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CN106924736B - gp130抑制剂在制备干预和治疗肥胖导致的血糖代谢疾病产品中的应用 - Google Patents

gp130抑制剂在制备干预和治疗肥胖导致的血糖代谢疾病产品中的应用 Download PDF

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CN106924736B
CN106924736B CN201710320342.5A CN201710320342A CN106924736B CN 106924736 B CN106924736 B CN 106924736B CN 201710320342 A CN201710320342 A CN 201710320342A CN 106924736 B CN106924736 B CN 106924736B
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atx
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Beijing Normal University
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Abstract

本发明公开了gp130抑制剂在制备干预和治疗肥胖导致的血糖代谢疾病产品中的应用，本发明提供了抑制gp130表达和/或活性的物质在如下1)‑4)中至少一种中的应用：1)制备干预和/或治疗动物肥胖导致的血糖代谢疾病产品；2)制备抑制脂肪组织或脂肪细胞中ATX的表达产品；3)制备降低血浆中LPA和/或ATX水平的产品；4)制备抑制脂肪细胞中STAT3活化的产品。本发明发现gp130抑制剂处理可以下调脂肪细胞中ATX的表达，显著改善肥胖相关的血糖代谢异常。在这些研究成果的基础上，提出了以gp130为靶点干预和治疗肥胖导致的二型糖尿病的新策略。

Description

gp130抑制剂在制备干预和治疗肥胖导致的血糖代谢疾病产 品中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及gp130抑制剂在制备干预和治疗肥胖导致的血糖代谢疾病产品中的应用。
背景技术
随着人民生活质量的提高，肥胖已经渐渐成为21世纪最严重的慢性疾病之一。有研究表明，肥胖与二型糖尿病、心血管疾病及癌症等多种疾病都有直接的联系。随着科学的进步，尤其是在近二十年的研究中，人们发现脂肪组织不仅仅是一种储能组织，而且是一种多功能的活跃的分泌器官。已经有研究发现，脂肪细胞可以分泌出包括白介素(Interleukin、IL)、干扰素(interferon、IFN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor、TNF)在内的多种细胞因子，参与慢性炎症应答、肿瘤发生等多种生理和病理过程。
Autotaxin(ATX)是核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(nucleotide pyrophosphatase,NPP)家族中的一员即NPP2，是一个分泌型糖蛋白。它具有lysoPLD活性，其主要功能是催化溶血磷脂胆碱(LPC)水解生成溶血磷脂酸(LPA)。ATX是催化LPA生成的关键酶，LPA是一种生物活性磷脂分子，可以通过细胞表面的LPA受体发挥生物学功能。ATX是生成LPA的关键酶，ATX在脂肪细胞中高表达，条件性敲除脂肪细胞中的ATX基因，小鼠血浆中ATX含量降低50％,血浆中LPA浓度下调38％，这表明脂肪组织是体内ATX的主要来源。当饲喂高脂食物(High-fat Diet,HFD)导致肥胖发生时，小鼠脂肪细胞中ATX的表达显著升高，血浆中LPA的含量显著增加，同时表现出胰岛素抵抗症状。与野生型小鼠比较，饲喂HFD的脂肪细胞ATX特异敲除(FATX-KO)小鼠的胰岛素抵抗症状显著减弱。遗传性肥胖的db/db糖尿病模型小鼠的脂肪细胞中，ATX的表达也显著升高，而且与胰岛素抵抗程度密切相关。临床研究发现，与正常人相比肥胖患者的内脏脂肪中ATX的表达显著升高；与葡萄糖代谢正常的肥胖患者相比，在患有糖尿病或表现葡萄糖耐量受损症状的肥胖人群中，脂肪组织ATX的表达水平更高。所有这些研究均表明，肥胖可以导致脂肪细胞中ATX表达的异常增加，由此引起的ATX/LPA水平上调与肥胖个体的葡萄糖代谢紊乱有密切的关系。
IL-6家族细胞因子是多个细胞因子的统称，包含IL-6、LIF、IL-11、CT-1、CNTF、OSM等，它们通过与细胞表面的特异性受体结合，激活下游信号通路发挥生物学功能。gp130是IL-6家族细胞因子受体中共有的一个亚基，当受到外界IL-6家族细胞因子刺激时，gp130自我形成二聚体或与另一个细胞因子特异性跨膜受体形成二聚体后，结合细胞外膜特异受体(例如IL6Receptor-α)形成受体复合物，介导激活JAK-STAT、PI3K-Akt和MAPK等下游信号通路。IL-6家族因子都需要gp130受体来参与介导发挥其生物学功能，因此IL-6家族细胞因子又被称为gp130细胞因子。脂肪细胞可以表达分泌IL-6、IL-11、LIF、CNTF和CT-1等多个IL-6家族细胞因子。脂肪是产生IL-6的主要组织，健康人体中1/3的IL-6由脂肪组织产生。肥胖个体的脂肪组织处于一种慢性炎症状态，发生免疫细胞的大量侵润，引起脂肪组织中IL-6、TNF-α等促炎症细胞因子的表达水平显著升高，是造成肥胖脂肪组织功能失调、导致肥胖相关疾病发生的重要因素之一。
发明内容
本发明的一个目的是提供抑制gp130表达和/或活性的物质或阻断gp130介导的JAK-STAT3信号通路的物质的用途。
本发明提供的抑制gp130表达和/或活性的物质或阻断gp130介导的JAK-STAT3信号通路的物质在如下1)-4)中至少一种中的应用：
1)制备干预和/或治疗肥胖导致的血糖代谢疾病产品；适合于人和任何非人动物
2)制备抑制脂肪组织或脂肪细胞中ATX表达的产品；
3)制备降低血浆中LPA和/或ATX水平的产品；
4)制备抑制脂肪细胞中STAT3活化的产品。
上述应用中，所述血糖代谢疾病为二型糖尿病。
上述应用中，所述抑制脂肪组织或脂肪细胞中ATX的表达是通过抑制gp130介导的JAK-STAT3信号通路中的STAT3的活化，即降低STAT3磷酸化水平(P-STAT3水平)实现的。
上述应用中，抑制gp130表达和/或活性的物质或阻断gp130介导的JAK-STAT3信号通路的物质可以是本领域技术人员结合现有技术不花费创造性劳动所知道的任何能够抑制gp130的物质，如小分子化合物、抑制基因的干扰RNA、抗体。
所述抑制gp130表达和/或活性的物质或阻断gp130介导的JAK-STAT3信号通路的物质为gp130抑制剂或干扰gp130表达的siRNA。
上述应用中，所述gp130抑制剂为SC144；
或所述干扰gp130表达的siRNA的核苷酸序列为序列1。
gp130或其配体在制备提高脂肪细胞中ATX的表达产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述gp130配体为IL-6家族细胞因子；
或，所述IL6家族细胞因子为IL-6、LIF、CT-1或CNT。
上述应用中，所述IL-6家族细胞因子通过激活脂肪细胞中gp130-STAT3信号通路提高脂肪细胞中ATX的表达。
上述应用中，所述产品为药物。
gp130作为靶点在设计或制备干预和治疗肥胖导致的二型糖尿病产品中的应用也是本发明保护的范围；
或抑制STAT3的表达的物质在制备抑制ATX的表达产品中的应用也是本发明保护的范围。
研究工作发现，gp130介导的JAKs-STAT3信号通路对脂肪细胞中ATX的表达具有重要的作用。IL-6家族细胞因子(如IL-6、LIF、CT-1或CNTF)可以通过gp130信号通路显著上调脂肪细胞中ATX的表达；使用gp130特异性抑制剂Sc144抑制gp130信号通路，可以显著下调脂肪细胞中ATX的表达；使用gp130特异的siRNA在脂肪细胞中敲低gp130同样可以显著下调脂肪细胞中ATX的表达。
动物实验表明，与正常饮食(ND)小鼠相比较，高脂食物饲喂(HFD)获得肥胖小鼠的脂肪组织中ATX的表达水平显著升高，肥胖小鼠血浆中ATX和LPA的含量也显著的增加，并产生胰岛素拮抗和高血糖耐受等二型糖尿病特征。使用gp130特异抑制剂SC144处理高脂食物饲喂(HFD)获得肥胖小鼠，可以显著下调脂肪组织中ATX表达，降低血浆中ATX和LPA含量，显著改善肥胖导致的胰岛素拮抗和葡萄糖耐量受损等二型糖尿病症状。
本发明的实验揭示了脂肪细胞中ATX高表达的分子机制，即IL-6家族细胞因子通过gp130介导的信号通路自反馈激活脂肪细胞中ATX的表达，发现gp130抑制剂处理可以下调脂肪细胞中ATX的表达，显著改善肥胖相关的血糖代谢异常。在这些研究成果的基础上，提出了以gp130为靶点干预和治疗肥胖导致的二型糖尿病的新策略。
附图说明
图1为脂肪细胞中ATX的表达依赖于gp130-JAK-STAT3信号通路。
图2为IL-6家族细胞因子通过gp130信号通路上调脂肪细胞中ATX的表达。
图3为口服gp130抑制剂SC144下调HFD肥胖小鼠脂肪组织中ATX的表达水平和血浆中的ATX含量。
图4为口服gp130抑制剂SC144下调HFD肥胖小鼠血浆中LPA的含量。
图5为口服gp130抑制剂SC144显著改善HFD肥胖小鼠的胰岛素拮抗与葡萄糖耐量受损症状。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
部分材料如下：
表1为试剂与抗体
Figure BDA0001289620880000041
下述实施例中采用的方法部分如下：
一、mRNA水平检测
1、RNA提取
1)细胞RNA提取：
a)收集细胞样品，用PBS溶液洗涤2遍，然后离心去上清。
b)在沉淀中加入1ml的Trizol溶液，吹打混匀，室温静置5分钟。
c)加入氯仿(0.2ml/1ml Trizol)，盖紧离心管，用手剧烈摇荡15秒。
d)室温静置5分钟，12000g，4℃离心15分钟。
e)将上层水相转移到新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后放置10分钟。
f)12000g，4℃离心10分钟，弃上清。
g)加入1ml的75％乙醇洗涤一次，7500g，4℃离心5分钟，弃上清，沉淀烘干10分钟。
h)加入20μl DEPC水溶解沉淀，放置于60℃水浴锅溶解10分钟。
i)通过分光光度计测量RNA浓度，将制备好的样品冻于-80℃冰箱储存。
2)组织RNA提取：
a)将组织使用灭菌小剪刀剪碎，加入1ml Trizol，使用匀浆器打匀
b)加入氯仿(0.4ml/1ml Trizol)，盖紧离心管，用手剧烈摇荡15秒。
c)室温静置5分钟，12000g，4℃离心15分钟。
d)将上层水相转移到新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后放置10分钟。
e)12000g，4℃离心10分钟，弃上清。
f)加入1ml的75％乙醇洗涤一次，7500g，4℃离心5分钟，弃上清，沉淀烘干10分钟。
g)加入40μl DEPC水溶解沉淀，放置于60℃水浴锅溶解10分钟。
h)通过分光光度计测量RNA浓度，将制备好的样品冻于-80℃冰箱储存。
2、RT-qPCR
取2μg RNA，加入2μl引物，70℃处理10分钟，立即放在冰上冷却。
按照以下体系进行混合：加入M-MLV 5×缓冲液5μl，dNTPs(10mM)1μl，RNAseinhibitor 0.5μl，M-MLV逆转录酶1μl，补入DEPC水至终体积25μl，将混合溶液放于42℃水浴中反应1小时，72℃灭活10分钟，冻存于-20℃冰箱储存。根据IQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)的操作手册，利用Bio-Rad的iCycleiQreal-time PCR仪器对目的基因检测，结果通过Bio-Rad iQ5分析软件进行检测。
3、引物序列如表2。
表2
Figure BDA0001289620880000061
二、检测蛋白表达水平
1、蛋白提取
1)细胞蛋白提取：
a)收集细胞，1500rpm离心5分钟，弃除上清，用预冷的PBS清洗细胞沉淀两次；
b)吸干残余的PBS，加入适量的细胞裂解液RIPA，吹打混匀，冰浴裂解30分钟；
c)12000rpm，4℃离心20分钟，取上清转移到新的离心管中；
2)组织蛋白提取：
a)收集组织，使用PBS洗干净，用灭菌小剪刀剪碎，加入适量RIPA(含蛋白酶抑制剂)后使用匀浆器打碎。
b)冰浴裂解30分钟；
c)12000rpm，4℃离心20分钟，取上清转移到新的离心管中。
2、BCA蛋白浓度定量试剂盒说明
1)将溶液A和溶液B根据体积比50：1配置成BCA工作液，充分混匀；
2)将蛋白标准品等比稀释至不同的浓度梯度
3)在200μl BCA工作液中加入20μl测量样品，充分混匀，37℃反应30分钟；
4)用分光光度计选用BCA测量模式进行测量，绘制标准曲线。
3、免疫印迹杂交(western blot)
1)电泳
配置SDS-PAGE蛋白胶，取40μg样品蛋白加入上样缓冲液中，沸水浴5分钟，12000rpm离心2分钟，冷却后离心取上清上样。先用80V恒压电泳，等溴酚蓝进入分离胶后换成120V电压进行电泳。
2)转膜
将PVDF膜用甲醇活化15秒，然后放入蒸馏水中浸泡5分钟，再放入转膜缓冲液中浸泡15分钟。按照Bio-Rad湿转仪方法进行转膜，120V，300mA 60分钟。
3)封闭与抗体孵育
(1)取出PVDF膜，用TTBS洗涤一次，放入封闭液(5％BSA)中室温孵育1小时；
(2)用TTBS洗涤3次，每次5分钟，放入一抗稀释液中4℃孵育过夜(8小时左右)；
(3)用TTBS洗涤3次，每次5分钟，放入二抗稀释液中室温孵育1小时；
4)取出膜，用TTBS洗涤3次，ECL发光显色。
三、siRNA转染
1、转染
1)根据吉玛公司说明书，将合成的siRNA加入150μl无RNase水溶解至浓度(20μM)，分装冻存于-80℃。
2)根据Lipofectamine 2000说明书进行siRNA转染，具体步骤如下(以35mm培养皿为例)：
(1)细胞转染前用更换新鲜培养基；
(2)用250μl Opti-MEM培养基稀释siRNA至终浓度为25nM或50nM；同时用250μlOpti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000，轻轻混合，室温放置5分钟；
(3)将siRNA和Lipofectamine2000轻轻混合，室温放置20分钟，然后加入到细胞培养基中，混匀。
3)转染48小时后收集细胞，提取细胞的RNA或者总蛋白，进行实验。
2、siRNA序列
siRNA由上海吉马公司按照表3中序列进行合成。
表3为siRNA序列
gp130siRNA 5′-ACGACUUAGGACUAUCUUAAA-3′(序列1)
STAT1siRNA 5′-GCCAAGGAGGAGAUCUCCGAAGAUA-3′
STAT3siRNA 5′-CUGGAUAACUUCAUUAGCA-3′
NC siRNA 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’
四、脂质的抽提和质谱检测
脂质抽提：玻璃离心管中加入0.5ml PBS，加入100μl 14:0LPA(5μM)作为内标，之后加入3ml甲醇/氯仿(2：1)。向上述溶液中加入50μl血浆和15μl 6NHCl，漩涡混匀后冰上放置10分钟。加入1ml氯仿，1.3ml蒸馏水，混匀，室温1750g离心10分钟，取下层有机相，氮气吹干，用150μl甲醇/水(9：1)溶解，取样上机检测。
脂质的分离和检测：使用液相色谱-质谱联用(LC-MS)法，通过液相色谱法分离脂质分子，利用质谱进行定量检测。具体方法：使用C18HPLC柱(5μm，2.1mm ID x 20mm，TR-0121-C185)进行脂质分离，体系含有两种流相，流相A：含有10mM甲酸铵的异丙醇/乙腈/甲酸(90:10:0.1，v/v/v)；流相B：甲醇/H2O/NH4OH(90:10:0.1，v/v/v)。流程包括：(1)以100μL/min-100％流相B灌流3min；(2)在1min内将流速由100μL/min增至300μL/min，同时流相由100％流相B变为50％流相B；(3)以300μL/min-50％流相B的灌流6min；(4)在1min内将流速由300μL/min降至100μL/min，同时流相由50％流相B变为100％流相B；(5)以100μL/min-100％流相B灌流1min。使用QTRap 4500质谱检测仪(API4500QTRap mass spectrometer)进行LPA定量检测。
五、实验动物血糖测定
断粮不断水饥饿小鼠过夜，之后进行胰岛素耐量试验和葡萄糖耐量实验，具体流程如下：1)胰岛素耐量试验：剪鼠尾取血检测记录0h时间点血糖水平，腹腔注射胰岛素(0.75U/kg)，之后每15分钟检测一次小鼠血糖含量，记录120分钟内的血糖变化；2)葡萄糖耐量试验：剪鼠尾取血检测记录0h时间点血糖水平，腹腔注射葡萄糖(1g/kg)，之后每15分钟检测一次小鼠血糖含量，记录120分钟内的血糖变化。购买罗氏(Roche)血糖检测仪和血糖检测试纸进行血糖检测。
实施例1、脂肪细胞的获得和检测
一、脂肪细胞的获得
3T3-L1鼠源前脂肪细胞购自协和医科大学细胞库。
诱导3T3-L1前脂肪细胞分化生成脂肪细胞的方法参考文献提供的cocktail法，具体过程如下：
3T3-L1前脂肪细胞使用含有10％新牛血清(Hyclone)的DMEN(Macgene)培养基培养，培养基中加入2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)，100μg/ml链霉素(LifeTechnologies)和100U/ml青霉素(Life Technologies)。当3T3-L1前脂肪细胞分裂生长至接触抑制剂为0天，开始分化过程。使用10％胎牛血清(Hyclone)DMEM+胰岛素(insulin,1μg/ml)+地塞敏松(Dex,0.25μM)+3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX,0.5mM)复合培养基培养48小时，更换为10％胎牛血清(Hyclone)DMEM+胰岛素(insulin,1μg/ml)复合培养基培养，每48小时更换新鲜培养基直到3T3-L1细胞内产生甘油三酯脂滴,诱导分化8天后获得成熟的脂肪细胞。
二、脂肪细胞的检测
1、脂滴积累检测
体外诱导前脂肪细胞3T3-L1分化成熟，诱导8天后油红染色观察到细胞中有明显的脂滴积累(图1A)，证明体外诱导获得了成熟脂肪细胞。
2、PPAR-γ表达检测
提取成熟的脂肪细胞的蛋白，免疫印迹杂交，一抗为PPAR-γ(作为脂肪细胞细胞分化的标志基因)抗体，结果如图1B右图所示，可以看出，脂肪细胞表达PPAR-γ，证明得到成熟脂肪细胞。
3、脂肪细胞和前脂肪细胞中ATX的mRNA和蛋白表达水平以及P-STAT3和STAT3水平的检测。
分别提取上述成熟的脂肪细胞和前脂肪细胞的总RNA作为模板，用ATX引物(表2)进行RT-PCR(方法为前面所述)，检测细胞中ATX mRNA的表达水平。
通过免疫印迹检测成熟脂肪细胞和前脂肪细胞的培养基中分泌的ATX蛋白水平；分别制备成熟脂肪细胞和前脂肪细胞的裂解液，通过免疫印迹杂交检测细胞中P-STAT3和STAT3的水平。免疫印迹检测一抗分别为抗ATX、P-STAT3、或STAT3抗体。
结果如图1B所示，与前脂肪细胞相比，成熟脂肪细胞中P-STAT3水平升高，ATX的mRNA和蛋白表达水平也都显著提高。
实施例2、阻断gp130-STAT3信号通路在抑制脂肪细胞ATX表达中的应用
一、gp130抑制剂处理和使用特异性siRNA敲低gp130可以降低脂肪细胞中ATX的表达
1、gp130抑制剂处理
gp130抑制剂SC144处理组：将溶解在DMSO中SC144加入细胞培养基中，以终浓度为10μM的SC144处理成熟脂肪细胞24小时；
DMSO对照组：使用与实验组相同体积的DMSO，加入细胞培养基中处理成熟脂肪细胞24小时。
分别提取上述gp130抑制剂SC144处理组和DMSO对照组细胞的RNA作为模板，用ATX引物(表2)进行RT-PCR(方法为前面所述)，检测细胞中ATX mRNA的表达水平。
通过免疫印迹检测gp130抑制剂SC144处理组和DMSO对照组细胞的培养基中分泌的ATX蛋白水平；分别制备两组细胞的裂解液，通过免疫印迹杂交检测细胞中P-STAT3和STAT3的水平。免疫印迹检测一抗分别为抗ATX、P-STAT3、或STAT3抗体。
结果如图1C所示，与DMSO对照组相比较，gp130抑制剂SC144处理组细胞中的gp130下游STAT3活化程度(即P-STAT3的水平)显著降低，ATX的mRNA和蛋白表达水平被显著抑制。
2、gp130siRNA处理
NC siRNA对照组：使用Lipofectamine 2000将NC siRNA按照前面的方法转染入成熟脂肪细胞，siRNA转染浓度100nM，siRNA处理成熟脂肪细胞48小时。
gp130siRNA处理组:使用Lipofectamine 2000将gp130siRNA转染入成熟脂肪细胞，siRNA转染浓度100nM，siRNA处理成熟脂肪细胞48小时。
分别提取上述gp130siRNA处理组和NC siRNA对照组细胞的RNA作为模板，用ATX引物(表2)进行RT-PCR(方法为前面所述)，检测细胞中ATX mRNA的表达水平。
通过免疫印迹检测gp130siRNA处理组和NC siRNA对照组细胞的培养基中分泌的ATX蛋白水平；分别制备两组细胞的裂解液，通过免疫印迹杂交检测细胞中gp-130、P-STAT3和STAT3的水平。免疫印迹检测一抗分别为抗ATX、gp130、P-STAT3、或STAT3抗体。
结果如图1D所示，与NC siRNA对照组细胞相比较，gp130siRNA处理组细胞中的gp130下游STAT3活化程度(即P-STAT3的水平)显著降低，ATX的mRNA和蛋白表达水平都被显著抑制。
二、STAT3抑制剂处理和使用特异性siRNA敲低STAT3可以降低脂肪细胞中ATX的表达
JAKs-STAT3是被gp130激活的重要下游的信号通路。
1、STAT3siRNA处理
NC siRNA对照组：使用Lipofectamine 2000将NC siRNA转染入成熟脂肪细胞，siRNA转染浓度100nM，siRNA处理成熟脂肪细胞48小时。
STAT1siRNA处理组:使用Lipofectamine 2000将STAT1siRNA转染入成熟脂肪细胞，siRNA转染浓度100nM，siRNA处理成熟脂肪细胞48小时。
STAT3siRNA处理组:使用Lipofectamine 2000将STAT3siRNA转染入成熟脂肪细胞，siRNA转染浓度100nM，siRNA处理成熟脂肪细胞48小时。
按照前面siRNA转染的方法，分别用NC siRNA、STAT1siRNA和STAT3siRNA转染脂肪细胞，得到NC RNAi组、STAT1siRNA组和STAT3siRNA组细胞。
分别提取上述NC RNAi组、STAT1siRNA组和STAT3siRNA组细胞的总RNA作为模板，用ATX引物(表2)进行RT-PCR(方法为前面所述)，检测细胞中ATX mRNA的表达水平。
通过免疫印迹分别检测NC RNAi组、STAT1siRNA组和STAT3siRNA组细胞的培养基中分泌的ATX蛋白水平；分别制备上述NC RNAi组、STAT1siRNA组和STAT3siRNA组细胞的裂解液，通过免疫印迹杂交检测细胞中STAT1和STAT3的水平。一抗分别为抗ATX、STAT1和STAT3抗体。
结果如图1E所示，敲低STAT3可以下调脂肪细胞中ATX的mRNA和蛋白表达水平，而敲低STAT1则不能。
2、STAT3抑制剂S3I-201处理
STAT3抑制剂处理组:20μM S3I-201，溶解在DMSO中，处理成熟脂肪细胞24小时)；
DMSO对照组：(使用与实验组相同体积的DMSO，处理成熟脂肪细胞24小时)
分别提取上述STAT3抑制剂处理组和DMSO对照组细胞的总RNA作为模板，用ATX引物(表2)进行RT-PCR(方法为前面所述)，检测细胞中ATX mRNA的表达水平。通过免疫印迹检测STAT3抑制剂处理组和DMSO对照组细胞的培养基中分泌的ATX蛋白水平。一抗分别为抗ATX抗体。
结果如图1F所示，与DMSO对照组相比较，STAT3抑制剂S3I-201处理组细胞中ATX的mRNA和蛋白表达水平都显著降低。
实施例3、IL-6家族细胞因子上调脂肪细胞ATX表达中的应用
IL-6家族细胞因子包括IL-6、LIF、CT-1和CNTF等。IL-6家族细胞因子可以通过gp130受体，激活JAK-STAT、PI3K-Akt和MAPK等下游信号通路，调控目的基因的表达。
对实施例1中体外诱导获得的脂肪细胞进行如下处理：
IL-6组细胞：血清饥饿脂肪细胞8小时，将重组鼠源IL-6加入脂肪细胞的细胞培养基中，使其终浓度为10ng/ml，处理8小时。
LIF组细胞：血清饥饿脂肪细胞8小时，将重组鼠源LIF加入脂肪细胞的细胞培养基中，使其终浓度为10ng/ml，处理8小时。
CT-1组细胞：血清饥饿脂肪细胞8小时，将重组鼠源CT-1加入脂肪细胞的细胞培养基中，使其终浓度为10ng/ml，处理8小时
CNTF组细胞：血清饥饿脂肪细胞8小时，将重组鼠源CNTF加入脂肪细胞的细胞培养基中，使其终浓度为10ng/ml，处理8小时
IL-6+SC144组细胞：血清饥饿脂肪细胞8小时，使用10μM SC144预处理脂肪细胞30分钟，之后使用重组鼠源IL-6(10ng/ml)和SC144(10μM)共同处理成熟脂肪细胞8小时。
分别提取上述各组细胞的总RNA作为模板，用ATX引物(表2)进行RT-PCR(方法为前面所述)，检测细胞中ATX mRNA的表达水平。
分别制备各组细胞的裂解液，通过免疫印迹检测各组细胞中P-STAT3和STAT3的蛋白水平，一抗分别为抗P-STAT3和STAT3的抗体。
结果如图2所示，IL6家族细胞因子IL-6、LIF、CT-1或CNTF处理脂肪细胞，均可以激活提高细胞中P-STAT3蛋白水平，并显著上调脂肪细胞中ATXmRNA的表达(图2A-D)。使用gp130抑制剂SC144预处理脂肪细胞30分钟后，可以显著抑制IL-6处理组脂肪细胞中ATX的表达(图2E)。
上述结果表明，IL-6家族细胞因子可以通过激活gp130-STAT3信号通路上调脂肪细胞中ATX的表达。
实施例4、gp130抑制剂在干预和治疗肥胖导致的血糖代谢疾病中的应用
一、gp130抑制剂SC144抑制肥胖小鼠脂肪组织中ATX的表达
实验小鼠选取雄性C57BL/6小鼠，小鼠饲养遵循12小时昼夜饲养周期，小鼠实验获得北京师范大学实验动物伦理审查会的许可。
选取8周龄健康雄性C57BL/6小鼠，分为3组(流程如图3A左图)：
正常(ND)组：饲喂正常食物，在饲喂7周后口服药物溶剂(0.9％NaCl with40％propylene glycol：配制40％丙二醇(体积比，丙二醇/H2O)，使用40％丙二醇作为溶剂配制终浓度为0.9％NaCl(质量体积比，NaCl(g)/溶剂(L)))；根据小鼠体重计算溶剂服用量；做到与服用的药物体积相同；
肥胖(HFD)组：饲喂高脂食物(HFD,60kcal％fat,Research Diets)，在饲喂7周后口服药物溶剂(40％丙二醇生理盐水：配制40％丙二醇(体积比，丙二醇/H2O)，使用40％丙二醇作为溶剂配制终浓度为0.9％NaCl(质量体积比，NaCl(g)/溶剂(L)))；根据小鼠体重计算溶剂服用量；做到与实验组小鼠服用药物的体积相同，模拟肥胖导致的血糖代谢疾病；
肥胖+SC144(HFD+SC144)组：饲喂高脂食物，在饲喂7周后口服p130抑制剂SC144药物(5mg/kg)；药物每日处理一次，为期一周。
每周称取小鼠体重，药物处理一周后，处死小鼠分离获取脂肪组织和血浆。
分别提取上述各组小鼠脂肪组织的总RNA作为模板，用ATX引物、IL-6引物或LIF引物(表2)分别进行RT-PCR(方法为前面所述)，检测脂肪组织中ATX、IL-6、LIF的mRNA表达水平；通过免疫印迹检测各组小鼠血浆中ATX蛋白水平，一抗分别为抗ATX抗体；通过免疫印迹检测各组小鼠脂肪组织中P-STAT3和STAT3的蛋白水平，一抗分别为抗P-STAT3和STAT3的抗体。
结果如图3所示，与正常饮食(ND)小鼠相比较，高脂食物(HFD)饲喂的肥胖小鼠的脂肪组织中ATX mRNA水平和血浆中ATX蛋白水平都显著上调(图3B、3C)。口服gp130抑制剂SC144处理HFD肥胖小鼠一周，肥胖小鼠的体重没有发生明显改变，但是脂肪组织中ATXmRNA水平和血浆中ATX蛋白水平都显著下调，基本回复到饲喂正常食物(ND)小鼠的水平(图3A-C)。gp130抑制剂SC144处理显著下调HFD肥胖小鼠脂肪组织中的P-STAT3水平，但对STAT3总蛋白水平没有明显影响(图3C)。
同时RT-PCR检测各组小鼠脂肪细胞中IL-6和LIF的mRNA表达水平，与ND组小鼠相比较，HFD肥胖小鼠脂肪组织中IL-6和LIF的mRNA表达水平显著的上调，但是口服gp130抑制剂SC144对HFD肥胖小鼠脂肪组织中IL-6和LIF的mRNA表达水平没用显著的影响(图3D，3E)。
对各组小鼠血浆样本进行脂质抽提，通过ESI LC MS/MS方法检测血浆中LPA含量(详见实施方法)。检测结果表明，与ND小鼠相比较，HFD肥胖小鼠血浆中LPA浓度显著上调，口服gp130抑制剂SC144处理可以使HFD肥胖小鼠血浆中总LPA含量回复到ND小鼠的水平(图4A)。进一步对各种LPA亚型的检测分析，得到了同样的结果(图4C-H)。另外，另一种不受到ATX调控的活性脂类S1P的血浆浓度在ND小鼠和HFD肥胖小鼠之间没有显著差异，而且口服gp130抑制剂SC144处理对于HFD肥胖小鼠血浆中S1P的浓度没有显著的影响(图4B)。
上述研究结果表明，在HFD肥胖小鼠的脂肪组织中gp130信号通路的激活导致脂肪细胞ATX表达上调，造成血浆中ATX和LPA含量增加；口服gp130抑制剂SC144处理可以下调HFD肥胖小鼠脂肪组织ATX的表达，使血浆中ATX和LPA含量恢复正常。
二、胰岛素耐量试验和葡萄糖耐量实验检测
实验小鼠选取雄性C57BL/6小鼠，小鼠饲养遵循12小时昼夜饲养周期，小鼠实验获得北京师范大学实验动物伦理审查会的许可。
选取8周龄健康雄性C57BL/6小鼠，分为4组(流程如图4A左图)：
正常(ND)组：饲喂正常食物，在饲喂7周后口服药物溶剂(0.9％NaCl with40％propylene glycol：配制40％丙二醇(体积比，丙二醇/H2O)，使用40％丙二醇作为溶剂配制终浓度为0.9％NaCl(质量体积比，NaCl(g)/溶剂(L)))；根据小鼠体重计算溶剂服用量；做到与服用的药物体积相同；
肥胖(HFD)组：饲喂高脂食物(HFD,60％脂肪含量,Research Diets公司生产)，在饲喂7周后口服药物溶剂(40％丙二醇生理盐水：配制40％丙二醇(体积比，丙二醇/H2O)，使用40％丙二醇作为溶剂配制终浓度为0.9％NaCl(质量体积比，NaCl(g)/溶剂(L)))；根据小鼠体重计算溶剂服用量；做到与实验组小鼠服用药物的体积相同；
肥胖+SC144(HFD+SC144)组：饲喂高脂食物，在饲喂7周后口服p130抑制剂SC144药物(5mg/kg)；药物每日处理一次，为期一周。
肥胖+Ki16425(HFD+Ki16425)组：饲喂高脂食物，在饲喂7周后腹腔注射LPA受体1/3(LPAR1/3)抑制剂Ki16425(5mg/kg)；药物每日处理一次，为期一周。
每周称取小鼠体重，药物处理一周后，对各组小鼠进行葡萄糖耐量(Glucosetolerance test，GTT)和胰岛素耐量(Insulin tolerance test，ITT)实验(详见实施方法)。
结果如图5所示，口服gp130抑制剂SC144对HFD肥胖小鼠的体重没有显著影响(图5A)，但是可以显著地改善HFD肥胖小鼠的胰岛素拮抗和葡萄糖耐量受损症状(图5B-C)。LPA受体1/3的抑制剂Ki16425处理也具有类似效果(图5B-C)。
上述研究成果表明，gp130是抑制脂肪细胞ATX表达、干预肥胖相关的血糖代谢疾病的新靶点，阻断gp130信号通路可以成为治疗肥胖相关的血糖代谢疾病的新策略，gp130抑制剂(如SC144)可以被应用于肥胖相关的血糖代谢疾病的治疗。
序列表
<110>北京师范大学
<120> gp130抑制剂在制备干预和治疗肥胖导致的血糖代谢疾病产品中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
acgacuuagg acuaucuuaa a 21

Claims (10)

1.抑制gp130表达和/或活性的物质或阻断gp130介导的JAK-STAT3信号通路的物质在如下1）或2）至少一种中的应用：
1）制备抑制脂肪组织或脂肪细胞中ATX表达的产品；
2）制备抑制血浆中LPA和/或ATX水平的产品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制脂肪组织或脂肪细胞中ATX的表达是通过抑制gp130介导的JAK-STAT3信号通路中的STAT3的活化实现的。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述抑制gp130表达的物质或阻断gp130介导的JAK-STAT3信号通路的物质为gp130抑制剂或干扰gp130表达的siRNA。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述gp130抑制剂为SC144；
或所述干扰gp130表达的siRNA的核苷酸序列为序列1。
5.gp130或其配体在制备提高脂肪细胞中ATX的表达产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述gp130配体为IL-6家族细胞因子。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述IL6家族细胞因子为IL-6、LIF、CT-1或CNT。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于： 所述IL-6家族细胞因子通过激活脂肪细胞中gp130-STAT3信号通路提高脂肪细胞中ATX的表达。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。
10.抑制STAT3活化的物质在制备抑制脂肪细胞中ATX的表达产品中的应用；
所述抑制STAT3活化的物质为STAT3 siRNA或STAT3抑制剂S3I-201；
所述STAT3 siRNA的核苷酸序列为5¢-CUGGAUAACUUCAUUAGCA-3¢。
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