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CN106795518A - 人类乳头瘤病毒构建体 - Google Patents

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CN106795518A
CN106795518A CN201580044832.6A CN201580044832A CN106795518A CN 106795518 A CN106795518 A CN 106795518A CN 201580044832 A CN201580044832 A CN 201580044832A CN 106795518 A CN106795518 A CN 106795518A
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CN201580044832.6A
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R·L·加西亚
D·G·梅思雅克
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University of Colorado Boulder
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Abstract

本发明实施方式提供用于重组生成蛋白或多肽的无标签构建体的组合物和方法。在某些实施方式中，本文中揭示的重组蛋白或多肽涉及人类乳头瘤病毒(HPV)。其它实施方式涉及在组合物中使用这些构建体来诱发受试者对一种或多种HPV类型的免疫反应。还揭示了用来预防和治疗病毒感染的治疗性和预防性疫苗。提供了为本文中预期的构建体编码的核酸和表达载体。在某些实施方式中，生成的HPV衣壳蛋白没有融合标签。另外，预期了HPV L1的截短形式。

Description

人类乳头瘤病毒构建体
政府资助
本发明是在美国国家卫生研究院颁布的授权号为CA098252的政府资助下完成的。政府享有本发明中的某些权力。
优先权
本PCT申请主张2014年6月19日提交的美国临时申请No.62/014,495的优先权。为了各种目的该申请作为一个整体通过引用而并入本文中。
发明领域
本发明的实施方式为预防、治疗和/或诊断人类乳头瘤病毒感染及与此相关的宫颈癌提供新型疫苗和诊断试剂。本文中一些实施方式涉及没有标签、跟踪剂或融合元素的人类乳头瘤病毒(HPV)构建体。这些制品能够用于在受试者中诱发对目标HPV的免疫反应。在某些实施方式中，由本文中揭示的组合物和方法生成的HPV构建体是壳粒。
背景技术
乳头瘤病毒是能够感染多种不同种类的动物(包括人类在内)的致病性病毒。乳头瘤病毒感染的特征通常表现为诱发上皮和纤维上皮肿瘤，或者位于感染位点的疣。每个种类的脊椎动物都可以被一组物种特异性的乳头瘤病毒感染。例如，迄今为止，已分离了超过100种不同的人类乳头瘤病毒基因型。乳头瘤病毒是高度物种特异性的感染性试剂。尚未确认犬和兔乳头瘤病毒会在异源物种(如人类)体内诱发乳头瘤。抗一种乳头瘤病毒型感染的免疫力通常似乎不会赋予抗另一种类型的免疫力，即使这些类型的乳头瘤病毒感染同源物种时。
乳头瘤病毒诱发生殖器疣，这是一种流行性人类性传播疾病。HPV6型和11型通常多与良性的生殖器疣尖锐湿疣存在联系。生殖器疣非常普遍，并且相比于临床感染，亚临床的或不明显的HPV感染甚至更加普遍。尽管多数HPV诱发的病变是良性的，由某种乳头瘤病毒类型(如HPV-16和HPV-18)诱发的病变可能经历恶性进展，从而可能导致宫颈癌。涉及宫颈癌的HPV基因型中，HPV-16是最常见的，在大约50％的宫颈癌中都有发现。
鉴于普遍由乳头瘤病毒感染造成的重大的健康风险，特别是人类乳头瘤病毒感染，许多团队已经报告了重组乳头瘤病毒抗原的进展及作为诊断试剂和预防性疫苗的用途。一般而言，这些研究集中在制造含有单独的主要衣壳蛋白(L1)或与次要衣壳蛋白(L2)组合的预防性疫苗。
目前临床试验的预防性疫苗是基于VLPs(病毒样颗粒)。VLPs是72个五聚体或主要乳头瘤病毒衣壳蛋白L1的壳粒的集合体。然而，这些类型的疫苗的生产比较昂贵，因为需要真核表达系统或复杂的纯化，并且不如壳粒制品稳定。VLP疫苗不能提供针对其它乳头瘤病毒血清型的交叉保护，因为中和免疫反应倾向于类型特异性占主导。
发明概述
本文中揭示的实施方式提供没有亲和性或其它标签的人类乳头瘤病毒(HPV)壳粒，病毒衣壳的亚单位的有效组合物和生产方法，其中该构建体是无标签的。根据这些实施方式，可以采用本文中揭示的组合物和方法，从任何HPV物种生成该HPV壳粒。
在其它实施方式中，本文中生成的HPV蛋白或多肽可以用于生成在所描述的免疫原性组合物中使用的壳粒。根据这些实施方式，本文中揭示的实施方式中的壳粒可以用于以成本效率高的、高效的和稳定的方式生产用于使受试者免疫的免疫原性组合物，从而降低HPV感染的发病或发展的风险或者治疗患有HPV感染的受试者。
一些实施方式涉及使用产生HPV-蛋白的构建体来生成相比于标准方法大量的蛋白，同时消除了移除标签或融合分子的需要，使这一过程更加有效率。这些无标签构建体可以用来形成在本文中揭示的免疫原性组合物中使用的壳粒。本文中考虑的某些免疫原性组合物可以是药学上可以接受的组合物，这些组合物是用来生成疫苗的免疫原性组合物或用来使受试者对乳头瘤感染免疫的其它组合物。这些组合物可以用来在受试者中诱发对人类乳头瘤病毒的免疫反应以保护受试者免于HPV感染。描述了由本文中揭示的组合物产生的用来预防和/或治疗病毒性感染(如乳头瘤病毒感染、宫颈癌和与此相关的疣)的预防性疫苗。也揭示了组合物中使用的编码乳头瘤病毒构建体或多肽的核酸和表达载体。
在一些实施方式中，用本文中揭示的方法生成的构建体可以用来在细菌表达系统中表达HPV多肽以快速和成本效率高地生成和纯化大量HPV多肽。根据这些实施方式，用这些方法生产的HPV多肽可以被用于药物组合物或其它组合物中。因为这些HPV多肽没有被融合或者不包含标签或其它跟踪分子，所以不需要进一步处理。
其它实施方式进一步提供了使用本文中描述的无标签构建体生成的壳粒剂型。例如，完整结构的乳头瘤病毒蛋白L1可以用来生成无标签构建体。L1的序列是本领域熟知的并且可以在例如作为整体被并入本文中的U.S.Pat.No.6,228,368中找到。某些实施方式涉及HPV L1的截短形式。根据这些实施方式，本文中描述的HPV L1的截短形式可以包括具有位于N-端的至少3个且不超过24个氨基酸的截短和位于C-端的至多29个氨基酸的截短。根据这些实施方式，截短的L1蛋白可以形成五聚体壳粒亚单位并且可以包含HPV病毒粒子中发现的中和表位，但是缺乏形成如完整病毒衣壳或VLPs这样高阶结构的能力。
附图说明
下面的附图组成本说明书的一部分，并且用于进一步展示某些实施方式。通过单独参考一个或更多这些附图或者结合所提供的实施方式的详细描述，一些实施方式可以被更好的理解。
图1说明了本文中揭示的某些实施方式中的示例性表达质粒的构建体。
图2示出了图1所示的质粒构建体的琼脂糖凝胶电泳分离图像。
图3示出了证实在大肠杆菌中表达/诱导L1蛋白的典型SDS-PAGE的图像。诱导时间在顶部的上图中表示(以小时为单位)。L1的位置由箭头指示。
图4示出了与V5构象抗体的ELISA反应性。
图5示出了确认特征五聚体的形成的电子显微照片。
图6A-图6D示出了来自HPV假病毒中和试验的曲线图。
图7示出了证实N-端缺失3、5或9个氨基酸的HPV16L1的表达的典型SDS-PAGE图像。
图8示出了证实N-端缺失13或15个氨基酸的HPV16L1的表达的典型SDS-PAGE图像。
图9示出了证实N-端缺失20或25个氨基酸的HPV16L1的表达的典型SDS-PAGE图像。
图10示出了证实N-端缺失5或9个氨基酸的HPV18L1的表达的典型SDS-PAGE图像。
图11示出了证实N-端缺失15或16个氨基酸的HPV18L1的表达的典型SDS-PAGE图像。
具体实施方式
在下面的部分，为了详细描述各种实施方式，描述了多种示例性组合物和方法。对本领域技术人员来说显而易见的是，实践各种实施方式不需要使用所有甚至部分的本文中所概述的细节，而是可以通过常规试验修改浓度、时间和其它细节。在一些情况中，描述中没有包括熟知的方法和组分。
本文中揭示的组合物和方法涉及有效和低价地生产大量目标蛋白或多肽，其中未使用用于生产或分离的标签或融合多肽生产目标。可以预料的是，这些方法对快速生产目标蛋白并且避免与使用标签或其它跟踪剂相关的非必要步骤是有效的。
之前描述了可以从融合蛋白形式的构建体表达乳头瘤病毒衣壳蛋白L1蛋白。这些融合蛋白在细菌生物中作为重组分子被表达时可以保持L1天然构象和免疫原性的活性，如由利用例如中和抗体的试验测定的。为了跟踪目标蛋白或多肽的合成和/或纯化，当前本领域熟知的蛋白或多肽构建体需要用于表达的标签，这就需要材料(如标签或示踪剂)和人力上的额外花费以从存储和后续使用的制品的最终产品中去除该标签。这些额外的要求减缓了生产过程，并且在某些情况中可以导致目标分子的制造成本过高。本文中揭示了能克服这些问题并快速生产大量的成本效率高的有用蛋白产品的组合物和方法。由此，所需蛋白或多肽可以以大大降低的成本快速制造。
在某些实施方式中，本文中的组合物和方法涉及生产人类乳头瘤病毒(HPV)蛋白或多肽，及其在疫苗制造中的用途，所述人类乳头瘤病毒(HPV)蛋白或多肽在用于制造这些多肽或蛋白的组合物中有用。在某些实施方式中，本文中考虑的蛋白可以是衣壳蛋白。衣壳蛋白是病毒结构蛋白。衣壳蛋白典型地根据它们是衣壳结构中的多数(主要)成分还是较少数(次要)成分而被描述。该乳头瘤病毒(PV)衣壳结构的主要成分是衣壳蛋白L1蛋白。HPVL1 DNA可以来源于任何HPV毒株，例如来源于与导致癌症或其它健康状况有关的HPV。HPVL1可以来源于一种或多种以下的毒株，包括但不限于与癌症有关的HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56和HPV-58以及与疣有关的HPV-6、HPV-11、HPV-30、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55和HPV-70。
在某些实施方式中，通过本文中揭示的组合物和方法生成的蛋白或多肽包括正确折叠的L1蛋白：或者其片段，或者是其突变形式。根据这些实施方式，该蛋白或多肽假设呈递一个或多个HPV L1表位的构象结构。这些表位呈递在天然病毒衣壳或VLP上。在一些实施方式中，正确折叠的HPV L1蛋白可以代表一个或多个HPV L1构象表位。构象表位的呈递对HPV L1蛋白免疫原的效力(不管作为预防试剂还是诊断试剂)似乎是至关重要的。
在其它实施方式中，可以生成HPV L1蛋白来快速生产由L1蛋白组成的壳粒。壳粒是组成更大的病毒衣壳结构的亚单位结构。天然HPV衣壳由L1衣壳蛋白五聚体和次要衣壳蛋白L2单体组成。然而，只含有L1五聚体的壳粒足以诱导中和抗体。为了在壳粒组合物的制造中使用，在一些实施方式中，可以生产L1和L2的结合体，同时在其它实施方式中可以只生产L1。
在其它实施方式中，本文中预期的构建体可以用来生成疫苗制剂中使用的L1蛋白或多肽。根据这些实施方式，这些构建体可以包括全长或截短的L1的壳粒。本文中考虑的截短蛋白包括那些具有从该蛋白羧基末端缺失的一个或多个氨基酸残基、从该蛋白氨基末端缺失的一个或多个氨基酸残基、从该蛋白内部区域(例如，不是从任何一个末端)缺失的一个或多个氨基酸残基或上述几种缺失的组合的截短蛋白。另外，本文中描述的HPV L1的截短形式可以包括具有位于N-端的至少3且不超过24个氨基酸的截短和位于C-端的高达29个氨基酸的截短的形式。根据这些实施方式，截短的L1蛋白可以形成五聚体壳粒亚单位并且可以包含HPV病毒粒子中发现的中和表位，但是缺乏形成如完整病毒衣壳或VLPs这样的高阶结构的能力。
另外，本发明包括具有防止组装成VLP的特定半胱氨酸突变的蛋白。可以预料的是，任何来源于L1的蛋白或多肽可以包括作为第一氨基酸的蛋氨酸并且在表达时形成至少一个本文中使用的构象中和表位。
在与参考序列同一性低于100％的多肽序列的情况下，优选但不必须不相同的位置是对参考序列的保守替换。典型的保守替换包括在下列基团中的替换：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；及苯丙胺酸及酪胺酸。类似的微小变化还可以包括氨基酸的缺失或插入，或者两者都包括。关于确定哪种氨基酸残基可以被替换、插入或缺失而不摧毁生物学或免疫学活性的指导，可以通过使用本领域熟知的计算机程序来找到。
本发明的病毒蛋白可以来源于任何乳头瘤病毒。在某些实施方式中，病毒蛋白是任何人类乳头瘤病毒。许多HPV L1 DNA在文献中已有报告并是公开可用的。(参见例如Baker，Sequence Analysis of Papillomavirus(乳头瘤病毒的序列分析)，Genomes，pp.321-384；Long等人，U.S.Pat.No.5,437,931；Cole等人，J Mol.Biol.，193：599-608(1987)；Danos等人，EMBO J，1：231-236(1982)；Cole等人，J Virol.，38(3)：991-995(1986))任何这些揭示的HPV L1 DNA在本文中揭示的方法和组合物中是有用的。大量HPVL1 DNA已被克隆和表达并且在所揭示的某些实施方式描述的构建体中可用。
本文中的一些实施方式涉及使用表达系统(如原核的或其它适合的宿主系统)生产目标蛋白和多肽。根据这些实施方式，原核宿主细胞可包括细菌，如大肠杆菌或其它微生物。而且可以预期的是可以使用真核宿主细胞。任何预期的用来生产所需的目标分子的宿主细胞可以在有利于衣壳蛋白生产的条件下培养。这取决于所选的宿主系统和载体中包含的调控序列，例如是否衣壳蛋白的表达是否需要诱导。目标蛋白和多肽也可以在任何宿主细胞中被表达，该宿主细胞提供用于适当的构象的可回收产量的多肽的表达。用来表达重组蛋白的合适宿主系统众所周知，包括但不限于细菌、哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞。在一个实施方式中，表达系统可以包括大肠杆菌表达系统，因为众所周知这些系统可以实现壳粒的高产率。
本发明的用来克隆和表达多肽的适合的载体是本领域熟知的并且从商业途径可以得到的。而且，还熟知用于实现克隆和表达的适合的调控序列，例如启动子、聚腺苷酸化序列、增强子和筛选标记。在某些实施方式中，修饰后的载体可以包括由HPV DNA、用来表达HPV DNA的启动子、抗性基因(如卡那霉素抗性)和另外的填充序列组成的载体。
为了在适当的表达系统中进行表达，将编码多肽的L1核酸可操作地连接在表达载体中并引入宿主细胞从而使得能够通过细胞表达L1蛋白。提供在正确的方向和阅读框中具有适当调控区域的基因以使得能够进行表达。用于基因构建体的方法为本领域已知的。
本领域技术人员可以理解，作为遗传密码简并的结果，可以生产许多编码嵌合蛋白和复合物/壳粒的核苷酸序列，一些序列与任何已知的和天然产生的基因的核苷酸序列具有最小同源性。那么，可以预期的是可以生成核苷酸序列的每一个可能的突变，该突变可以通过基于可能的密码子来选择组合而完成。当应用于本发明的天然嵌合蛋白和复合物/壳粒时，这些组合可以根据核苷酸序列的标准三联体基因编码作出，并且认为所有这样的变化是具体的公开。
生产具有实质上不同的密码子使用的编码蛋白和壳粒的核苷酸序列是有利的。可以根据宿主对特殊密码子的使用频率来选择密码子，从而增加多肽在特殊原核或真核宿主中表达的速率。
一些实施方式涉及本文中生产的蛋白、多肽和壳粒，用于进行预防性施用以降低感染风险，用于感染的治疗和现有状况的诊断。关于用作疫苗或诊断剂而生产的蛋白、多肽和壳粒的适用性可以通过与抗体或单克隆抗体的反应来确认，该抗体或单克隆抗体反应或识别完整版本的病毒中存在的构象表位，且该适用性是基于诱发中和抗血清产生的能力。确定是否产生中和抗体的其它适合试验是本领域已知的并在本文中预期。HPV衣壳蛋白或其它病毒衣壳蛋白的特征对其在HPV或其它病毒疫苗中的使用是至关重要的。
在某些实施方式中，目标HPV蛋白和多肽用来生产抗HPV感染的免疫原性组合物。根据这些实施方式，这些免疫原性组合物可以包括采用用于产生足够壳粒的足量的本文中描述的构建体来生产的蛋白和/或壳粒，将该壳粒引入到有需要的受试者中时诱发中和抗体的形成。本文中预期的免疫原性或疫苗组合物可以进一步包括药学可接受的载体或其它抗病毒剂或其它本领域已知的试剂来补充该组合物。
本文中的实施方式可以包括在受试者中诱发对HPV抗原的免疫反应的多肽。诱发的免疫反应可以是预防性的，预防随后被特定的目标病毒类型感染，或者可以是治疗性的，降低感染或疾病的严重程度。免疫反应可以包括响应于所提供的抗原的体液(例如抗体)反应，和/或响应于疫苗中所提供的抗原的细胞介导的反应。测量免疫反应的方法为本领域的技术人员知晓的。如果存在一种免疫反应类型或两种免疫反应类型都存在，它们可以保护受试者免于病况的发展。根据某些实施方式，本文中揭示的组合物保护免于患病的能力指的是本文中生成的壳粒或嵌合蛋白在治疗、改善和/或预防由本文中预期的病毒或交叉反应剂引起的疾病的能力，例如通过在受试者中诱发免疫反应。需要注意的是受试者可以被本发明的组合物保护，甚至不需要检测对该组合物的体液或细胞介导反应。保护可以用本领域技术人员已知的方法测量。
在其它实施方式中，由于多于一种的HPV类型与HPV感染有关，免疫原性组合物或疫苗可以包括来源于多于一种的HPV类型的稳定HPV衣壳蛋白。根据这些实施方式，由于HPV16和HPV18与宫颈癌以及影响男性受试者的癌症有关，抗宫颈肿瘤发展的疫苗可以包括由本文中揭示的构建体生成的壳粒，该构建体选自HPV 16、HPV 18、或HPV 16和HPV 18这两者。已知许多肿瘤与HPV感染有关。例如，HPV 3a和HPV 10与扁平疣有关。已报导许多HPV类型与疣状表皮发育不良(EV)有关，包括HPV 3a、HPV 5、HPV 8、HPV 9、HPV 10和HPV 12。已报导HPV 1、HPV 2、HPV 4和HPV 7与皮肤疣有关，HPV 6b、HPV 11a、HPV 13和HPV 16与粘膜病变有关。其它形式的癌症还发生在受影响受试者的肛门甚至口腔和喉咙。本文中揭示的疫苗制剂可以包括来源于不同HPV类型的衣壳蛋白或片段的混合物，该HPV类型取决于所需的保护。这些制剂可以用于降低患病风险或治疗因一种或多种HPV类型而患病的受试者。
再另一方面包括一种通过向受试者施用本文中某些实施方式描述的组合物从而在受试者中诱发对本文中生成的蛋白或壳粒的免疫反应的方法。免疫原性组合物或疫苗可以以治疗有效量进行施用。也就是足以产生保护性免疫反应的量。根据这些实施方式，可以将范围在约0.1mg蛋白到约20mg蛋白，更普遍的在约0.001mg蛋白到约1mg蛋白的剂量引入到有需要的受试者中或引入到为降低与感染(如HPV感染)有关的发病症状的受试者中。单剂量或多剂量施用可以由健康专家决定。
在另一实施方式中，任何药学可接受的方式，如非肠道；局部或系统，包括例如口服滴剂或片剂；鼻内；静脉；肌肉；皮下；吸入和局部施用都可以实现含有壳粒的疫苗的施用。施用的方式受包括自然感染途径在内的因素影响。施用剂量取决于年龄、健康状况、体重、同步治疗类别，以及若有的话特定病毒如人类乳头瘤病毒的性质和类别。该疫苗或免疫原性组合物可以以用于口服施用的剂型如胶囊、液体溶液、悬浮液或酏剂使用，或可以作为无菌液态制剂如溶液或悬浮液在肠外或鼻内使用。
本文中预期了任何本领域已知的疫苗制药制剂。可以预期的是制剂可以含有受试者的疫苗中使用的其它药剂，包括但不限于本领域技术人员已知的其它活性或非活性成分或组分。
所有预期的疫苗组合物可以通过本领域技术人员已知的方法制备。在某些实施方式中，病毒组合物是冻干的并且与医药上可接受的赋形剂(如水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、润湿剂等)混合在一起。在其它实施方式中，疫苗组合物可以包括熟知的用来降低制剂退化并延长组合物保质期的稳定剂。
在其它实施方式中，佐剂可以添加到组合物中来诱发、提高、刺激或加强针对本文中描述的疫苗的施用的细胞免疫反应或体液免疫反应。
任何本领域已知的与本文中揭示的组合物兼容的佐剂均被预期。典型而言，佐剂是通常可以加强患者对特定抗原的免疫反应的物质。适合的抗原包括但不限于其它细菌细胞壁组分，铝基盐，钙基盐，二氧化硅，多聚核苷酸，毒素如霍乱毒素、类毒素如霍乱类毒素，血清蛋白，其它病毒衣蛋白，其它细菌衍生的制品，嵌段共聚物佐剂和皂苷及它们的衍生物。
本文中的一些实施方式涉及本文中预期的疫苗或免疫原性组合物的施用量或施用剂量或施用体积，并且该量或剂量取决于施用途径和其它具体事项如接种疫苗的受试者(如年龄、健康状况、体重等)。
其它实施方式涉及用于与方法一起使用的试剂盒(如本文中预期的生成构建体的方法)和本文中描述的组合物。一些实施方式涉及具有疫苗组合物的试剂盒，该疫苗组合物用以预防或治疗带有、暴露于或怀疑暴露于HPV的受试者。在某些实施方式中，试剂盒可以包括用本文中揭示的方法(如无标签方法)生产的HPV毒株或类型的一种或多于一种制剂。试剂盒可以是便携式的，例如，能够被运输并在偏远地区使用，如军事基地或偏远村庄。其它试剂盒可以在卫生机构中使用，以治疗已经暴露于或携带HPV的受试者，诱发其产生免疫反应。
试剂盒还可以包括合适的容器，例如小瓶、管、小型或微量离心管、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器。当提供附加组分或试剂时，试剂盒可以包括一个或多个附加容器，可在这些容器中放置该试剂或组分。本文中的试剂盒通常也可以包括严格限制用于商业销售的用于容纳试剂容器、组合物容器和任何其它试剂容器的装置。这样的容器可以包括注射或吹塑成型的塑料容器，在它们中保留所需的小瓶。可选地，一个或多个附加试剂如免疫原性试剂或其它抗病毒试剂、抗真菌试剂或抗细菌试剂对于所描述的组合物是必需的，例如对于用作抗一种或多种附加微生物的疫苗的组合物是必需的。
在其它实施方式中，试剂盒可以包括用于向受试者施用(如皮肤内、皮下、肌肉施用)一种或多种疫苗的设备或施用本文中揭示的疫苗组合物的吸入器或其它设备。
实施例
通过介绍下面的实施例来阐述本文中出现的某些实施方式。本领域的技术人员可以理解，在下面的实施例中揭示的技术代表了已发现的在本文中揭示的实践中运行良好的技术。然而，根据本文的揭示，本领域的技术人员可以理解，在不背离本文的精神和范围的情况下，在所揭示的某些实施方式中可以进行许多改变，并且仍然能得到类似或相似的结果。
在下面的某些示例性方法中，通过PCR从大肠杆菌密码子优化的基因中扩增截短的HPV L1蛋白的编码区并克隆到pTac启动子的下游，从而当在大肠杆菌中表达时生成无标签多肽。或者，天然HPV L1基因可以用来代替密码子优化的版本。而且，全长L1编码区或其它截短基因版本可以用于基因构建。在一些示例性方法中，使用内源限制酶切位点代替PCR来生成L1编码区是可行的。实现克隆和表达的适合的调控序列是本领域熟知的，如启动子和选择标记。从在细菌中的质粒构建体来进行蛋白表达的基本需求是启动子(如pLac、pTac或pT7)、选择标记(如卡那霉素抗性)和复制起点。因此，本文中预期的修饰后的构建体可以由能够编码多肽的HPV DNA、抗生素抗性基因和附加的填充序列组成。
在这些实施例中，大肠杆菌HMS174(DE3)细胞(Novagen)可以用于蛋白表达。另外，大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)细胞(Novagen)已经用于表达HPV L1构建体。由于HPV-p3质粒利用pTac启动子来表达，因此上面列出的大肠杆菌细胞中的DE3溶素原(编码T7RNA聚合酶)在这里不再是必需的。例如，可以使用大肠杆菌HMS174细胞(Novagen)及其它已知的细胞。而且，可以修改表达条件(诱导温度、IPTG浓度或培养密度)来改进L1表达和后续的产率。
HPV L1无标签质粒构建体。图1说明了本文中揭示的某些实施方式的示例性质粒图。正如所示，质粒片段源于其它质粒。通过PCR从具有便于克隆的NdeI和XhoI限制性位点的大肠杆菌密码子优化的基因扩增截短的HPV L1蛋白的HPV16 L1编码区。Kan是指卡那霉素抗性基因。
图2代表DNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离。编码HPV-16 L1的质粒被转化至大肠杆菌来生成大肠杆菌的无性系种群。在三种情况下(#2、#3、#4克隆体)实施。产生的质粒被从大肠杆菌提取出来并用XhoI和NdeI消化，以释放～1500bp插入片段。该分析是用于确认L1编码序列的存在。这是用于确认该表达质粒身份进行的诊断分析。
图3代表蛋白的凝胶电泳分离的图像，该蛋白通过无标签构建体、利用本领域已知的方法生产，然后分离目标蛋白。箭头指示了L1蛋白带的迁移。诱导大肠杆菌并且添加IPTG来表达L1蛋白(在大约52kDa用红色箭头指示)。蛋白诱导进行三小时，在1小时、2小时和3小时(T1，T2，T3)时取样并用SDS-PAGE分离，接下来用考马斯亮蓝着色。
图4代表与V5构象抗体的ELISA反应性。已知该V5单克隆Ab与HPVL1上的表位反应，该表位对应于中和抗体结合HPV16-L1五聚体的位点。正如所示的，纯化的L1蛋白被连续稀释。吸光度随着V5结合的升高而升高。与抗体的反应性确认了HPV-L1无标签蛋白的五聚体结构。已知该V5单克隆Ab与HPVL1上的表位反应，该表位对应于中和抗体结合HPV16-L1五聚体的位点。
图5代表HPV16-L1的四级结构：确认特征五聚体形成的电子显微照片。纯化的蛋白施加于电子显微镜网格并用乙酸双氧铀进行负染色。
图6A-图6D代表示例性假病毒中和试验。为了测试中和来自4个所示的不同PSV类型的假病毒介导的报导基因表达的能力而测试取自注射了纯化的L1蛋白(所示的Gr 1-4)的小鼠的血清。小鼠Gr1、Gr2、Gr3和Gr4被分别注射了HPV16、HPV18、HPV31和HPV33 L1壳粒。这些结果表明了如所述表达和纯化的L1蛋白可以在小鼠体内诱发特定的中和抗体。
图7-图11：WCL＝全细胞裂解物、S1＝可溶部分、P1＝不溶性颗粒，箭头指示了L1蛋白带的迁移。
图7代表典型SDS-PAGE图像，图像证实了N-端缺失3、5或9个氨基酸的HPV16L1的表达。
图8代表典型SDS-PAGE图像，图像证实了N-端缺失13或15个氨基酸的HPV16L1的表达。
图9代表典型SDS-PAGE图像，图像证实了N-端缺失20或25个氨基酸的HPV16L1的表达。
图10代表典型SDS-PAGE图像，图像证实了N-端缺失5或9个氨基酸的HPV18L1的表达。
图11代表典型SDS-PAGE图像，图像证实了N-端缺失15或16个氨基酸的HPV18L1的表达。
材料和方法
质粒构建
用本领域熟知的方法来生产图1阐述的构建体。对于编码16、18、31、33、35、45、52和58型HPV的L1蛋白的各个DNA序列，针对大肠杆菌进行密码子优化和化学合成(GenScript)。侧翼具有NdeI和XhoI限制性位点的这些L1基因的截短序列通过PCR生成，用NdeI和XhoI消化并且连接于pET-TAC质粒骨架(见图1)。在启动子控制下编码GST-六聚组氨酸-HPV16 L1/E7融合蛋白的质粒(pET-TAC E7L1，Biosidus)用NdeI和XhoI限制酶切消化，以从L1/E7融合蛋白盒中分离质粒骨架。质粒骨架包括DTac启动子、卡那霉素抗性基因和大肠杆菌复制起点(见图1)。L1/E7片段被丢弃。NdeI位点编码被用作翻译初始位点的“ATG”。或者，也可以使用NcoI位点。对于PCR，在每个反应里使用5′寡核苷酸“AGTAGTCATATGACCGTGTATCTGCCGCC”(SEQ ID NO：9)。为了生成HPV16、HPV33或HPV35 L1的截短编码区，也可以在PCR里使用寡核苷酸“ATCTCGAGTTATTACGCTTTCAGGCCCGCC”(SEQ IDNO：10)。用于PCR以生成其它血清型的截短L1编码区的第二寡核苷酸为，针对HPV18的“ATCTCGAGTTATTAACGACGCAGGCCCGCC”，(SEQ ID NO：11)，针对HPV31的”ATCTCGAGTTATTACGCACGATAGCCCGCC”，(SEQ ID NO：12)，针对HPV45的“ATCTCGAGTTATTATCGACGCAGACCTGCC”，(SEQ ID NO：13)，针对HPV52的“ATCTCGAGTTATTATGCCTGCAGACCTGCC”，(SEQ ID NO：14)，和针对HPV58的“ATCTCGAGTTATTACGCTTTCAGGCCGCTC”，(SEQ ID NO：15)。
使用从每个连接反应得到的等份来转化大肠杆菌HMS174(DE3)细胞(Novagen)。截短的DNA序列编码具有N-端9个氨基酸的编码区缺失和C-端29个氨基酸的编码区缺失(基于HPV 16 L1序列)的L1蛋白。所有质粒构建体(被称为“HPV16-p3”，“HPV18-p3”，“HPV31-p3”等)已经DNA序列分析核实。编码截短L1蛋白(不包括ATG)的DNA序列是：
HPV16-p3(SEQ ID NO：1)
“ACCGTGTATCTGCCGCCGGTGCCTGTGAGCAAAGTTGTGAGCACCGATGAATATGTGGCGCGTACCAACATTTATTATCATGCGGGCACCAGCCGTCTGCTGGCGGTGGGCCATCCGTATTTTCCGATCAAGAAACCGAACAACAACAAAATTCTGGTGCCGAAAGTGAGCGGCCTGCAGTATCGTGTGTTTCGTATTCATCTGCCTGATCCAAACAAATTTGGCTTTCCGGATACCAGCTTTTATAACCCGGATACCCAGCGTCTGGTGTGGGCATGCGTGGGTGTGGAAGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTGGGCATTAGCGGCCATCCGCTGCTGAACAAACTGGATGATACCGAAAACGCGAGCGCGTATGCGGCGAACGCGGGCGTGGATAACCGTGAATGCATTAGCATGGATTATAAACAGACCCAGCTGTGCCTGATTGGCTGCAAACCGCCGATTGGCGAACATTGGGGTAAAGGCAGCCCGTGCACCAACGTGGCAGTGAACCCGGGTGATTGCCCGCCGCTGGAACTGATTAACACCGTGATTCAGGATGGCGATATGGTGGATACCGGCTTTGGCGCGATGGATTTTACCACCCTGCAGGCGAACAAAAGCGAAGTGCCGCTGGATATTTGCACCAGCATTTGCAAATATCCGGATTATATTAAAATGGTTAGCGAACCGTATGGCGATAGCCTGTTTTTCTACCTGCGTCGTGAACAGATGTTTGTGCGTCATCTGTTTAACCGTGCGGGCGCGGTGGGCGAAAACGTGCCGGATGATCTGTATATTAAAGGCAGCGGCAGCACCGCGAACCTGGCGAGCAGCAACTATTTTCCGACCCCGAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGATGCGCAGATTTTTAACAAACCGTATTGGCTGCAGCGTGCGCAGGGCCATAACAACGGCATTTGCTGGGGCAACCAGCTGTTTGTGACCGTGGTGGATACCACCCGTAGCACCAACATGAGCCTGTGCGCGGCGATTAGCACCAGCGAAACCACCTATAAAAACACCAACTTTAAAGAATATCTGCGTCATGGCGAAGAATATGATCTGCAGTTTATTTTTCAGCTGTGCAAAATTACCCTGACCGCGGATGTGATGACCTATATTCATAGCATGAACAGCACCATTCTGGAAGATTGGAACTTTGGCCTGCAGCCGCCGCCGGGCGGCACCCTGGAAGATACCTATCGTTTTGTGACCAGCCAGGCGATTGCGTGCCAGAAACATACCCCGCCGGCGCCGAAAGAAGATCCGCTGAAAAAATATACCTTTTGGGAAGTGAACCTGAAAGAAAAATTTAGCGCGGATCTGGATCAGTTTCCGCTGGGCCGTAAATTTCTGCTGCAGGCGGGCCTGAAAGCG”
HPV18-p3(SEQ ID NO：2)
“ACCGTGTATCTGCCGCCGCCGAGCGTGGCGCGTGTGGTGAACACCGATGATTATGTGACCCGCACCAGCATCTTCTACCATGCGGGCAGCAGCCGTCTGCTGACCGTGGGCAACCCGTATTTTCGTGTGCCGGCAGGTGGAGGCAACAAACAGGATATTCCGAAAGTGAGCGCGTATCAGTATCGTGTGTTTCGTGTGCAGCTGCCTGATCCAAACAAATTTGGCCTGCCGGATACCAGCATTTATAACCCGGAAACCCAGCGTCTGGTGTGGGCATGCGCCGGTGTGGAAATTGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTGGGTCTGAGCGGTCATCCGTTTTATAACAAACTGGATGATACCGAAAGCAGCCATGCGGCGACCAGCAACGTGAGCGAAGATGTGCGTGATAACGTGAGCGTGGATTATAAACAGACCCAGCTGTGCATTCTGGGCTGCGCGCCGGCGATTGGCGAACATTGGGCAAAAGGTACCGCATGCAAAAGCCGTCCGCTGAGCCAGGGCGATTGCCCGCCGCTGGAACTGAAAAACACCGTGCTGGAAGATGGCGATATGGTGGATACCGGCTATGGCGCGATGGATTTTAGCACCCTGCAGGATACCAAATGCGAAGTGCCGCTGGATATTTGCCAGAGCATTTGCAAATATCCGGATTATCTGCAGATGAGCGCAGATCCATATGGCGATAGCATGTTTTTCTGCCTGCGTCGTGAACAGCTGTTTGCGCGTCATTTTTGGAACCGTGCGGGCACCATGGGCGATACCGTGCCGCAGAGCCTGTATATTAAAGGTACCGGTATGCGCGCAAGCCCGGGCAGCTGCGTGTATAGCCCGAGCCCGAGCGGCAGCATTGTGACCAGCGATAGCCAGCTGTTTAACAAACCGTATTGGCTGCATAAAGCGCAGGGCCATAACAACGGCGTGTGCTGGCATAACCAGCTGTTTGTGACCGTGGTGGATACCACCCGCAGCACCAACCTGACCATTTGCGCGAGCACCCAGAGCCCGGTGCCGGGCCAGTATGATGCGACCAAATTTAAACAGTATAGCCGTCATGTGGAAGAATATGATCTGCAGTTTATTTTTCAGCTGTGCACCATTACCCTGACCGCGGATGTGATGAGCTATATTCATAGCATGAACAGCAGCATTCTGGAAGATTGGAACTTTGGCGTGCCGCCGCCGCCGACCACCAGCCTGGTGGATACCTATCGTTTTGTGCAGAGCGTGGCGATTACCTGCCAGAAAGATGCGGCGCCGGCGGAAAACAAAGATCCGTACGATAAACTGAAATTCTGGAACGTGGATCTGAAAGAAAAATTCAGCCTGGATCTGGATCAGTATCCGCTGGGCCGTAAATTTCTGGTGCAGGCGGGCCTGCGTCGT”
HPV31-p3(SEQ ID NO：3)
“ACCGTGTATCTGCCGCCGGTGCCTGTGAGCAAAGTTGTGAGCACCGATGAATATGTGACCCGTACCAACATTTATTATCATGCGGGCAGCGCGCGTCTGCTGACCGTGGGCCATCCGTATTATAGCATTCCGAAAAGCGATAACCCAAAGAAAATCGTGGTGCCGAAAGTGAGCGGCCTGCAGTATCGTGTGTTTCGTGTGCGTCTGCCTGATCCAAACAAATTTGGCTTTCCGGATACCAGCTTTTATAACCCGGAAACCCAGCGTCTGGTGTGGGCATGCGTGGGTCTGGAAGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTGGGCATTAGCGGCCATCCGCTGCTGAACAAATTTGATGATACCGAAAACAGCAACCGTTATGCAGGTGGACCGGGCACCGATAACCGTGAATGCATTAGCATGGATTATAAACAGACCCAGCTGTGCCTGCTGGGCTGCAAACCGCCGATTGGCGAACATTGGGGCAAAGGCAGCCCGTGCAGCAACAACGCGATTACCCCGGGCGATTGCCCGCCGCTGGAACTGAAAAACAGCGTGATTCAGGATGGCGATATGGTGGATACCGGCTTTGGCGCGATGGATTTTACCGCGCTGCAGGATACCAAAAGCAACGTGCCGCTGGATATTTGCAACAGCATTTGCAAATATCCGGATTATCTGAAAATGGTGGCGGAACCGTATGGCGATACCCTGTTTTTCTACCTGCGTCGTGAACAGATGTTTGTGCGTCATTTCTTTAACCGTAGCGGCACCGTGGGCGAAAGCGTGCCGACCGATCTGTATATTAAAGGCAGCGGCAGCACCGCGACCCTGGCGAACAGCACCTATTTTCCGACCCCGAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGATGCGCAGATTTTTAACAAACCGTATTGGATGCAGCGTGCGCAGGGCCATAACAACGGCATTTGCTGGGGCAACCAGCTGTTTGTGACCGTGGTGGATACCACCCGTAGCACCAACATGAGCGTGTGCGCGGCGATTGCGAACAGCGATACCACCTTTAAAAGCAGCAACTTTAAAGAATATCTGCGTCATGGCGAAGAATTTGATCTGCAGTTTATTTTTCAGCTGTGCAAAATTACCCTGAGCGCGGATATTATGACCTATATTCATAGCATGAACCCGGCGATTCTGGAAGATTGGAACTTTGGCCTGACCACCCCGCCGAGCGGCAGCCTGGAAGATACCTATCGTTTTGTGACCAGCCAGGCGATTACCTGCCAGAAAACCGCGCCGCAGAAACCGAAAGAAGATCCGTTTAAAGATTATGTGTTTTGGGAAGTGAACCTGAAAGAAAAATTTAGCGCGGATCTGGATCAGTTTCCGCTGGGCCGTAAATTTCTGCTGCAGGCGGGCTATCGTGCG”
HPV33-p3(SEQ ID NO：4)
“ACCGTGTATCTGCCGCCGGTGCCTGTGAGCAAAGTTGTGAGCACCGATGAATATGTGAGCCGTACCAGCATTTATTATTATGCGGGCAGCAGCCGTCTGCTGGCGGTGGGCCATCCGTATTTTAGCATTAAAAACCCGACCAACGCGAAAAAACTGCTGGTGCCGAAAGTGAGCGGCCTGCAGTATCGTGTGTTTCGTGTGCGTCTGCCTGATCCAAACAAATTTGGCTTTCCGGATACCAGCTTTTATAACCCGGATACCCAGCGTCTGGTGTGGGCATGCGTGGGTCTGGAAATTGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTGGGTATTAGCGGTCATCCGCTGCTGAACAAATTTGATGATACCGAAACCGGCAACAAATATCCGGGCCAGCCGGGCGCGGATAACCGTGAATGCCTGAGCATGGATTATAAACAGACCCAGCTGTGCCTGCTGGGCTGCAAACCGCCGACCGGTGAACATTGGGGTAAAGGCGTGGCATGCACCAACGCAGCACCGGCAAACGATTGCCCGCCGCTGGAACTGATTAACACCATTATTGAAGATGGCGATATGGTGGATACCGGCTTTGGCTGCATGGATTTTAAAACCCTGCAGGCGAACAAAAGCGATGTGCCGATTGATATTTGCGGCAGCACCTGCAAATATCCGGATTATCTGAAAATGACCAGCGAACCGTATGGCGATAGCTTGTTCTTTTTCCTGCGTCGAGAACAGATGTTTGTGCGTCATTTCTTTAACCGTGCGGGCACCCTGGGCGAAGCGGTGCCGGATGATCTGTATATTAAAGGCAGCGGCACCACCGCGAGCATTCAGAGCAGCGCATTTTTCCCGACCCCGAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGAAAGCCAGCTGTTTAACAAACCGTATTGGCTGCAGCGTGCGCAGGGCCATAACAACGGCATTTGCTGGGGCAACCAGGTGTTTGTGACCGTGGTGGATACCACCCGTAGCACCAACATGACCCTGTGCACCCAGGTGACCAGCGATAGCACCTACAAAAACGAAAACTTCAAAGAATACATCCGTCATGTGGAAGAATACGATCTGCAGTTCGTGTTTCAGCTGTGCAAAGTGACCCTGACCGCGGAAGTGATGACCTATATTCATGCGATGAACCCGGATATTCTGGAAGATTGGCAGTTTGGCCTGACCCCGCCGCCGAGCGCGAGCCTGCAGGATACCTATCGTTTTGTGACCAGCCAGGCGATTACCTGCCAGAAAACCGTGCCGCCGAAAGAAAAAGAAGATCCGCTGGGCAAATATACCTTTTGGGAAGTGGATCTGAAAGAAAAATTTAGCGCGGATCTGGATCAGTTTCCGCTGGGCCGTAAATTTCTGCTGCAGGCGGGCCTGAAAGCG”
HPV35-p3(SEQ ID NO：5)
“ACCGTGTATCTGCCGCCTGTGAGCGTGAGCAAAGTTGTGAGCACCGATGAATATGTGACCCGTACCAACATTTATTATCATGCGGGCAGCAGCCGTCTGCTGGCGGTGGGCCATCCGTATTATGCGATCAAGAAACAGGATAGCAACAAAATTGCGGTGCCGAAAGTGAGCGGCCTGCAGTATCGTGTGTTTCGTGTGAAACTGCCTGATCCAAACAAATTTGGCTTTCCGGATACCAGCTTTTATGATCCGGCAAGCCAGCGTCTGGTGTGGGCATGCACCGGTGTGGAAGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGCGTGGGCATTAGCGGCCATCCGCTGCTGAACAAACTGGATGATACCGAAAACAGCAACAAATATGTGGGCAACAGCGGCACCGATAACCGTGAATGCATTAGCATGGATTATAAACAGACCCAGCTGTGCCTGATTGGCTGCCGTCCGCCGATTGGCGAACATTGGGGCAAAGGCACCCCGTGCAACGCGAACCAGGTGAAAGCGGGCGAATGCCCGCCGCTGGAACTGCTGAACACCGTGCTGCAGGATGGCGATATGGTGGATACCGGCTTTGGCGCGATGGATTTTACCACCCTGCAGGCGAACAAAAGCGATGTGCCGCTGGATATTTGCAGCAGCATTTGCAAATATCCGGATTATCTGAAAATGGTTAGCGAACCGTATGGCGATATGCTGTTTTTCTACCTGCGTCGTGAACAGATGTTTGTGCGTCATCTGTTTAACCGTGCGGGCACCGTGGGCGAAACCGTGCCGGCGGATCTGTATATTAAAGGCACCACCGGCACCCTGCCGAGCACCAGCTATTTTCCGACCCCGAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGATGCGCAGATTTTTAACAAACCGTATTGGCTGCAGCGTGCGCAGGGCCATAACAACGGCATTTGCTGGAGCAACCAGCTGTTTGTGACCGTGGTGGATACCACCCGTAGCACCAACATGAGCGTGTGCAGCGCGGTGTCTAGTAGCGATAGCACCTATAAAAACGATAACTTTAAAGAATATCTGCGTCATGGCGAAGAATATGATCTGCAGTTTATTTTTCAGCTGTGCAAAATTACCCTGACCGCGGATGTGATGACCTATATTCATAGCATGAACCCGAGCATTCTGGAAGATTGGAACTTTGGCCTGACCCCGCCGCCGAGCGGCACCCTGGAAGATACCTATCGTTATGTGACCAGCCAGGCGGTGACCTGCCAGAAACCGAGCGCGCCGAAACCGAAAGATGATCCGCTGAAAAACTATACCTTTTGGGAAGTGGATCTGAAAGAAAAATTTAGCGCGGATCTGGATCAGTTTCCGCTGGGCCGTAAATTTCTGCTGCAGGCGGGCCTGAAAGCG”
HPV45-p3(SEQ ID NO：6)
“ACCGTGTATCTGCCGCCGCCGAGCGTGGCGCGTGTGGTTAGCACCGATGATTATGTGAGCCGTACCAGCATCTTCTACCATGCGGGCAGCAGCCGTCTGCTGACCGTGGGCAACCCGTATTTTCGTGTGGTGCCGAACGGCGCGGGCAACAAACAGGCGGTGCCGAAAGTGAGCGCGTATCAGTATCGTGTGTTTCGTGTGGCGCTGCCTGATCCAAACAAATTTGGCCTGCCGGATAGCACCATTTATAACCCGGAAACCCAGCGTCTGGTGTGGGCATGCGTGGGTATGGAAATTGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTATTGGTCTGAGCGGTCATCCGTTTTATAACAAACTGGATGATACCGAAAGCGCGCATGCGGCGACCGCGGTGATTACCCAGGATGTGCGTGATAACGTGAGCGTGGATTATAAACAGACCCAGCTGTGCATTCTGGGCTGCGTGCCGGCGATTGGCGAACATTGGGCAAAAGGTACCCTGTGCAAACCGGCACAGCTGCAGCCGGGTGATTGCCCGCCGCTGGAACTGAAAAACACCATTATTGAAGATGGCGATATGGTGGATACCGGCTATGGCGCGATGGATTTTAGCACCCTGCAGGATACCAAATGCGAAGTGCCGCTGGATATTTGCCAGAGCATTTGCAAATATCCGGATTATCTGCAGATGAGCGCAGATCCATATGGCGATAGCATGTTTTTCTGCCTGCGTCGTGAACAGCTGTTTGCGCGTCATTTTTGGAACCGTGCGGGCGTGATGGGCGATACCGTGCCGACCGATCTGTATATTAAAGGCACCAGCGCGAACATGCGTGAAACCCCGGGCAGCTGCGTGTATAGCCCGAGCCCGAGCGGCAGCATTATTACCAGCGATAGCCAGCTGTTTAACAAACCGTATTGGCTGCATAAAGCGCAGGGCCATAACAACGGCATTTGCTGGCATAACCAGCTGTTTGTGACCGTGGTGGATACCACCCGTAGCACCAACCTGACCCTGTGCGCGAGCACCCAGAACCCGGTGCCGAGCACCTATGATCCGACCAAATTTAAACAGTATAGCCGTCATGTGGAAGAATATGATCTGCAGTTTATTTTTCAGCTGTGCACCATTACCCTGACCGCGGAAGTGATGAGCTATATTCATAGCATGAACAGCAGCATTCTGGAAAACTGGAACTTTGGCGTGCCGCCGCCGCCGACCACCAGCCTGGTGGATACCTATCGTTTTGTGCAGAGCGTGGCGGTGACCTGCCAGAAAGATACCACCCCGCCGGAAAAACAGGACCCATATGATAAACTGAAATTTTGGACCGTGGATCTGAAAGAAAAATTTAGCAGCGATCTGGATCAGTATCCGCTGGGCCGTAAATTTCTGGTGCAGGCAGGTCTGCGTCGA”
HPV52-p3(SEQ ID NO：7)“ACCGTGTATCTGCCGCCGGTGCCTGTGAGCAAAGTTGTGAGCACCGATGAATATGTGAGCCGTACCAGCATTTATTATTATGCGGGCAGCAGCCGTCTGCTGACCGTGGGCCATCCGTATTTTAGCATTAAAAACACCAGCAGCGGCAACGGCAAAAAAGTGCTGGTGCCGAAAGTGAGCGGCCTGCAGTATCGTGTGTTTCGTATTAAACTGCCTGATCCAAACAAATTTGGCTTTCCGGATACCAGCTTTTATAACCCGGAAACCCAGCGTCTGGTGTGGGCATGCACCGGTCTGGAAATTGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTGGGTATTAGCGGTCATCCGCTGCTGAACAAATTTGATGATACCGAAACCAGCAACAAATATGCGGGCAAACCGGGCATTGATAACCGTGAATGCCTGAGCATGGATTATAAACAGACCCAGCTGTGCATTCTGGGCTGCAAACCGCCGATTGGCGAACATTGGGGCAAAGGCACCCCGTGCAACAACAACAGCGGCAACCCGGGCGATTGCCCGCCGCTGCAGCTGATTAACAGCGTGATTCAGGATGGCGATATGGTGGATACCGGCTTTGGCTGCATGGATTTTAACACCCTGCAGGCGAGCAAAAGCGATGTGCCGATTGATATTTGCAGCAGCGTGTGCAAATATCCGGATTATCTGCAGATGGCGAGCGAACCGTATGGCGATAGCTTGTTCTTTTTCCTGCGTCGAGAACAGATGTTTGTGCGTCATTTCTTTAACCGTGCGGGCACCCTGGGCGATCCGGTGCCGGGCGATCTGTATATTCAGGGCAGCAACAGCGGCAACACCGCGACCGTGCAGAGCAGCGCATTTTTCCCGACCCCGAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGAAAGCCAGCTGTTTAACAAACCGTATTGGCTGCAGCGTGCGCAGGGCCATAACAACGGCATTTGCTGGGGCAACCAGCTGTTTGTGACCGTGGTGGATACCACCCGTAGCACCAACATGACCCTGTGCGCGGAAGTGAAAAAAGAAAGCACCTATAAAAACGAAAACTTTAAAGAATATCTGCGTCATGGCGAAGAATTTGATCTGCAGTTTATTTTTCAGCTGTGCAAAATTACCCTGACCGCGGATGTGATGACCTATATTCATAAAATGGATGCGACCATTCTGGAAGATTGGCAGTTTGGCCTGACCCCGCCGCCGAGCGCGAGCCTGGAAGATACCTATCGTTTTGTGACCAGCACCGCGATTACCTGCCAGAAAAACACCCCGCCGAAAGGCAAAGAAGATCCGCTGAAAGATTATATGTTTTGGGAAGTGGATCTGAAAGAAAAATTTAGCGCGGATCTGGATCAGTTTCCGCTGGGCCGTAAATTTCTGCTGCAGGCAGGTCTGCAGGCA”
HPV58-p3(SEQ ID NO：8)
“ACCGTGTATCTGCCGCCGGTGCCTGTGAGCAAAGTTGTGAGCACCGATGAATATGTGAGCCGTACCAGCATTTATTATTATGCGGGCAGCAGCCGTCTGCTGGCGGTGGGCAACCCGTATTTTAGCATTAAAAGCCCGAACAACAACAAAAAAGTGCTGGTGCCGAAAGTGAGCGGCCTGCAGTATCGTGTGTTTCGTGTGCGTCTGCCTGATCCAAACAAATTTGGCTTTCCGGATACCAGCTTTTATAACCCGGATACCCAGCGTCTGGTGTGGGCATGCGTGGGTCTGGAAATTGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTGGGTGTGAGCGGTCATCCGTATCTGAACAAATTTGATGATACCGAAACCAGCAACCGTTATCCGGCGCAGCCGGGCAGCGATAACCGTGAATGCCTGAGCATGGATTATAAACAGACCCAGCTGTGCCTGATTGGCTGCAAACCGCCGACCGGCGAACATTGGGGCAAAGGCGTGGCGTGCAACAACAACGCGGCGGCGACCGATTGCCCGCCGCTGGAACTGTTTAACAGCATTATTGAAGATGGCGATATGGTGGATACCGGCTTTGGCTGCATGGATTTTGGCACCCTGCAGGCGAACAAAAGCGATGTGCCGATTGATATTTGCAACAGCACCTGCAAATATCCGGATTATCTGAAAATGGCGAGCGAACCGTATGGCGATAGCTTGTTCTTTTTCCTGCGTCGAGAACAGATGTTTGTGCGTCATTTCTTTAACCGTGCGGGCAAACTGGGCGAAGCGGTGCCGGATGATCTGTATATTAAAGGCAGCGGCAACACCGCGGTGATTCAGAGCAGCGCATTTTTCCCGACCCCGAGCGGCAGCATTGTGACCAGCGAAAGCCAGCTGTTTAACAAACCGTATTGGCTGCAGCGTGCGCAGGGCCATAACAACGGCATTTGCTGGGGCAACCAGCTGTTTGTGACCGTGGTGGATACCACCCGTAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAAGTGACCAAAGAAGGCACCTATAAAAACGATAACTTTAAAGAATATGTGCGTCATGTGGAAGAATATGATCTGCAGTTTGTGTTTCAGCTGTGCAAAATTACCCTGACCGCGGAAATTATGACCTATATTCATACCATGGATAGCAACATTCTGGAAGATTGGCAGTTTGGCCTGACCCCGCCGCCGAGCGCGAGCCTGCAGGATACCTATCGTTTTGTGACCAGCCAGGCGATTACCTGCCAGAAAACCGCGCCGCCGAAAGAAAAAGAAGATCCGCTGAACAAATATACCTTTTGGGAAGTGAACCTGAAAGAAAAATTTAGCGCGGATCTGGATCAGTTTCCGCTGGGCCGTAAATTTCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAAGCG”
重组L1蛋白的表达和纯化
含有HPV16-L1基因的表达质粒(HPV16-p3)被转化至大肠杆菌菌株HMS174(DE3)。培养物在37℃下生物反应器中生长到O.D.为50。这时添加1mM IPTG诱导培养物并且用4小时将温度降低到22℃。细菌细胞通过离心分离而颗粒化并在-70℃环境中保存直至使用。随着在冰上进行搅拌，细胞颗粒再悬浮于均化缓冲液(200ml/5g细胞、200mM NaCl、50mM TrispH 8.0、1mM EDTA、1mM PMSF、10％甘油、5mM DTT、2种蛋白酶抑制剂片剂(Roche))中。在800-1000巴、4℃的条件下，细胞通过2次穿过Niro Panda(GEA Process Engineering，Columbia，MD)均质器从而被裂解。Panda裂解的均浆在4℃、22，000x g条件下离心30分钟。
澄清的均浆与50mM Tris、200mM氯化钠、pH 8.1、10％甘油、0.01％吐温80和5mMDTT一起装载于Q快速柱(QFF)(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。QFF流通物与添加的固体硫酸铵一起沉淀，达到30％饱和。使用Panda使HPV16-L1硫酸铵沉淀物再次裂解，离心后的可溶材料被用于进一步纯化(ASp)。对于Asp二次溶解试样，将电导率调节至～5mS/cm，pH8.5并装载到Q高效(QHP)柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)上。将含有L1蛋白的QHP片段集中在起来并定量以确定蛋白浓度。用线性盐梯度洗脱该蛋白。SDS-PAGE分析显示，HPVL1(52kDa带)洗脱为主要对称峰。将含有纯化的HPV L1的由QHP集中的片段集中在一起并在液氮中快速冷冻直至进一步使用。
在一个示例性方法中，为了测试L1在大肠杆菌中的表达和溶解度，在DNA表达质粒的位于HPV16 L1或HPV18L1基因的5’-末端进行了一系列缺失。这些基因还在C-端29个氨基酸上缺失。含有多种表达构建体的大肠杆菌的培养物在37℃、250ml液体培养基中生长到OD595为4.0。通过将IPTG添加到每个培养物来诱导蛋白表达。然后，该培养物在25℃的条件下孵育，直到达到OD595为8.0。然后，将培养物离心并在-20℃的条件下储藏细菌颗粒。
然后，将该颗粒再悬浮于100ml缓冲液L中并在800-1000巴、2次穿过Panda均质器的条件下裂解。对每个匀浆(全细胞裂解，WCL)样品进行SDS-PAGE分析。然后，通过离心澄清裂解物。移除上清液并取每个上清液的样品(S1)进行SDS-PAGE分析。颗粒再悬浮在等体积的水中并取每个颗粒的样品(P1)进行SDS-PAGE分析。每个上清液的样品也与硫酸铵一起沉淀。添加硫酸铵到每个上清液(0.164g/ml)的样品中，并在4℃条件下震动2小时。然后，将硫酸铵溶液在13,000g离心30分钟。丢弃该上清液并将沉淀物再悬浮于等体积的缓冲液L中。取每个再悬浮的沉淀物的样品(ASp)进行SDS-PAGE分析。
如图所示(例如参见图7和图8)缺失或截短5、9或15个氨基酸的蛋白被表达且该蛋白部分可溶。如图所示从氨基端缺失20个氨基酸的蛋白被表达，但与从上述氨基端缺失5、9或15个氨基酸的那些蛋白相比，具有更低的溶解度(例如见图9)。与上述突变的蛋白相比，缺失3或25个氨基酸的蛋白表达的不好(例如见图7和图9)。当与上述修饰的蛋白相比时，缺失13个氨基酸生成了弱表达的蛋白(图8)。这可以部分归因于在氨基端的蛋氨酸后存在2个脯氨酸。也有可能的是，氨基端缺失3、13或25个氨基酸的蛋白以高水平被表达，但是是不稳定的且被降解。
表1：HPV16L1变体
N3 N5 N9 N13 N15 N20 N25
表达 + +++ +++ +/- +++ +++ +/-
可溶性 + + + + + +/- +
缺失也可以在DNA表达质粒的HPV18L1基因的5’-末端上进行。缺失5、9、15或16个氨基酸的蛋白非常好地进行表达得并且该蛋白可以部分溶解(图10和图11)。与一些其它构建体相比，缺失约5个氨基酸的蛋白显现出具有更高的溶解度。与一些其它截短构建体相比，缺失4到9个氨基酸也显现出具有增加的表达和溶解度。
表2：HPV18L1变体
N5 N9 N15 N16
表达 +++ +++ +++ ++
溶解性 + +/- +/- +/-
****************************
根据本公开内容，可以作出和执行本文中公开和主张的所有组合物和方法而不需要过度的实验。虽然以最佳实施方案的形式记载了组合物和方法，但对本领域的技术人员而言显而易见的是，在不背离本文的构思、精神和范围的情况下，可以对本文中描述的组合物和方法以及方法中的步骤或步骤顺序作出改变。更具体地说，既化学相关也生理学相关的某些试剂在可以达到相同或相似的结果的情况下可以被替换为本文中描述的试剂。所有这些对本领域的技术人员来说显而易见的类似替换和改变应当认为落入由所附权利要求定义的精神、范围和构思之中。

Claims (20)

1.一种质粒构建体，包含：
具有转录起始密码子的目标人类乳头瘤病毒(HPV)DNA分子，所述目标HPV DNA分子编码一种或多种蛋白或多肽；
与所述目标HPV DNA分子相连、能够诱导所述目标HPV DNA转录的启动子；
位于所述启动子和所述目标HPV DNA分子之间的限制位点；
能够赋予对抗筛选剂的抗性基因，并且
所述质粒构建体没有标签或跟踪分子，是无标签的。
2.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中所述目标HPV DNA分子编码单一蛋白或嵌合蛋白。
3.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中所述目标HPV DNA编码在抗所述目标HPV的免疫原性组合物中使用的蛋白或多肽。
4.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中所编码的蛋白或多肽选自HPV6、HPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18、HPV30、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV54、HPV55、HPV56和HPV70中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中所述目标HPV DNA分子编码截短的HPV L1蛋白，所述截短的HPV L1蛋白具有下述中的至少一种：在N-端缺失3个且不超过24个氨基酸和在C-端缺失多达29个氨基酸。
6.根据权利要求5所述的质粒构建体.其中产生的HPV L1蛋白或多肽形成壳粒。
7.根据权利要求5所述的质粒构建体，其中编码所述多肽的所述目标DNA分子包括SEQID NO.2。
8.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中所述启动子是Tac启动子。
9.一种药物组合物，包括：一种或多种权利要求1所述的构建体和药学上可接受的载体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述构建体包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV-35、HPV45、HPV52和HPV58中的至少一种构建体。
11.一种在受试者中诱发对至少一种HPV类型的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，以及在所述受试者中诱发对至少一种HPV类型的免疫反应，所述组合物包括一种或多种根据权利要求1所述的构建体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述构建体包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33，HPV-35、HPV45、HPV52和HPV58中的至少一种构建体。
13.一种在受试者中诱发对至少一种HPV类型的免疫反应的预防性治疗方法，包括：向所述受试者施用预防有效量的组合物以及减少或防止所述受试者感染所述至少一种HPV类型，所述组合物包括一种或多种根据权利要求1所述的构建体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述构建体包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV-35、HPV45、HPV52和HPV58中的至少一种构建体。
15.一种在受试者中诱发对至少一种HPV类型感染的免疫反应的治疗性治疗方法，包括：向所述受试者施用治疗有效量的组合物以及在所述受试者中治疗所述感染，所述组合物包括一种或多种根据权利要求1所述的构建体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述构建体包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV-35、HPV45、HPV52和HPV58中的至少一种构建体。
17.一种质粒构建体，包含：
具有转录起始密码子的目标人类乳头瘤病毒(HPV)DNA分子，所述目标HPV DNA分子编码一种或多种蛋白或多肽，所述目标HPV DNA分子包括下列中的一种或多种：
1)编码多肽的SEQ ID NO：1的核酸序列、
2)编码多肽的SEQ ID NO：2的核酸序列、
3)编码多肽的SEQ ID NO：3的核酸序列、
4)编码多肽的SEQ ID NO：4的核酸序列、
5)编码多肽的SEQ ID NO：5的核酸序列、
6)编码多肽的SEQ ID NO：6的核酸序列、
7)编码多肽的SEQ ID NO：7的核酸序列、或
8)编码多肽的SEQ ID NO：8的核酸序列；
与所述目标HPV DNA分子相连、能够诱导所述目标HPV DNA转录的启动子；
位于所述启动子和所述目标HPV DNA分子之间的限制位点；
能够赋予对抗筛选剂的抗性基因；并且
所述质粒构建体没有标签或跟踪分子，是无标签的。
18.一种转化细胞，包括权利要求1或17所述的载体。
19.一种表达的包涵体的分离制品，包括权利要求1或17所述的构建体的编码多肽。
20.一种载体，包括权利要求1或17所述的核酸构建体。
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