CN106979966A - 一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：纤维连接蛋白单克隆抗体1作为捕获探针，利用蛋白质巯基与金形成稳定的共价键，自组装固定在电极表面；在纤维连接蛋白存在下，单克隆抗体捕获探针与纤维连接蛋白结合；末端标记有生物素的纤维连接蛋白多克隆抗体再与纤维连接蛋白结合；亲和素标记的辣根过氧化物酶可通过与多克隆抗体标记的生物素结合，使HRP固定在电极表面；将构建的电极置于含TMB和H2O2的溶液中，在酶催化下，TMB被氧化生成双偶氮联苯胺类物质，并在电极上产生电信号，即制备了一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器。具有简便、经济、灵敏度高，特异性强特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物免疫技术、电化学免疫传感器技术领域，尤其涉及一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的制备方法。
背景技术
纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)是指结构上类似，免疫性相同的一组糖蛋白，由两条近似相同的单体分子在羧基末端通过一对二硫键交联形成“V”字形二聚体结构。根据体内分布不同，FN 分为细胞型(cFN)与血浆型(pFN)2 种。纤维连接蛋白广泛存在于细胞外基质、血浆及其他体液中，作为一种重要的粘附分子，能与肝素、胶原蛋白以及细胞表面整合素家族受体结合，参与细胞的粘附、增殖、迁移、炎症反应，维持血管完整性等多项生理过程，与许多疾病有着密切的联系。FN可促进单核巨噬系统活性，具有调理素作用，保持网状内皮系统功能、及时清除血液循环中颗粒性有害物质。现有技术中，对于人体血浆中纤维连接蛋白(FN)水平的检测方法主要有两种，一种是酶联免疫吸附法(ELISA)，另一种是放射免疫扩散法。ELISA法检测时间长，操作步骤复杂，检测成本高；放射免疫扩散法虽检测时间短，但需有放射性保护。故两种检测方法都不能实现快速、简便、灵活地检测的血浆纤维连接蛋白(FN)水平，不能满足临床的需求。
为了解决现有纤维连接蛋白检测技术的不足，亟需研究一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明第一目的是提供了一种检测FN的电化学免疫传感器；其中，工作电极为金电极，依次组装纤维连接蛋白抗体1捕获探针、牛血清蛋白(BSA)封闭剂、纤维连接蛋白抗原、生物素修饰的抗体2层及亲和素修饰的辣根过氧化物酶所得。
本发明第二目的是提供了一种检测FN的电化学免疫传感器的制备方法。
本发明的目的是这样实现的，所述的检测FN的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：将纤维连接蛋白的单克隆抗体1固定在电极的表面，利用抗体与抗原的特异性免疫反应捕获纤维连接抗原蛋白，再通过捕获在电极上的抗原进一步结合末端标记有生物素的多克隆抗体2，最后利用生物素与亲和素的特异性反应，将标记有亲和素的辣根过氧化酶结合到电极表面，实现该特异性免疫反应与电化学酶联放大的高灵敏性相结合的电化学免疫传感器的制备。
所述电化学传感器的工作电极的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）金电极表面预处理：将金电极表面进行抛光处理，使其呈镜面状，并用N2吹干，备用；
（2）孵育纤维连接蛋白的单克隆抗体1：先将纤维连接蛋白抗体加到步骤（1）制备得到的工作电极表面上孵育1-15 h，再用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白抗体，室温下晾干，备用；
（3）BSA封闭非特异性吸附位点：将步骤（2）所制得电极在一定反应条件下将其浸泡在一定浓度牛血清蛋白溶液中，反应15-30 min，封闭非特异性吸附位点，再用pH 7.4的PBS洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的牛血清蛋白，室温下晾干，备用；
（4）抗原与金电极上纤维连接蛋白的单克隆抗体1的特异性免疫反应：将不同浓度的纤维连接蛋白溶液加到步骤（3）所制得的电极表面上，在一定反应条件下抗原特异性结合到纤维连接蛋白的单克隆抗体1上，再用pH 7.4的PBS洗掉与纤维连接蛋白的单克隆抗体1结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白，室温下晾干，备用；
（5）末端标记有生物素的多克隆抗体2与抗原结合：将一定浓度的末端标记有生物素的多克隆抗体2加到步骤（4）所制得的电极表面上，在一定条件下抗原与末端标记有生物素的多克隆抗体2发生特异性免疫反应，再用pH 7.4的PBS洗掉与抗原结合不够稳定及未结合的末端标记有生物素的多克隆抗体2，室温下晾干，备用；
（6）标记有亲和素的辣根过氧化物酶(s-HRP)与末端标记有生物素的多克隆抗体2结合：将足量的s-HRP溶液加到步骤（5）所制得的电极表面上，在一定条件下标记有亲和素的辣根过氧化物酶中的亲和素与末端标记有生物素的多克隆抗体2中的生物素特异性结合，再用pH 7.4的PBS洗掉与生物素结合不够稳定及未结合的s-HRP，即制得检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器。
步骤（4）反应条件为温度25～45 ℃，时间30～90 min。
步骤（5）反应条件为温度37 ℃，时间30～120 min。
步骤（6）反应条件为室温，时间15～30 min。
步骤（2）构建电化学免疫传感器中，所述纤维连接蛋白单克隆抗体的浓度为50～200 μg/mL。
所述步骤（3）构建电化学免疫传感器中，所述的牛血清蛋白质量浓度为0.5 wt%～2 wt%。
所述步骤（5）构建电化学免疫传感器中，所述的末端标记有生物素的多克隆抗体2浓度为60～300 μg/mL。
本发明上述的方法制得的检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器。
本发明上述的方法制得的电化学免疫传感器或权利要求9所述的检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器应用于特异性检测纤维连接蛋白，不受甲状腺球蛋白、胎牛血清白蛋白、癌胚抗原或前列腺癌抗原等干扰。
更具体地说，本发明所述的检测FN的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：
（1）金电极表面处理：先将Au电极在有0.05 μm Al2O3溶液的麂皮上打磨抛光呈镜面状，再依次于1:1的HNO3、无水乙醇和蒸馏水中超声清洗，取出后用足量双蒸水洗净，然后置于稀硫酸溶液中扫描CV，进一步清理电极表面，待扫描信号稳定后取出，足量双蒸水冲洗干净，高纯N2吹干，备用。
（2）孵育纤维连接蛋白的单克隆抗体1：先将纤维连接蛋白单克隆抗体1滴加到步骤（1）制备得到的工作电极上，于4 ℃条件下孵育1～15 h，再用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白抗体1，室温下晾干，备用；
（3）BSA封闭非特异性吸附位点：将步骤（2）所制得的电极浸泡在一定浓度牛血清蛋白溶液中，于37 ℃水浴锅中孵育15 min，再用pH 7.4的PBS洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的牛血清蛋白,室温下晾干，备用；
（4）抗原与金电极上捕获探针抗体1的特异性免疫反应：将不同浓度的纤维连接蛋白溶液加到步骤（3）所制得的电极表面上，在一定反应条件下抗原特异性结合已固定于金电极上的抗体1，再用pH 7.4的PBS洗掉与抗体结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白，室温下晾干，备用；
（5）末端标记生物素的多克隆抗体2与抗原特异性免疫反应：将一定浓度的抗体2滴加到步骤（6）所制得的电极表面上，在一定条件下抗原与抗体2发生特异性免疫反应后，再用pH 7.4的PBS洗掉与抗原结合不够稳定及未结合的抗体2，室温下晾干，备用；
（6）标记有亲和素的辣根过氧化物酶(s-HRP)与标记有生物素的抗体2的特异性结合：将足量的s-HRP溶液加到步骤（5）所制得电极表面上，在一定条件下，亲和素与生物素发生特异结合，再用pH 7.4的PBS洗掉与生物素结合不够稳定及未结合的s-HRP，制得检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器，即工作电极。
其中步骤（4）反应条件为温度25～45 ℃，时间30～90 min；
优选地步骤（4）反应条件为温度37 ℃，时间60 min；
步骤（5）反应条件为温度37 ℃，时间30～120 min；
优选地步骤（5）反应条件为温度37 ℃，时间60 min；
步骤（5）反应条件为室温，时间15～30 min；
优选地步骤（6）反应条件为室温，时间30 min；
所述步骤（2）构建电化学免疫传感器中，所述纤维连接蛋白单克隆抗体1的浓度
为50～200 μg/ mL；
优选地所述步骤（2）构建电化学免疫传感器中，所述纤维连接蛋白单克隆抗体1的浓度为100 μg/mL；
所述步骤（3）构建电化学免疫传感器中，所述的牛血清蛋白质量浓度为0.5 wt%～2wt%；
优选地所述步骤（3）构建电化学免疫传感器中，所述的牛血清蛋白质量浓度为0.5wt%；
所述步骤（5）构建电化学免疫传感器中，所述的抗体2浓度为60～300 μg/mL；
优选地所述步骤（5）构建电化学免疫传感器中，所述的抗体2浓度为250 μg/mL；
本发明上述的制备方法制备的一种电化学免疫传感器，用于纤维连接蛋白的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和银氯化银作为参比电极，铂丝电极作为对电极，所制备的电化学免疫传感器为工作电极，在含有H2O2的3，3’，5，5’—四甲基联苯胺（TMB）中进行检测；
（2）用时间-电流(i-t)法对分析物进行检测，初始电位0.1 V,取样间隔为0.1 s，运行时间100 s，通过i-t 曲线记录第100 s时的电流值。
本发明的有益效果：
本发明利用金电极吸附性好、电子传导性强及化学性质稳定等特性，通过抗原抗体的特异性免疫反应，利用链霉亲和素与生物素化特异性结合，引入酶联信号放大技术，构建了一种新型的电化学免疫传感器，该传感器采用在电极表面形成抗体-抗原-抗体的“三明治夹心”结构，再利用酶联信号放大技术，提高了电化学检测的特异性和灵敏性。其操作简便、检测下限低、灵敏度较高、重复性好且检测成本低廉，检测范围为0.07-3 μg/mL，检测限为0.07 μg/mL，线性相关系数为0.9992，最终实现纤维连接蛋白含量的床边快速检测或危重病人连续监测。
附图说明
图1为本发明的基于一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器工作原理图。
图2a为本发明的基于一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的抗体1孵育时间的优化图。
图2b为本发明的基于一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的抗原与抗体1反应时间优化图。
图2c为本发明的基于一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的抗原与抗体1反应温度优化图。
图2d为本发明的基于一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的抗体2与抗原反应时间的优化图。
图3为本发明的基于一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的特异性及干扰图。
图4为本发明的基于一种电化学免疫传感器检测纤维连接蛋白的标准曲线图。
具体实施方式
以下是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
纤维连接蛋白的单克隆抗体1（以下简称抗体1）；末端标记有生物素的多克隆抗体2（以下简称抗体2）。
如图1所示，使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和银氯化银作为参比电极，铂丝电极作为对电极，采用下述实施例制备的电化学免疫传感器为工作电极，在含有H2O2的3，3’，5，5’—四甲基联苯胺（TMB）中进行检测；用时间-电流(i-t)法对分析物进行检测，初始电位0.1 V,取样间隔为0.1 s，运行时间100 s，通过i-t 曲线记录第100 s时的电流值。
实施例
1、电化学免疫传感器的制备方法：（1）金电极表面处理：先将Au电极在含有0.05 μmAl2O3溶液的麂皮上打磨抛光呈镜面状，再依次在1:1的HNO3、无水乙醇和蒸馏水中超声清洗，取出后用双蒸水洗净，于稀硫酸溶液中扫描CV，进一步清理电极表面，待扫描信号稳定后取出，足量双蒸水冲洗干净，高纯N2吹干备用。（2）构建电化学免疫传感器步骤如下：（a）先3 μL 100 μg/mL的纤维连接蛋白的单克隆抗体1（以下简称抗体1）加到步骤（1）制备得到的金电极表面上，并置于4℃冰箱中孵育6h，再用10 mM pH 7.4的PBS冲洗，待室温下自然晾干，备用；（b）再将步骤(a)制备得到的电极浸泡到含0.5 wt%的BSA溶液，置于37 ℃水浴锅中15 min后，用10 mM pH 7.4的PBS冲洗，待室温下自然晾干，备用；（c）将不同浓度的纤维连接蛋白溶液加到步骤(b)所得电极表面上，在37 ℃、湿度为60 %的恒温箱里进行抗原抗体特异性免疫反应1 h，抗原特异性结合到捕获抗体1上，再用10 mM pH 7.4的PBS冲洗，待室温下自然晾干，备用；（d）将5μL浓度为250 μg/mL的标记有生物素的抗体2加到步骤(c)所得的电极表面上，在37 ℃、湿度为60 %的恒温箱里再次进行抗原抗体特异性免疫反应1 h，使抗体2特异性结合到抗原上后，用10 mM pH 7.4的PBS冲洗，待室温下自然晾干，备用；（e）将5μL的s-HRP溶液加到步骤(d)所得的电极表面上，在室温下反应30 min，再用10 mM pH7.4的PBS冲洗，即得本发明的电化学免疫传感器。
2、捕获抗体1孵育时间优化过程：纤维连接蛋白单克隆抗体1通过金硫键组装到金电极上的量随孵育时间的延长，检测信号呈现递增并达到最大值。在构建免疫传感器界面过程中，考查了抗体1孵育时间在2-15 h的范围内，检测信号的大小。如图2a所示，电流值随孵育时间的延长，逐渐增大，当孵育时间为6 h时接近饱和，因此捕获探针抗体1组装孵育时间选择6 h。
3、抗原抗体特异性免疫反应时间的优化过程：抗原与抗体1发生免疫特异性结合的量与反应时间有关，抗原抗体的不同免疫反应时间与检测信号存在一定数量关系。从图2b中可以看出，随着反应时间的延长，检测信号也随之增大，60 min后，免疫反应已接近饱和，检测信号值趋于平台，因此，选择抗原与抗体1最佳免疫反应时间为60 min。
4、抗原抗体反应温度的优化过程：温度是影响抗原抗体免疫反应的重要条件之一，抗原孵育温度与检测信号值存在的一定关系；从图2c中可以看出，在25-37 ℃范围内，电流信号随反应温度的升高而增大，说明在这个范围内，温度越高对免疫反应越有利，时间电流信号值在37 ℃达到最大；但是当温度过高（大于37 ℃），会导致抗原和抗体等生物分子的失活，从而导致检测信号值减小。因此，选择37 ℃作为抗原抗体最佳反应温度。
5、抗原与抗体2免疫反应时间的优化过程：“三明治型”免疫传感器构建过程中，抗体2与抗原的免疫反应时间也会影响到电流信号值，因此进一步考察抗体2与抗原的不同反应时间与检测值大小的关系。从图2d中可以看出，随着抗体2孵育时间的延长，检测信号值也随之增大，60 min时达到最大值，免疫反应已经接近饱和，检测信号基本趋于稳定，故选择抗原最佳反应时间为60 min。
6、电化学免疫传感器的特异性的检测：电化学免疫传感器的特异性的强弱是决定能否投入使用的至关重要的因素，在步骤1-5优化后的条件下，探索该传感器的特异性；将纤维连接蛋白抗原分别由甲状腺球蛋白(TG 10 μg/mL)、胎牛血清白蛋白(BSA 10 wt%)、癌胚抗原(CEA 20 ng/mL)及前列腺癌抗原(PSA 4 μg/mL)等取代，后续可引入更多的蛋白质，亦作为本发明的保护范围，由图3柱状图所示，该电化学传感器的特异性强。
7、电化学免疫传感器的标准曲线的制定：通过步骤1-5优化条件后构建的电化学免疫传感器，依次完成抗原浓度为0 μg/mL、0.3 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、3 μg/mL的检测，得到线性图4，该标准曲线的检测范围为0.07-3 μg/mL，检测限为0.07 μg/mL，线性相关系数为0.9992。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：将纤维连接蛋白的单克隆抗体1固定在电极的表面，利用抗体与抗原的特异性免疫反应捕获纤维连接抗原蛋白，再通过捕获在电极上的抗原进一步结合末端标记有生物素的多克隆抗体2，最后利用生物素与亲和素的特异性反应，将标记有亲和素的辣根过氧化酶结合到电极表面，实现该特异性免疫反应与电化学酶联放大的高灵敏性相结合的电化学免疫传感器的制备。
2.根据权利要求1所述电化学传感器的工作电极的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）金电极表面预处理：将金电极表面进行抛光处理，使其呈镜面状，并用N2吹干，备用；
（2）孵育纤维连接蛋白的单克隆抗体1：先将纤维连接蛋白抗体加到步骤（1）制备得到的工作电极表面上孵育1-15 h，再用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白抗体，室温下晾干，备用；
（3）BSA封闭非特异性吸附位点：将步骤（2）所制得电极在一定反应条件下将其浸泡在一定浓度牛血清蛋白溶液中，反应15-30 min，封闭非特异性吸附位点，再用pH 7.4的PBS洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的牛血清蛋白，室温下晾干，备用；
（4）抗原与金电极上纤维连接蛋白的单克隆抗体1的特异性免疫反应：将不同浓度的纤维连接蛋白溶液加到步骤（3）所制得的电极表面上，在一定反应条件下抗原特异性结合到纤维连接蛋白的单克隆抗体1上，再用pH 7.4的PBS洗掉与纤维连接蛋白的单克隆抗体1结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白，室温下晾干，备用；
（5）末端标记有生物素的多克隆抗体2与抗原结合：将一定浓度的末端标记有生物素的多克隆抗体2加到步骤（4）所制得的电极表面上，在一定条件下抗原与末端标记有生物素的多克隆抗体2发生特异性免疫反应，再用pH 7.4的PBS洗掉与抗原结合不够稳定及未结合的末端标记有生物素的多克隆抗体2，室温下晾干，备用；
（6）标记有亲和素的辣根过氧化物酶(s-HRP)与末端标记有生物素的多克隆抗体2结合：将足量的s-HRP溶液加到步骤（5）所制得的电极表面上，在一定条件下标记有亲和素的辣根过氧化物酶中的亲和素与末端标记有生物素的多克隆抗体2中的生物素特异性结合，再用pH 7.4的PBS洗掉与生物素结合不够稳定及未结合的s-HRP，即制得检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器。
3.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：步骤（4）反应条件为温度25～45 ℃，时间30～90 min。
4.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：步骤（5）反应条件为温度37 ℃，时间30～120 min。
5.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：步骤（6）反应条件为室温，时间15～30 min。
6.根据权利要求2～5中任一项权利要求所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：步骤（2）构建电化学免疫传感器中，所述纤维连接蛋白单克隆抗体的浓度为50～200μg/mL。
7.根据权利要求2～5中任意一项权利要求所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）构建电化学免疫传感器中，所述的牛血清蛋白质量浓度为0.5 wt%～2wt%。
8.根据权利要求2～5中任意一项权利要求所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）构建电化学免疫传感器中，所述的末端标记有生物素的多克隆抗体2浓度为60～300 μg/mL。
9.权利要求1-8任一所述的方法制得的检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器。
10.权利要求1-8任一所述的方法制得的电化学免疫传感器或权利要求9所述的检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器应用于特异性检测纤维连接蛋白，不受甲状腺球蛋白、胎牛血清白蛋白、癌胚抗原或前列腺癌抗原干扰。
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