CN106957315A

CN106957315A - N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物及其制备药物的用途

Info

Publication number: CN106957315A
Application number: CN201610009585.2A
Authority: CN
Inventors: 郑灿辉; 朱驹; 周有骏; 王重庆; 王明萍; 杨超; 田巍
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2016-01-08
Filing date: 2016-01-08
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2036-01-08
Also published as: CN106957315B

Abstract

本发明涉及一类N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物，其晶型、药学上可接受的盐类、水合物、溶剂合物或前药，及其制备方法和制药用途。所述化合物的结构通式如式(Ⅰ)所示。试验表明其对Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员和HDAC具有较高的抑制活性，并表现出结合选择性，同时该类化合物对人血液肿瘤(骨髓瘤、白血病)和实体瘤(卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌)显示了广谱抗肿瘤活性。提示该类化合物具有制备与Bcl-2或HDAC活性相关的疾病的治疗药物，制备抗肿瘤药物，以及制备增效剂与其它抗肿瘤药物或放射治疗合用以治疗肿瘤的潜在用途。

Description

N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物及其制备药物的用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体而言，本发明涉及一类N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物，本发明还涉及该类化合物的组合物、制备方法及其在制备抗肿瘤药和抗肿瘤增效剂中的用途。

背景技术

细胞凋亡是细胞受到某种信号刺激后进行的程序化死亡，是细胞的一种基本生物学现象。Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡通路中起重要的调节作用，它可以分为抗凋亡成员(如Bcl-2、Bcl-x_L、Mcl-1等)和促凋亡成员两类。研究表明Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员过度表达可导致正常细胞凋亡通路受阻，与许多疾病(如肿瘤、自身免疫性疾病等)的发生相关，特别是肿瘤产生及发生耐药的重要原因之一(Nature 2000,407,796-801；Nat Rev Cancer 2004,4,592-603.)。

研究表明Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员在许多肿瘤中过度表达，在不同肿瘤以及不同肿瘤亚型中的表达水平不同(Oncogene 2003,22,8590-607；Oncogene 2008,27,6398-406)。通过抑制肿瘤细胞中过度表达的抗细胞凋亡成员的抗凋亡作用，可以恢复其正常的凋亡通路，增加其对化疗放疗的敏感性，是治疗肿瘤的新策略。Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员是通过其表面的疏水凹槽与促凋亡成员的Bcl-2蛋白家族保守区域(BH)3结合而发生相互作用，来调节细胞正常的生理凋亡。小分子抑制剂通过结合于抗凋亡成员表面疏水凹槽，可以干扰促凋亡成员BH3区域与之结合起到促进细胞凋亡的作用(Nat Rev Cancer 2005,5,876-85；Kelly,P.N.；Cell Death Differ 2011,18,1414-24.)。近些年该类小分子抑制剂引起了研究者的广泛兴趣，通过不同途径发现了一系列小分子抑制剂，其中有四个(ABT-199，ABT-263，AT-101，GX15-07)作为口服抗肿瘤药物进入临床研究。研究结果表明Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员小分子抑制剂展现出较好的抗肿瘤作用和对其他抗肿瘤药物或放射治疗的增效协同作用，具有很好的发展前景(Nat Rev Drug Discov 2008,7,989-100；中国新药杂志2008,17,2008-2013.；药学进展2004,28,97-103；Clin Cancer Res 2012,18,1-7；J Thorac Oncol 2011,6,1757-1760；Lung Cancer 2011,74,481-485)。

HDAC和组蛋白乙酰化酶是体内两组具有相反功能的酶，可以调节包括组蛋白在内的多种核内外蛋白乙酰化状态的作用，从而发挥调节基因转录、细胞分化、细胞周期和细胞凋亡等多种功能。HDAC包括四个亚家族，Zn²⁺依赖的I型(HDAC1-3，8)、IIA(HDAC4，5，7，9)、IIB(HDAC6，10)和IV(HDAC11)，及NAD⁺依赖的III型(sirtuins 1-7)。HDAC被证实与肿瘤、神经系统疾病及炎症和感染等疾病的发生和发展有密切关系。因而HDAC广谱和选择性小分子抑制剂被用于肿瘤、神经系统疾病、炎症和病毒感染等疾病的治疗和研究(Nat Rev Drug Discov 2014,13,673-91；Pharmacol Ther 2014,143,323-36.)。

HDAC高表达或活性提高而导致的蛋白去乙酰化增加是很多肿瘤的典型特征之一，在多种血液系统肿瘤中都可观察到HDAC表达增加(Cancer Lett 2009,280,168-76)。多发性骨髓瘤也被明确证实I型HDAC(特别是HDAC1)常见高表达，并与不良预后密切相关(Epigenetics 2014,9,1511-20)。因此，靶向HDAC逐渐成为肿瘤治疗的研究热点之一(Lancet Oncol 2013,14,1038-9.)。近年来，HDAC小分子抑制剂发展非常迅速，主要包括异羟肟酸类、苯甲酰胺类、环肽类和短链脂肪酸类等。它们在体内外表现出针对血液系统肿瘤、肺癌和前列腺癌等的广泛抗肿瘤效果(Nat Rev Drug Discov 2014,13,673-91；J Med Chem 2008,51,1505-29.)。目前国外已批准上市三个该类药物伏立诺他(vorinostat，SAHA)、罗米地辛(romidepsin)(J Clin Invest 2014,124,30-9.)和贝利司他(belinostat，2014.07批)(Br J Haematol 2015,168,811-9.)，国内刚批准上市一个药物西达本胺(chidamide，2015.01批准)(Cancer Chemother Pharmacol 2012,69,1413-22.)，被批准用于皮肤或外周T细胞淋巴瘤的治疗。而多个HDAC抑制剂已在临床试验中显示出很好的抗多发性骨髓瘤效果，且与其他抗肿瘤药物合用可起到显著增效作用，2015.02帕比司他(panobinostat)被FDA批准与硼替佐米和地塞米松合用用于多发性骨髓瘤治疗(Lancet Oncol 2014,15,1195-206.)。另外，由于亚型选择性抑制剂可能具有更好的疗效和更低的副作用，逐渐成为近年研究热点(Nat Rev Drug Discov 2014,13,673-91；Curr Pharm Des 2015,21,1472-502.)。研究证实新近发现的HDAC6选择性抑制剂(如rocilinostat，ACY-1215)能通过影响聚集小体形成参与到蛋白质降解系统，从而与该系统另一蛋白酶体通路的抑制剂硼替佐米起到协同增效治疗多发性骨髓瘤的作用，目前已经进入临床试验中(Blood 2012,119,2579-89；Br J Haematol.2015,169,423-34)。HDAC6选择性抑制剂还被用于神经系统疾病(神经退行性疾病、阿尔兹海默症等)和炎症等疾病治疗的研究(Nat Rev Drug Discov 2014,13,673-91.)。

如前所述，HDAC抑制剂和Bcl-2抗凋亡蛋白亚家族抑制剂各自被证实对其他抗肿瘤药物或放射治疗具有增效协同作用。目前正在开展的临床试验也多采用与现有治疗药物联合用药的方案。研究还显示这两类药物相互之间也具有协同增效抗肿瘤作用(Mol Cell Biol 2009,29,6149-69；Cell Death Dis 2013,4,e798)，且最新研究表明它们联用能更好的起到对其他抗肿瘤药物的增效协同作用(Blood 2014,124,2687-97)。研究表明，对于肿瘤、中枢神经系统疾病等机制复杂的疾病，多靶点药物可同时作用于疾病网络系统中的多个环节，不易产生耐药性，对各靶点的作用产生协同效应，减低靶点相关毒性，达到更佳治疗效果(Nat Rev Cancer 2010,10,130-7)。并且与两类药物联用相比，双靶点药物具有更加单一药代动力学性质，不存在复杂的药物间相互作用，有利于药物疗效的完全发挥，也可以降低开发成本，增加患者依从性(J Med Chem 2014,57,7874-87)。因此，Bcl-2抗凋亡蛋白亚家族和HDAC双靶点抑制剂可通过互相协同效应，起到更好的抗肿瘤或增效作用。

综上所述，研发Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员或HDAC的抑制剂，尤其是能同时作用于这两个靶点的双重抑制剂，对于肿瘤等疾病的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一类新型的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物以及该类化合物的制备方法、用途和组合物。

在本发明的第一方面，提供了一种N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物，其特征在于，其结构通式如式(I)所示：

其中，

R₁基团是其中，R₂为C₁～C₅直链、支链或环状烷烃基；

Z是N，O，S，

Y是C₁～C₁₀直链、支链或环状烷烃基，C₁～C₁₀直链、支链或环状烯烃基，芳香单环，芳香稠环。

作为本发明的一个优选例：

R₁基团是其中，R₂为C₁～C₅直链、支链或环状烷烃基；

Z是N，O，S；

Y是C₁～C₁₀直链、支链或环状烷烃基，C₁～C₁₀直链、支链或环状烯烃基。

作为本发明的另一优选例：

R₁基团是

Z是N，O，S；

作为本发明的另一优选例：

R₁基团是

Z是N；

Y是C₁～C₁₀直链烷烃基。

作为本发明的一种优选实施方式，所述N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物为下列化合物中的任一个：

1)2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-N-(4-(8-(羟基氨基)-8-氧代辛氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺

2)2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-N-(4-(7-(羟基氨基)-7-氧代庚氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺

3)2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-N-(4-(6-(羟基氨基)-6-氧代己氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺

4)2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-N-(4-(5-(羟基氨基)-5-氧代己氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺

5)2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-N-(4-(4-(羟基氨基)-4-氧代己氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺

6)2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-N-(4-(3-(羟基氨基)-3-氧代己氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺

7)2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-N-(4-(2-(羟基氨基)-2-氧代乙氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺。

在本发明的第二方面，提供了所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物的晶型、药学上可接受的无机酸盐或有机酸盐、水合物、溶剂合物或前药。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有药学上可接受的赋形剂或载体，以及所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物或所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物的晶型、药学上可接受的无机酸盐或有机酸盐、水合物、溶剂合物或前药。

作为本发明的一种具体实施方式，所述的药物组合物还含有其他药物活性成分。

作为本发明的一个优选例，所述的其他药物活性成分为硼替佐米。

更优选地，该药物组合物中所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物与硼替佐米的摩尔比例为20-3000。

在本发明的第四方面，提供了所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物，或所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物的晶型、药学上可接受的无机酸盐或有机酸盐、水合物、溶剂合物或前药在制备药物中的用途，所述的药物用于：

a)治疗与Bcl-2或HDAC活性相关的疾病或症状，

b)抗肿瘤，或

c)作为抗肿瘤药或放射治疗的增效剂。

作为本发明的一种具体实施方式，所述的肿瘤为骨髓瘤、白血病、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或肺癌。

在本发明的第五方面，提供了所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物的制备方法，包括下列步骤：在缩合剂存在的条件下，不同取代的氮杂吲哚氧基苯甲酸与不同取代的磺酰胺发生缩合生成不同取代的N-取代苯磺酰基苯甲酰胺类化合物。

本文中，“前药”是指一个试剂在体内转化为原型药。前药通常是有用的，因为在某种情况下，它们可能比原型药容易给药。前药通常是药的前体，接下来的给药和吸收被转化为活性物质，或通过一些过程变为活性更强的种类，如通过代谢途径转化。一些前药具有的化学基团使其活性较低和/或对比原型药的溶解性或一些其它性质有所改变。一旦前药的化学基团被去除和/或对其修饰，得到活性药。

所述的药学上可接受的无机酸盐可选自盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐；所述的药学上可接受的有机酸盐可选自乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、草酸盐。

所述药物组合物可以是固体形式或是液体形式，其剂型可以是片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。当本发明化合物用于上述用途时，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、丸剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或以外用方式给药：软膏剂、凝胶、含药胶布等，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约0.01-99％，更佳地约为0.1-90％(重量)的活性成分。适合的给药途径包括但不限于口服、静脉注射、直肠、气雾剂、非肠道给药、眼部给药、肺部给药、经皮给药、阴道给药、耳道给药、鼻腔给药及局部给药。

“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指代是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的疗效。药学上可接受的载体部分例子有糖(如葡萄糖、蔗糖、乳糖等)，淀粉(如玉米淀粉、马铃薯淀粉等)，纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)，明胶，滑石粉，固体润滑剂(如硬脂酸钠、硬脂酸镁)，硫酸钙，植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)，多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)，乳化剂(如吐温类)、润湿剂(如十二烷基磺酸钠)，着色剂，调味剂，稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，无热原水等。

所述的“增效剂”是指一类与某类药物配伍使用时，以特定的机制增强该类药物活性的药物，发挥协同作用。作为增效剂，可以与其他药物联合用药，所述“联合给药”指将几种所选的治疗药物给一个病人用药，以相同或不同的给药方式在相同或不同的时间给药。术语“协同”、“协同作用”或“增效”，如本文所用，指对原本存在抑制Bcl-2活性、或抑制HDAC活性、或抗肿瘤的药物在合用另一种药物时能够增强原来药物抑制HDAC活性、或抑制HDAC活性、或抗肿瘤效果的作用。

本发明优点在于：

1、本发明的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物显示了对Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员较高的抑制活性，特别是部分化合物对HDAC同时显示了很好的抑制活性，并表现出结合选择性。因此这些化合物具有制备抗肿瘤药物，以及制备增效剂与其它抗肿瘤药物或放射治疗合用以治疗肿瘤的潜在用途。

2、本发明的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物对人血液肿瘤(骨髓瘤、白血病)和实体瘤(卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌)显示了广谱和显著的抗肿瘤活性。并且与现有药物联用表现出较好的增效作用。因此，本发明的化合物可望有良好的开发前景。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，即本发明的各取代基团之间可以互相组合，其所构成的具体化合物均为本发明的一部分。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-N-(4-(8-(羟基氨基)-8-氧代辛氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺(表1中化合物1)的制备：

合成路线为：

具体步骤为：

1)8-(4-(N-(2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)磺酰基氨基)-2-硝基苯基氨基)辛酸乙酯的制备：

将(2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸100mg(0.175mmol)，8-(2-硝基-4-磺酰基氨基苯基氨基)辛酸乙酯68mg(0.175mmol)，1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)167mg(0.875mmol)，4-二甲氨基吡啶25.6mg(0.21mmol)，以无水DCM为溶剂，常温反应24h。反应结束后，依次用1M的盐酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水洗，水相用EA萃取，合并有机相，浓缩得到固体160mg，柱层析纯化，产率85％。

2)2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)-N-(4-(8-(羟基氨基)-8-氧代辛氨基)-3-硝基苯基磺酰基)苯甲酰胺的制备：

将8-(4-(N-(2-(1H-吡咯[2,3-b]吡啶-5-基氧基)-4-(4-((2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己烯-1-烯基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)磺酰基氨基)-2-硝基苯基氨基)辛酸乙酯160mg(0.170mmol)溶于现制的8ml的1.12mol/L的氢氧化钾的羟胺的甲醇溶液中，室温搅拌3h，TLC检测反应完全，将溶液旋干，用稀酸调pH，不断有固体析出，过滤，收集滤渣，得到固体，柱层析纯化，产率90％。

实施例2-7

重复实施例1，不同点在于：使用不同的原料，从而制得表1中化合物2-7。具体如下：使用7-(2-硝基-4-磺酰基氨基苯基氨基)庚酸乙酯、6-(2-硝基-4-磺酰基氨基苯基氨基)己酸乙酯、5-(2-硝基-4-磺酰基氨基苯基氨基)己酸乙酯、4-(2-硝基-4-磺酰基氨基苯基氨基)己酸乙酯、3-(2-硝基-4-磺酰基氨基苯基氨基)己酸乙酯和2-(2-硝基-4-磺酰基氨基苯基氨基)乙酸乙酯代替实施例1中原料8-(2-硝基-4-磺酰基氨基苯基氨基)辛酸乙酯，分别制得化合物2-7。

以上实施例1-7合成的通式(I)中目标产物的化学结构见表1，核磁氢谱和质谱系统表征了目标产物的化学结构，其具体数据见表2。

表1通式(I)中目标化合物结构

表2通式(I)中目标化合物的氢谱和质谱数据

实施例8 Bcl-2和Mcl-1蛋白亲和力测试

参考前期工作和相关文献(Bioorg Med Chem Lett 2012,22,39-44；ChemMedChem 2011,6,904-21)，以醋酸棉酚(AT-101)和ABT-199作为对照药，采用荧光偏振(FP)方法考察目标化合物竞争抑制Bcl-2和Mcl-1蛋白与促凋亡蛋白Bim或Bid的BH3肽段(荧光素标记)结合的能力来评价其与靶蛋白的亲和力。荧光偏振信号由荧光分光光度计在激发光波长485nm和发射光波长为535nm的条件下检测。将系列浓度目标化合物与荧光素标记的Bim或Bid的BH3肽段与Bcl-2或Mcl-1蛋白一起在室温下培养20分钟后，检测其荧光偏振信号，计算该化合物的IC₅₀值。并根据测量中所使用的蛋白总浓度、荧光多肽的总浓度、蛋白-多肽复合物的解离常数以及检测化合物的IC₅₀值，计算检测化合物的竞争性抑制常数K_i。阳性对照药为AT-101和ABT-199(雅培公司开发)。实验结果见表3。

表3通式(I)中目标化合物与Bcl-2和Mcl-1蛋白亲和力

结果表明，表1中化合物1-7显示了与Bcl-2蛋白很好的结合能力，明显优于阳性药AT-101，与ABT-199相当，且具有较高的结合选择性。以上结果表明本发明的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物具有制备与Bcl-2蛋白家族抗细胞凋亡成员高表达相关的疾病的治疗药物，制备抗肿瘤药物，以及制备增效剂与其它抗肿瘤药物或放射治疗合用以治疗肿瘤的潜在用途。

实施例9 HDAC抑制活性测试

采用荧光法考察目标化合物对HDAC家族的抑制作用，其基本原理是用HDAC催化含有乙酰化侧链的底物使其去乙酰化，然后用胰蛋白酶水解去乙酰化的底物生成具有荧光的水解产物。将系列浓度目标化合物与含有底物和胰蛋白酶的缓冲液，以及配制好的HDAC溶液混合在室温下孵育一段时间后检测荧光信号(激发光波长355nm、发射波长460nm)。荧光吸光值的变化能够反映HDAC的受抑制情况，利用其数值变化计算化合物的抑制IC₅₀值。阳性对照药为ACY-1215和SAHA。实验结果见表4。

表4通式(I)中目标化合物的HDAC抑制活性

结果表明，表1中化合物1-2除了具有较好的Bcl-2蛋白亲和力以外，还显示了与HDAC较好的抑制活性，化合物1活性优于两个阳性药ACY-1215和SAHA，它还对HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6显示了很好的选择性抑制活性。表1中化合物3-7的具体结果未示出，但同样表现出对HDAC的抑制活性。以上结果表明本发明的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物具有制备与HDAC活性相关的疾病的治疗药物，制备抗肿瘤药物，以及增效剂与其它抗肿瘤药物或放射治疗合用以治疗肿瘤的潜在用途。

实施例10体外抗肿瘤活性测试

1、实验肿瘤株

本实验采用肿瘤细胞株系分别为：RPMI-8226(人骨髓瘤细胞)、HL-60(人白血病细胞)、U266(人骨髓瘤细胞)、SKOV3(人卵巢癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、A375(人黑色素瘤细胞)和NCI-H23(人肺癌细胞)，均购自上海医药工业研究院。

2、样品配制

用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成1000μg/mL的溶液或均匀的混悬液，然后用含DMSO的PBS(-)稀释。阳性对照药为ABT-199(雅培公司开发)、ACY-1215和SAHA。

3、试验方法

根据实验检测和相关文献(Bioorg Med Chem Lett 2012,22,39-44；Nature.2005,437,677-681)，采用MTT法。96孔板每孔加入浓度为4～5×10⁴个/mL的细胞悬液100μL，置37℃，5％CO₂培养箱内。24h后，加入样品液，10μL/孔，设双复孔，37℃，5％CO₂作用72h。每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，作用4h后加入溶解液，100μL/孔，置培养箱内，溶解后用MK-2全自动酶标仪测570nm OD值。测试结果见表5。

表5通式(I)中目标化合物对人体肿瘤细胞的体外增殖抑制作用

从表5可知，表1中化合物1-3、7对人血液肿瘤和实体瘤显示了广谱抗肿瘤活性，其中，表1中化合物1-3、7对于多发性骨髓瘤的抑制作用优于三个阳性药ABT-199、ACY-1215和SAHA，表1中化合物1对于黑色素瘤的抑制作用优于三个阳性药，表1中化合物2对于乳腺癌的抑制作用优于三个阳性药。表1中化合物4-6的具体结果未示出，但同样表现出广谱抗肿瘤活性。以上结果表明本发明的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物具有广谱抗肿瘤活性，且部分化合物在多发性骨髓瘤、卵巢癌和乳腺癌上显示出优于三个阳性药的活性，展现出了双重抑制剂相对单靶点抑制剂的潜在优势，也预示着本发明的化合物可望有良好的开发前景。

实施例11对现有抗肿瘤药物增效活性测试

考察目标化合物在对现有治疗药物敏感或耐药的多发性骨髓瘤细胞上对现有抗肿瘤药物的增效活性。目标化合物对肿瘤细胞生长抑制活性采用MTT法来进行。多发性骨髓瘤细胞株采用H929细胞。硼替佐米耐药的H929R细胞可通过在逐渐提高硼替佐米浓度(最初0.5nM，以0.2nM为梯度递增，最终增加到15nM)的培养基中连续培养来获得。将肿瘤细胞分入96孔板中，加入不同浓度的目标化合物或组合，用含血清的培养基培养72小时。之后加入MTT，在37℃下培养4小时后用酶标仪检测溶液的吸收度，通过与空白对照比较来评价其细胞增殖抑制情况。基于不同浓度下目标化合物和硼替佐米单独用药对肿瘤细胞的抑制率，和联合用药时对肿瘤细胞的抑制率，采用CalcuSyn 2.1计算目标化合物与硼替佐米的协同指数(combination index，CI)，CI<0.9表明具有增效作用。测试结果见表6。

表6通式(I)中部分目标化合物在耐药和非耐药H929细胞上对硼替佐米的增效活性

从表6可知，表1中化合物1不管是在非耐药还是在耐药细胞上，对现有抗肿瘤药物都具有增效作用，且在多种浓度比例下(如表1中化合物1与硼替佐米浓度比例为7.5μM:40nM、7.5μM:320nM、15μM:320nM、60μM:640nM、60μM:320nM)其增效作用非常显著。表1中化合物2-7的具体结果未示出，但实验数据同样表明其对现有抗肿瘤药物都具有增效作用。以上结果表明本发明的化合物与现有抗肿瘤药物之间具备协同作用，可望有良好的开发前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物，其特征在于，其结构通式如式(I)所示：

其中，

R₁基团是其中，R₂为C₁～C₅直链、支链或环状烷烃基；

Z是N，O，S，

2.根据权利要求1所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物，其特征在于，

R₁基团是其中，R₂为C₁～C₅直链、支链或环状烷烃基；

Z是N，O，S；

3.根据权利要求1所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物，其特征在于，

R₁基团是

Z是N，O，S；

4.根据权利要求1所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物，其特征在于，

R₁基团是

Z是N；

Y是C₁～C₁₀直链烷烃基。

5.根据权利要求1所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物，其特征在于，所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物为下列化合物中的任一个：

6.权利要求1所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物的晶型、药学上可接受的无机酸盐或有机酸盐、水合物、溶剂合物或前药。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有药学上可接受的赋形剂或载体，以及权利要求1所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物或权利要求6所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物的晶型、药学上可接受的无机酸盐或有机酸盐、水合物、溶剂合物或前药。

8.权利要求1所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物，或权利要求6所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物的晶型、药学上可接受的无机酸盐或有机酸盐、水合物、溶剂合物或前药在制备药物中的用途，其特征在于，所述的药物用于：

a)治疗与Bcl-2或HDAC活性相关的疾病或症状，

b)抗肿瘤，或

c)作为抗肿瘤药或放射治疗的增效剂。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为骨髓瘤、白血病、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或肺癌。

10.权利要求1所述的N-取代苯磺酰基-氮杂吲哚氧基苯甲酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：在缩合剂存在的条件下，不同取代的氮杂吲哚氧基苯甲酸与不同取代的磺酰胺发生缩合生成不同取代的N-取代苯磺酰基苯甲酰胺类化合物。