CN106924723B

CN106924723B - 经口腔黏膜给药的含人胰高血糖素样肽-1类似物的药物组合物

Info

Publication number: CN106924723B
Application number: CN201611190250.1A
Authority: CN
Inventors: 彭飞; 魏薇; 徐小萍; 李晓鹏; 何太平; 张宝华
Original assignee: Xinlitai Chengdu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xinlitai Chengdu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2015-12-28
Filing date: 2016-12-21
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2036-12-21
Also published as: CN106924723A

Abstract

本发明涉及经口腔黏膜给药的含人胰高血糖素样肽‑1类似物的药物组合物，包括高浓度的人胰高血糖素样肽‑1类似物、透明质酸酶、一种以上的黏膜吸附剂、或者进一步含有或者不含有一种以上的增稠剂，所述的药物组合物具有优良的渗透吸收性、生物学活性，且生物利用度高，配方安全无毒。本发明还提供了所述的药物组合物的制备方法，及其在制备治疗高血糖症和/或糖尿病药物中的用途，该药物组合物使用方便，使用过程无毒无刺激，用药起效快，可显著提高患者临床用药的依从性。

Description

经口腔黏膜给药的含人胰高血糖素样肽-1类似物的药物组合物

技术领域

本发明涉及医药领域，更具体的，本发明涉及一种经口腔黏膜给药的含有人胰高血糖素样肽-1类似物的药物组合物及其制备方法，以及该药物组合物在治疗高血糖症和/或糖尿病方面的用途。

背景技术

糖尿病是一类因胰岛素分泌不足或胰岛素作用障碍，导致血糖过高、出现尿糖，甚至会引发一系列代谢紊乱的慢性疾病。如果糖尿病不能得到及时有效的治疗，还会引起酮症酸中毒、心血管疾病、肾衰竭以及视网膜病变等并发症。糖尿病已成为继肿瘤、心血管疾病之后又一个严重危害人类生命健康的慢性疾病。目前，我国糖尿病患者人数已达1亿，约占全球糖尿病人总数的三分之一，其中2型糖尿病患者占90％以上。

目前，治疗2型糖尿病的药物需要长期服用，主要有二甲双胍类、α糖苷酶抑制剂、磺酰脲类、列奈类、噻唑烷二酮类等化合物药物，以及胰岛素、人胰高血糖素样肽-1类似物等生物药，虽然这些化合物药物短时间内在降低血糖水平方面具良好疗效，但是副作用较大，长期使用会因胰岛素分泌过度导致胰岛细胞功能衰竭。胰岛素和人胰高血糖素样肽-1类似物等生物药在治疗糖尿病相对于化合物药物在副作用方面有一定优势，但需要通过注射给药，，注射给药的方式给患者长期使用带来诸多不便。

Exendin-4是从美国西南部与墨西哥北部地区的希拉毒蜥(Helodermasuspectum)唾液中分离出来的一种39个氨基酸多肽，与哺乳动物以高血糖素样多肽-1(Glucagon like peptide-1，GLP-1)的氨基酸同源性为53％，分子量为4186.57。多种动物模型表明胰腺GLP-1受体对exendin-4和GLP-1有相同的亲和力，并且这两种多肽具有同样的刺激GLP-1受体的功能。因此，exendin-4作为GLP-1类似物，是GLP-1受体的拮抗剂，具有促进胰腺β细胞增殖、改善其功能，以及促进胰岛素分泌，增加机体对胰岛素的敏感性和延缓胃排空、降低食欲，且不易被DPP-Ⅳ降解，可显著改善2型糖尿病患者的空腹及餐后血糖水平。

艾塞那肽是Exendin-4的人工合成物，艾塞那肽注射液(Byetta)1天两次皮下注射；艾塞那肽缓释微球(Bydureon)一周注射一次。但是，艾塞那肽体内半衰期只有2.4h，需要频繁注射，且注射疼痛，导致患者顺应性较差；此外，注射剂使用不便以及可能会产生药物注射副作用(如肠胃道反应、增加胰腺炎、甲状腺癌的患病风险等)，且制造过程复杂，生产成本较高。目前，Exendin-4也可通过现有公知的基因工程重组技术制备得到，较人工合成的具有生产成本更低，可满足大规模生产的特点

经口给药的蛋白质和多肽类药物成为一种理想的改变给药途径。然而，蛋白质多肽类药物经口给药后，会面临肝脏首过效应、胃肠道内蛋白酶降解等问题，导致其生物利用度低。

口腔黏膜作为一种较常见的给药方式，给药方便，患者依从性高；口腔黏膜面积约200cm²，有丰富的血管，药物可以通过毛细血管直接进入体循环，较皮肤药物更易穿透被吸收；低酶活性，避免胃肠道蛋白酶和酸的降解作用及肝脏首过效应，使药物能更好的被吸收；与鼻黏膜相比，口腔黏膜不易损伤。

尽管口腔黏膜给药系统已经得到了广泛的研究，但是目前还未有上市的经口腔黏膜吸收的蛋白质或多肽类药物，这是因为口腔黏膜特有的生物学特性所引起的，如上皮屏障、上皮内屏障、基底膜屏障等作用，导致口腔黏膜给药的渗透系数较低，从而阻碍大分子药物进入血液循环；同时，药物的相对分子量、解离度等也会影响药物通过口腔黏膜渗透吸收的效果，因而蛋白质类药物的生物利用度较低。此外，口腔内上皮表面分泌的黏液及口腔唾液、酶和免疫蛋白等生理环境，对蛋白质类药物构成了酶屏障和扩散屏障。由于Exendin-4是大分子物质，受口腔黏膜结构和口腔生理环境的影响，不易通过口腔黏膜直接被吸收进入血液循环中，例如现有技术CN103566376A公开了一种包括艾塞那肽和蛋白水解物及多种辅料组成的口腔黏膜剂，但在实验中发现，仍难达到理想的临床利用效果，因此，亟需开发一种经口腔黏膜给药的Exendin-4的新剂型，达到理想的治疗效果，替代注射给药使用。

发明内容

本发明从解决现有技术的不足出发，提供了一种经口腔黏膜给药的含人胰高血糖素样肽-1类似物的药物组合物及其制备方法，该药物组合物可用于大规模生产制备经口腔黏膜给药的人胰高血糖素样肽-1类似物制剂，该药用组合物具有、渗透吸收性高、起效快、生物利用度高、患者依从性良好等特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种经口腔黏膜给药的含有人胰高血糖素样肽-1类似物的药物组合物，包含：

1)人胰高血糖素样肽-1类似物；

2)透明质酸酶；

3)一种以上药学上可接受的口腔黏膜给药载体，所述的药物组合物中黏膜吸附剂的质量百分比为1％-99％。所述口腔黏膜给药载体优选一种以上药学上的黏膜吸附剂。

所述的人胰高血糖素样肽-1类似物是Exendin-4，通过现有公知的基因工程重组技术制备得到的Exendin-4，较人工合成的Exendin-4具有生产成本更低，可满足大规模生产的特点。

所述药物组合物中Exendin-4为5～1000μg，优选的，所述药物组合物中Exendin-4为25～500μg。所述药物组合物中透明质酸酶为hPH20，酶活性为500～20000U，优选的，所述的PH20为人PH20(hPH20)，其酶活性为1000～20000U。即hPH20以酶活性U计与Exendin-4以μg为单位计的配比为0.2-4000，优选为2-800。

所述药物组合物优选制备优选为溶液体系，如喷雾，溶剂包括水、含醇溶剂等；或者口腔黏膜贴剂等剂型。在溶剂系统中，所述药物组合物中Exendin-4浓度为5～1000μg/ml,优选25～500μg/ml。所述药物组合物中hPH20酶活性为500～20000U/ml，优选的，所述的hPH20酶活性为1000～20000U/ml。

由于Exendin-4属于亲水性多肽，分子量约为4.2KD，受口腔黏膜结构和口腔生理环境的影响，很难直接通过口腔黏膜的上皮细胞间途径渗透进入血液被吸收。为了使Exendin-4能够经口腔黏膜渗透进入毛细血管，增加其渗透吸收量以达到药物的有效治疗浓度是目前需要克服的技术难题。

本发明通过大量的实验意外的发现，透明质酸酶hPH20用于本发明的口腔黏膜剂中短时间内能形成＜200nm的细胞外基质孔道，使口腔黏膜的粘滞性降低、渗透性增加，从而促进Exendin-4在黏膜中快速扩散渗透，增强毛细血管对其吸收作用，提高Exendin-4的生物利用度。同时，hPH20能快速被血浆清除，血浆半衰期短，且具有局部作用的特点，黏膜间质中的透明质酸可在24-48h内完全重建，可快速恢复黏膜结构的完整性。

现有技术已知的透明质酸酶hPH20属于粘多糖分解酶，皮下注射后能水解细胞间基质中的透明质酸，帮助皮下注射给药的生物药提供生物利用度。由于口腔黏膜给药途径不同于皮下注射，透明质酸酶hPH20在本发明组合物中所起的作用不等同于其在皮下注射中的作用，同时作为单一的组合物，实验发现是与本发明的药物间起到了一定的协同作用才带来了上述优异效果。在实验中发现，相对于其他常用的吸收促渗透剂，如胆酸盐、脂肪酸、醇类和表面活性剂类等，本发明采用hPH20作为Exendin-4的口腔黏膜促渗透剂，可解决这些常规渗透剂长期使用对黏膜的损伤甚至是降解作用，从而可有效避免黏膜发生炎症等不良反应。

本发明通过添加hPH20，一方面可以可逆地改变口腔黏膜角质层屏障作用以促进Exendin-4的黏膜渗透吸收，另一方面对口腔黏膜不会形成严重刺激和损害，且黏膜损伤后可以快速恢复。所述的hPH20，可通过现有技术已知的技术进行制备。具体的，本发明采用hPH20是通过基因重组技术制备的可溶性hPH20(rhPH20)，rhPH20是成熟的PH20多肽，所述多肽在C-端缺少全部或部分糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点，使其在在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达表达后，不与CHO细胞膜结合，从而使得rhPH20分泌溶解在细胞培养基中。

所述的黏膜吸附剂包括：聚维酮、聚乙烯酸(PVA)、聚卡波菲(PC)、卡波姆(CP)、羧甲基壳聚糖，优选的，所述药物组合物中的黏膜吸附剂为聚维酮、羧甲基壳聚糖、卡波姆的一种或组合。为了使药物组合物能够有效的渗透通过口腔黏膜，首先需保证组合物能与口腔黏膜接触，减少口腔环境对药物组合物活性成分的影响，因此在药物组合物中加入黏膜吸附剂，以保证药物组合物在口腔环境中药物活性成分的有效利用率。由于口腔黏膜分泌黏液，黏液主要成分是水，当黏膜吸附剂与黏膜接触时会吸收黏液中的水分，通过物理作用与黏膜接触并粘附在一起，有助于提高rhPH20的利用率以及Exendin-4通过黏膜的渗透吸收性。聚维酮是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的简称，可溶于水，粘性高，在液体制剂中可作为粘度调节剂、结晶抑制剂和药物增溶剂，使药物组合物可粘附于口腔黏膜上，增强rhPH20对黏膜间质的降解率，提高Exendin-4的渗透率；羧甲基壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、生物粘附性，且无生物毒性，具有良好的水溶性，可作为一种良好的生物材料输送蛋白质多肽类药物，其不仅可有效维持药物组合物中的活性成分，而且使上皮组织中的黏蛋白保持湿润，从而延长药物组合物中活性成分在黏膜表面的吸收时间，增加Exendin-4的穿透口腔黏膜的能力，促进口腔黏膜对Exendin-4的吸收；卡波姆作为羧基高分子聚合物，具有很强的生物粘附性，通过产生于聚合物表面大分子链间的相互渗透，提高rhPH20对黏膜间质的降解作用，促使Exendin-4的透膜作用，在快速释药的同时又可维持药物活性物质的有效浓度。具体的，所述的药物组合物中黏膜吸附剂的质量百分比为1％-99％，优选2％-85％，例如每份单独包装的液体药物组合物中，浓度为0.2～50mg/ml，优选浓度为0.2～15mg/ml。

所述组合物进一步含有或者不含有一种以上的其他性质的辅料，包含一种以上的增稠剂等。所述的增稠剂选自：羧甲基纤维素、羧甲基纤维素纳(CMC-Na)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素，优选的，所述的增稠剂为CMC-Na。CMC-Na可以增加药物组合物的粘度，降低口腔黏液对药物的粘滞性、减少蛋白酶对药物活性成分的降解作用；当与黏液中的水分结合后，不仅有利于增加对口腔黏膜的粘合性，而且可增强黏膜吸附剂对黏膜的粘附作用，易于rhPH20和Exendin-4的释放，以及促使Exendin-4快速穿透黏膜进入血液循环，增加其血清浓度。具体的，所述的药物组合物中增稠剂的质量百分比为1％-99％，优选为1％-35％，例如每份单独包装的液体药物组合物中，CMC-Na的浓度为0.1～5mg/ml，优选的，所述的CMC-Na浓度为0.2～4mg/ml。

上述经口腔黏膜给药的含Exendin-4的药物组合物处方中活性成分与辅料具有较好的兼容性，所包含的辅料种类及用量使得处方在整体上维持Exendin-4有效的药物活性和rhPH20对口腔黏膜作用的良好活性；此外，黏膜吸附剂、增稠剂与rhPH20对口腔黏膜间质的降解作用，以及Exendin-4黏膜渗透吸收性具有协同作用。该药物组合物配方有利于后续的制剂生产工艺的开发，以及通过后续工艺制备得到符合临床使用的制剂产品。

本发明的另一目的在于提供一种前述经口腔黏膜给药的含有Exendin-4的药用组合物的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

1)制备含有黏膜吸附剂(或者进一步含有增稠剂)的混合溶液；

2)将重组制备所得的rhPH20蛋白原液加入到步骤1)所制备的混合溶液中，混匀；

3)将重组制备所得的Exendin-4蛋白原液加入到步骤2)所制备的混合溶液中，混匀；

4)除菌，即可得到经口腔黏膜给药的含有Exendin-4的药用组合物。

本发明的第三个目的在于提供一种经口腔黏膜给药的含有Exendin-4药用组合物在制备用于治疗高血糖症和/或糖尿病的药物中的用途，所述的药物组合物中Exendin-4使用量为5～1000μg，优选的，所述药物组合物中Exendin-4使用量为25～500μg。由于该药物组合物中含有黏膜吸附剂、增稠剂和高活性的rhPH20，可使药物活性物质Exendin-4快速通过口腔黏膜渗透吸收进入血液循环，并达到有效的血药浓度，可减少给药次数，无给药疼痛，从而显著提高患者临床用药的依从性，且采用基因工程重组技术规模化生产Exendin-4和rhPH20，可满足临床大量用药的需求，具有良好的临床应用前景。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果，包括但不限于此：

1、本发明提供的药物组合物，通过Exendin-4，透明质酸酶PH20和黏膜吸附剂组合物用于口腔黏膜给药，一方面可以可逆地改变口腔黏膜角质层屏障作用以促进Exendin-4的黏膜渗透吸收，另一方面对口腔黏膜不会形成严重刺激和损害，且黏膜损伤后可以快速恢复，黏膜吸附剂可使组合物快速粘附到黏膜表面，且快速释放药物组合物中活性物质，提高活性物质的利用率。

2、所提供的一种经口腔黏膜给药的含有Exendin-4的药用组合物，所述药物组合物含有增稠剂，增加了药物组合物活性物质间的粘性，减少口腔黏液对药物组合物的粘滞性以及黏液中蛋白酶对药物活性物质的降解作用。

3、所提供的一种经口腔黏膜给药的含有Exendin-4的药用组合物，提高口腔黏膜对亲水性多肽的传导性，使得Exendin-4以高浓度快速渗透口腔黏膜进入血液循环，达到药物的有效血清浓度，提高了Exendin-4的系统生物利用度，可作为Exendin-4注射给药的一种替代使用方式。

4、所提供的一种经口腔黏膜给药的含有Exendin-4的药用组合物在制备用于治疗高血糖症和/或糖尿病的药物中的应用，该药物组合物配方安全无毒，使用方便，使用过程无毒无刺激，用药起效快，显著提高了患者临床用药的依从性。

5、实验发现本发明的组合物是透明质酸酶与本发明的药物间起到了一定的协同作用才带来了上述优异效果，相对于透明质酸酶和CD20抗体的组合，其难以满足口腔给药的临床效果。

附图说明

图1为不同酶活性的rhPH20对Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性的影响，其中，●、■和▲表示Exendin-4的不同浓度，分别为48、280和500μg/ml；P_c表示Exendin-4通过TR146细胞的渗透系数。

图2为不同浓度的黏膜吸附剂对Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性的影响，其中，●、■和▲表示Exendin-4的不同浓度，分别为48、280和500μg/ml；P_c表示Exendin-4通过TR146细胞的渗透系数。

图3为不同浓度的药物组合物W，经单次口腔黏膜给药，对自发性Ⅱ型糖尿病KK^Ay小鼠血糖(mmol/L)的影响，其中，●表示空白对照，■表示皮下注射0.6μg/kg的Exentin-4，◆、▲和※表示药物组合物W的不同浓度，分别为56、168和504μg/kg。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例使用的含有Exendin-4的蛋白质原液采用文献：CN200410062650.5的方法制备，所得蛋白质原液含有Exendin-4浓度为1.5mg/ml，纯度98.0％；使用的含有rhPH20的蛋白质原液采用文献：CN200680013224.X的方法制备，所得蛋白质原液含有rhPH20酶活性为500～20000U/ml，纯度98.0％。

实施例1.经口腔黏膜给药的含Exendin-4药物组合物及其制备方法

将重组制备的Exendin-4蛋白原液(纯度98％，浓度1.5mg/ml)和rhPH20蛋白原液(纯度98％，活性为500-20000U/ml)分别于室温或2～8℃下解冻，解冻后于2～8℃保存。

按照下表1中药物组合物A-X各成分配比，分别准确称量黏膜吸附剂和/或增稠剂，用注射用水溶解后配制为混合液，加入解冻后的rhPH20蛋白原液，混匀，最后加入Exendin-4蛋白原液，搅拌混匀，无菌条件下用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌，分别得到药物组合物A-X。

表1.药物组合物A-X各成分配比

实施例2经口腔黏膜给药的含Exendin-4药物组合物中活性成分的检测

1)检测药物组合物A-X中Exendin-4的生物学活性：

采用cAMP测定法检测上述药物组合物A-X中Exendin-4生物学活性，高效液相色谱法(其中，色谱柱采用Source 5RPC预装柱(4.6×150mm，Amersham Biosciences))检测Exendin-4的纯度及浓度。

表2.药物组合物A-X中Exendin-4生物学活性、纯度及浓度

实验结果如表2所示，药物组合物A-X中Exendin-4纯度均在98％以上，生物学活性保持较高水平，且浓度基本维持不变。

2)经口腔黏膜给药的含Exendin-4药物组合物中rhPH20的活性测试：

根据中国药典2010版二部附录XII C提供的透明质酸酶的活性测定方法(浊度法)，检测上述药物组合物A-X中rhPH20的酶活性。该测定法是基于在酸性条件下透明质酸会和血清反应形成稳定的胶状物，经透明质酸酶降解后，反应形成的胶状物减少，变得澄清，以640nm波长测量澄清度，透明质酸酶的含量和澄清程度成正比关系。根据用rhPH20测定参照标准品的稀释物产生的标准曲线，计算rhPH20的酶活性。

表3.药物组合物A-X中rhPH20的酶活性

实验结果如表3所示，药物组合物A-X中rhPH20酶活性保持较高水平，且纯度在98％以上。

由此表明，本发明制备的经口腔黏膜给药的含Exendin-4药物组合物中活性成分具有较高的生物学活性，且纯度高，且加入增稠剂后可进一步提高Exendin-4的生物学活性及纯度，以及rhPH20的酶活性和纯度。

对比实施例1、含Exendin-4药物组合物及其制备方法

按照表4中A1-A5中各成分配比，其中组合物A1除了不含rhPH20、增稠剂CMC-Na和黏膜吸附剂，其余各组分及其配比与组合物E的相同；组合物A1+除不含Exendin-4、增稠剂CMC-Na和黏膜吸附剂，其余组分及其配比与组合物E相同；组合物A2除了不含rhPH20，其余各组分及其配比与组合物L的相同；组合物A3除了不含增稠剂CMC-Na和黏膜吸附剂，其余各组分及其配比与组合物R的相同；组合物A4除了不含rhPH20，其余各组分及其配比与组合物U的相同；组合物A5除了不含增稠剂CMC-Na和黏膜吸附剂，其余各组分及其配比与组合物X的相同，采用与实施例1相同的方法制备得到药物组合物A1-A5。

表4.药物组合物A1-A5的配方

对比实施例2使用常规渗透剂代替rhPH20的药物组合物

(1)将脱氧胆酸钠作为药物组合物的吸收促渗透剂，按照表5中各成分配比，使用同实施例1相同的方法制备组合物B1-B4。

表5药物组合物B1-B4的配方

(2)将乳铁蛋白水解物作为药物组合物的吸收促渗透剂，浓度为5mg/ml，按照表5中B1各成分配比，使用同实施例1相同的方法制备组合物B5，其中乳铁蛋白水解物采用文献：CN103566376A所公开的制备方法。

对比实施例3经口腔黏膜给药的含抗CD20单克隆抗体的药物组合物

表6含抗CD20单克隆抗体的药物组合物C

抗CD20单抗，如利妥昔单抗，若要实现口腔黏膜给药，可根据表6中组合物C中各成分配比，采用与实施例1相同的方法制备。但是，制备含如此高浓度利妥昔单抗的组合物，需要对抗体进行浓缩，但是浓缩后的抗体易发生聚集，不能保证抗体活性，并且通过口腔黏膜吸收后，在体内容易引起治疗性抗体的免疫原性反应，此过程中产生的中和性抗体可以使治疗性抗体无效。由此可见，在技术上无法实现经口腔黏膜给药的含抗CD20单抗的药物组合物的制备及其在治疗相关疾病中的用途。

实施例3Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性体外检测

采用TR146食管鳞状癌细胞(来源于ATCC)作为口腔粘膜上皮细胞渗透转运模型，以检测Exendin-4的渗透吸收性。采用文献Portero A.Pharm Res,2002,19(2):169-174中所述方法：

吸去插入式培养皿上下各室的DMEM培养液，用HBSS缓冲液清洗TR146细胞。然后在上、下腔室分别加入HBSS溶液，平衡1h后，吸出上室HBSS溶液，加入2mL供试品(药物组合物A-X，药物组合物B1-B4)。按设定时间从下室取样100μL，并立即补充等量HBSS溶液。采用色谱方法，进样分析，记录得到的峰面积(A)，计算各时间点Exendin-4的累积渗透量。根据得到的数据计算以下指标：(1)Exendin-4表观渗透系数：P_app＝(dQ/dt)/(A×C₀)；(2)Exendin-4通过插入式培养皿(无细胞时)的渗透系数：P_E-4＝(dQ/dt)/(A×C₀)；(3)细胞渗透系数：1/P_app＝1/P_c+1/P_E-4；(4)渗透吸收增强比率：ER＝P_c(组合物)/P_c(对照)。其中dQ/dt表示稳态的渗透速率，A是渗透面积(cm²)，C₀是指上腔室Exendin-4的起始浓度，P_c指Exendin-4通过细胞的渗透系数，P_E-4指无细胞时插入式培养皿的渗透系数，P_c(组合物)指药物组合物A-X中Exendin-4通过TR146的细胞渗透系数，P_c(对照)指组合物A1-A5中Exendin-4通过TR146的细胞渗透系数，其中药物组合物E、L、R、U、X的对照组分别为组合物A1和A1⁺、A2、A3、A4和A5。

组合物A1⁺对Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透性检测方法是：吸去插入式培养皿上下各室的DMEM培养液，用HBSS缓冲液清洗TR146细胞。然后在上、下腔室分别加入HBSS溶液，平衡1h后，吸出上室HBSS溶液，先加入1mL组合物A1⁺，然后再加入1ml组合物A(浓度为48μ8/ml的Exendin-4)。按设定时间从下室取样100μL，并立即补充等量HBSS溶液。采用色谱方法，进样分析，记录得到的峰面积(A)，计算各时间点Exendin-4的累积渗透量。

(1)实施例1和对比实施例1各药物组合物对Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞渗透吸收性的影响

表7.实施例1和对比实施例1各药物组合物对Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞渗透吸收性的影响(x±s，n＝3)

实验结果如表7所示，药物组合物A-X中Exendin-4具有良好的经TR146口腔粘膜上皮细胞的渗透吸收作用；组合物A1缺少rhPH20和黏膜吸附剂，使得Exendin-4的渗透吸收作用显著低于药物组合物A；组合物A1⁺(只含有rhPH20)，当与组合物A1(只含有Exendin-4)分别放入上下室时，Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性高于组合物A1，但是仍显著低于组合物A，表明rhPH20与有效成分Exendin-4分别使用时，在一定程度上可以促进Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收作用，但是仍显著低于本发明的药物组合物对Exendin-4的渗透吸收性；组合物A2、A4含有黏膜吸附剂，使得Exendin-4的经TR146口腔粘膜上皮细胞的渗透吸收作用略高于组合物A1，但是由于缺少rhPTH20，使得Exendin-4的渗透吸收作用显著低于组合物L、U；组合物A3、A5含有rhPH20，提高了Exendin-4经TR146口腔粘膜上皮细胞的渗透吸收作用，且高于组合物A1、A2和A4，但是难以在组合物中形成均一稳定的物质，仍显著低于组合物R、X。由此可知，rhPH20与黏膜吸附剂、增稠剂对TR146口腔黏膜上皮细胞渗透吸收Exendin-4具有协同作用。

(2)、对比实施例2采用常规吸收促渗透剂对Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性影响

脱氧胆酸钠作为药物组合物的吸收促渗透剂时，虽然可改变TR146口腔粘膜上皮细胞脂质双分子层有序结构，使磷脂分子的有序性降低，从而降低TR146口腔黏膜上皮细胞间的黏度和提高黏膜细胞间的通透性，但是，TR146口腔黏膜上皮细胞间形成的孔径大小有限，不如rhPH20降解黏膜细胞间透明质酸后所形成的孔径大，因此Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性较实施例1中Exendin-4的低。

乳铁蛋白水解物作为药物组合物的吸收促渗透剂时，虽然可以嵌入到TR146口腔黏膜上皮细胞表面，使得Exendin-4渗透黏膜，但是，降低TR146口腔黏膜上皮细胞间粘度的能力有限，不如rhPH20改变黏膜细胞间紧密连接的作用力强，因此，Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性较实施例1中Exendin-4的低。

实施例4不同酶活性的rhPH20对Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性影响

按照表8中D1-D3各组合物配比，其中rhPH20酶活性分别为300、600、1000、2000、5000、8000、12000、20000U/ml，采用同实施例1相同的方法制备得到含不同酶活性的rhPH20的药物组合物，并使用同实施例3相同的方法检测不同酶活性的rhPH20对Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性的影响。

表8药物组合物D1-D3的配方

实验结果如图1所示，当rhPH20酶活性为1000～20000U/ml，可有效促进Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收作用；当rhPH20酶活性小于1000U/ml时，Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收作用较rhPH20酶活性为1000～20000U/ml时较低，而在rhPH20酶活性小于500U/ml时，Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性极低，不能显著增加Exendin-4的生物利用度；当rhPH20酶活性高于20000U/ml时，不再显著增加Exendin-4的渗透吸收作用。由此得出，rhPH20酶活性为1000～20000U/ml时，Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性存在剂量依赖性。

实施例5不同浓度黏膜吸附剂对Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性影响

按照表9中E1-E3各组合物配比，其中黏膜吸附剂聚维酮K30，其浓度分别为0.2、0.8、1、5、8、12、15、18、25mg/ml，采用同实施例1相同的方法制备得到含不同浓度的黏膜吸附剂的组合物，并使用同实施例3相同的方法检测不同浓度黏膜吸附剂对Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性的影响。

表9药物组合物E1-E3的配方

实验结果如图2所示，当黏膜吸附剂聚维酮K30的浓度为1～15mg/ml时，可有效促进组合物粘附在口腔黏膜上，并有利于Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收作用，可提高其生物利用度；当聚维酮K30的浓度小于1mg/ml时，Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收作用很低，表明聚维酮K30浓度过低，不利于组合物的粘附作用，使得Exendin-4的渗透吸收作用显著降低；当聚维酮K30的浓度大于15mg/ml时，Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性没有显著增加，表明聚维酮K30浓度高于15mg/ml时，会显著增加组合物的粘稠度，使得与口腔黏膜接触时，粘附力高，影响Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的扩散吸收作用。由此可得，聚维酮K30浓度为1～15mg/ml，Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收性存在剂量依赖性。

此外，当黏膜吸附剂卡波姆浓度为0.2～1mg/ml，以及羧甲基壳聚糖浓度为1～5mg/ml时，具有与聚维酮K30浓度为1～15mg/ml时相似的Exendin-4经TR146口腔黏膜上皮细胞的渗透吸收作用趋势图。

实施例6.经口腔黏膜给药的含Exendin-4组合物体内药效实验

选取60只自发性Ⅱ型糖尿病KK^Ay小鼠，随机分为5组，每组12只。3组待试药物组的小鼠分别单次口腔黏膜给予实施例1制备的药物组合物W，分别按照56、168、504μg/kg(分别相当于Exendin-4为2、6、18μg/kg，参照已有研究的胰岛素喷雾剂Oral-lyn相对于注射给药设定剂量倍数)体重给药；阳性药对照组小鼠单次皮下注射给予0.6μg/kg体重Exendin-4；空白对照组小鼠单次口腔黏膜给予等量磷酸盐缓冲液。

其中，空白对照组和待试药物组的小鼠尾静脉注射60mg/kg戊巴比妥钠溶液进行麻醉后，使其在麻醉台上保持仰卧姿势，并经食管结扎，口腔黏膜给药时，保证每只实验动物处于水平线上的同一位置。将空白对照组和待试药物组的组合物分别装载在不同的喷雾瓶中，并将不同组别的组合物喷入到对应组别动物的口腔黏膜中，给药后10min解开食管结扎。

5组动物分别于给药前(0h)，首次给药后1h、2h、3h、4h、5h和6h时，对小鼠进行眼眶取血，用葡萄糖氧化酶法测定其空腹血糖浓度，考察药物组合物W有效成分Exendin-4对自发性Ⅱ型糖尿病KK^Ay小鼠血糖浓度的影响。每次取血测定血糖当天，在停食3h后给药，并在取血完成后恢复进食。

结果表明，药物组合物经单次口腔黏膜给药，与皮下单次注射Exendin-4，在给药后1h、2h和3h，与空白对照组相比，均显著降低自发性Ⅱ型糖尿病KK^Ay小鼠的血糖浓度(P<0.05)；高剂量药物组合物W(504μg/kg)和中剂量药物组合物W(168μg/kg)在给药后1h、2h和3h降低小鼠血糖浓度幅度显著高于皮下单次注射Exendin-4；给药后6h时，高剂量药物组合物W(504μg/kg)、中剂量药物组合物W(168μg/kg)和低剂量药物组合物W(56μg/kg)使得小鼠血糖浓度维持在一个低于皮下单次注射Exendin-4的水平；而空白对照组的自发性Ⅱ型糖尿病KK^Ay小鼠的血糖浓度一直处于较高水平(见表10、图3)。

表10药物组合物W单次口腔黏膜给药对自发性Ⅱ型糖尿病KK^Ay小鼠血糖(mmol/L)的影响

与空白对照组比，*p<0.05；**p<0.01

由此表明，本发明实施例1制备的经口腔黏膜给药的含Exendin-4药物组合物具有显著降低糖尿病小鼠血糖浓度的作用，且相较于皮下注射Exendin-4，本发明实施例1制备的药物组合物可以使小鼠的血糖浓度在较长时间内维持在一个较低水平。说明口腔黏膜给药途径已经实现了药物Exendin-4良好的吸收和利用。

在相同的实验条件下，药物组合物A-V和X表现出与药物组合物W近似的降糖效果，尤以药物组合物W最佳。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.用于口腔黏膜给药的含人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）类似物的药物组合物，其特征在于，包含：

1）浓度为25～500 μg/ml人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）类似物，所述人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）类似物为Exendin-4；

2）酶活性为1000~20000 U/ml 的人透明质酸酶（hPH20）；

3）一种以上药学上可接受的黏膜吸附剂，所述黏膜吸附剂浓度为0.2~15mg/ml，所述黏膜吸附剂为聚维酮、羧甲基壳聚糖、卡波姆中的一种或两种以上以任意比例混合所得的组合物；

4）一种增稠剂，所述增稠剂的质量百分比为1%-35%，所述增稠剂为羧甲基纤维素钠。

2.如权利要求1所述的用于口腔黏膜给药的含人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）类似物的药物组合物在制备用于治疗高血糖症和/或糖尿病的药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物制备为喷雾剂或口腔黏膜贴剂。

4.一种如权利要求1所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

1）制备含有黏膜吸附剂和增稠剂的混合溶液；

2）将重组制备所得的人透明质酸酶溶液加入到步骤1）所制备的混合溶液中，

混匀；

3）将重组制备所得的人胰高血糖素样肽-1 （hGLP-1）类似物溶液加入到步骤2）所制备的混合溶液中，所述人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）类似物为Exendin-4，混匀；

4）除菌，即得。