CN106977591A - 一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，采用两种混合机制的填料，两步层析及超滤的方式有效地去除了内毒素、大肠杆菌菌体残留蛋白(HCP)、大肠杆菌残留DNA、蛋白质聚集体等一系列杂质，采用最少的步骤，获得最纯的目标样品，节省了工艺控制成本，同时具有稳定性好、过程控制指标明确、适合规模化工业化生产等特点。经纯化后的蛋白溶液，用高效液相及SDS‑PAGE电泳测得蛋白纯度大于97％；蛋白回收率大于75％；内毒素降低至1EU/mg以下；HCP及大肠杆菌残留DNA均低于5ppm，可作为原材料用于合成临床用葡萄球菌蛋白A免疫吸附剂。
Description
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法。
背景技术：
葡萄球菌蛋白A(简称蛋白A或SPA)是一种多肽单链结构的蛋白质，含有5个高度类似的免疫球蛋白Fc段结合区，能特异性地与人体免疫球蛋白(IgG)结合。将SPA偶联到琼脂糖载体上，制备成载体-SPA复合物装入柱子制成葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱，人体血浆通过该层析柱时，血浆中的IgG型致病抗体将被特异性地吸附掉，一些因IgG型抗体质与量的改变而导致的疾病与症状能够得到明显的治疗和缓解。葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱已广泛应用于自身免疫性疾病、器官移植及恶性肿瘤等疾病的治疗，市场前景广阔。
由于葡萄球菌蛋白A的用途广泛，市场需求量日益增加。仅从金黄色葡萄球菌中直接提取天然蛋白，不仅无法满足市场需求。因此近年来人们开始转向基因工程的方法来生产重组葡萄球菌蛋白A。目前葡萄球菌蛋白A主要是通过基因工程菌-大肠杆菌进行表达，通过层析技术纯化，最终得到符合要求的产品。由于大肠杆菌的培养液中含有多种蛋白杂质以及核酸、脂类等非蛋白杂质，给下游的纯化带来严峻考验。其中内毒素是影响最大的因素，内毒素会导致人体发热、寒颤等不良影响，医药行业对医药制品的内毒素含量有较高的要求，例如注射用药剂中内毒素含量必须保证每千克体重每小时的摄入量低于5EU。但是从蛋白体系中去除内毒素仍然是业界的一个难题，其主要原因是蛋白质体系比较复杂，并且多种蛋白质与内毒素之间存在强烈的作用力，两者结合在一起，难以分离，因此目前还没有从蛋白质体系中去除内毒素的普适法则，相关研究也都仅适用于某一种蛋白体系。杂质宿主蛋白和宿主DNA对机体影响也较大，100ppm的大肠杆菌菌体残留蛋白(HCP)便能够引起患者的免疫反应，宿主DNA因存在特别的潜在安全风险，一直都是国内外药监部门关注的重点。葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱进行临床治疗时，需要在体外建立循环，属于三类医疗器械，风险较大。葡萄球菌蛋白A作为重要原材料之一，其质量直接影响吸附柱的安全性。所以开发工艺简便、可放大、纯度较高的葡萄球菌蛋白A的纯化方法尤为重要。
目前关于重组葡萄球菌蛋白A纯化的专利报道非常多，如通过Ni柱亲和层析纯化(CN201010614100.5，CN201210096913.9，CN200810028707.8，CN200810028706.3，CN200810028704.4，CN201010110754.4，CN201010110754.4)；用Sephacryl S200分子筛法纯化(CN03149982.1，CN200710085148.X，CN201010225393.8)；以IgG的Fc片段为配基亲和层析填料一步纯化法或结合离子交换纯化(CN201010227290.5，CN201210118134.4)GSTrapFF柱亲和层析和Superdex 7510/300GL分子筛法纯化(CN201080013514.0)。CN200680034577.8所用的第一层析柱为阴离子交换柱、HIC柱和陶瓷羟基磷灰石柱，第二层析柱为阳离子交换柱，或者1，2柱使用顺序相交换。上述这些专利均未提到蛋白溶液中杂质的含量。但对于蛋白A的分离纯化而言，不仅要求达到较高的纯度，还要严格控制内毒素、蛋白杂质以及核酸、脂类等非蛋白杂质的含量。专利CN103145813B提到了如何去除内毒素，主要采用两次活性炭吸附—疏水层析法，因活性炭为粉末状，实际操作不太方便。
发明内容：
本发明的目的是提供一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，该方法操作简便，有效地去除内毒素、蛋白质聚集体、大肠杆菌菌体残留蛋白(HCP)、大肠杆菌残留DNA等杂质，纯化的蛋白溶液中大肠杆菌残留DNA及HCP量均低于5ppm，内毒素低于1EU/mg，蛋白纯度达97％以上，适用于工业化生产，可作为原材料用于合成临床用葡萄球菌蛋白A免疫吸附剂。
本发明中术语蛋白A或重组葡萄球菌蛋白A是指全长或仅含有其中某个或某些结构域的葡萄球菌蛋白A基因经克隆、转化并在大肠杆菌细胞内表达得到的重组蛋白质。
术语纯化指从含有目标蛋白质及一种或多种杂质的组合物或样品中提高目的多肽或蛋白质或靶蛋白的纯度。
术语免疫球蛋白(Ig)指由两条相同的轻链和两条相同的重链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。
术语“层析填料”、“介质”、“填料”、“层析介质”意义相同，指装填于层析柱中，利用各组分物理化学性质的不同，将多组分混合物进行分离，以完成层析过程的物质。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，该方法包括以下步骤：
1)菌体预处理：将含有葡萄球菌蛋白A的菌体加入到Bis-tris缓冲液，然后用均质机破碎后离心收集上清液，调节pH至2.0-4.0，离心收集上清液，然后调节pH至6.5-7.2，得到蛋白液；
2)第一层析柱处理：将步骤1)得到的蛋白液上样至已用平衡液平衡的装有耐盐型阴离子交换填料的层析柱中，继续用平衡液平衡，用冲洗液冲洗，最后用洗脱液洗脱葡萄球菌蛋白A，收集洗脱峰得第一收集液；所述平衡液含10-30mM Bis-tris、0.5-2wt％TritonX-100、0.1mol/L NaCl，pH6.5-7.2；所述冲洗液含10-30mM Bis-tris、0.1mol/LNaCl，pH 6.5-7.2；所述洗脱液含10-30mM Bis-tris、1mol/L NaCl，pH 6.5-7.2；
3)超滤置换缓冲液：将步骤2)得到的第一收集液用截流分子量为5KD的超滤膜包超滤置换为pH 6.8-7.5，含5-20mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.1-0.3M脯氨酸的缓冲液，由此得到蛋白液；
4)第二层析柱处理：将步骤3)得到的蛋白溶液上样至已用平衡液平衡的装有羟基磷灰石层析填料的柱子中，继续用平衡液平衡，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰得第二收集液；所述平衡液含5-20mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.1-0.3M脯氨酸，pH 6.8-7.5；所述洗脱液含100mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH 6.8-7.5；
5)超滤置换为保存液：将步骤4)得到的第二收集液用截流分子量为5KD的超滤膜包超滤置换为生理盐水溶液，由此得到分离纯化的葡萄球菌蛋白A。
所述的步骤1)的菌体预处理优选为：取含有葡萄球菌蛋白A的菌体，按照质量:体积＝1kg:10L的比例将菌体加入到pH＝7.2，浓度为10-30mM的Bis-tris缓冲液，用高压均质机800bar压力下破碎然后离心收集上清液；用盐酸调节pH至2.0-4.0，离心收集上清液，然后用NaOH调节pH至6.5-7.2，得到蛋白液。步骤1)用高压均质机800bar压力下破碎取代加热及溶菌酶的方法破碎菌体，能耗低，不需要复杂的加热保温装置，能够实现连续化操作及工业放大。
步骤2)中的耐盐型阴离子交换填料为TOYOPEARL NH2-750F耐盐型阴离子交换填料，其粒径为30-60μm，内毒素在pH>3.1的溶液中带有部分的负电荷，通过电荷作用结合于TOYOPEARL NH2-750F阴离子交换填料上，被内毒素污染的蛋白上样后，用平衡液和冲洗液除去部分内毒素，然后利用梯度洗脱的方法，先将目标蛋白洗脱下来，再用高盐缓冲液及NaOH将留在柱子上的内毒素去除。
步骤2)，优选地，平衡液含20mM Bis-tris及1％TritonX-100、0.1mol/LNaCl，pH7.0；冲洗液含20mM Bis-tris、0.1mol/LNaCl，pH 7.0；洗脱液含20mM Bis-tris及1mol/LNaCl，pH7.0。
步骤4)羟基磷灰石层析填料粒径为40μm，优选CHT typeⅠ。羟基磷灰石是目前应用最广泛的无机层析填料，高度耐碱，生物安全性好，由于其独特的分离机制，可进行高分辨率的分离。
步骤4)，优选地，平衡液含5mM Na2HPO4-NaH2PO4及0.2M脯氨酸，pH 7.0；洗脱液为100mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0。
步骤3)、步骤5)中超滤膜包的材料优选为聚醚砜(PES)。
本发明的有益效果如下：
1.本发明利用蛋白A在酸性条件下极其稳定，能够耐受最低pH 2.0的极端条件，步骤1)中将破碎上清的pH降低至2.0-4.0后，能够将其中含有的大肠杆菌残留DNA及部分杂蛋白、细胞碎片共沉淀，大大降低了溶液的浊度，从而与阴离子交换柱的结合更加紧密，蛋白得率提高；同时也大大降低了大肠杆菌残留DNA的残留量，提高了蛋白纯度；也避免了用深层过滤器过滤去除杂质的方法，大大降低了生产成本。
2.本发明纯化的第一步采用TOYOPEARL NH2-750F耐盐型阴离子交换填料，此阴离子交换填料兼具了疏水作用和离子交换作用，高度耐盐，所以步骤1)得到的蛋白液不用稀释可以直接上样，简化了纯化流程，蛋白得率增高；同时填料的粒径30-60μm，比传统的sepharose平均粒径90μm，粒径越小，分离效果越好，能够除去更多的杂蛋白，减轻下一步的纯化压力。另外，离子交换填料能够有效地去除大肠杆菌破碎上清中的内毒素，内毒素含量由5000～10000EU/mg降至100EU/mg以下。
3.在下游合成吸附剂填料时主要通过蛋白质氨基连接至琼脂糖、纤维素载体上。常用的离子交换柱采用Tris-HCl缓冲液，在终蛋白溶液中会有少量的残留，因Tris(结构式为：)分子式含有氨基，所以微量的tris(mM)也会干扰下游吸附剂的合成，导致吸附性能降低。本发明中第一层析柱采用Bis-tris(结构式为)缓冲液代替常用的Tris-HCl缓冲液能够显著提高蛋白A与层析柱的结合力，增加蛋白的回收率。同时，因为Bis-tris分子结构不含有自由的氨基，不会与蛋白质上的氨基竞争结合位点，所以对下游的蛋白连接到载体合成蛋白A吸附填料无影响。
4.本发明采用羟基磷灰石作为最后一步精细纯化，其平均粒径40μm，能够进一步去除二聚体、内毒素、微量的大肠杆菌残留DNA、HCP等杂质，提高产品纯度。
5.在蛋白纯化过程中因浓度、pH、温度等原因会导致蛋白质的聚集，以类二聚体或多聚体的形式存在，是影响蛋白纯度的主要原因。L-脯氨酸是人体合成蛋白质的十八种氨基酸之一，能够抑制蛋白质的聚集，增强蛋白质的稳定性。加入少量的脯氨酸能够促进蛋白质处于天然构象，使蛋白A与类二聚体更好地分离，通过精细分离除去更多的蛋白杂质。
综上所述，本发明操作简单，采用2种混合机制的填料，两步层析及超滤的方式有效地去除了内毒素、大肠杆菌菌体残留蛋白(HCP)、大肠杆菌残留DNA、蛋白质聚集体等一系列杂质，采用最少的步骤，获得最纯的目标样品，节省了工艺控制成本，同时具有稳定性好、过程控制指标明确、适合规模化工业化生产等特点。经纯化后的蛋白溶液，用高效液相及SDS-PAGE电泳测得蛋白纯度大于97％；蛋白回收率大于75％；内毒素降低至1EU/mg以下；HCP及大肠杆菌残留DNA均低于5ppm，可作为原材料用于合成临床用葡萄球菌蛋白A免疫吸附剂，可实现年产量千克级的规模化生产，同时也为其它蛋白纯化的工业化生产提供参考。
附图说明：
图1是为重组葡萄球菌蛋白A的SDS-PAGE凝胶电泳结果；其中泳道1为低分子量蛋白marker，由上往下分子量大小分别为98kDa、66.2kDa、45kDa、31kDa、20kDa、14.4kDa，重组葡萄球菌蛋白A的分子量大小约为20kDa；泳道2为实施例1得到的终蛋白溶液；泳道3为实施例2得到的终蛋白溶液。
图2为实施例1中重组葡萄球菌蛋白A的HPLC图谱。
图3为实施例2中重组葡萄球菌蛋白A的HPLC图谱。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1)菌体预处理：取1kg含有葡萄球菌蛋白A的菌体(如表达葡萄球菌蛋白A的基因工程菌大肠杆菌)，加入10L，pH＝7.2，浓度为10mM的Bis-tris缓冲液悬浮菌体，然后用高压均质机在压力800bar破碎2次，离心收集上清液约10L。将所得到的溶液加入盐酸调节pH至2.0，离心，上清液用氢氧化钠调至pH＝6.5，得到蛋白液。
2)第一层析柱处理：将装有TOYOPEARL NH2-750F填料的层析柱用含10mM Bis-tris及0.5wt％TritonX-100、0.1mol/LNaCl,，pH 6.5的平衡液平衡5倍柱体积，将步骤1得到的蛋白液上样至已用平衡液平衡的装有TOYOPEARL NH2-750F耐盐型阴离子交换填料的层析柱中，继续用平衡液平衡5倍柱体积，然后用含10mM Bis-tris、0.1mol/LNaCl，pH 6.5的冲洗液冲洗5倍柱体积，最后用含10mM Bis-tris及1mol/L NaCl，pH 6.5的洗脱液洗脱目标蛋白葡萄球菌蛋白A，收集洗脱峰得到第一收集液。
3)超滤置换缓冲液：将步骤2)得到的第一收集液用截流分子量为5KD的PES超滤膜包，等体积超滤5倍体积，置换为pH 6.8，含5mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.1M脯氨酸的缓冲液，得到蛋白液。
4)第二层析柱处理：将装有羟基磷灰石层析填料的柱子用含5mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.1M脯氨酸，pH6.8的平衡液平衡5倍柱体积，将步骤3)得到的蛋白液上样至已用平衡液平衡的装有羟基磷灰石层析填料的柱子中，继续用平衡液平衡5倍柱体积，然后用100mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH 6.8洗脱液洗脱，收集洗脱峰得第二收集液。
5)超滤置换为保存液：将步骤4)得到的第二收集液用截流分子量为5KD的超滤膜包等体积超滤5倍体积，置换为生理盐水溶液，由此得到蛋白溶液，即为分离纯化的葡萄球菌蛋白A。
步骤5的蛋白溶液中蛋白纯度及杂质的测定：蛋白纯度采用电泳法和高效液相色谱法测定，结果分别参见图1和图2，用反相色谱法测得蛋白纯度为97.1％(图2)。内毒素含量用凝胶法鲎试剂进行测定。大肠杆菌菌体残留蛋白量使用大肠杆菌宿主残留蛋白(E.coli P)ELISA试剂盒测定。大肠杆菌残留DNA残留量使用Quant-iTTM dsDNA试剂盒进行测定。结果见表1。
表1步骤5的蛋白溶液中各杂质测定结果
| 测定项目 | 结果 |
| 蛋白纯度 | 97.1％ |
| 蛋白回收率 | 78％ |
| 内毒素 | ＜1EU/mg |
| HCP | ＜2ppm |
| 大肠杆菌残留DNA | ＜5ppm |
实施例2
1)菌体预处理：取1kg含有葡萄球菌蛋白A的菌体(如表达葡萄球菌蛋白A的基因工程菌大肠杆菌)，加入10L，pH＝7.2，浓度为30mM的Bis-tris缓冲液悬浮菌体，然后用高压均质机在压力800bar破碎2次，离心收集上清液约10L。将所得到的溶液加入盐酸调节pH至4.0，离心，上清液用氢氧化钠调至pH＝7.2，得到蛋白液。
2)第一层析柱处理：将装有TOYOPEARL NH2-750F填料的层析柱用平衡液(含20mMBis-tris及1wt％TritonX-100、0.1mol/LNaCl,，pH 7.0)平衡5倍柱体积，将步骤1得到的蛋白液上样至已用平衡液平衡的装有TOYOPEARL NH2-750F耐盐型阴离子交换填料的层析柱中，继续用平衡液平衡5倍柱体积，然后用冲洗液(含20mM Bis-tris、0.1mol/LNaCl，pH7.0)冲洗5倍柱体积，最后用洗脱液(含20mM Bis-tris及1mol/L NaCl，pH 7.0)洗脱目标蛋白葡萄球菌蛋白A，收集洗脱峰得到第一收集液。
3)超滤置换缓冲液：将步骤2)得到的第一收集液用截流分子量为5KD的PES超滤膜包，等体积超滤5倍体积，置换为pH 7.0，含5mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.2M脯氨酸的缓冲液，得到蛋白液。
4)第二层析柱处理：将装有羟基磷灰石层析填料的柱子用平衡液(pH 7.0，含5mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.2M脯氨酸)平衡5倍的柱体积，将步骤3)得到的蛋白液上样至已用平衡液平衡的装有羟基磷灰石层析填料的柱子中，继续用平衡液平衡5倍柱体积，然后用洗脱液(100mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0)洗脱，收集洗脱峰第二收集液。
5)超滤置换为保存液：将步骤4)得到的第二收集液用截流分子量为5KD的超滤膜包等体积超滤5倍体积，置换为生理盐水溶液，由此得到蛋白溶液(蛋白A溶液)，即为分离纯化的葡萄球菌蛋白A。
步骤5的蛋白溶液中蛋白纯度及各杂质的检测方法同实施例1。结果分别参见图1和图2，用反相色谱法测得蛋白纯度为97.6％(图3)。结果见表2。
表2蛋白溶液中各杂质测定结果
| 测定项目 | 结果 |
| 蛋白纯度 | 97.6％ |
| 蛋白回收率 | 76％ |
| 内毒素 | ＜1EU/mg |
| HCP | ＜1ppm |
| 大肠杆菌残留DNA | ＜1ppm |
实施例3
基本同实施例1，不同之处在于，步骤1)菌体预处理：取1kg含有葡萄球菌蛋白A的菌体，加入10L，pH＝7.2，浓度为20mM的Bis-tris缓冲液悬浮菌体，然后用高压均质机在压力800bar破碎2次，离心收集上清液约10L。将所得到的溶液加入盐酸调节pH至3.0，离心，上清液用氢氧化钠调至pH＝7.2，由此得到蛋白溶液。
实施例4
基本同实施例1，不同之处在于，步骤2)中第一层析柱处理：平衡液含30mM Bis-tris及2wt％TritonX-100、0.1mol/LNaCl,，pH7.2；冲洗液含30mM Bis-tris、0.1mol/LNaCl，pH7.2洗脱液含30mM Bis-tris及1mol/L NaCl，pH 7.2。
实施例5
基本同实施例2，不同之处在于，步骤3)中超滤置换缓冲液为pH 7.2，含10mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.2M脯氨酸的缓冲液。步骤4)第二层析柱处理中平衡液含10mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.2M脯氨酸，pH为7.2；洗脱液含100mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.2。
实施例6
基本同实施例2，不同之处在于，步骤3)中超滤置换缓冲液为含20mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.3M脯氨酸，pH7.5的缓冲液。步骤4)第二层析柱处理中平衡液含20mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.3M脯氨酸，pH7.5；洗脱液含100mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.5。
实施例7：蛋白A活性鉴定
将纯化后得到的重组葡萄球菌蛋白A连接至琼脂糖载体上，进行血浆吸附实验，测定合成的吸附剂对人血浆中IgG型抗体的吸附效果，以此评价蛋白的活性。
利用高碘酸钠氧化法，将实施例1、2得到的蛋白A溶液分别偶联到Sepharose 6FF上。具体方法如专利201010512304.8所述。通过模拟临床上免疫吸附的步骤，在体外对血浆内免疫球蛋白吸附性能测试，评价其吸附性能，进而可以了解其临床使用价值，具体步骤如专利201010512304.8所示，测得实施例1，2中重组葡萄球菌蛋白A为配基的免疫吸附剂对人血浆中IgG的吸附量分别为34mg/g、37mg/g填料，对比同条件下阴离子交换层析采用tris-HCl体系纯化的蛋白，其合成填料的吸附性能分别为30mg/g、33mg/g填料，平均吸附性能提高了13％和12％。吸附性能越高，相同治疗时间或循环次数下，致病性抗体的下降率越高，对疾病的转归更有帮助，所以提高10％-15％的吸附性能也是非常有意义的。
对实施例3、4、5、6中的蛋白溶液按照上述检测方法分别对蛋白纯度、HCP残留量、大肠杆菌残留DNA残留量、吸附性能等进行检测，检测结果均符合要求，即蛋白纯度大于97％；蛋白回收率大于75％；吸附性能大于33mg/g；内毒素降低至1EU/mg以下；HCP及DNA均低于5ppm。
Claims (7)
1.一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)菌体预处理：将含有葡萄球菌蛋白A的菌体加入到Bis-tris缓冲液，然后用均质机破碎后离心收集上清液，调节pH至2.0-4.0，离心收集上清液，然后调节pH至6.5-7.2，得到蛋白液；
2)第一层析柱处理：将步骤1)得到的蛋白液上样至已用平衡液平衡的装有耐盐型阴离子交换填料的层析柱中，继续用平衡液平衡，用冲洗液冲洗，最后用洗脱液洗脱葡萄球菌蛋白A，收集洗脱峰得第一收集液；所述平衡液含10-30mM Bis-tris、0.5-2wt％TritonX-100、0.1mol/L NaCl，pH6.5-7.2；所述冲洗液含10-30mM Bis-tris、0.1mol/LNaCl，pH 6.5-7.2；所述洗脱液含10-30mM Bis-tris、1mol/L NaCl，pH 6.5-7.2；
3)超滤置换缓冲液：将步骤2)得到的第一收集液用截流分子量为5KD的超滤膜包超滤置换为pH 6.8-7.5，含5-20mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.1-0.3M脯氨酸的缓冲液，由此得到蛋白液；
4)第二层析柱处理：将步骤3)得到的蛋白溶液上样至已用平衡液平衡的装有羟基磷灰石层析填料的柱子中，继续用平衡液平衡，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰得第二收集液；所述平衡液含5-20mM的Na2HPO4-NaH2PO4及0.1-0.3M脯氨酸，pH 6.8-7.5；所述洗脱液含100mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH 6.8-7.5；
5)超滤置换为保存液：将步骤4)得到的第二收集液用截流分子量为5KD的超滤膜包超滤置换为生理盐水溶液，由此得到分离纯化的葡萄球菌蛋白A。
2.根据权利要求1所述的分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，其特征在于，步骤2)中的耐盐型阴离子交换填料为TOYOPEARL NH2-750F耐盐型阴离子交换填料，其粒径为30-60μm。
3.根据权利要求1或2所述的分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，其特征在于，所述的菌体预处理为：取含有葡萄球菌蛋白A的菌体，按照质量:体积＝1kg:10L的比例将菌体加入到pH＝7.2，浓度为10-30mM的Bis-tris缓冲液，用高压均质机800bar压力下破碎然后离心收集上清液；用盐酸调节pH至2.0-4.0，离心收集上清液，然后用NaOH调节pH至6.5-7.2，得到蛋白液。
4.根据权利要求1或2所述的分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，其特征在于，步骤2)中平衡液含20mM Bis-tris及1％TritonX-100、0.1mol/LNaCl，pH 7.0；冲洗液含20mM Bis-tris、0.1mol/LNaCl，pH 7.0；洗脱液含20mM Bis-tris及1mol/L NaCl，pH7.0。
5.根据权利要求1或2所述的分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，其特征在于，步骤4)的羟基磷灰石层析填料粒径为40μm。
6.根据权利要求1或2所述的分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，其特征在于，步骤4)的平衡液含5mM Na2HPO4-NaH2PO4及0.2M脯氨酸，pH 7.0；洗脱液为100mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0。
7.根据权利要求1或2所述的分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，其特征在于，步骤3)、步骤5)中超滤膜包的材料为聚醚砜。
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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