CN107022015A

CN107022015A - 马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN107022015A
Application number: CN201710289176.7A
Authority: CN
Inventors: 郭强; 孟林; 毛培春; 田小霞
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2017-08-08
Anticipated expiration: 2037-04-27
Also published as: CN107022015B

Abstract

本发明公开了马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2及其编码基因与应用。本发明首次克隆获得马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2的编码基因(SEQ ID NO:1)，基因IlHMA2可用于增强植物对镉的耐受性与富集能力或提高植物体内镉的转运能力，进而提高植物对土壤镉污染的修复效率。利用基因工程技术制备得到具有耐镉性与富集能力强的转基因植物，使其可以在镉污染环境中生长，为培育高效镉富集转基因植物提供新的思路，在提高土壤镉污染修复效率与改善生态环境方面具有重要的应用前景，将为重金属污染土壤的修复提供新的途径和技术支撑。

Description

马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体地说，涉及马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2及其编码基因与应用。

背景技术

随着我国工农业的快速发展，土壤重金属污染问题日益加剧。其中，与其它重金属元素相比，镉(Cd)更易溶于水，具有极强的生物毒性(Guo et al.2013)。归其原因是土壤中Cd²⁺极易被植物根系吸收，导致大量的Cd²⁺积累在植物体内,造成产量和品质下降，更为严重的是通过食物链进入人体,对人类的健康构成严重威胁(Clemens，2006；Ueno etal.2010；Takahashi et al.2012)。因此，如何行之有效地控制和减轻镉对环境的污染和危害已成为一个亟待解决的问题。

植物修复技术是利用重金属超积累植物对重金属的吸收能力，将土壤中的重金属富集并转运至植株地上部，以达到降低土壤中重金属含量的目的(Salt et al.1995；Yanget al.2005；王欣，2010；Hanikenneand Nouet，2011)。与传统的物理、化学修复手段相比，植物修复手段具有成本低、对土壤扰动性小、不造成二次污染等优点，是一种能源节约型和环境友好型修复土壤重金属污染的最佳方法(Guo et al.2014)。然而，大多数重金属超积累植物，往往体型较小或呈莲座型生长，而且生长缓慢、生物量低，这严重限制了植物修复效率及其应用。随着分子生物学技术的快速发展，应用基因工程技术将重金属超积累植物耐重金属基因转入到生物量大、生长速率快的植物中提高它们对重金属的耐受性与富集能力，从而提高植物修复效率与实用性。因此对耐重金属基因的研究成为当下热点。

研究表明，重金属ATP酶(Heavy metal P_1B-ATPase)转运蛋白HMA广泛存在于细菌、人及高等植物中，主要负责重金属离子的转运及解毒过程，在维持植物体内重金属离子稳态中起主要作用(Axelsen and Palmgren，1998；Williams and Mills，2005)。其中，HMA2/4在植物体内Cd²⁺长距离运输及解毒中起关键性作用。马蔺又名马莲(IrislacteaPall.var.chinensis(Fisch.)Koidz.)是鸢尾科鸢尾属多年生宿根草本植物，广泛分布于我国北方地区，对镉表现出极强的耐受性和富集能力(Guo et al.2017)。然而，目前有关IlHMA2在马蔺体内Cd²⁺长距离运输及解毒中的作用机制研究尚未见报道。鉴于此，我们从马蔺中克隆得到重金属ATP酶转运蛋白基因IlHMA2，并将其导入到至烟草中，显著增强了烟草对镉的耐受性与富集能力，为培育出高效富集镉特性的转基因植物提供了新思路，在土壤镉污染的修复方面具有广阔的应用前景和实践价值。

发明内容

本发明的目的是提供马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，本发明马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

编码上述蛋白的基因IlHMA2，其核苷酸序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供表达盒、表达载体或克隆载体，其包括包含所述基因IlHMA2的核酸序列。

本发明还提供含有所述基因IlHMA2、或者上述表达盒、表达载体或克隆载体的工程菌、转基因细胞系。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method forPlant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd Edition)。

本发明还提供所述基因IlHMA2在提高植物对镉的耐受性与富集能力或提高植物体内镉的转运能力中的应用。

本发明所述植物包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述单子叶植物为谷类作物、草本能源植物或草坪草。所述双子叶植物为烟草或拟南芥。

本发明进一步提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有所述基因IlHMA2的重组表达载体转化目标植物，筛选转基因植株。

优选地，所述重组表达载体的出发载体为植物双元表达载体pCAMBI3301。

本发明首次克隆获得马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2的编码基因，基因IlHMA2可用于增强植物对镉的耐受性与富集能力或提高植物体内镉的转运能力，进而提高植物对土壤镉污染的修复效率。实验证明，IlHMA2具有与Cd²⁺转运相关的功能，将其转入到烟草中，能显著增强烟草对镉的耐受性与富集能力，从而提高植物的修复效率和实用性。利用基因工程技术制备得到具有耐镉性与富集能力强的转基因植物，使其可以在镉污染环境中生长，为培育高效镉富集转基因植物提供新的思路，在提高土壤镉污染修复效率与改善生态环境方面具有重要的应用前景，将为重金属污染土壤的修复提供新的途径和技术支撑。

附图说明

图1为本发明马蔺IlHMA2与小麦TaHMA2、水稻OsHMA2以及拟南芥AtHMA2氨基酸多重序列比较结果。

图2为本发明实施例3中马蔺IlHMA2基因与其它植物HMA基因的系统进化树分析结果；其中，AhHMA2(鼠耳芥)、AlHMA2(琴叶拟南芥)、AtHMA2/4(拟南芥)、BjHMA4(芥菜)、BrHMA2(芜菁)、BnHMA2/4(欧洲油菜)、CasHMA2/4(亚麻荠)、CcHMA2(克萊门柚)、CisHMA2(橙子)、CrHMA2(荠菜)、CsHMA2/4(黄瓜)、EsHMA2(山嵛菜属)、HvHMA2(大麦)、IlHMA2(马蔺)、MtHMA2(蒺藜苜蓿)、NcHMA4(天蓝遏蓝菜)、ObHMA2(短花药野生稻)、OsHMA2(水稻)、PeHMA2(胡杨)、RcHMA2(蓖麻)、SbHMA2(高粱)、StHMA2(马铃薯)、TaHMA2(小麦)、TcHMA3(可可树)、VvHMA3(葡萄)、ZmHMA2(玉米)。

图3为本发明实施例4中不同浓度镉(CdCl₂·2.5H₂O)处理24h后马蔺地上部和根中IlHMA2基因相对表达水平分析结果。图中每个点均代表平均值±标准误(n＝3)。

图4为本发明实施例5中构建的植物双元表达载体pCAMBI3301-IlHMA2；其中，A为双元表达载体的结构示意图；B为双元表达载体构建酶切检测，M1：DNA Marker DL10000，1：双元表达载体质粒经BglII和BstEII酶切；C为双元表达载体构建PCR检测，M2：DNA MarkerDL5000，2：以双元表达载体质粒为模板的PCR鉴定。

图5为本发明实施例6中转基因烟草植株分子鉴定示意图；其中，A为转基因烟草PCR扩增检测，M3：DNA Marker DL1500，P：阳性对照，WT：野生型，OE1-12：T2代各转基因烟草株系；B为半定量RT-PCR对转基因烟草相对表达水平的检测，WT：野生型，OE1-12：T2代各转基因烟草株系。

图6为本发明实施例7中镉胁迫14d后对野生型(WT)与转基因烟草株系(OE2、OE11)耐受性的影响；其中，A为0mg/L和50mg/LCdCl₂·2.5H₂O胁迫14d后对WT与OE2、OE11转基因烟草株系(A)生长状况、(B)地上部干重与(C)根中干重的影响。图中每个点均代表平均值±标准差(n＝8)，柱上不同字母分别表示野生型与转基因烟草株系间差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a LaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1马蔺重金属ATP酶转运蛋白基因IlHMA2的克隆

将水培培养至8周龄的马蔺幼苗在100mg/L CdCl₂·2.5H₂O的Hoagland营养液中胁迫处理24h，剪取根部经无菌水冲洗后，置于消毒滤纸上吸干水分，称取其鲜根100mg，于液氮中充分研磨，按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒说明书提取总RNA，利用Quawell5000核酸蛋白仪测定浓度，并经1.2％的甲醛变性凝胶电泳检测其RNA完整性，取1μg总RNA，按照TaKaRaPrimeScriptRTase cDNA第一链合成试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA。

根据NCBI数据库已公布的植物重金属ATP酶转运蛋白基因HMA核苷酸序列，通过DNAMAN 8.0软件找出高度保守的区域，并遵循同源性高和简并性低的原则，利用Primer5.0软件设计一对核心简并性引物P1和P2，利用RT-PCR方法获得马蔺HMA基因核心片段，将该片段PCR扩增产物经回收、纯化、加A以及TA克隆测序，序列长度为265bp。

按照Clontech SMARTer RACE试剂盒说明书合成5’-RACE和3’-RACE的方法，分别合成5’-cDNA和3’-cDNA；以马蔺HMA基因核心序列为基础，利用DNAMAN 8.0和Primer 5.0软件分别设计5’-RACE外侧引物P3、巢式引物P4和3’-RACE外侧引物P5、巢式引物P6；SMARTerRACE试剂盒自带外侧引物为UPM、自带内侧引物为NUP；利用RT-PCR方法分别获得马蔺HMA基因5’-RACE和3’-RACE片段，将这些片段PCR扩增产物经回收、纯化、加A以及TA克隆测序，5’-RACE片段序列长度为897bp，3’-RACE片段序列长度为2898bp；最后将以上三个片段拼接得到马蔺HMA基因全长cDNA，序列长度为3538bp(SEQ ID NO:1)，包含2829bp的开放阅读框(ORF)，29bp的5’非翻译区(UTR)和680bp的3’-UTR，编码942个氨基酸(SEQ ID NO:2)。通过Compute pI/Mw程序(http://web.expasy.org/compute_pi/)预测其等电点为8.12，蛋白质分子量为101.5kDa。Blast分析表明，其克隆到的HMA基因与已知植物HMA2基因的同源性达到60％以上，故将其命名为IlHMA2。

引物序列如下：

P1:5’-TCVCTKGTYTGGGCTGGNAC-3’

P2:5’-GTATAASAAGKGCCAAWTTCAT-3’

P3:5’-ATCACAGCCACACCAGCTGCTATGA-3’

P4:5’-CCATTCTAGCCACAGCAGAATCCT-3’

P5:5’-GGCGGTCTCTGTTGGTTTGTATCC-3’

P6:5’-GGGACGGGTCAAGTTGTGGAT-3’

UPM:

Long(0.4μM):

5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

Short(2μM):5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’

NUP:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

实施例2马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2结构特征的预测分析

运用TMpred程序(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)对马蔺IlHMA2的跨膜区进行预测，IlHMA2具有8个跨膜区(TM1-TM8)。通过NCBI网站blast比对IlHMA2与小麦、水稻和拟南芥植物的HMA2蛋白同源性分别为68％、66％和55％，并对其IlHMA2蛋白进行功能预测，结果显示含有重金属P_1B-ATP酶特有的GICCPSE、CPC、DKTGT、HP以及GDGMNDAPAL基序(图1)。其中，N端含的有金属结合域的基序为GICCPSE，属于金属相关调节的功能域；CPC位点负责金属离子传导、DKTGT是磷酸化结合位点起到酶的磷酸化作用；HP位点涉及金属离子的易位；GDGMNDAPAL是ATP结合域，负责能量转导。进一步利用DNAMAN8.0软件对IlHMA2与小麦TaHMA2、水稻OsHMA2和拟南芥AtHMA2的氨基酸序列多重比较，发现马蔺HMA2蛋白功能的结构域与这些植物高度保守(图1)。因此，马蔺IlHMA2属于重金属ATP酶转运蛋白。

实施例3马蔺重金属ATP酶转运蛋白基因IlHMA2的系统进化树分析

为了分析马蔺IlHMA2基因与其它植物HMA基因的亲缘关系，利用MEGA 6.0软件对其他植物(鼠耳芥AhHMA2、琴叶拟南芥AlHMA2、拟南芥AtHMA2/4、芥菜BjHMA4、芜菁BrHMA2、欧洲油菜BnHMA2/4、亚麻荠CasHMA2/4、克萊门柚CcHMA2、橙子CisHMA2、荠菜CrHMA2、黄瓜CsHMA2/4、山嵛菜属EsHMA2、大麦HvHMA2、马蔺IlHMA2、蒺藜苜蓿MtHMA2、天蓝遏蓝菜NcHMA4、短花药野生稻ObHMA2、水稻OsHMA2、胡杨PeHMA2、蓖麻RcHMA2、高粱SbHMA2、马铃薯StHMA2、小麦TaHMA2、可可树TcHMA3、葡萄VvHMA3、玉米ZmHMA2)的HMA基因进行系统进化树分析。结果表明，IlHMA2与小麦TaHMA2基因、水稻OsHMA2基因、及大麦HvHMA2基因等单子叶植物的亲缘关系较近，其而与双子叶植物，如拟南芥AtHMA2、欧洲油菜BnHMA4的亲缘关系相对较远(图2)。这预示着，马蔺IlHMA2基因是重金属ATP酶转运蛋白一类的表明基因。实施例4不同浓度镉处理对马蔺重金属ATP酶转运蛋白基因IlHMA2表达水平的影响

通过实时荧光定量RT-PCR方法对不同镉浓度(0、5、25、50、100和150mg/L CdCl₂·2.5H₂O)处理24h后的马蔺幼苗地上部和根中IlHMA2基因表达水平进行分析。按照TaKaRaMiniBEST Plant RNAExtraction Kit试剂盒说明书的方法提取总RNA，利用Quawell5000核酸蛋白仪测定浓度，并经1.2％的甲醛变性凝胶电泳检测其RNA完整性，取1μg总RNA，按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit withgDNA Eraser试剂盒说明书的方法进行反转录合成cDNA。利用Primer5.0软件设计马蔺IlHMA2基因实时荧光定量RT-PCR上游引物P7和下游引物P8，长度为273bp；马蔺内参Actin基因实时荧光定量RT-PCR上游引物A1和下游引物A2，PCR产物长度为129bp。根据TaKaRa Premix Ex Taq II试剂盒说明书的方法在Step One Plus仪器上进行实时荧光定量RT-PCR反应。最后，采用2-^△△CT方法对马蔺IlHMA2基因的表达数据进行的相对定量计算，所有实验均为3次生物学重复。结果表明，随着镉处理浓度的增加(0-150mg/L CdCl₂·2.5H₂O)其根中的IlHMA2基因表达水平呈递增趋势，而地上部中的IlHMA表达水平呈递减趋势，特别是根中的IlHMA2基因表达水平显著高于地上部(图3)。由此表明，基因IlHMA2的表达受镉胁迫的诱导和调节。

引物序列如下：

P7:5’-GGGCGGATGCTATCGTCAAA-3’

P8:5’-CTTACTGCTGGCTCTGGACTC-3’

A1:5’-TGAGGTTCTCTTCCAGCCATCC-3’

A2:5’-CCACTGAGCACAATGTTGCCATA-3’

实施例5植物双元表达载体pCAMBI3301-35S-IlHMA2-Nos的构建

首先经BglII/BstEII对植物双元表达载体pCAMBIA3301载体上限制性酶切位点进行双酶切，切胶回收大片段，命名为pCAMBIA3301-H；利用Primer 5.0软件并结合IlHMA2基因序列和pCAMBIA3301载体序列设计带有BglII酶切位点的正向引物P9和带有Bst EII酶切位点的反向引物P10，经PCR扩增、切胶回收得到IlHMA2-G；再按照Clontech Infusion无缝连接技术相应技术体系(1μLpCAMBIA3301-H，3μL IlHMA2-G，2μL 5×In-Fusion HDEnzymePremix，加水补至10μL，瞬时离心后置于50℃孵育15min)，即可将目的基因IlHMA2插入到线性化植物双元表达载体中得到重组质粒pCAMBIA3301-IlHMA2(图4A)；最后取5μLInfusion反应液，转化到感受态大肠杆菌DH5α中，用含有50mg/L Kan(卡那霉素)的LB固体培养基进行筛选，转化细菌并提取质粒，再经BglII/BstEII双酶切得到与目的基因IlHMA2大小的特异条带(图4B)，其大小与PCR鉴定结果相符(图4C)，送至上海生工测序。

引物序列如下：

P9:5’-CATGGTAGATCTATGGAATTCTTCCAAGTACTA-3’

P10:5’-ATTCGAGCTGGTCACCTTATTCGCTTCCACTCCCATG-3’

实施例6转基因烟草植株的分子鉴定

采用冻融法将构建好的植物双元表达载体(pCAMBIA3301-35S-IlHMA2-Nos)转化到农杆菌EHA105感受态中，将转化的菌液均匀涂布于YEB固体培养基上[含50mg/L Kan和50mg/L Rif(利福平)]，28℃避光倒置培养，2-3d后长出单菌落，用接种针挑取单菌落，接种于50mL YEB液体培养基中(含50mg/L Kan和50mg/L Rif)，200rpm、28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，而后提取质粒并经PCR鉴定确认阳性克隆。然后，按照烟草叶盘侵染的相应技术方法：(1)将预先培养好的无菌烟草苗叶片切成2-3cm²大小，浸泡在含有pCAMBIA3301-35S-IlHMA2-Nos的农杆菌EHA105菌液中侵染10min，取出叶片用无菌滤纸吸干，平铺在垫有一层无菌滤纸的烟草共培养培养基[MS粉+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.2mg/L萘乙酸(NAA)，pH值5.8]上黑暗培养3d；(2)共培养结束后，将叶片转移到抑菌培养基[MS粉+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+500mg/L Cef(头孢霉素)，pH值5.8]上培养7d至外植体边缘膨大；(3)将外植体转移到分化筛选培养基[MS粉+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+8mg/L Bsata(草铵膦)+500mg/L Cef，pH值5.8]上，诱导不定芽的生成；(4)当不定芽长出3-4片叶子时，切下小芽转入生根培养基[1/2MS粉+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+0.05mg/L IBA(吲哚丁酸)+8mg/L Bsata+250mg/L Cef，pH值5.8]中诱导生根；(5)待根长伸长至3-5cm时移栽到蛭石：营养土＝1：1的花盆中，即获得T₀代转基因烟草植株。

将收获的T₀代转基因烟草种子先用5％次氯酸钠消毒，再放置于含有8mg/L Bsata的1/2MS培养基中，待7d后将发芽的转基因烟草转至到蛭石：营养土＝1：1的花盆中，获得T₁代转基因烟草植株，收获T₁代转基因烟草种子；按照上述方法获得T₂代转基因烟草植株。然后，按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit试剂盒说明书提取WT和T₂代转基因植株叶片的DNA，利用Quawell5000核酸蛋白仪测定浓度，并经电泳检测其DNA完整性，用上游引物P11和下游引物P12扩增得到480bp片段的仅有12株(图5A)。随后，将上述获得的T₂代转基因植株扩繁，并按照实施案例1中的方法提取它们的叶片总RNA并合成cDNA；通过半定量RT-PCR的方法检测转基因烟草植株的表达丰度(IlHMA2基因半定量RT-PCR上游引物P11和下游引物P12；烟草内参Actin基因半定量RT-PCR上游引物A2和下游引物A4，长度为564bp)。如图5B所示，各转基因烟草株系的表达丰度均有所不同，其中OE1和OE2转基因烟草株系表达丰度最高、而OE10和OE11号转基因株系的表达丰度最低。因此，随机选取OE2和OE11转基因烟草株系进行各组织中Cd²⁺含量及其生理生化的分析。

引物序列如下：

P11:5’-TCGTCTTCTCGGTGGTAACTAA-3’

P12:5’-AACAAGATGACTCGCAGGATTT-3’

A3:5’-TATGCTAGTGGTCGTACAACTG-3’

A4:5’-AACAACCTTAATCTTCATGCTG-3’

实施例7镉处理对野生型与转基因烟草镉的耐受性、转运与富集能力的影响

通过温室盆栽将8周龄野生型(WT)和转基因烟草株系(OE2、OE11)在0mg/L和50mg/L CdCl₂·2.5H₂O处理14d，测定WT和OE2、OE11植株的地上部与根部的干重；参照Guo et al(2017)的方法，利用原子吸收分光光度计(AA-6300C,Shimadza,Kyoto,Japan)测试WT和OE2、OE11植株的地上部与根中的Cd²⁺含量及其耐镉性。结果表明：

(1)正常条件下(0mg/L CdCl₂·2.5H₂O)，WT和OE2、OE15转基因烟草植株在形态上及其地上部和根部干重没有显著的差异；但在50mg/L CdCl₂·2.5H₂O胁迫14d后，野生型植株生长受到严重抑制，出现了萎蔫的症状，反之OE2、OE15转基因烟草植株正常生长(图6A)；

(2)如图6B所示，50mg/L CdCl₂·2.5H₂O胁迫14d后，OE2和OE11地上部的干重分别是WT的1.52倍和1.41倍，OE2和OE11根部的干重分别是WT的1.87倍和1.79倍，说明转基因烟草比野生型具有较强的耐镉性；

(3)表1为镉(50mg/L CdCl₂·2.5H₂O)胁迫14d后对野生型(WT)与转基因烟草株系(OE2、OE11)的Cd²⁺含量、转运及其富集能力的影响。表1中每个值均代表平均值±标准差(n＝8)，不同字母分别表示野生型与转基因株系间差异显著(P<0.05)。由表1可知，50mg/LCdCl₂·2.5H₂O胁迫14d后，与WT相比，OE2和OE11地上部Cd²⁺含量分别增加了22.84％和17.89％，而OE2和OE11根中Cd²⁺含量分别降低了11.78％和6.15％；相应的OE2和OE11的转运与富集系数也显著高于WT。

表1

以上结果表明，马蔺IlHMA2介导的Cd²⁺长距离运输将根系Cd²⁺转运至地上部，减轻了Cd²⁺对根系的毒害，从而提高了植物对Cd²⁺的耐受性与富集能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2及其编码基因与应用

<130> KHP171112523.3

<160> 2

<170> Patent In version 3.3

<210> 1

<211> 3538

<212> DNA

<213> 马蔺

<400> 1

ttccccctgt ggttccacct tccacccaca tggaattctt ccaagtacta tacaccagca 60

cccagaggag ttattttgat gtccttggca tctgctgccc ctctgaagtc cctctcatag 120

agaaaatcct gctcccattg gatggtgttc acaaggttaa tgttgttgtc acctcaagga 180

ccgtcatcgt tgtccatgac accaacctca tcactcagca ggatatcgtt aatacgttaa 240

atcaagcaag gcttgaagcc acggttcgag catatggggc ggatgctatc gtcaaaaaat 300

ggcctaaccc ctacgttttg gcctgtgggg ttttccttat attatcattg tttcataggt 360

tcttccgacc gctacgatgg ctggccttaa tggcggtctc tgttggtttg tatcccatta 420

tattgaggag cattgcttct gttcgtagat gcaatttgga tatcaacatt cttatgctga 480

tagcagtggc cggtgctgtc gcactgaggg actactcaga agcaggattc atcgttttcc 540

tctttacact tgctgaatgg ttggagtcca gagccagcag taaggccaca gccgggatgt 600

cagccctgat gagcatggct cctcaaaaag ccattatagc cgggacgggt caagttgtgg 660

atgcacgaga aatacaggtg aataccatcc ttgcagtcaa ggctggagaa gtcataccaa 720

ttgacggagt tgtgatcgag ggaagaagcg aagtcaatga gcaaagccta actggggagt 780

ccttccctgt tgccaagcaa gctcagtccc ttgtttgggc tggtaccctt aacatagatg 840

gttatatcag tgtgaaaaca actgctttgg ctgaggattc tgctgtggct agaatggcaa 900

agctggtgga ggaagcacag cacaacaggt ccaagacaca gagatatata gactatacat 960

ccttgaactt tagaggagct gtggtggtca tagcagctgg tgtggctgtg attcctgtca 1020

tattaaggtc ccacaacacc aggttctgga tgaaattggc acttgttata ctggtaagcg 1080

catgcccatg tgctctagtg ctatccacac ccgtggcaac cttctgtgca ttattgacag 1140

cggcaaaaac agggcttctt gtgaaaggag gagatgtcct tgaaaccctt gcaagaacta 1200

gaatcgtggc ttttgacaag actggaacca ttacaaaagg ggagttcaca gtccatgagc 1260

tctgtcctat tggctgccaa gtaaccctgg atactcttct ttactgggtt tcaagtatag 1320

agagtaaatc aagtcaccca atggcttctg cactcgttaa ccatgctcgg tcaaatttca 1380

tcaagccaaa accagagatc gtaaatgagt ttgagattta tcctggcgag ggagtatgtg 1440

gaattataga tggaaagaag atttatattg gaaacaaaag aattgcaaca agggctgggt 1500

gtcagacagt tccaagcatg ggaagcatga aggaaggtgt tactcacgga tatgtgttct 1560

tagaaaaaga accaattgga atgttcaccc ttaatgacac ctgtcgtact ggagtagcta 1620

aagcaatcag agagttgaaa tctttaggag tgaagagtat tatgcttact ggagatagca 1680

ctgcagcagc tatgcatgcc cagagtcagc tgggaaatgt tctgcaagaa ttgcaagcag 1740

agctgcttcc tgatgacaag gtccgtataa ttaacgacct caagaccaag gaagggccta 1800

ccacgatggt tggagatgga atgaatgatg cgcctgcact agctgcagca gacgttggga 1860

tttccatggg tgtttcggga tctgcagttg caatggaaac cagccacata actttgatgt 1920

ccaatgacat tttgaagatt ccaaaagcca tcaggcttgc aagaagaacc cgcaggtgta 1980

tcatatttaa catcgtcttc tcggtggtaa ctaaacttgc cattctcgcg ctatcttttg 2040

caggacatcc tctcatatgg gctgcagtct tagccgatgt gggaacctgc ttgcttgtca 2100

tactcaacag catgactttg ttaagaacaa gtgccccaaa gaaaaatgat aaatgccacc 2160

gatcttgtca tgcatcggac ggggaaaagc ataagcatgc aaatcatcgc gacagtaaac 2220

cctgttgcca accagcacat tccagggcag atgtctgtgg cagtgacatc cacaataggc 2280

acactcaaag gtctgtgcat gtagaccaat gttctcaagg tgcatgcaat aaatcaccag 2340

atcgtatgcg ctgttgtcaa gaagccggaa tgagtgctgc caaagcaagc catgaaggta 2400

tcatctctgt tgggtgcgag cacagtgatg tgcacaaaac gaatgtaccg aaatcctgcg 2460

agtcatcttg ttgctctcag gcgacgaatg taaaagatga tcatgtgatc gggtgcatag 2520

caaagagtca tgatcatatt ctggacaaag agggtttaag cacatgtggg catggaaaca 2580

atgaaagtaa gaactgcggc attacccaag agaaggaaga aatcggttgg tgttgccaga 2640

ccgagaggaa ggagtgtgca aagagagact gttgctcatc ttcttcatca ctagtgaacc 2700

ttgcagaaaa ggaagggaaa cccggcaaat cagcttgttg cagtggggca acaaatgcag 2760

aagatgaaca tgtggttgtg attgggcgcg tagcagagaa tcatagtggg gacagagagt 2820

acttaagctc atgtgggcat gggagtggaa gcgaataaga agctcagcgc tgctgcccga 2880

gagaaggaag atattggtgg gctgctgcca ggcagatagg aaggtgcttg gaaggcgaga 2940

ctgctgctca tcttcttcac aagtggaaga gattggggga tgttgcgaga gagaggatga 3000

ctgtaggggt gctaaagaaa agaaagagat tggtcggtgt tgcccgaccg agagtaagga 3060

ctgtggaaag cgggactgct gctcgcctat tttgccagtg gctcctacta gctgttgcga 3120

gagtgagaca ggtggtaaga tgcagatagc tgcctgttgt aagcctgaaa gtaggaagtg 3180

tgggagcaca gattattgtt cgtcatttgc gctgtggggt gccaatacgc gagaggtcgg 3240

cagctgttgc cagagttaca ggaagaaatg ttgcggaggt gtagttcagc tgcctgagat 3300

catcacagag tgattgttgc tgtggagatt agtaggccaa tactggaaca gcagaacatt 3360

ggtatagttg caaactacat acagaatctc tttatacact gtaagagcaa acttgtatgt 3420

cgtttaacat ttgaaagact tgtggtggaa atcaattaag ctggccacaa tatatatata 3480

ttctctcaat aaaacatgct tttttcccca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3538

<210> 2

<211> 942

<212> PRT

<213> 马蔺

<400> 2

Met Glu Phe Phe Gln Val Leu Tyr Thr Ser Thr Gln Arg Ser Tyr Phe

1 5 10 15

Asp Val Leu Gly Ile Cys Cys Pro Ser Glu Val Pro Leu Ile Glu Lys

20 25 30

Ile Leu Leu Pro Leu Asp Gly Val His Lys Val Asn Val Val Val Thr

35 40 45

Ser Arg Thr Val Ile Val Val His Asp Thr Asn Leu Ile Thr Gln Gln

50 55 60

Asp Ile Val Asn Thr Leu Asn Gln Ala Arg Leu Glu Ala Thr Val Arg

65 70 75 80

Ala Tyr Gly Ala Asp Ala Ile Val Lys Lys Trp Pro Asn Pro Tyr Val

85 90 95

Leu Ala Cys Gly Val Phe Leu Ile Leu Ser Leu Phe His Arg Phe Phe

100 105 110

Arg Pro Leu Arg Trp Leu Ala Leu Met Ala Val Ser Val Gly Leu Tyr

115 120 125

Pro Ile Ile Leu Arg Ser Ile Ala Ser Val Arg Arg Cys Asn Leu Asp

130 135 140

Ile Asn Ile Leu Met Leu Ile Ala Val Ala Gly Ala Val Ala Leu Arg

145 150 155 160

Asp Tyr Ser Glu Ala Gly Phe Ile Val Phe Leu Phe Thr Leu Ala Glu

165 170 175

Trp Leu Glu Ser Arg Ala Ser Ser Lys Ala Thr Ala Gly Met Ser Ala

180 185 190

Leu Met Ser Met Ala Pro Gln Lys Ala Ile Ile Ala Gly Thr Gly Gln

195 200 205

Val Val Asp Ala Arg Glu Ile Gln Val Asn Thr Ile Leu Ala Val Lys

210 215 220

Ala Gly Glu Val Ile Pro Ile Asp Gly Val Val Ile Glu Gly Arg Ser

225 230 235 240

Glu Val Asn Glu Gln Ser Leu Thr Gly Glu Ser Phe Pro Val Ala Lys

245 250 255

Gln Ala Gln Ser Leu Val Trp Ala Gly Thr Leu Asn Ile Asp Gly Tyr

260 265 270

Ile Ser Val Lys Thr Thr Ala Leu Ala Glu Asp Ser Ala Val Ala Arg

275 280 285

Met Ala Lys Leu Val Glu Glu Ala Gln His Asn Arg Ser Lys Thr Gln

290 295 300

Arg Tyr Ile Asp Tyr Thr Ser Leu Asn Phe Arg Gly Ala Val Val Val

305 310 315 320

Ile Ala Ala Gly Val Ala Val Ile Pro Val Ile Leu Arg Ser His Asn

325 330 335

Thr Arg Phe Trp Met Lys Leu Ala Leu Val Ile Leu Val Ser Ala Cys

340 345 350

Pro Cys Ala Leu Val Leu Ser Thr Pro Val Ala Thr Phe Cys Ala Leu

355 360 365

Leu Thr Ala Ala Lys Thr Gly Leu Leu Val Lys Gly Gly Asp Val Leu

370 375 380

Glu Thr Leu Ala Arg Thr Arg Ile Val Ala Phe Asp Lys Thr Gly Thr

385 390 395 400

Ile Thr Lys Gly Glu Phe Thr Val His Glu Leu Cys Pro Ile Gly Cys

405 410 415

Gln Val Thr Leu Asp Thr Leu Leu Tyr Trp Val Ser Ser Ile Glu Ser

420 425 430

Lys Ser Ser His Pro Met Ala Ser Ala Leu Val Asn His Ala Arg Ser

435 440 445

Asn Phe Ile Lys Pro Lys Pro Glu Ile Val Asn Glu Phe Glu Ile Tyr

450 455 460

Pro Gly Glu Gly Val Cys Gly Ile Ile Asp Gly Lys Lys Ile Tyr Ile

465 470 475 480

Gly Asn Lys Arg Ile Ala Thr Arg Ala Gly Cys Gln Thr Val Pro Ser

485 490 495

Met Gly Ser Met Lys Glu Gly Val Thr His Gly Tyr Val Phe Leu Glu

500 505 510

Lys Glu Pro Ile Gly Met Phe Thr Leu Asn Asp Thr Cys Arg Thr Gly

515 520 525

Val Ala Lys Ala Ile Arg Glu Leu Lys Ser Leu Gly Val Lys Ser Ile

530 535 540

Met Leu Thr Gly Asp Ser Thr Ala Ala Ala Met His Ala Gln Ser Gln

545 550 555 560

Leu Gly Asn Val Leu Gln Glu Leu Gln Ala Glu Leu Leu Pro Asp Asp

565 570 575

Lys Val Arg Ile Ile Asn Asp Leu Lys Thr Lys Glu Gly Pro Thr Thr

580 585 590

Met Val Gly Asp Gly Met Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Ala Ala Asp

595 600 605

Val Gly Ile Ser Met Gly Val Ser Gly Ser Ala Val Ala Met Glu Thr

610 615 620

Ser His Ile Thr Leu Met Ser Asn Asp Ile Leu Lys Ile Pro Lys Ala

625 630 635 640

Ile Arg Leu Ala Arg Arg Thr Arg Arg Cys Ile Ile Phe Asn Ile Val

645 650 655

Phe Ser Val Val Thr Lys Leu Ala Ile Leu Ala Leu Ser Phe Ala Gly

660 665 670

His Pro Leu Ile Trp Ala Ala Val Leu Ala Asp Val Gly Thr Cys Leu

675 680 685

Leu Val Ile Leu Asn Ser Met Thr Leu Leu Arg Thr Ser Ala Pro Lys

690 695 700

Lys Asn Asp Lys Cys His Arg Ser Cys His Ala Ser Asp Gly Glu Lys

705 710 715 720

His Lys His Ala Asn His Arg Asp Ser Lys Pro Cys Cys Gln Pro Ala

725 730 735

His Ser Arg Ala Asp Val Cys Gly Ser Asp Ile His Asn Arg His Thr

740 745 750

Gln Arg Ser Val His Val Asp Gln Cys Ser Gln Gly Ala Cys Asn Lys

755 760 765

Ser Pro Asp Arg Met Arg Cys Cys Gln Glu Ala Gly Met Ser Ala Ala

770 775 780

Lys Ala Ser His Glu Gly Ile Ile Ser Val Gly Cys Glu His Ser Asp

785 790 795 800

Val His Lys Thr Asn Val Pro Lys Ser Cys Glu Ser Ser Cys Cys Ser

805 810 815

Gln Ala Thr Asn Val Lys Asp Asp His Val Ile Gly Cys Ile Ala Lys

820 825 830

Ser His Asp His Ile Leu Asp Lys Glu Gly Leu Ser Thr Cys Gly His

835 840 845

Gly Asn Asn Glu Ser Lys Asn Cys Gly Ile Thr Gln Glu Lys Glu Glu

850 855 860

Ile Gly Trp Cys Cys Gln Thr Glu Arg Lys Glu Cys Ala Lys Arg Asp

865 870 875 880

Cys Cys Ser Ser Ser Ser Ser Leu Val Asn Leu Ala Glu Lys Glu Gly

885 890 895

Lys Pro Gly Lys Ser Ala Cys Cys Ser Gly Ala Thr Asn Ala Glu Asp

900 905 910

Glu His Val Val Val Ile Gly Arg Val Ala Glu Asn His Ser Gly Asp

915 920 925

Arg Glu Tyr Leu Ser Ser Cys Gly His Gly Ser Gly Ser Glu

930 935 940

Claims

1.马蔺重金属ATP酶转运蛋白IlHMA2，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

4.表达盒、表达载体或克隆载体，其包括包含如权利要求2或3所述基因的核酸序列。

5.含有权利要求2或3所述基因、或者权利要求4所述表达盒、表达载体或克隆载体的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在提高植物对镉的耐受性与富集能力或提高植物体内镉的转运能力中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物包括单子叶植物或双子叶植物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述单子叶植物为谷类作物、草本能源植物或草坪草，所述双子叶植物为烟草或拟南芥。

9.一种转基因植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体转化目标植物，筛选转基因植株。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体的出发载体为植物双元表达载体pCAMBI3301。