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CN106834117A - 用于解除动物细胞贴附的酶反应器及智能酶反应工作站 - Google Patents

用于解除动物细胞贴附的酶反应器及智能酶反应工作站 Download PDF

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CN106834117A CN201610414257.0A CN201610414257A CN106834117A CN 106834117 A CN106834117 A CN 106834117A CN 201610414257 A CN201610414257 A CN 201610414257A CN 106834117 A CN106834117 A CN 106834117A
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何明哲
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Abstract

本发明公开了一种用于解除动物细胞贴附的酶反应器及智能酶反应工作站。所述酶反应器包括密闭罐体、截留组件及搅拌组件，所述搅拌组件包括搅拌轴和固定连接于所述搅拌轴上的搅拌桨，所述搅拌桨分布于所述密闭罐体内腔中，所述搅拌桨采用提升带桨，所述提升带桨的直径与所述密封罐体的内径之比为1.0:1.3～1.0：2.0，所述提升带桨的桨叶倾角为5～25°。本发明可用于收获贴壁依赖性动物细胞和其中的表达产物，通过在无菌环境中将细胞从已经饱和的培养介质上分离，将细胞和表达产物收集，而培养介质可以重复使用。本发明还可用于贴壁依赖性动物细胞培养过程的全体积培养液更换，更换效率可以达到98％以上。

Description

用于解除动物细胞贴附的酶反应器及智能酶反应工作站
技术领域
本发明涉及生物制品生产过程中贴壁依赖性动物细胞的培养、接种、扩增、换液、清洗和收获技术，具体涉及一种用于解除动物细胞贴附的智能酶反应工作站。
背景技术
目前，大量生物药物均是哺乳动物细胞表达的产品。大部分国内厂商在利用动物细胞生产生物制品时，都是借助细胞工厂和滚瓶培养技术而实现的，但这些技术存在批量小、效率低、劳动强度大等缺陷。
一般而言，用于生产人用和动物用疫苗、重组蛋白类药物以及部分小分子药物的动物细胞具有贴壁依赖型，这类细胞在体外不能直接悬浮在培养液中，需要依附于培养介质，常用的培养介质有GE公司的Cytodex1、Cytodex2等，NBS公司的DISC载体，以及台湾赛宇公司的纸片载体等。在工业级生物反应器培养动物细胞生产相应生物制品过程中，必须先达到一定的培养规模，一般为500L至5000升，在这一过程中，需要不断的将饱和的介质上所含有的细胞与载体脱离并富集后，进入到新的载体上，实现细胞的扩增和培养规模的放大。获得富集的游离贴壁细胞种子是工业级放大生产的关键。此外，在生产过程中，对培养介质进行全体积清洗、更换培养液也十分关键。最后在生产结束后，回收培养介质与收获细胞产品也涉及到细胞与介质的分离过程。
目前实现上述功能的方法主要有直接消化分离、原位消化转移、球转球迁移、离位消化转移法等四种。
但无论采用这些分离方法中的哪一种，其中都必须有一个阶段是通过物理作用分离动物细胞和介质。然而，因动物细胞十分脆弱，所以对物理分离作用产生的剪切力十分敏感，但是剪切力不够又不能实现分离的效果，如何能达成这两者的平衡，一直是业界渴求解决的难题。
另一方面，随着生产过程分析技术(PAT)的普及和GMP标准要求的逐渐提高，对生产用设备的在线控制和智能自动化要求越来越高，但现有的酶反应设备均难以满足这些实际需求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于解除动物细胞贴附的酶反应器及智能酶反应工作站。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
一种用于解除动物细胞贴附的酶反应器，包括密闭罐体、截留组件及搅拌组件，所述截留组件包括至少一层筛板或滤网，该至少一层筛板或滤网分布于所述密闭罐体内腔下部，且所述筛板或滤网外周部与所述密封罐体内壁环绕连接，所述搅拌组件包括搅拌轴和固定连接于所述搅拌轴上的搅拌桨，所述搅拌轴与设于所述密闭罐体顶部的轴承座配合，所述搅拌桨分布于所述密闭罐体内腔中，所述搅拌桨采用提升带桨，所述提升带桨的直径与所述密封罐体的内径之比为1.0:1.3～1.0：2.0，所述提升带桨的桨叶倾角为5～25°。
在一些实施方案之中，所述搅拌轴的转速为20～200rpm。
在一些实施方案之中，所述密闭罐体主要由罐体和与罐体上、下端密封连接的上、下密封盖组成，所述上、下密封盖上还连接有与所述罐体内腔连通的物料输入、输出管道。
在一些实施方案之中，所述截留组件包括一层筛板或滤网，所述筛板或滤网的滤孔的孔径由上至下依次减小；
或者，所述截留组件主要由两层以上筛板或滤网叠加而成，并且任意一层筛板或滤网的滤孔孔径小于分布于其上方的筛板或滤网的滤孔孔径。
在一些实施方案之中，所述酶反应器还包含有温度控制组件、pH控制组件、气压控制组件、在线活细胞传感器监测组件和称重组件；
所述温度控制组件包括设于所述罐体内腔反应区的温度传感器，附着于所述罐体外壁的夹套水系统，以及包覆所述夹套水系统的电热毯；
所述pH控制组件包含设置于所述罐体内腔反应区的pH传感器以及与所述罐体内腔连通的酸碱液补加管路，所述酸碱液补加管路上分布有泵体；
所述气压控制组件包括安装于所述罐体上的呼吸器以及与所述罐体内腔连通的排气管道，所述排气管道设有压力调节阀；
所述在线活细胞传感器监测组件包括设于所述罐体内腔反应区的电极，所述电极贴近所述截留组件。
在一些较为具体的实施方案之中，所述称重组件设于所述密闭罐体底部的、不能与任何物料相接触的位置处。
本发明还提供了一种智能酶反应工作站，其包括所述的酶反应器以及中央控制柜，所述中央控制柜包括分别与所述搅拌组件、温度控制组件、pH控制组件、气压控制组件、在线活细胞传感器监测组件和称重组件连接的中央控制单元。
在一些实施方案之中，所述的智能酶反应工作站还包括如下组件中的至少一种：
快速进出液模块，用于将所述酶反应器中的液体快速导出，同时将所需的液体快速导入所述酶反应器；
循环水温控制模块，用以与所述夹套水系统配合而对所述酶生物反应器内的温度进行调控；
光谱分析模块，用于对所述酶反应器内的反应情况进行监测；
罐压提供模块，用于调控所述酶反应器内的气压；
所述快速进出液模块、循环水温控制模块、光谱分析模块、罐压提供模块还均与所述中央控制单元连接。
在一些较为具体的实施方案之中，所述的智能酶反应工作站还包括：与所述中央控制单元并行设置的独立监控模块，并且所述独立监控模块还与所述搅拌组件、温度控制组件、pH控制组件、气压控制组件、在线活细胞传感器监测组件、称重组件、快速进出液模块、循环水温控制模块、光谱分析模块，罐压提供模块中的部分组件或全部组件连接。
在一些较为具体的实施方案之中，所述中央控制单元包括PLC，所述PLC与触控屏连接。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1.本发明解除动物细胞贴附的智能酶反应工作站可以用于贴壁依赖性动物细胞的种子制备和扩大培养，通过在无菌环境中将上述细胞从已经饱和的培养介质(如微载体、多孔载体或纸片载体等)上分离，可以富集后形成新鲜的种子细胞，接种于新的空白培养介质或直接悬浮培养，形成培养规模上的放大，另一方面种子细胞获得了新的生长空间，继续扩增提高细胞总量。
2.本发明解除动物细胞贴附的智能酶反应工作站可以用于收获贴壁依赖性动物细胞和其中的表达产物，通过在无菌环境中将上述细胞从已经饱和的培养介质(如微载体、多孔载体或纸片载体等)上分离，将细胞和表达产物收集，而培养介质可以重复使用或进行无公害处理。
3.本发明解除动物细胞贴附的智能酶反应工作站可以用于贴壁依赖性动物细胞培养过程的全体积培养液更换，更换效率可以达到98％以上。
附图说明
图1a为本发明解除动物细胞贴附的智能酶反应工作站的实施例2中中央控制柜的结构示意图；
图1b为本发明解除动物细胞贴附的智能酶反应工作站的实施例2中酶生物反应器的结构示意图；
图1c为本发明解除动物细胞贴附的智能酶反应工作站的实施例2中辅助控制模块的结构示意图；
图2为本发明解除动物细胞贴附的智能酶反应工作站中实施例2的实施流程图；
图3为本发明解除动物细胞贴附的智能酶反应工作站中实施例3的实施流程图；
图4a为PK-15(猪睾丸细胞)细胞与介质(Cytodex-1)脱离前的图片；
图4b为本发明在应用于脱离PK-15(猪睾丸细胞)细胞与介质(Cytodex-1)后的效果图；
附图标记说明：1—玻璃罐体，2—气体分布器，3—搅拌桨，4—标准螺口，5—固定瓶盖，6—标准电极口，7—进气口，8—密封圈，9—磁流体密封，10—伺服电机机架，11—伺服电机23—称重模块，24—中央控制模块，25—循环控温模块，26—人机操作界面，27—罐压提供模块，28—快速进出液模块。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要涉及一种用于解除动物细胞贴附的智能酶反应工作站。
本发明的实施例提供了一种用于解除动物细胞贴附的智能酶反应工作站，该设备包括两个核心部分：酶生物反应器和中央控制柜。此外，所述工作站还包括辅助控制模块：如快速进出液模块、循环控制模块和光谱分析模块等。
所述工作站的各个部分和模块均有通讯线路相连，其中酶反应器电源由中央控制柜提供，除此之外，中央控制柜还向光谱分析模块供电，而快速进出液模块和循环控制模块均单独连接电源。
所述酶反应器的主体是一个密闭的反应区，由密闭罐体、截留组件与搅拌组件组成。罐体一般采用玻璃或316L不锈钢材质，其形状一般为圆柱形，高径比小于1:1。
反应罐上端设置有密封盖，密封盖上有物料进出通道，罐体侧面设置有水夹套，而夹套通过连接于中央控制柜的电热毯控温。罐体底部同样设有密封盖，密封盖上有物料进出通道。
所述酶反应器的底密封盖托着截流组件。截流组件为多层圆形不锈钢滤网(2-10层)，根据需要使用20-200目均可。截留组件的不锈钢滤网安装方式与传统技术相反，正面(上面)为粗制滤孔，反面则为细制滤孔，这样做的目的是减少细胞的拥堵。
所述酶反应器的搅拌组件采用上磁力搅拌，搅拌轴由上密封盖通过轴承座进入到罐体。通过CFD技术对罐内流体进行计算，结合单细胞悬浮状态的生理特性，罐内搅拌系统一般可以采用常规的平叶桨(叶片倾角30-60度)和三叶大倾角桨(叶片倾角30-60度)，这些桨叶对于微载体等密度较小的载体可以起到混合的作用，而对于密度较高的载体介质则难以平衡剪切力，推动载体运动的剪切力往往会导致细胞损伤。所以，本发明的酶反应器使用提升带式搅拌系统。所使用的提升带(倾角5-25度)，桨的直径和罐体直径为1.0:1.3-1.0：2.0，通过提升作用将低密度或高密度载体强制性提升到桨叶中部，再通过离心力的作用甩出桨区。通过CFD计算及实践证明，这一过程仅产生极低的剪切力。由于其可以大容量运输高密度载体介质，较前述桨叶更好的起到了混合和细胞介质分离的效果。搅拌系统的驱动是通过伺服电机实现的，伺服电机转速设定范围20-200rpm，通过电源线和数据线与中央控制柜连接。
所述酶反应器所涉及的温度控制组件包括：(1)由罐体上密封盖进入罐体的温度传感器；(2)夹套水系统；(3)电热毯加热系统三个部分。具体的，温度传感器与中央控制柜相连；夹套水系统还包括一个进水口和一个出水口，以及相应的进出水开关和管道；电热毯与中央控制柜相连，由中央控制柜提供电源并控制。在温度控制过程中，温度电极会向中央控制系统发出实时温度检测值，如果检测值低于设定值，则电热毯会根据PID原理计算出加热功率并加热夹套，夹套水受热向反应罐内部传热，并加热反应罐内部，由于反应罐在使用过程中内部液体容量会经常性发生变化，所以该加热系统可以持续稳定的保证反应罐内的液体和气体温度稳定在设定值。
所述酶反应器含有pH控制组件，其包含pH传感器和酸碱补加控制两个部分，其中pH传感器通过上密封盖的pg-13.5标准电极孔进入到罐体内部，并且贴近下截留组件，通过数据线与中央控制柜相连，向中央控制系统实时传输反应罐内的pH数值。酸碱补加通过上密封盖上的同体双通道分别进入反应罐内。酸液储存于外接试剂瓶内，可以使用高浓度盐酸、硝酸、硼酸等。碱液也储存于外接试剂瓶内，可以使用高浓度氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠等。上述试剂瓶分别通过硅胶管与同体双通道连接，并且通过中央控制柜的小型蠕动泵控制进入和流速。
所述酶反应器还含有气压控制组件，上密封盖装有呼吸器，用于气体的进入和排出。另外上密封盖还含有一个排气管道，该管道装有压力调节阀，能够根据罐内压力调节气体的排放速率。在缺少快速进出液模块的情况下，使用者为了实现快速排液的目的，常常会使用压缩空气提高罐内压力的方式增加排液速率，该压力调节阀可以确保反应罐内的压力处于安全范围，并且恒定。
所述酶反应器还含有在线活细胞传感器监测组件。该电极通过上密封盖上的pg-13.5标准电极接口进入到反应罐内部，并贴近截留组件。电极通过数据线与中央控制柜连接。该组件可以通过即时监测反应罐内细胞尺度上的电压和电容变化来表征游离活细胞密度，并能够反应介质上细胞脱离程度的变化，其所反馈的数据信号经过中央控制系统转换后，可以用来作为调节各项控制参数的最重要指标。
所述酶反应器还含有称重组件，其位于反应罐的底部，不与任何物料相接触，并且通过数据线和中央控制柜连接。称重系统实时反馈反应罐体的总重量，主要用于测量反应罐体的进出液量，并反馈调节进出液开闭。
所述酶反应器的上下密封盖还含有若干物料进出管道。
所述中央控制柜为带有工控机及执行元器件的电气控制柜，并安装有2-8个小型蠕动泵。该设备的核心组件为可编程逻辑控制器(PLC)，其与上位机(触摸屏)相连接，控制着全部的电控组件。此外，中央控制柜还包含如下组件：
(1)马达电机变送器，由PLC中控，控制伺服电机的运行，搅拌转速的变化；
(2)2-8个独立定速蠕动泵，由PLC中控，控制硅胶管内液体的流速和方向；
(3)电热毯变送器，由PLC中控，以PID模式控制电热毯的加热功率和时间；
(4)pH电极变送器，由PLC中控，实时传输pH电极检测值；
(5)温度电极变送器，由PLC中控，实时传输温度电极检测值；
(6)活细胞电极变送器，由PLC中控，实时传输检测值；
(7)电子称重变送器，由PLC中控，实时传输检测值；
(8)与各辅助模块相连的变送器等，由PLC中控，控制各模块运行和参数。
上述中央控制柜由针对性开发的上位机操作系统，实现人机互动。可以实施的复杂联动功能如下：
(1)搅拌控制：根据设定值改变酶反应器中搅拌组件的转速，并根据程序设定调节。
(2)pH控制：根据设定值，通过pH传感器反馈的数据，通过PID模式控制蠕动泵调节酸液和碱液的加入量，使pH值快速达到设定值，并减少波动，可设置报警值。
(3)温度控制：根据设定值，通过温度传感器反馈的数据，通过PID模式控制电热毯的加热功率和周期，加热夹套，并进一步控制酶反应器内的温度。
(4)酶反应进程控制：根据活细胞电极反馈的数值，模拟酶反应进行的过程，并程序性的启动或关闭相应组件，保证酶反应过程的稳定性和精确性。
(5)进出液控制：通过电子称重反馈的数值，控制蠕动泵，使进液量和出液量与设定值吻合。
程序自动化控制：通过事先设定参数，控制各组件的自动运行，并监控运行的稳定性，提供报警功能。
所述智能工作站还可以通过辅助模块增强功能，辅助模块具有独立的设备和配件，和中央控制柜连接或独立运行，常用的模块有如下几种：
快速进出液模块：由多种类型和规格的蠕动泵有规律的搭配组成，用于将酶生物反应器中的液体快速导出，同时将所需的液体快速导入到其中；该模块与中央控制柜相连接，由操作软件控制。由于在酶反应器过程中，反应时间很短，所以液体的快速进出非常关键，该模块所含蠕动泵的规格远大于中央控制柜的蠕动泵，增强其功能，保证在不损伤细胞活性的前提下，尽可能快的完成移液、进出料的过程，以降低通常移液过程较长给细胞活性带来的不利影响。移液的时间通常控制在1～3分钟，进出料的时间通常控制在2～5分钟。
(1)循环水温控制模块：由循环恒温箱、调速泵和管道组成，独立于中央控制柜运行，用于酶生物反应器更加精准的温度控制，并降低温度调节时间；因为其能够循环提供从16-40摄氏度的恒温水，相比较电热毯加热方式能更快的改变酶反应器内的温度，另外，当需要快速降温时，该模块能够发挥巨大作用，适合在非空调环境工作。
(2)光谱分析模块：由小型拉曼光谱检测仪及配件组成，用于酶生物反应器内反应情况的分析和反馈控制；该模块与中央控制柜相连，可以实时反馈酶反应器中的细胞数目、状态、关键物质的浓度等参数，且不受罐体内复杂环境的影响，数据更加稳定可靠，可以辅助活细胞电极的检测，增强控制系统的酶反应器过程反馈控制功能。
(3)罐压提供模块：由小型空压机和压力调节阀以及管道配件组成，用于保持罐内正压和增强酶反应器的进出液效率。该模块独立运行，使用该模块，可以通过向酶反应器内加压的方式快速排空液体，也可以通过向储液罐加压的方式快速打入液体。压力调节阀调节压力，并保证罐体承受的压力在合理范围。该模块和快速进出液模块一般不同时使用。
独立电脑监控模块：是指单独配置电脑系统，替代工作站上位机操作系统，提高控制的便利性，需要安装控制软件。
除此之外，还有其它的模块，可以根据实际需要选择。
上述智能酶反应器工作站，使用过程主要包括如下几个阶段：
(1)准备阶段：工作站安装、调试和管道连接。准备缓冲液、酶液和酸液、碱液、培养基，各储液罐、试剂瓶及相关配套管道灭菌。
(2)灭菌消毒阶段：使用前需要对玻璃酶反应器进行离位灭菌(对于不锈钢材质可以使用在线灭菌方式)，离位灭菌前需要将伺服电机、配套管道阀门和电极数据线等取下，并将固定在罐体上的管道封闭，反应罐体加入20％-50％超纯水，夹套需要加入20％-50％纯净水，送入蒸汽灭菌锅或蒸汽灭菌柜121摄氏度灭菌，取出后重新安装，液体和气体管道需通过快速接头无菌连接，电极需要通过数据线和中央控制柜连接，进出液硅胶管安装到蠕动泵，并连接酸碱瓶。
(3)无菌安装阶段：使用时，先通过罐压提供模块恒定酶反应器内的罐压至略微正压，一方面降低罐内温度，另一方面检查罐体密封性。启动循环水温控制系统，根据温度电极的数值将温度设定在合适的数值，如高于设定值，则根据需要启动电热毯加热升温，如低于设定值，则使用循环水机用低温水降温。待酶反应器内的水温达到设定值后调整夹套内循环水温至设定值，此时仅通过电热毯控温。
(4)清洗第一阶段：进出液控制模块通过大流量蠕动泵快速将罐体内的液体排出，并使用清洗液冲洗罐体后排净，该过程中无需控制温度。将培养悬液(培养基中含有长满细胞的载体介质)通过进液口导入到罐体内，系统将根据称重组件反馈的数据进行比较，达到设定值后停止蠕动泵，进液停止，之后系统将启动密封盖底部的排料口蠕动泵，快速排空罐体内的培养基，而培养载体将被截留组件拦截在罐体内。待液体陪空后，系统再次启动清洗液蠕动泵，通过进料口进入罐体，待称重量达到设定值后，系统将按照设定值启动搅拌组件。搅拌开启后，系统将根据温度电极反馈的数值，启动电热毯，加热夹套水，使罐体内液体温度快速达到设定温度，一般为细胞培养温度。短暂清洗完成后，停止搅拌和控温，并快速排空清洗液。上述步骤重复1-3次。
(5)酶反应阶段：待清洗阶段结束后，系统将开启酶液进入步骤，通过蠕动泵快速将酶液通过单独的酶液进口导入到罐体内，称重组件控制进入体积，搅拌系统低速运转。与此同时，系统同时启动两个控制，一方面系统将根据实测和设定pH值的差值，通过PID控制模式加入酸液或者碱液，快速调节pH值至设定值；另一方面系统将根据温度实测和设定值的差距，通过PID控制模式加热电热毯(酶液的温度几乎均小于设定温度，如需降温，需提前将循环温度控制模块打开并设定较低的夹套水温)。上述过程应在很短的时间内完成。活细胞传感器或光谱分析模块在该阶段开始后即启动，即时监控酶反应全过程，游离悬浮活细胞数目初始数值极低并一段时间保持稳定，随后逐渐升高，并呈现加速升高的状况。系统将分析上述数值，并按照设定的参数，在一个时刻启动酶液排出通道的蠕动泵，关闭搅拌、pH控制和温控，酶液将被快速排净，并进入下一个阶段。
(6)清洗第二阶段：与第一阶段基本相同，系统开启清洗液通道的蠕动泵，清洗液进入适量体积并启动低速搅拌，温度控制在培养温度。该过程可重复1-3次，活细胞传感器或光谱分析模块全程监控细胞损失情况。
(7)终止阶段：待清洗第二阶段完成之后，系统开启培养基进入通道的蠕动泵，培养基进入适量体积并启动高速搅拌，温度控制在培养温度。该过程可以持续较长时间，一般根据活细胞传感器或光谱分析模块监测的游离悬浮细胞数目不再增加，或细胞活性开始下降为终止。
(8)细胞转移阶段：待细胞与载体介质分离完毕后，系统开启细胞转移通道的蠕动泵，培养基携带着细胞进入到新的容器中，而载体介质留在酶反应器中，实现了两者的无菌分离。
如下将结合附图及若干实施例对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
实施例1
该实施例介绍使用所述智能酶反应器工作站实现PK-15细胞从90升生物反应器培养转移到300升生物反应器培养的方式。使用的智能酶反应器工作站如图1所示，酶反应器的工作体积是12升，所配备的辅助模块包括快速进出液模块、循环温控模块和罐压控制模块。酶反应器使用传送带桨，桨叶直径与罐体直径比值为：1.0:1.8。
90升生物反应器培养PK-15细胞，培养体积是60升，载体介质使用GE公司生产的Cytodex-1，3克/升，细胞密度为2.5×106cells/mL。300升生物反应器培养体积180升，同样使用3克/升，预计接种细胞密度为0.6×106cells/mL。
第一阶段：相关准备工作，配制清洗液100升，盛放于100升储液罐。配制酶液(0.25％胰酶)10升，盛放于10升无菌补料瓶，新鲜培养基30升，盛放于100升储液罐，培养基中含3％新生牛血清。其余无菌储液罐、补料瓶、硅胶管道和接头若干，无菌酸液(1N HCl)和碱液(3N NaOH)各1升。
第二阶段：酶反应器内含3升18兆欧超纯水，夹套含1升2兆欧去离子水，截留组件采用150目316不锈钢滤网3层。置于1立方米蒸汽灭菌柜中121摄氏度灭菌45分钟，取出后重新安装，液体和气体管道通过快速接头无菌连接，各电极通过数据线和中央控制柜连接，进出液硅胶管安装到蠕动泵，并连接酸碱瓶。
第三阶段：安装完毕后，通过罐压提供模块将罐体内压力增加到0.1bar。启动循环水温控制系统，设定出水温度为36摄氏度，罐体内温度设定为37摄氏度，系统通过电热毯加热夹套给罐内液体升温，等待10分钟，待系统稳定。
第四阶段：清洗第一阶段，进出液控制模块通过大流量蠕动泵快速将罐体内的液体排出，并加入清洗液5升，冲洗罐体后排净。首先将60升生物反应器中培养的培养液沉降，抽掉上清，此时通过罐底阀将剩余的约10升悬液无菌连接转移到罐体内，该转移过程使用大流量蠕动本，待罐体重量不再增加后，停止蠕动泵，系统将启动密封盖底部的排料口蠕动泵，快速排空罐体内的培养基，而微载体拦截在罐体内。之后系统再次启动清洗液蠕动泵，补加8升清洗液。开启搅拌转速60rpm，温度设定为37摄氏度，清洗持续5分钟，停止搅拌和控温，并快速排空清洗液。上述步骤重复两次。
第五阶段：酶反应，待清洗阶段结束后，系统通过蠕动泵快速将6升酶液通过单独的酶液进口导入到罐体内，搅拌转速20rpm，设定pH为7.2，温度为37摄氏度。活细胞传感器显示细胞密度处于低位，约15分钟后，数值逐渐升高，当活细胞传感器数值经换算达到0.6×106cells/mL后，系统启动酶液排出通道的蠕动泵，关闭搅拌、pH控制和温控，酶液将被快速排净。
第六阶段：清洗第二阶段，系统开启清洗液通道的蠕动泵，加入8升清洗液，20rpm，37摄氏度，5分钟后排出，该阶段活细胞传感器检测细胞密度如超过2.0×106cells/mL，则清洗立即终止，停止搅拌并立即排空清洗液。
第七阶段：酶反应终止，待清洗第二阶段完成之后，系统开启培养基进入通道的蠕动泵加入10升培养基，搅拌转速为100rpm，温度设定为37摄氏度，搅拌持续约10分钟，待活细胞传感器检测细胞密度达到11×106cells/mL以上稳定，或细胞活性开始下降停止。
第八阶段：细胞转移阶段，系统开启细胞转移通道的蠕动泵，培养基携带着细胞通过截流组件进入到300升生物反应器中，补充培养基后，接种细胞密度约为0.6×106cells/mL，12小时后细胞已经贴附到新的微载体上。
实施例2
该实施例介绍使用所述智能酶反应器工作站实现生产猪流行性腹泻病毒的Vero细胞从300升生物反应器中与Cytodex-1微载体脱离，含有病毒粒子的细胞被收集的过程。使用的智能酶反应器工作站如图1所示，酶反应器的工作体积是18升，所配备的辅助模块包括快速进出液模块和罐压控制模块。酶反应器使用三叶平叶桨，桨叶直径与罐体直径比值为：1.0:1.1。
200升生物反应器培养Vero细胞，培养体积是150升，培养时间是接毒后96小时，载体介质使用Cytodex-1，3克/升，总细胞密度为2.0×106cells/mL。预计收集细胞总数2.0×1011cells，回收微载体430克。
第一阶段：相关准备工作，配制清洗液100升，盛放于100升储液罐。配制酶液(0.25％胰酶)20升，盛放于20升无菌补料瓶，病毒保护液20升，盛放于20升补料瓶内。其余无菌储液罐、补料瓶、硅胶管道和接头若干，无菌酸液(1N HCl)和碱液(3N NaOH)各1升。
第二阶段：酶反应器内含5升18兆欧超纯水，夹套含2升2兆欧去离子水，截留组件采用200目316不锈钢滤网2层。置于1立方米蒸汽灭菌柜中121摄氏度灭菌50分钟，取出后重新安装，液体和气体管道通过快速接头无菌连接，各电极通过数据线和中央控制柜连接，进出液硅胶管安装到蠕动泵，并连接酸碱瓶。
第三阶段：安装完毕后，通过罐压提供模块将罐体内压力增加到0.05bar。罐体内温度设定为37摄氏度，系统通过电热毯加热夹套给罐内液体升温，等待10分钟，待系统稳定。
第四阶段：清洗进液，进出液控制模块通过大流量蠕动泵快速将罐体内的液体排出，并加入清洗液5升，冲洗罐体后排净。首先将200升生物反应器中培养的培养液沉降，抽掉上清，此时罐体内剩余悬液约35升，通过罐底阀无菌连接罐体内，该转移过程使用大流量蠕动本，第一次转移18升悬液，启动密封盖底部的排料口蠕动泵，快速排空罐体内的培养基，而微载体拦截在罐体内，之后再次转移入罐体17升，重复着之前操作，将全部微载体和细胞均转移到酶反应器中。之后系统再次启动清洗液蠕动泵，补加16升清洗液。开启搅拌转速80rpm，清洗持续5分钟，停止搅拌和控温，并快速排空清洗液，该过程重复2次。
第五阶段：酶反应，待清洗阶段结束后，系统通过蠕动泵快速将15升酶液通过单独的酶液进口导入到罐体内，搅拌转速40rpm，设定pH为7.0，温度为36.5摄氏度。活细胞传感器显示细胞密度处于低位，约5分钟后，数值逐渐升高，当活细胞传感器数值经换算达到2.0×106cells/mL后，系统启动酶液排出通道的蠕动泵，关闭搅拌、pH控制和温控，酶液将被快速排净。
第六阶段：酶反应终止，系统开启培养基进入通道的蠕动泵加入18升病毒保护液，搅拌转速为160rpm，搅拌持续约15分钟，或待活细胞传感器检测细胞密度达到10×106cells/mL以上稳定结束。
第七阶段：收集，系统开启细胞转移通道的蠕动泵，病毒保护液携带着细胞通过截流组件无菌的进入到收集补料瓶中。然后打开酶反应器，收集微载体。完成分离。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于解除动物细胞贴附的酶反应器，包括密闭罐体、截留组件及搅拌组件，所述截留组件包括至少一层筛板或滤网，该至少一层筛板或滤网分布于所述密闭罐体内腔下部，且所述筛板或滤网外周部与所述密封罐体内壁环绕连接，所述搅拌组件包括搅拌轴和固定连接于所述搅拌轴上的搅拌桨，所述搅拌轴与设于所述密闭罐体顶部的轴承座配合，所述搅拌桨分布于所述密闭罐体内腔中，其特征在于：所述搅拌桨采用提升带桨，所述提升带桨的直径与所述密封罐体的内径之比为1.0:1.3～1.0：2.0，所述提升带桨的桨叶倾角为5～25°。
2.根据权利要求1所述的酶反应器，其特征在于：在所述酶反应器工作时，所述搅拌轴的转速为20～200rpm。
3.根据权利要求1所述的酶反应器，其特征在于：所述密闭罐体主要由罐体和与罐体上、下端密封连接的上、下密封盖组成，所述上、下密封盖上还连接有与所述罐体内腔连通的物料输入、输出管道。
4.根据权利要求1所述的酶反应器，其特征在于：
所述截留组件包括一层筛板或滤网，所述筛板或滤网的滤孔的孔径由上至下依次减小；
或者，所述截留组件主要由两层以上筛板或滤网叠加而成，并且任意一层筛板或滤网的滤孔孔径小于分布于其上方的筛板或滤网的滤孔孔径。
5.根据权利要求1所述的酶反应器，其特征在于：所述酶反应器还包含有温度控制组件、pH控制组件、气压控制组件、在线活细胞传感器监测组件和称重组件；
所述温度控制组件包括设于所述罐体内腔反应区的温度传感器，附着于所述罐体外壁的夹套水系统，以及包覆所述夹套水系统的电热毯；
所述pH控制组件包含设置于所述罐体内腔反应区的pH传感器以及与所述罐体内腔连通的酸碱液补加管路，所述酸碱液补加管路上分布有泵体；
所述气压控制组件包括安装于所述罐体上的呼吸器以及与所述罐体内腔连通的排气管道，所述排气管道设有压力调节阀；
所述在线活细胞传感器监测组件包括设于所述罐体内腔反应区的电极，所述电极贴近所述截留组件。
6.根据权利要求5所述的酶反应器，其特征在于：所述称重组件设于所述密闭罐体底部的、不能与任何物料相接触的位置处。
7.一种智能酶反应工作站，其特征在于包括：权利要求5所述的酶反应器以及中央控制柜，所述中央控制柜包括分别与所述搅拌组件、温度控制组件、pH控制组件、气压控制组件、在线活细胞传感器监测组件和称重组件连接的中央控制单元。
8.根据权利要求7所述的智能酶反应工作站，其特征在于还包括如下组件中的至少一种：
快速进出液模块，用于将所述酶反应器中的液体快速导出，同时将所需的液体快速导入所述酶反应器；
循环水温控制模块，用以与所述夹套水系统配合而对所述酶生物反应器内的温度进行调控；
光谱分析模块，用于对所述酶反应器内的反应情况进行监测；
罐压提供模块，用于调控所述酶反应器内的气压；
所述快速进出液模块、循环水温控制模块、光谱分析模块、罐压提供模块还均与所述中央控制单元连接。
9.根据权利要求8所述的智能酶反应工作站，其特征在于还包括：与所述中央控制单元并行设置的独立监控模块，并且所述独立监控模块还与所述搅拌组件、温度控制组件、pH控制组件、气压控制组件、在线活细胞传感器监测组件、称重组件、快速进出液模块、循环水温控制模块、光谱分析模块，罐压提供模块中的部分组件或全部组件连接。
10.根据权利要求7所述的智能酶反应工作站，其特征在于所述中央控制单元包括PLC，所述PLC与触控屏连接。
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