CN106950314A

CN106950314A - 一种检测罗库溴铵或其注射液中烯丙基溴含量的方法

Info

Publication number: CN106950314A
Application number: CN201710248626.8A
Authority: CN
Inventors: 唐咏群; 黄锡伟; 田欣欣; 胡铮; 汤燕
Original assignee: NANJING KING-FRIEND BIOCHEMICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: NANJING KING-FRIEND BIOCHEMICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2017-04-17
Filing date: 2017-04-17
Publication date: 2017-07-14

Abstract

本发明公开了一种检测罗库溴铵或其注射液中烯丙基溴含量的方法，具体为用50%~100%乙腈水溶液配制烯丙基溴对照品溶液；同样用50%~100%乙腈水溶液配制罗库溴铵原料药和罗库溴铵注射液供试品溶液；采用十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱，不含盐的纯水相作为流动相和梯度洗脱的方式，以外标法计算样品中的烯丙基溴含量。本发明解决了现有技术方法中检测专属性差、系统平衡难度大、出峰时间漂移，峰型拖尾的缺点，本发明技术中检测结果仅有烯丙基溴出峰，提高了检测的专属性，改善了峰型。本方法具有操作简单，重复性好，专属性强等特点。

Description

一种检测罗库溴铵或其注射液中烯丙基溴含量的方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体地说是一种检测罗库溴铵或其注射液中烯丙基溴含量的方法。

背景技术

罗库溴铵，化学名：溴化1-[17β-乙酰氧基-2β-(4-吗啉基)-5α-雄甾烷-3α-羟基-16β-基]-1-(2-丙烯基)吡咯溴化物，分子式：C₃₂H₅₃BrN₂O₄，分子量：609.68，其结构式为：

罗库溴铵是一种新型中效非去极化神经肌肉阻滞剂，为全身麻醉辅助用药，用于常规诱导麻醉期间气管插管，以及维持术中骨骼肌松弛。它通过竞争性机制与乙酰胆碱受体结合，阻止离子通道地激活及细胞膜地去极化，达到肌肉松弛地效果。1994年在美国批准上市，现如今年销量稳定在五千万美元。目前，国内有两家进口和两家本土企业也已上市。

目前已报道的罗库溴铵合成工艺中大多数使用了大量的烯丙基溴，文献报道烯丙基溴急性毒性：LD5030mg/kg(豚鼠经口)；LC501000mg/m³，1/2小时(大鼠吸入)，其残留可能会对人体健康造成伤害，需要对产品中烯丙基溴含量进行控制。然而，据文献检索可知，当前只有一篇名为“HPLC法测定罗库溴铵中溴丙烯的含量”的文章及授权公告号CN102288705B专利中给出了罗库溴铵中烯丙基溴含量检测的方法，同时专利中也提到它的方法在流动相调pH值之前，拖尾严重，且与罗库溴铵主峰较接近，另外，方法中使用了离子对试剂四甲基氢氧化铵来配制流动相，一方面增加了检测成本，另一方面增加了检测难度：①需使用磷酸调节水相的pH值，从强碱性调节到5.0；②流动相中加入了四甲基氢氧化铵，会造成系统难以平衡，增加检测时间；③四甲基氢氧化铵的加入会带来烯丙基溴主峰保留时间的漂移。

由于上述方法存在这些缺点，研究一种专属性强、简单快速的检测罗库溴铵及其注射液中烯丙基溴含量的方法显得尤为重要。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明通过对流动相、对照品/供试品配制方式和洗脱方式等特征进行改进，提供了一种适合于罗库溴铵原料或其注射液中烯丙基溴含量的方法。该方法具有流动相配制简单，系统稳定，专属性和重复性高的优点。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种检测罗库溴铵或其注射液中烯丙基溴含量的方法，将烯丙基溴对照品溶液、罗库溴铵供试品溶液分别注入高效液相色谱仪中，以外标法检测计算供试品溶液中烯丙基溴含量；

其中流动相采用梯度洗脱的方式进行：0~20min，流动相A：B=70%：30%；25~30min，流动相A：B=50%：50%；35~50min，流动相A：B=70%：30%；所述流动相A为纯水相，流动相B为乙腈；

所述烯丙基溴对照品溶液为由烯丙基溴对照品经由乙腈水溶液溶解稀释得到的原料药对照品溶液或注射液对照品溶液；所述罗库溴铵供试品溶液为由罗库溴铵原料药经由乙腈水溶液溶解得到的原料药供试品溶液或由罗库溴铵注射液经由乙腈水溶液稀释得到的注射液供试品溶液。

在一种优选方案中，原料药对照品溶液的浓度为0.25~0.30μg/mL，所述注射液对照品溶液的浓度为0.12~0.15μg/mL。罗库溴铵注射液的浓度为10mg/mL，原料药供试品溶液的浓度为15~20mg/mL，所述注射液供试品溶液的浓度为4～6mg/mL，优选5mg/mL。

在配制烯丙基溴对照品溶液或供试品溶液时，采用的50%~100%的乙腈水溶液，优选50%~70%或80%~100%乙腈水溶液，更优选50%~60%或85%~100%乙腈水溶液。

本发明中的色谱条件为：固定相采用十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱，优选150×4.6mm 3μm。柱温35~45℃；流速0.8~1.2mL/min；检测波长205~215nm。

在进行高效液相色谱检测时，用于检测原料药的进样体积为20~30μL，用于检测注射液的进样体积为40~50μL，以对照品溶液中烯丙基溴计算理论塔板数不低于5000，拖尾因子为0.9~1.1前提下采用外标法对测定结果进行分析。

本发明的流动相A为纯水相，水相为超纯水、纯化水或饮用水；流动相B为分析级或色谱级乙腈。烯丙基溴对照品为USP级别、CP级别或工作标准品。

以下提供了一种具体的检测罗库溴铵或其注射液中烯丙基溴含量的方法，其包括如下步骤：

（1）流动相配制：流动相A为纯水相；流动相B为乙腈；

（2）称取烯丙基溴对照品，用50%~100%乙腈水溶液进行溶解，得到对照品储备液，移取对照品储备液，再用50%~100%乙腈水溶液进行稀释，得到对照品溶液，即原料药对照品溶液或注射液对照品溶液；

（3）称取罗库溴铵原料药，用50%~100%乙腈水溶液进行稀释，得到原料药供试品溶液

（4）移取罗库溴铵注射液，用50%~100%乙腈水溶液进行稀释，得到注射液供试品溶液；

（5）色谱条件：

色谱柱：固定相是十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；

流动相：流动相A为纯水相；流动相B为乙腈；

③ 梯度：0~20min，流动相A：B=70%：30%；25~30min，流动相A：B=50%：50%；35~50min，流动相A：B=70%：30%；

（6）样品检测：将烯丙基溴对照品溶液、原料药供试品溶液分别注入高效液相色谱仪中进行检测，在对照品溶液中以烯丙基溴计算理论塔板数不低于5000，拖尾因子为0.9~1.1前提下采用外标法对测定结果进行分析；或者，

（7）样品检测：将烯丙基溴对照品溶液、注射液供试品溶液分别注入高效液相色谱仪中进行检测，在对照品溶液中以烯丙基溴计算理论塔板数不低于5000，拖尾因子为0.9~1.1前提下采用外标法对测定结果进行分析。

在上述步骤（1）中，流动相配制：流动相A为纯水相，水相为超纯水、纯化水或饮用水；流动相B为分析级或色谱级乙腈。

在上述步骤（2）中，称取烯丙基溴对照品，用50%~100%乙腈水溶液进行溶解，优选80%~100%乙腈水溶液，再优选85%~95%乙腈水溶液；烯丙基溴对照品为USP级别、CP级别或工作标准品；配制的烯丙基溴对照品储备液浓度在0.25~0.30mg/mL。

在上述步骤（2）中，移取对照品储备液，再用50%~100%乙腈水溶液进行稀释，优选80%~100%乙腈水溶液，再优选85%~95%乙腈水溶液用来配制检测原料药中烯丙基溴含量的对照品溶液，溶液浓度在0.25~0.30μg/mL；移取对照品储备液，再用50%~100%乙腈水溶液进行稀释，优选50%~70%乙腈水溶液，再优选50%~60%乙腈水溶液用来配制检测注射液中烯丙基溴含量的对照品溶液，溶液浓度在0.12~0.15μg/mL。

在上述步骤（3）中，称取罗库溴铵原料药，用50%~100%乙腈水溶液进行溶解，优选80%~100%乙腈水溶液，再优选85%~95%乙腈水溶液；配制的原料药供试品溶液浓度为15~20mg/mL。

在上述步骤（4）中，移取罗库溴铵注射液，罗库溴铵注射液为50mg:5mL、100mg:10mL或其它规格的注射剂产品，用50%~100%乙腈水溶液进行稀释，优选80%~100%乙腈水溶液，再优选85%~100%乙腈水溶液；配制的注射液供试品溶液浓度为5mg/mL。

本发明中的100%乙腈水溶液是指纯乙腈。

在上述步骤（5）中，色谱柱：固定相是十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱，优选150×4.6mm 3μm；流动相：流动相A为纯水相，如果水相中加入离子对试剂或其它缓冲盐，比如四甲基氢氧化铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠等会造成高效液相系统长时间难以平衡，或给检测系统带来不必要的杂质，增加检测难度，另外影响产品的出峰稳定性，实验室研究发现流动相中加入这些盐，会引起烯丙基溴峰型不对称和漂移。把流动相从盐溶液换成纯水相，省去了pH值调节步骤，不会有因为盐的加入而引入的相关杂质，整个系统的流动相更简单，而烯丙基溴的出峰时间更稳定。

在上述步骤（5）中，③ 梯度：0~20min，流动相A：B=70%：30%；25~30min，流动相A：B=50%：50%；35~50min，流动相A：B=70%：30%，洗脱方式由现有技术中的等度改为梯度，加上流动相A的转换，使得检测结果中只有烯丙基溴出峰，其它的相关杂质与罗库溴铵主峰均不会被采集到，经过供试品出峰的峰面积/保留时间与烯丙基溴对照品出峰的峰面积/保留时间进行比对，验证出供试品中唯一出现的峰为烯丙基溴峰。由于在本发明的检测结果中只有烯丙基溴唯一的峰，该方法用于检测烯丙基溴的专属性非常高，供试品经过强酸、强碱、氧化、高温、光照破坏后，该方法的强专属性依然成立。

在上述步骤（5）中，色谱条件如下：柱温35~45℃；流速0.8~1.2mL/min；进样体积20~50μL，用于检测原料药的进样体积为20~30μL，用于检测注射液的进样体积为40~50μL；检测波长205~215nm。

在上述步骤（6）和（7）中，无论是检测原料药或注射液中烯丙基溴的含量，均以其对应的对照品溶液中，以烯丙基溴计算理论塔板数不低于5000，拖尾因子为0.9~1.1前提下采用外标法对测定结果进行分析，如果系统适应性达不到要求（烯丙基溴理论塔板数低于5000，拖尾因子＜0.9或＞1.1），则不能进行供试品溶液中烯丙基溴含量的计算。

本发明所述的技术方案是能够对罗库溴铵或其注射液中烯丙基溴含量进行检测的，该方法的构建解决了现有罗库溴铵中烯丙基溴含量检测方法中专属性差、系统平衡难度大、出峰时间漂移，峰型拖尾的缺点。本发明采用纯水代替含盐的水相，梯度洗脱代替等度洗脱，使得检测结果中仅有烯丙基溴出峰，大大地提高了检测的专属性，改善了峰型。本方法具有操作简单，重复性好，专属性强等特点。

附图说明

图1罗库溴铵原料药中烯丙基溴含量检测对照品溶液的谱图；

图2罗库溴铵原料药中烯丙基溴含量检测供试品溶液的谱图；

图3罗库溴铵注射液中烯丙基溴含量检测对照品溶液的谱图；

图4罗库溴铵注射液中烯丙基溴含量检测供试品溶液的谱图。

具体实施方式

实施例一：

色谱条件如下，色谱柱： Agilent ，150×4.6mm 3μm；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；梯度：0~20min，流动相A：B=70%：30%；25~30min，流动相A：B=50%：50%；35~50min，流动相A：B=70%：30%。

量取1000mL的纯化水加入到流动相瓶中，标记为流动相A；量取1000mL的分析级乙腈加入到流动相瓶中，标记为流动相B；将流动相A和B两个瓶子放入到超声仪中，超声1-2min后，取出，上液相，进行仪器系统平衡。

准确称取约28.0mg烯丙基溴对照品（百灵威）于100mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液进行溶解、稀释至刻度线，摇匀，得到烯丙基溴对照品储备液。移取1.0mL上述溶液于100mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀；再移取5.0mL上述溶液于50mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀，得到用于检测原料药中烯丙基溴对照品溶液（0.25μg/mL）。移取1.0mL烯丙基溴对照品储备液于200mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀；再移取5.0mL上述溶液于50mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀，得到用于检测注射液中烯丙基溴对照品溶液（0.125μg/mL）。

称取罗库溴铵原料药150mg于10mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液进行稀释，得到原料药供试品溶液（15mg/mL）；移取50mg:5mL规格的罗库溴铵注射液5mL于10mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液进行稀释，得到注射液供试品溶液（5mg/mL）。

烯丙基溴检测（原料药）：分别向高效液相色谱仪中注入烯丙基溴对照品溶液（0.25μg/mL）、原料药供试品溶液（15mg/mL）30μL，对照品溶液中的烯丙基溴在15.795min出峰，以烯丙基溴计算理论塔板数为9566，拖尾因子为0.9，供试品溶液中的烯丙基溴在15.796min出峰，浓度=0.25×2862/11700=0.06115μg/mL，含量=0.06115μg/mL/15mg/mL=4.1ppm，符合规定（≤20ppm）。

烯丙基溴检测（注射液）：分别向高效液相色谱仪中注入烯丙基溴对照品溶液（0.125μg/mL）、注射液供试品溶液（5mg/mL）50μL，对照品溶液中的烯丙基溴在15.791min出峰，以烯丙基溴计算理论塔板数为9781，拖尾因子为0.9，供试品溶液中的烯丙基溴在15.788min出峰，浓度=0.125×1154/13337=0.01082μg/mL，含量=0.01082μg/mL/5mg/mL=2.2ppm，符合规定（≤20ppm）。

实施例二：

色谱条件如下，色谱柱： YMC ，150×4.6mm 3μm；柱温：40℃；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；梯度：0~20min，流动相A：B=70%：30%；25~30min，流动相A：B=50%：50%；35~50min，流动相A：B=70%：30%。

量取1000mL的超纯水加入到流动相瓶中，标记为流动相A；量取1000mL的色谱级乙腈加入到流动相瓶中，标记为流动相B；将流动相A和B两个瓶子放入到超声仪中，超声1-2min后，取出，上液相，进行仪器系统平衡。

准确称取约28.0mg烯丙基溴对照品（Sigma）于100mL容量瓶中，用70%乙腈水溶液进行溶解、稀释至刻度线，摇匀，得到烯丙基溴对照品储备液。移取1.0mL上述溶液于100mL容量瓶中，用70%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀；再移取5.0mL上述溶液于50mL容量瓶中，用70%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀，得到用于检测原料药中烯丙基溴对照品溶液（0.28μg/mL）。移取1.0mL烯丙基溴对照品储备液于200mL容量瓶中，用70%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀；再移取5.0mL上述溶液于50mL容量瓶中，用70%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀，得到用于检测注射液中烯丙基溴对照品溶液（0.14μg/mL）。

称取罗库溴铵原料药180mg于10mL容量瓶中，用70%乙腈水溶液进行稀释，得到原料药供试品溶液（18mg/mL）；移取100mg:10mL规格的罗库溴铵注射液5mL于10mL容量瓶中，用70%乙腈水溶液进行稀释，得到注射液供试品溶液（5mg/mL）。

烯丙基溴检测（原料药）：分别向高效液相色谱仪中注入烯丙基溴对照品溶液（0.28μg/mL）、原料药供试品溶液（18mg/mL）25μL，对照品溶液中的烯丙基溴在14.618min出峰，以烯丙基溴计算理论塔板数为8763，拖尾因子为1.0，供试品溶液中的烯丙基溴在14.587min出峰，浓度=0.28×2045/9632=0.05945μg/mL，含量=0.05945μg/mL/18mg/mL=3.3ppm，符合规定（≤20ppm），见图1、图2。

烯丙基溴检测（注射液）：分别向高效液相色谱仪中注入烯丙基溴对照品溶液（0.14μg/mL）、注射液供试品溶液（5mg/mL）45μL，对照品溶液中的烯丙基溴在14.540min出峰，以烯丙基溴计算理论塔板数为7545，拖尾因子为1.0，供试品溶液中未检测出烯丙基溴，符合规定（≤20ppm）见图3、图4。另外，（加标100%限度浓度）供试品溶液中的烯丙基溴在14.644min出峰。

实施例三：

色谱条件如下，色谱柱： Waters ，150×4.6mm 3μm；柱温：45℃；流速：1.2mL/min；检测波长：215nm；梯度：0~20min，流动相A：B=70%：30%；25~30min，流动相A：B=50%：50%；35~50min，流动相A：B=70%：30%。

量取1000mL的饮用水加入到流动相瓶中，标记为流动相A；量取1000mL的色谱级乙腈加入到流动相瓶中，标记为流动相B；将流动相A和B两个瓶子放入到超声仪中，超声1-2min后，取出，上液相，进行仪器系统平衡。

准确称取约30.0mg烯丙基溴对照品（阿拉丁）于100mL容量瓶中，用100%乙腈水溶液（即纯乙腈，下同）进行溶解、稀释至刻度线，摇匀，得到烯丙基溴对照品储备液。移取1.0mL上述溶液于100mL容量瓶中，用100%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀；再移取5.0mL上述溶液于50mL容量瓶中，用100%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀，得到用于检测原料药中烯丙基溴对照品溶液（0.30μg/mL）。移取1.0mL烯丙基溴对照品储备液于200mL容量瓶中，用100%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀；再移取5.0mL上述溶液于50mL容量瓶中，用100%乙腈水溶液稀释至刻度线，摇匀，得到用于检测注射液中烯丙基溴对照品溶液（0.15μg/mL）。

称取罗库溴铵原料药200mg于10mL容量瓶中，用100%乙腈水溶液进行稀释，得到原料药供试品溶液（20mg/mL）；移取100mg:10mL规格的罗库溴铵注射液5mL于10mL容量瓶中，用100%乙腈水溶液进行稀释，得到注射液供试品溶液（5mg/mL）。

烯丙基溴检测（原料药）：分别向高效液相色谱仪中注入烯丙基溴对照品溶液（0.30μg/mL）、原料药供试品溶液（20mg/mL）20μL，对照品溶液中的烯丙基溴在13.313min出峰，以烯丙基溴计算理论塔板数为6571，拖尾因子为1.1，供试品溶液中的烯丙基溴在13.324min出峰，浓度=0.30×1874/9432=0.05961μg/mL，含量=0.05961μg/mL/20mg/mL=3.0ppm，符合规定（≤20ppm）。

烯丙基溴检测（注射液）：分别向高效液相色谱仪中注入烯丙基溴对照品溶液（0.15μg/mL）、注射液供试品溶液（5mg/mL） 40uL，对照品溶液中的烯丙基溴在13.521min出峰，以烯丙基溴计算理论塔板数为5432，拖尾因子为1.1，供试品溶液中的烯丙基溴在13.574min出峰，浓度=0.15×789/8565=0.01382μg/mL，含量=0.01382μg/mL/5mg/mL=2.8ppm，符合规定（≤20ppm）。

Claims

1.一种检测罗库溴铵或其注射液中烯丙基溴含量的方法，其特征在于将烯丙基溴对照品溶液、罗库溴铵供试品溶液分别注入高效液相色谱仪中，以外标法检测计算供试品溶液中烯丙基溴含量；其中流动相采用梯度洗脱的方式进行：0~20min，流动相A：B=70%：30%；25~30min，流动相A：B=50%：50%；35~50min，流动相A：B=70%：30%；所述流动相A为纯水相，流动相B为乙腈；

所述烯丙基溴对照品溶液为由烯丙基溴对照品经由乙腈水溶液溶解稀释得到的原料药对照品溶液或注射液对照品溶液；

所述罗库溴铵供试品溶液为由罗库溴铵原料药经由乙腈水溶液溶解得到的原料药供试品溶液或由罗库溴铵注射液经由乙腈水溶液稀释得到的注射液供试品溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述原料药对照品溶液的浓度为0.25~0.30μg/mL，所述注射液对照品溶液的浓度为0.12~0.15μg/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述原料药供试品溶液的浓度为15~20mg/mL，所述注射液供试品溶液的浓度为5mg/mL；所述罗库溴铵注射液的浓度为10mg/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于配制烯丙基溴对照品溶液或供试品溶液时，采用的50%~100%的乙腈水溶液，优选50%~70%或80%~100%乙腈水溶液，更优选50%~60%或85%~100%乙腈水溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于高效液相色谱仪的固定相采用十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱，优选150×4.6mm 3μm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于进行高效液相色谱检测时，柱温35~45℃；流速0.8~1.2mL/min；检测波长205~215nm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于进行高效液相色谱检测时，用于检测原料药的进样体积为20~30μL，用于检测注射液的进样体积为40~50μL，以对照品溶液中烯丙基溴计算理论塔板数不低于5000，拖尾因子为0.9~1.1前提下采用外标法对测定结果进行分析。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于流动相A为纯水相，水相为超纯水、纯化水或饮用水；流动相B为分析级或色谱级乙腈。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述烯丙基溴对照品为USP级别、CP级别或工作标准品。