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CN106987649A - 一种用于检测脑胶质瘤的引物组及检测方法 - Google Patents

一种用于检测脑胶质瘤的引物组及检测方法 Download PDF

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CN106987649A CN201710405289.9A CN201710405289A CN106987649A CN 106987649 A CN106987649 A CN 106987649A CN 201710405289 A CN201710405289 A CN 201710405289A CN 106987649 A CN106987649 A CN 106987649A
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朱珍芳
陈婷婷
冯姜焜
李静
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Shanghai Bo Kang Biotechnology Co Ltd
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Shanghai Bo Kang Biotechnology Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

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Abstract

本发明提供用于检测脑胶质瘤的引物组，本发明的引物包括SEQ ID No.1‑‑SEQ ID No.14,可对CEA、CK8、EPCAM、Muc1、CK18、CK19、KLF4基因进行联合检测。通过PCR或荧光定量PCR的方法，可在短时间内灵敏检测出靶基因的表达及表达水平；采用优化的PCR条件，通过增加扩增反应的循环数，使观察结果更显著，进一步提高方法适用性；扩增产物具有特异性，确保PCR和荧光定量PCR检测高准确度和灵敏度。

Description

一种用于检测脑胶质瘤的引物组及检测方法
技术领域
本发明涉及肿瘤基因领域，具体涉及一种用于检测脑胶质瘤的引物组及检测方法。
背景技术
脑胶质瘤(别名：神经胶质瘤英文：glioma)也称为胶质细胞瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半，广义是指所有神经上皮来源的肿瘤，狭义是指源于各类胶质细胞的肿瘤。脑胶质瘤死亡率非常高，造成其病死率居高不下的原因是由于脑胶质瘤生长部位隐蔽，无法直接看到，早期脑胶质瘤症状不明显，仍缺乏简便实用的诊断方法。因此对脑胶质瘤的早期诊断十分必要。
目前脑胶质瘤的诊断方法包括影像学检查，细胞病理学和组织病理学诊断。影像学检查包括淋巴造影、CT扫描、核磁共振检查等，但是其效率较低并且检测准确度不高。通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者穿刺的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而且会对患者造成人体伤害，甚至可能造成穿刺道肿瘤转移。
近来，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。
CTC的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选则是通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获未表达表面肿瘤标记物的CTC细胞。
采用RT-PCR的方法检测CTC细胞的特异性基因是CTC细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。
目前采用RT-PCR方法检测脑胶质瘤CTCs的标准还没有完全建立。我们通过检测脑胶质瘤患者的CTCs特征基因，确定脑胶质瘤CTCs的检测方法和检测标准。这些检测方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物，包括NK和CAR-T免疫治疗的疗效及制定个体化治疗方案。
针对上述问题，本发明开发一种高灵敏的多基因联合检测的试剂盒，通过联合检测CEA、CK8、EPCAM、Muc1、CK18、CK19和KLF4共7个基因实现肿瘤的早期筛查或诊断。本发明设计运用靶向特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到96％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测脑胶质瘤的引物组及检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于检测脑胶质瘤的引物组，包含：
本发明的引物组可通过以下两种方法实现脑胶质瘤的检测。
方法1：PCR方法。
(1)将权利要求1所述的7对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；
(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。
方法2：荧光定量PCR方法
(1)将权利要求1所述的7对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；
(2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；
(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。
本发明的有益效果在于：本发明通过设计特异性PCR引物，开发出用于脑胶质瘤早期检测的多基因联合检测方法。此方法：(1)建立的PCR体系可对CEA、CK8、EPCAM、Muc1、CK18、CK19和KLF4基因进行联合检测；(2)通过同时对多个基因进行检测脑胶质瘤检出率可达到96％；(3)灵敏度高，低至1-5拷贝的基因表达水平均可检出；(4)特异性较强，正常人或非脑胶质瘤病人样本不会产生很强的非特异性信号；(5)检测速度快，操作简单，费用低廉。
附图说明
图1为实施例中健康人外周血样本检测阴性PCR图。
图2为实施例中非脑胶质瘤肿瘤患者外周血样本检测阴性PCR图。
图3为实施例中非脑胶质瘤患者组织样本检测阴性PCR图。
图4为实施例中脑胶质瘤患者外周血检测阳性PCR图。
图5为实施例中脑胶质瘤患者肿瘤组织检测阳性PCR图。
图中，M.100bp marker；1.B2M；2.CEA；3.CK8；4.EPCAM；5.Muc1；6.CK18；7.CK19；8.KLF4
具体实施方式
本发明针对目前肿瘤中主要的驱动性突变基因，联合检测CEA、CK8、EPCAM、Muc1、CK18、CK19和KLF4共7个基因实现脑胶质瘤的早期筛查或诊断。针对目前检测方法灵敏度低，检测过程复杂繁琐，检测所需时间长，无法满足临床检测的实际需求。针对上述问题，设计出用于检测上述7个基因的一整套特异性引物组。
根据上述7个基因的参考序列设计特异性扩增引物，其PCR产物长度最优是在180-220bp之间，退火温度不高于60度，GC含量在40-60％之间，符合一般引物设计软件的要求。通过采用实时荧光PCR反应检测体系，实现多个基因联合的高灵敏检测，其检测方法如下所述。
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》第三版(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的(带标记的)探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:基因选择
多项研究表明，单基因筛查敏感度约为20-60％，大部分用于肿瘤早期筛查的单个基因检测，其检测敏感度或特异度偏低，不能满足临床需要。采用多基因联合检测可以有效解决敏感度低的问题，提高肿瘤早期筛查和诊断的准确度。
为了提高早期肿瘤的检出率，提高肿瘤患者的治愈率，改善病人预后，我们对脑胶质瘤和正常组织的差异表达基因进行了筛选。我们通过大量比对实验发现CEA、CK8、EPCAM、Muc1、CK18、CK19和KLF4组成的基因组对脑胶质瘤具有较高的检出率，达到96％。
实施例2:引物筛选
(1)设计引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3，具体为：利用生物信息学软件对靶基因A-G序列进行分析，利用序列分析软件设计特异性引物组，利用NCBI引物搜索软件检测各配对引物在人基因组中的特异性，分别设计出3对特异性扩增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3；
表1：PCR检测引物
(2)外周血样品的处理
收集某医院收治并经病理证实的脑胶质瘤患者外周血，清晨7点，空腹，经肘静脉采集新鲜血液，存放于抗凝管中，摇匀，常温下保存≤4h。
2.1将抗凝管中的全血样本加入等体积PBS(pH7.0)，于室温3000rpm离心5min，去除上层血浆；
2.2加入等体积氯化铵红细胞裂解液，于室温200rpm离心8min混匀后，以3000rpm室温离心5min，弃去上清；
2.3将下层血细胞和生理盐水按照体积比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分离液，混合液与Ficoll分离液的体积比为1:2～2:1，离心力为700g，离心20～40min；
2.4吸弃上清，取细胞沉淀，洗涤，即得到PBMC；
2.5取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保护剂重悬，保存于-20度。
(3)核酸的提取
3.1取不多于5×105的PBMC，加入250μL Buffer RLT Plus，吹打混匀；
3.2将裂解液转移至gDNA清除离心型柱中，8000×g(10,000rpm)离心30s。收集流穿液，弃离心柱；
3.3加入1倍体积的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混匀；
3.4将样品转移至RNeasyMinElute离心柱，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；
3.5在RNeasyMinElute离心柱中加入700μL Buffer RW1，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；
3.6在RNeasyMinElute离心柱中加入500μL Buffer RPE，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；
3.7将RNeasyMinElute离心柱置于新的2mL收集管中，打开盖子，全速离心5min，使乙醇挥发；
3.8将RNeasyMinElute离心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-freeH2O，盖紧盖子，全速离心1min洗脱RNA。
(4)模板cDNA的获得
4.1准确测得样品RNA浓度；
4.2严格按照cDNA反转录试剂盒说明书在冰上制备反转录体系；
成分 体积
5×Mix 8μL
RNA 500ng
RNase-free H2O 至40μL
4.3混匀以上反应体系，并利用离心机短暂离心，55度20min，85度2min，获得模板cDNA；
(5)普通PCR扩增
用Taq DNA聚合酶配置反应体系，用引物为a-g和人内参基因(B2M)进行PCR扩增各样品，产物用1％凝胶检测；扩增体系如下：
成分 体积
2×Mix 10μL
cDNA 1μL
引物-F 0.8μL
引物-R 0.8μL
RNase-free H2O 7.4μL
PCR反应条件是：95℃预变性3分钟，1个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35个循环；72℃延伸7分钟。
(6)荧光实时定量PCR扩增
根据设计的特异引组a-g，通过荧光定量PCR进行扩增，体系如下：
PCR反应条件是：95℃预变性20s，1个循环；95℃10s，60℃30s，40个循环；每管设立三个复孔；
根据步骤5和6的pcr结果，筛选出以下引物组，作为本发明用于检测脑胶质瘤的引物组。
实施例3：效果验证
根据实施例2的筛选结果，采用下表的引物组对100个肿瘤样本进行检测。
序号 多基因联合检测 检出率
1 CEA、CK8、EPCAM和Muc1 70％
2 CEA、CK8、EPCAM、Muc1和CK18 75％
3 CEA、CK8、EPCAM、Muc1、CK18和KLF4 83％
4 CEA、CK8、EPCAM、Muc1、CK18、CK19和KLF4 96％
5 CEA、CK8、EPCAM、Muc1、CK18、CK19和EGFR 82％
6 CEA、CK8、EPCAM、Muc1、CK18、CK19和hTERT 84％
其中，CEA的正向引物为ACAGTCACGACGATCACAGT，反向引物为CAGCTGCAGCCTGGGACTGA；
CK8的正向引物为GAGCTAGACAAGTACTGGTC，反向引物为CCTCAGGCTGTTCTCCAAGC；
EPCAM的正向引物为AATGATGTGGACATAGCTGA，反向引物为TAGACCCTGCATTGAGAATT；
Muc1的正向引物为GCCTCTCGATATAACCTGAC，反向引物为TCGGCGGCACTGACAGACAG；
CK18的正向引物为GAGCTAGACAAGTACTGGTC，反向引物为CCTCAGGCTGTTCTCCAAGC；
CK19的正向引物为AGCTGGCCTACCTGAAGAAG，反向引物为AGGCTTCAGCATCCTTCCGG；
KLF4的正向引物为CGGGAAGGGAGAAGACACTG，反向引物为GGTTGCTACCGCCGCAAGCC；
1～6号引物组的检出率如上表所示，从表中可以看出，引物组中，随着引物数量的增加，在一定程度上可以提高其检出率。进一步地，通过比较1～6号引物组可以发现，引物组内的组合对于检出率的高低有重要影响。同时在相同的检测基因数量情况下，4号引物组的检出率高于5～6号引物组。因此，我们优选4号引物组的基因组合用于脑胶质瘤的检测。进一步通过研究发现，4号引物组中，EPCAM、CK8、CK18，CK19的表达可提示上皮细胞来源的肿瘤,CK的多种组分中CK18与CK19被认为有肿瘤转移诊断价值；MUC1在肿瘤组织中多出现异常表达，在炎症和肿瘤的进展中起着重要的作用；KLF4是肿瘤细胞的干性分子，表达的高低与肿瘤的恶性程度直接相关。7对引物组相铺相成，使得检出率得到大幅度提升。综上所述，本专利中选择的基因涉及肿瘤的代谢、增殖、侵袭等方面，可较为全面的检测出脑胶质瘤的细胞生物学特征。
实施例4：特异性分析
根据实施例3的筛选结果，采用4号引物组对正常人外周血样本(图1)、非脑胶质瘤患者的外周血(图2)、非脑胶质瘤患者的肿瘤组织(图3)进行检测。图中1-8基因分别为：CEA、CK8、EPCAM、Muc1、CK18、CK19和KLF4检测结果如图1-5所示，从图中可见所述的引物组在正常人外周血(图1)、非脑胶质瘤病人的外周血(图2)和非脑胶质瘤病人的组织中(图3)均未检测到较强的基因表达。在脑胶质瘤病人的外周血液样本(图4)和组织样本(图5)中可检测到多个基因的强表达，分别为4/7和7/7，说明本专利中所述引物组具有高度的特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海博慷生物科技有限公司
<120> 一种用于检测脑胶质瘤的引物组及检测方法
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> 人工合成
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Claims (3)

1.一种用于检测脑胶质瘤的引物组，其特征在于，所述引物组包含a～g7对引物，所述引物a的正向引物如SEQ ID No.1所示，引物a的反向引物如SEQ ID No.2所示，引物b的正向引物如SEQ ID No.3所示，引物b的反向引物如SEQ ID No.4所示，引物c的正向引物如SEQID No.5所示，引物c的反向引物如SEQ ID No.6所示，引物d的正向引物如SEQ ID No.7所示，引物d的反向引物如SEQ ID No.8所示，引物e的正向引物如SEQ ID No.9所示，引物e的反向引物如SEQ ID No.10所示,引物f的正向引物如SEQ ID No.11所示，引物f的反向引物如SEQ ID No.12所示,引物g的正向引物如SEQ ID No.13所示，引物g的反向引物如SEQ IDNo.14所示。
2.一种用于检测脑胶质瘤的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的7对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；
(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。
3.一种用于检测脑胶质瘤的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的7对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；
(2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；
(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。
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