CN106872718A - 一种尿微量白蛋白检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种尿微量白蛋白检测试剂盒及其制备方法，检测试剂盒由试剂R1和试剂R2组成，试剂R1由缓冲液1、无机盐离子1、加速剂1、稳定剂1和防腐剂1组成；试剂R2由缓冲液2、无机盐离子2、防腐剂2、稳定剂2、助悬剂1和抗人白蛋白抗体组成。本发明检测试剂盒的制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的尿微量白蛋白的浓度。本发明检测试剂盒制备成本低廉，灵敏度高、准确性及精密度好，易于保存，数据重复性好，可广泛应用于临床生化分析仪。

Description

一种尿微量白蛋白检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种尿微量白蛋白检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

正常人尿中白蛋白通常在20mg/L以下，当尿白蛋白量低浓度升高，范围在20-200mg/L时，被称之为微量白蛋白尿，此时尿中的蛋白称为尿微量白蛋白。当尿微量白蛋白大于300mg/24h时称其为大量白蛋白尿。尿微量白蛋白排出量增加是疾病早期的改变，对疾病的早期诊断，早期治疗有重要的参考价值和临床意义。

尿微量白蛋白检测是一项筛选早期肾病高危人群的重要诊断工具，患有糖尿病(1型、2型)和高血压等病症的患者都应作为主要的被检人群，应引起积极的关注。此外，微量白蛋白尿症还是进行性肾病和心血管疾病危险因子的可靠指标。尿微量白蛋白的降低亦表示治疗有效。

测定尿微量白蛋白最理想的方法是留取24小时尿标本，由于尿白蛋白的排泄量存在较大程度的变异，所以未定时的尿液标本(随机尿)一次白蛋白排泄量增加，可能并无意义，连续2～3次增高方有诊断价值。某些进展缓慢的疾病，观察一段时期内尿液白蛋白排泄的变化，比一次测定结果更为重要。上述在实际应用上虽受到很多限制，但不应因留取尿液困难而废弃。随机尿测定尿微量白蛋白在目前也有应用，是简单易行的方法。但应掌握测定时间，因每日尿微量白蛋白排除量相对不恒定，应避免尿量变化对结果的影响。

综上所述，许多研究认为尿液微量白蛋白测定对早期发现肾脏功能改变及随后的治疗监控，其特异性和敏感度都比总蛋白高。高血压、糖尿病及系统性红斑狼疮等常伴有肾脏医学病变且呈缓慢进行性恶化，尿液微量白蛋白测定能较早发现这些异常。在糖尿病时，尿液白蛋白排泄量增加常伴随有肾小于滤过率增加，它发生于肾病的早期阶段，在肾组织学或结构改变之前即可检出，对预防糖尿病肾脏并发症的发生有重要的意义。尿微量白蛋白的检测可提示临床给予特定人群相应的治疗使上述人群获益，早期治疗避免或减少了以后进行的透析和一些昂贵的末期治疗。此项检测虽简单有效意义却很深远。

国内目前应用的尿微量白蛋白检测方法主要有干化学检验法、免疫荧光法、酶免疫法、放射免疫法以及免疫比浊法。干化学检验法只能提供半定量或定性的结果，同时干化学试纸条检测结果受较多因素影响，在临床检验中不可避免的会出现假阴性和假阳性结果。免疫荧光法及酶免疫法操作复杂且耗时长，不便广泛临床应用；放射免疫法灵敏度高，特异性强，但具有放射性污染，试剂保存期短等缺点。免疫比浊法具有操作简单，测定周期短，精密度高在生化分析仪上使用较为广泛。但是，由于免疫比浊法的检测原理是反应生成不溶性抗原-抗体复合物，并产生一定的浊度，浊度的高低反映样品中微量白蛋白的含量，导致现有的尿微量白蛋白试剂盒不可避免的出现灵敏度较低的不足。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种尿微量白蛋白的检测试剂盒，该试剂盒可直接应用于全自动生化分析仪上，结果准确性强、灵敏度高、使用方便，且便于大规模推广。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种尿微量白蛋白检测试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由缓冲液1、无机盐离子1、加速剂1、稳定剂1和防腐剂1组成；所述试剂R2由缓冲液2、无机盐离子2、防腐剂2、稳定剂2、助悬剂2和抗人白蛋白抗体组成；

所述试剂R1的组分为：

所述试剂R2的组分为：

本发明中的防腐剂1和防腐剂2是指可以抑制试剂中细菌和微生物污染的一类试剂，对试剂具有防腐杀菌的作用。稳定剂1和稳定剂2可以保持抗人白蛋白抗体活性。

优选地，所述试剂R1中的缓冲液1选自MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一种或多种的组合，其pH为7.0～9.0；所述试剂R2中的缓冲液2选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液Hepes缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中任意一种或多种的组合，其pH为7.0～9.0。

进一步地，所述缓冲液1为MES缓液；所述缓冲液2为PBS缓冲液。

所述缓冲液1、缓冲液2可以采用本领域内公知的各种pH调节剂来进行pH调节。

优选地，所述试剂R1中的无机盐离子1选自KCl、NaCl、MgCl₂、CaCl₂中的任意一种或多种的组合；所述试剂R2中的无机盐离子2选自NaCl、KCl、Na₂CO₃、Na₂SO₄、K₂SO₄中的任意一种或多种的组合。

进一步地，所述无机盐离子1和无机盐离子2均为NaCl，这样可以保持体系长期稳定并且有价格低廉、原料易得的优点。

优选地，所述试剂R1中的防腐剂1为叠氮钠、硫柳汞或者ProClin300；所述试剂R2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或ProClin300。

进一步地，所述防腐剂1和防腐剂2均为叠氮钠，具有优良的防腐杀菌性能。

优选地，所述试剂R1中的加速剂1为PEG6000、PEG8000或葡聚糖。

进一步地，所述加速剂1为PEG6000，由于PEG6000属于非离子型水溶性聚合物，在水中的溶解性比较大，可以调节试剂R1的粘度，促进抗原和抗体分子结合为复合物。

优选地，所述试剂R1中的稳定剂1和试剂R2中的稳定剂2均为牛血清白蛋白，稳定剂1和稳定剂2可以保护抗人白蛋白抗的活性。

优选地，所述助悬剂2为阿拉伯胶、海藻酸钠、黄原胶或者甘油。

进一步地，所述助悬剂2为甘油，可以在加入样本后使抗原-抗体复合物悬浮，提高了反应的准确度。

优选地，所述试剂R1由MES缓冲液、NaCl、PEG6000、牛血清白蛋白和叠氮钠组成；所述试剂R2由PBS缓冲液、NaCl、叠氮钠、牛血清白蛋白、甘油和抗人白蛋白抗体组成；

所述试剂R1的组分为：

试剂R1：

所述试剂R2的组分为：

上述尿微量白蛋白检测试剂盒的制备方法，具体包括如下步骤：

A、试剂R1的制备：

在缓冲液1中依次加入无机盐离子1、加速剂1、稳定剂1、防腐剂1搅拌混合均匀，即得试剂R1；

B、试剂R2的制备：

在缓冲液2中依次加入无机盐离子2、防腐剂2、稳定剂2、助悬剂2、抗人白蛋白抗体搅拌混合均匀，即得试剂R2。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性及精密度好，且生产成本低的优点。

2、本发明采用的尿微量白蛋白检测方法为免疫透射比浊法，该方法使得尿微量白蛋白的检测更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪，特别是对急诊能实现快速定量检测。

3、本发明创新性的在试剂R2中添加了甘油作为助悬剂，使得在样本加入后参与反应时产生的抗原-抗体复合物悬浮且分散均匀，即使在较低浓度下也可以被检测出来，极大的提高了试剂的检测灵敏度。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。

实施例1

一种尿微量白蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其组成如下：

试剂R1，其组分为：

试剂R2，其组分为：

实施例2

一种尿微量白蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其组成如下：试剂R1，其组分为：

试剂R2，其组分为：

实施例3

试剂盒的制备及使用方法：

1、试剂准备

A、试剂R1的制备：

在MES缓冲液50mmol/L中依次加入NaCl 0.5％、PEG6000 25g/L、牛血清白蛋白10g/L、叠氮钠1g/L搅拌混合均匀，用0.22微米混合纤维素膜过滤，即得试剂R1；

B、试剂R2的制备：

在PBS缓冲液50mmol/L中依次加入NaCl 0.5％、叠氮钠1g/L、牛血清白蛋白10g/L、甘油30mmol/L、抗人白蛋白抗体3.0g/L搅拌混合均匀，用0.22微米混合纤维素膜过滤，即得试剂R2。

2、全自动生化分析仪参数设置

a、检测温度：37℃；

b、检测波长：主波长340nm，副波长700nm；

c、反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；

d、反应方向：正反应；

3、检测步骤

a、取200μl试剂R1与20μl待测样本混匀；

b、将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；

c、加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；

d、根据样本中尿微量白蛋白(mg/L)＝CS×ΔA_W/ΔA_S(mg/L)计算出样本中的尿微量白蛋白的浓度。

实施例4

试剂盒的制备和使用方法：

1、试剂准备

A、试剂R1的制备：

在Tris-HCl缓冲液75mmol/L中依次加入KCl 0.5％、PEG6000 25g/L、牛血清白蛋白10g/L、叠氮钠1g/L搅拌混合均匀，用0.22微米混合纤维素膜过滤，即得试剂R1；

B、试剂R2的制备：

在甘氨酸缓冲液50mmol/L中依次加入KCl 0.5％、叠氮钠1g/L、牛血清白蛋白10g/L、甘油20mmol/L、抗人白蛋白抗体2.0g/L搅拌混合均匀，用0.22微米混合纤维素膜过滤，即得试剂R2。

2、全自动生化分析仪参数设置

a、检测温度：37℃；

b、检测波长：主波长340nm，副波长700nm；

c、反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；

d、反应方向：正反应；

3、检测步骤

a、取200μl试剂R1与20μl待测样本混匀；

b、将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；

c、加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；

d、根据样本中尿微量白蛋白(mg/L)＝CS×ΔA_W/ΔA_S(mg/L)计算出样本中的尿微量白蛋白的浓度。

下述测试为对实施例试剂盒的性能测试

1、灵敏度

用试剂盒测试已知浓度在(20±2)mg/L的样品，记录在试剂盒规定参数下的吸光度变化。换算为20mg/L微量白蛋白含量的吸光度变化。表1为实施例1所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒分别对样品进行测定的结果，测定结果见表1：

表1

由表1可知，本发明所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒对样品吸光度变化的测定结果ΔA较大，因此测定灵敏度高，而且实施例1为最优的选择。

2、准确度

表2为实施例1所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的尿微量白蛋白的浓度为35mg/L，测定结果见表2：

表2

	第1次(mg/L)	第2次(mg/L)	第3次(mg/L)	均值(mg/L)	偏差(％)
						实施例1	33.33	33.7	34.31	33.78	3.49％
实施例2	37.56	37.04	36.23	36.94	5.55％

由表2可知，本发明所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。

表3为实施例1所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的尿微量白蛋白的浓度为126mg/L，测定结果见表2：

表3

	第1次(mg/L)	第2次(mg/L)	第3次(mg/L)	均值(mg/L)	偏差(％)
						实施例1	127.68	125.78	126.82	126.76	0.60％
实施例2	126.54	127.74	128.83	127.70	1.35％

由表3可知，本发明所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。

3、精密度

表4为实施例3所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：

表4

由表4可知本发明所制得的测定尿微量白蛋白的试剂盒的精密度比较好，而且由表1、表2和表3可知，实施例3为最优的选择。

实施例5

一种尿微量白蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其组成如下：

试剂R1，其组分为：

试剂R2，其组分为：

实施例6

一种尿微量白蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其组成如下：试剂R1，其组分为：

试剂R2，其组分为：

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种尿微量白蛋白检测试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由缓冲液1、无机盐离子1、加速剂1、稳定剂1和防腐剂1组成；所述试剂R2由缓冲液2、无机盐离子2、防腐剂2、稳定剂2、助悬剂2和抗人白蛋白抗体组成；

所述试剂R1的组分为：

所述试剂R2的组分为：

2.根据权利要求1所述的一种尿微量白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的缓冲液1选自MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一种或多种，其pH为7.0～9.0；所述试剂R2中的缓冲液2选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液Hepes缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中任意一种或多种，其pH为7.0～9.0。

3.根据权利要求1所述的一种尿微量白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的无机盐离子1选自KCl、NaCl、MgCl₂、CaCl₂中的任意一种或多种；所述试剂R2中的无机盐离子2选自NaCl、KCl、Na₂CO₃、Na₂SO₄、K₂SO₄中的任意一种或多种。

4.根据权利要求1所述的一种尿微量白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的防腐剂1为叠氮钠、硫柳汞或者ProClin300；所述试剂R2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或ProClin300。

5.根据权利要求1所述的一种尿微量白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的加速剂1为PEG6000、PEG8000或葡聚糖。

6.根据权利要求1所述的一种尿微量白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的稳定剂1和试剂R2中的稳定剂2均为牛血清白蛋白，助悬剂2为阿拉伯胶、海藻酸钠、黄原胶或甘油。

7.根据权利要求6所述的一种尿微量白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述助悬剂2为甘油。

8.根据权利要求1所述的一种尿微量白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液1为MES缓液，缓冲液2为PBS缓冲液，无机盐离子1和无机盐离子2均为NaCl，加速剂1为PEG6000，防腐剂1和防腐剂2均为叠氮钠。

9.根据权利要求1所述的一种尿微量白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1由MES缓冲液、NaCl、PEG6000、牛血清白蛋白和叠氮钠组成；所述试剂R2由PBS缓冲液、NaCl、叠氮钠、牛血清白蛋白、甘油和抗人白蛋白抗体组成；

所述试剂R1的组分为：

试剂R1：

所述试剂R2的组分为：

10.如权利要求1所述的一种尿微量白蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

A、试剂R1的制备：

在缓冲液1中依次加入无机盐离子1、加速剂1、稳定剂1、防腐剂1搅拌混合均匀，即得试剂R1；

B、试剂R2的制备：

在缓冲液2中依次加入无机盐离子2、防腐剂2、稳定剂2、助悬剂2、抗人白蛋白抗体搅拌混合均匀，即得试剂R2。