈现单层疏松的网络初始形态；当材料浓度达到1.8mg/mL时致密网络结构形成，其平均孔径小于1μm。

实施例2盐酸小檗碱紫外分光光度法含量测定方法的建立

盐酸小檗碱(BBH)紫外吸收波长的确定

精密称取105℃干燥至恒重的盐酸小檗碱标准品18mg，用超纯水完全溶解后，定容于25mL容量瓶中，得盐酸小檗碱储备液。精密吸取1mL盐酸小檗碱储备液于25mL容量瓶中定容，最终制得浓度为29μg/mL的盐酸小檗碱溶液。用紫外-可见分光光度计在200-600nm范围内扫描测定吸光度。结果显示，盐酸小檗碱在228、263、345nm三个波长处均有最大吸收，为了避免200nm低波长附近可能存在的杂质干扰，故选择较高波长处345nm作为检测波长。

标准曲线的绘制

称取7mg BBH标准品，加入适量超纯水，加热溶解后，置于100mL容量瓶中，超纯水定容。制得浓度为70μg/mL的BBH储备液。分别精密量取1,1.5,2,2.5,3,3.5,4mL的BBH储备液于25mL容量瓶中，均用超纯水定容。以超纯水为空白对照，采用紫外分光光度法于345nm波长处测定吸光度。由表1可知，盐酸小檗碱在2.8-11.2μg/mL浓度范围内，浓度与吸光度呈良好线性关系，回归方程：A＝0.0599C-0.0078，r＝0.9995。

表1盐酸小檗碱标准曲线测定结果(n＝7)

精密度试验

精密吸取盐酸小檗碱标准品储备液，分别配置成3、7、11μg/mL三种浓度的盐酸小檗碱溶液。三份样品于1天内，间隔相同时间段重复测定5次吸光度，考查日内精密度；三份样品每天测一次吸光度，连续测定5天，考查日间精密度。由表2可知，高中低三中浓度标准品溶液的日内和日间RSD值均小于1％，说明仪器精密度良好，可满足紫外测定要求。

表2精密度试验结果(n＝5)

实施例3CMCD-APTES-MMT超分子网络材料载药性能考查实验

根据下列公式计算CMCD-APTES-MMT的载药率：

载药时间对载药率的影响

称取50mg盐酸小檗碱于圆底烧瓶中，加入100mL超纯水加热溶解，称取100mgCMCD-APTES-MMT均匀分散上述药物溶液中，持续搅拌，并于选定时间点：0.5、1、2、3、4、5、6小时精密吸取混悬液，于12,000rpm离心5分钟，收集上清液，并用0.45μm微孔滤膜过滤上清液去除悬浮粒子。采用紫外分光光度法于345nm波长处测定上清液中游离盐酸小檗碱的含量。所有样品一式三份，平行试验。由图5可知，载药0.5小时载药率为3.01％；载药1小时载药率为5.67％；载药2小时载药率为12.11％；载药3小时载药率为15.02％；载药4小时载药率为15.56％；载药5小时载药率为17.23％。5小时内CMCD-APTES-MMT的载药率随着载药时间的增加而提高，因此本发明选定5小时作为最优载药时间进行后续试验。

初始药物浓度对载药率的影响

分别称取5、10、15、20、25、30、35mg盐酸小檗碱于圆底烧瓶中，再分别加入100mL超纯水加热溶解。称取100mg CMCD-APTES-MMT分别加入上述7个浓度的盐酸小檗碱溶液中，于室温持续搅拌5小时。反应结束后，同上法收集上清液，并测定上清液中游离盐酸小檗碱的含量。由图6可知，当盐酸小檗碱的初始浓度为50μg/mL时，CMCD-APTES-MMT的载药率为5.69％；初始浓度为100μg/mL时，载药率为7.33％；初始浓度为150μg/mL时，载药率为10.68％；初始浓度为200μg/mL时，载药率为13.23％；初始浓度为250μg/mL时，载药率为16.41％；初始浓度为300μg/mL时，载药率为18.73％。可见随着初始浓度的增加，CMCD-APTES-MMT的载药率也相应提高，直到初始浓度增加到350μg/mL时，载药率降为18.10％，因此选定初始浓度300μg/mL进行后续试验。

温度对载药率的影响

称取30mg盐酸小檗碱加热溶解于100mL超纯水，再加入100mg CMCD-APTES-MMT，分别于30、40、50、60、70、80℃条件下持续搅拌5小时，同上法测定游离BBH含量。由图7可知，CMCD-APTES-MMT的载药率随着温度增加而提高，到50℃时达到27.8％，在此之后继续升高温度，载药率提高不明显。因此从节能方面考虑，选择50℃作为最优载药温度。

pH对载药率的影响

称取适量0.1M KH₂PO₄溶解于超纯水中，分别加入不同量的0.1M HCL和0.1M NaOH，采用pH计调节pH，制得pH2-11系列缓冲液。分别加入30mg BBH加热溶解，再分别加入100mgCMCD-APTES-MMT，于50℃持续搅拌5小时后，用紫外分光光度计测定游离药物含量，依公式计算不同pH条件下CMCD-APTES-MMT的载药率。如图8可知，随着pH值的升高，载药率也呈现上升趋势，在pH＝10时，载药率达到最大值27.8％。CMCD-APTES-MMT超分子网络材料体外释放度考查

称取200mg载药CMCD-APTES-MMT于透析袋中(截留分子量8,000–12,000Da))，加入2mL of PBS(0.1M,pH 7.4)后封紧袋口。将透析袋置于装有100mL PBS(0.1M,pH 7.4)的锥形瓶中，将锥形瓶放于37±0.5℃的恒温振荡箱中以150rpm持续振摇，并在选定时间间隔内，于溶出介质取样4mL，并补充入新的等量的PBS溶液。采用紫外分光光度计于345nm处，测定溶出介质中BBH含量。载药超分子网络材料历时5天的体外模拟释放试验可看出(图9)，载体中盐酸小檗碱的释放主要分两步，在前12小时的释放度可达49.3％，之后释放减慢展现出缓释特征，5天内总释放率为63.7％。

本发明CMCD-APTES-MMT超分子网络载体中盐酸小檗碱的释放行为受多种因素影响，通场发射扫描电镜观察可知，蒙脱石材料本身在水中极易发生溶胀(图10)，随着溶胀的发生，装载于蒙脱石层间的盐酸小檗碱分子逐步释放出来，因此溶胀的程度可对释放行为产生影响；蒙脱石的阳离子交换属性，使溶出介质中的离子可与装载于蒙脱石层间的阳离子化合物放生置换，从而影响释放。

本发明通过温和、环保的反应条件和试剂，首次成功合成了CMCD-APTES-MMT超分子网络材料。经体外载药、释放试验证明，CMCD-APTES-MMT超分子网络对模型药物盐酸小檗碱有较高的装载率，在模拟生理环境条件下，载药CMCD-APTES-MMT超分子网络具有长效缓释性能。

实施例4本发明释药系统的体外抗菌性能实验

菌悬液的制备

LB培养基的制备

称取1.25g LB肉汤培养基粉末于锥形瓶中，加入50mL PBS加热溶解制得LB肉汤培养基备用。称取4g LB琼脂培养基加入100mL PBS加热溶解后，在未冷却前与肉汤培养基一起放入高压灭菌锅于121℃灭菌30分钟。取灭完菌的琼脂培养，在琼脂未凝固前快速倒入一次性无菌培养皿(约15mL)，待琼脂凝固后，倒置备用。

菌种的复苏与传代

取适量冻干菌粉于肉汤培养基中，将锥形瓶置于37℃恒温振荡器中，以150rpm培育24小时，得1代菌。用接种环沾取含有1代菌的肉汤，于琼脂平板上划线接种。将琼脂平板倒置放于生化培养箱中37℃培养24小时。得第2代菌。在琼脂平板上，挑取2个菌落，再接种于50mL肉汤培养基中。经37℃振荡培育24小时，得浓度约为10⁷CFU/mL的第3代菌的菌悬液，用于后续的抗菌试验。

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌存活时限考查

本发明首先对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)在有限营养条件下的生存时限进行了实验。分别取浓度为10⁷CFU/mL的两种菌菌悬液0.1mL于锥形瓶中，再分别加入4mL肉汤。将锥形瓶置于37℃恒温振荡器中100rpm培育5天，每天取样0.1mL采用平板稀释法观察活菌数，考查2种菌在5天内的存活情况。分别含有大肠杆菌和金葡菌菌悬的肉汤培养基，经过5天的培育，每天取样取涂布平板，于24小时后观察菌落数。结果表明，在1-3天，两种的菌的活菌数差异不大，但在培育第4天后，肉汤中活菌数开始明显降低。说明在有限的营养条件下，大肠杆菌和金葡菌在3天内的存活度不受影响，但在4天后细菌由于得不到充足的营养供给和自身有毒物质的排出，导致细菌死亡。因此为了排除条件因素的干扰，真实反映载药材料抗菌活性数据的可靠性，后续所有抗菌试验的培育时间都控制在3天以内。

载药CMCD-APTES-MMT超分子网络抗菌活性考查

分别称取BBH 0.6mg和2mg；载药CMCD-APTES-MMT(含600μg BBH)2mg和7mg，于超净台内紫外照射30分钟后，分别分散于1mL灭菌PBS中。再分别加入装有4mL菌悬液(10⁷CFU/mL)的锥形瓶中，使最终S.aureus菌悬液中BBH含量为150μg/mL，E.coli菌悬液中BBH含量为400μg/mL。37℃振荡培养24小时。各取0.5mL培育后的菌悬液，适当稀释后，再吸取0.1mL稀释的菌液于琼脂平板上，均匀涂布，静置10分钟，待菌液被琼脂充分吸收后倒置平板于37℃生化培养箱，培育24小时。计算菌落数。通过比较琼脂平板上的菌落数，可明显看出无论是对大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌，载药CMCD-APTES-MMT的抗菌活性都明显高于游离的BBH。实验结果显示，载药CMCD-APTES-MMT分别于金葡菌、大肠杆菌一起培育24小时之后，活菌浓度从初始的10⁷CFU/mL分别下降到10¹CFU/mL(金葡菌)和10²CFU/mL(大肠杆菌)，而经游离BBH处理的菌悬液中的活菌数则为10⁴和10⁷。因此，采用CMCD-APTES-MMT超分子网络材料作为BBH载体，极大的提高了BBH的抗菌活性。

载药CMCD-APTES-MMT超分子网络浓度对抗菌活性的影响

稀释平板计数法观测活菌数

分别称取适量载药CMCD-APTES-MMT，紫外线照射灭菌后，分散于PBS中，得到50-600μg/mL不同浓度的载药CMCD-APTES-MMT混悬液，再分别加入装有10⁷CFU/mL E.coli和S.aureus菌悬液的锥形瓶中，于37℃振摇培育24小时。以不含药的PBS作为空白。培育完毕后，于各锥形瓶中取样0.5mL，适当稀释后，取0.1mL涂布平板，倒置培育24小时后计算菌落数并拍照。结果显示，载药CMCD-APTES-MMT对金葡菌和大肠杆菌的抑制作用均呈现出浓度依赖的特性。当载药CMCD-APTES-MMT浓度达到600μg/mL时，其对大肠杆菌的抑制率达到91.57±2.11％；当载药CMCD-APTES-MMT浓度达到250μg/mL时，其对金葡菌的抑制率则达到93.9±1.35％。

荧光显微镜观测细菌胞内盐酸小檗碱浓度

将浓度为50-600μg/mL的载药超分子载体分别加入菌浓度为10⁷CFU/mL的LB肉汤中，经过37℃，24小时培育后，分别取样，将载体肉汤混悬液以500rpm离心10分钟，除去载体材料，收集上清液，再于4000rpm离心20分钟。收集菌体，用PBS重新离心3次，再复悬于超纯水中已备荧光观察。荧光显微镜选用激发波长355nm，发射波长517nm。由于小檗碱自身具有的荧光性，因此可采用荧光显微镜来观察细菌对盐酸小檗碱的吸收。结果显示，随着载药CMCD-APTES-MMT浓度的提高，盐酸小檗碱进入细菌的量也逐渐增多，因此细菌的荧光强度逐渐增强。荧光显色直观的印证了载药CMCD-APTES-MMT浓度依赖的抗菌活性。

载药CMCD-APTES-MMT超分子网络长效抑菌性能考查

将浓度为50-600μg/mL的载药超分子载体分别分散于1mL of PBS中，再将混悬液分别加入4mL菌液浓度为10⁷CFU/mL的肉汤中。空白组的含菌肉汤只加入PBS。上述样品全部于37℃，100rpm振摇培育，分别于4、8、12、18、24、36、48和72小时取样，采用紫外分光光度法于600nm波长处测定光密度值。结果显示，在3天内选定的时段对经载药CMCD-APTES-MMT处理的菌悬液的光密度进行了检测，随着载药CMCD-APTES-MMT浓度的增加，光密度值明显降低。在处理三天后，浓度为600μg/mL的载药CMCD-APTES-MMT对大肠杆菌的抑制率达到98.45％；浓度为250μg/mL的载药CMCD-APTES-MMT对金黄色葡萄球菌的抑制率达97.81％。

通过场发射扫描电镜观察，载药CMCD-APTES-MMT超分子网络可对细菌菌体进行包裹，从而加强了盐酸小檗碱与细菌之间的接触。如图11，在载药CMCD-APTES-MMT超分子网络与金葡菌和大肠杆菌分别接触24小时之后，材料对菌体实现了完全的包裹，并使菌体发生了扭曲变形。装载盐酸小檗碱的CMCD-APTES-MMT超分子网络的体外抑菌试验结果表明，其对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的的抑制作用远高于游离药物，并且抑菌性能呈现浓度依赖性和长效性，在本发明中载药CMCD-APTES-MMT超分子网络对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别可达到98.45％和97.81％。

材料毒性考查

分别称取与装载50-600μg/mL BBH等量的不含药的CMCD-APTES-MMT载体材料，分别加入菌液浓度为10⁷CFU/mL的肉汤中，于37℃真要培育24小时。采用稀释平板计数法计算培育后的活菌数。结果显示，经过37℃，72小时的培育，在50-600μg/mL剂量范围内，空白材料对细菌的生长，几乎没有抑制作用，因此CMCD-APTES-MMT网络材料是安全可靠的。

在本发明中，由CMCD-APTES-MMT自组装而形成的超分子网络首次被合成并对其作为抗菌药物载体的各项性能进行了体外评估。CMCD-APTES-MMT超分子网络中，蒙脱石和环糊精可同时作为药物载体，装载模型药物盐酸小檗碱，因此CMCD-APTES-MMT超分子网络相比单一的蒙脱石材料，载药率得到了极大提升，在体外最优条件下载药率可达27.8％。载药率的提高使得在药物释放的过程中，局部的药物浓度也相对增加，因此作用于细菌的药物的浓度提高，抗菌作用增强。通过体外抑菌试验也可发现，游离药物在抑制大肠杆菌生长时，所需的药物浓度大大高于抑制金黄色葡萄球菌所需药物，这主要是由于革兰氏阴性菌的细胞外层有一层特殊的外膜结构，阻碍了药物的进入。虽然载药CMCD-APTES-MMT超分子网络对抗大肠杆菌所需浓度也高于金黄色葡萄球菌，但相比游离药物，载药CMCD-APTES-MMT超分子网络对抑制大肠杆菌的最小抑菌浓度有明显降低。

Claims (10)

1.一种羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料，其特征在于：产生的红外光谱在3421cm^-1, 2934cm^-1, 1637cm^-1, 1414cm^-1, 1159cm^-1, 1087cm^-1, 1039cm^-1, 745cm^-1,613cm^-1, 587cm^-1显示出吸收峰。

2.如权利要求1所述羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料，其特征在于：在衍射角度2θ为5.39±0.2°、8.72±0.2°处有衍射峰。

3.如权利要求1或2所述羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料，其特征在于：在热重分析过程中，90±2℃失去水分子，在411±2℃受热分解。

4.如权利要求1-3任一项所述羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料的制备方法，其特征在于：采用β-环糊精在碱性条件下与一氯乙酸反应合成羧甲基环糊精；对蒙脱石进行硅烷化，得到三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脱石；在室温条件下通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺催化，使羧甲基环糊精与三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脱石反应，得到羧甲基环糊精功能化的蒙脱石材料。

5.载小檗碱的羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石释药系统的制备方法，其特征在于，采用以下步骤：将盐酸小檗碱用超纯水溶解得到浓度为50µg/mL～350µg/mL的小檗碱水溶液，按照小檗碱与羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料质量比为5～35：100加入羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料，在温度为30-80℃、pH为2-11的条件下，反应0.5-6小时，将得到的混悬液离心、微孔滤膜过滤，收集上清液，用紫外分光光度计于345nm波长处测定未被装载的游离盐酸小檗碱的含量；然后按以下公式计算载药量

。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述小檗碱水溶液的浓度为250µg/mL～350µg/mL。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述反应时间为3-6小时。

8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述反应pH为9-11。

9.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述反应温度为50-80℃。

10.载小檗碱的羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石释药系统的制备方法，其特征在于，采用以下步骤：

（1）、羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料的制备；

β-环糊精在氢氧化钠为催化剂的条件下与一氯乙酸反应合成羧甲基环糊精；对蒙脱石进行硅烷化，得到三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脱石；在室温条件下通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺催化，使羧甲基环糊精与三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脱石反应，得到羧甲基环糊精功能化的蒙脱石材料；

（2）、载小檗碱的羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石释药系统的制备

将盐酸小檗碱用超纯水溶解得到浓度为250µg/mL～350µg/mL的小檗碱水溶液，按照小檗碱与羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料质量比为25～35：100加入羧甲基β-环糊精功能化蒙脱石超分子网络材料，在温度为50-80℃、pH为9-11的条件下，反应3-6小时，将得到的混悬液离心、用0.45µm的微孔滤膜过滤，收集上清液，用紫外分光光度计于345nm波长处测定未被装载的游离盐酸小檗碱的含量；然后按以下公式计算载药量

。