CN106771237B

CN106771237B - 一种检测猪萨佩罗病毒抗体的elisa试剂盒

Info

Publication number: CN106771237B
Application number: CN201611145457.7A
Authority: CN
Inventors: 葛猛; 余兴龙; 彭旺; 李润成; 赵墩; 郑金; 丁彦彬
Original assignee: Hunan Kang Holiding Biotechnology Co Ltd; Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Kang Holiding Biotechnology Co Ltd; Hunan Agricultural University
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2018-01-23
Anticipated expiration: 2036-12-13
Also published as: CN106771237A

Abstract

一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，其是以纯化的猪萨佩罗病毒VP1重组蛋白作为抗原，首次建立检测PSV抗体的ELISA方法并组装成试剂盒，可对目前我国流行的PSV病毒进行有效的血清学诊断和调查，判断猪群中PSV抗体水平和自然感染的状况，为PSV病毒的防制提供一种快速、简便的检测方法。

Description

一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，能用于猪萨佩罗病毒抗体检测及猪萨佩罗病毒感染的判断。

背景技术

猪萨佩罗病毒(Porcine Sapelovirus,PSV)可引起猪脑脊髓灰质炎、肺炎、繁殖障碍、心包炎、心肌炎、皮肤损伤、腹泻等多系统综合征。PSV能在猪肠道上皮细胞繁殖，并随粪便排出体外，感染猪只康复后依然会继续排毒，使该病毒在环境中大量存在，成为重要的病毒传染源。PSV还能和猪流行性腹泻、猪瘟、猪蓝耳病、猪细小等常见猪疫病病原相互作用，加重该些病的危害。

PSV的实验室诊断方法主要包括病理组织学检测、病毒的分离与鉴定、RT-PCR等，但这些方法主要用于检测病原，且对试验条件和技术要求较高，不适合高通量检测。

目前还没有关于猪萨佩罗病毒抗体检测方法的报道，本发明利用分子生物学基因克隆表达技术，获得PSV病毒VP1重组蛋白，以其作为抗原首次建立检测PSV抗体的ELISA方法并组装成试剂盒，可对目前我国流行的PSV病毒进行有效的血清学诊断和调查，判断猪群中PSV抗体水平和自然感染的状况，为PSV病毒的防制提供一种快速、简便的检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种快速、准确、简便、适于大批量检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，以便于猪萨佩罗病毒感染的诊断及流行病学调查。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，其特点是，所述试剂盒内含有猪萨佩罗病毒VP1抗原蛋白。

所述猪萨佩罗病毒VP1抗原蛋白为纯化的利用重组原核表达载体质粒pET-28a-VP1表达的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

所述试剂盒内设有猪萨佩罗病毒抗体检测板条，该检测板条为包被猪萨佩罗病毒VP1抗原蛋白的96孔酶标板。

所述试剂盒内还设有阴性对照血清、阳性对照血清、血清稀释液、酶标二抗、洗涤液、底物显色液及终止液。其中，所述阴性对照血清为没有感染猪萨佩罗病毒的健康猪血清，阳性血清为接种猪萨佩罗病毒后采集的猪血清；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG。

本发明的试剂盒，能用于PSV抗体检测，弥补了PSV抗体检测方法的空白；具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、操作简单的特点，易于基层推广。

附图说明

图1是PSV VP1基因的PCR产物电泳图。

其中，1为阴性对照；2为VP1基因扩增产物；M为DNA分子量标准。

图2是PSV重组VP1蛋白的表达电泳图。

其中，M为蛋白分子量标准；1为阴性对照菌全菌；2为重组表达菌上清；3为重组表达菌沉淀。

图3是纯化的PSV重组VP1蛋白的电泳图。

其中，1为纯化的重组VP1蛋白；M为蛋白分子量标准。

具体实施方式

实施例1PSV重组VP1蛋白的制备

1)猪萨佩罗病毒RNA提取及反转录：用病毒RNA提取试剂盒(北京天恩泽公司),按说明书操作从组织病料中提取猪萨佩罗病毒RNA。以所提取的RNA为模板,用反转录试剂盒(美国Theremo公司),按说明书操作获得cDNA。

2)猪萨佩罗病毒VP1基因的克隆：根据GenBank中猪萨佩罗病毒的基因序列(登录号：KX354740)设计两条引物，上游引物(Fp)为：CGCGGATCCGGGGATATAAAAGAAGTGGTGCA(SEQID No:2)；下游引物(Rp)为：CCCAAGCTTCTATTGAGTTGCAGGGTAATATCT(SEQ ID No:3)，两引物序列中下划线分别表示BamH I和Hind III酶切位点，以上述反转录成的cDNA为模板，通过PCR方法扩增VP1基因。PCR体系含10μL 5×Buffer、4μL dNTP、1μL Fp、1μL Rp、1μL高保真DNA聚合酶、2μL模板及23μL灭菌超纯水；PCR条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环。反应完后取6μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增片段经电泳检测，结果见图1，扩增片段大小与预期目的片段大小相符。

3)重组表达质粒的构建：将扩增的PCR产物和和pET28-a(+)载体分别经BamH I和Hind III酶切,37℃恒温箱中反应2h，回收各自的酶切片段，用T4DNA连接酶连接，连接体系为：1μL载体酶切产物、7μL目的基因酶切产物、1μL 10×T4连接Buffer及1μL T4连接酶，将配好的体系置于16℃水浴中12h。将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态中，提取质粒，酶切鉴定阳性克隆，将鉴定为阳性克隆的质粒送华大公司基因公司进行序列测定。测序结果表明VP1基因片段已于BamH I和Hind III酶切位点之间与pET-28a(+)载体正确相连，表达蛋白的阅读框正确，说明重组原核表达载体质粒pET28a-VP1构建成功。

4)重组蛋白的表达：将pET28a-VP1重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，转化过程为：取5ul连接产物，加入到100ul上述大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min，42℃热冲击90s，再冰浴2min，于超净工作台中加入700ul LB培养基，于37℃180rmp/min摇床中摇菌45min后3000rmp离心3min，留100ul上清重悬菌泥，取菌液涂布于含卡那霉素30μg/mL的LB琼脂平板上，置于37℃恒温箱中培养24h后，挑取单克隆菌落，参照Novagen公司pET Syetem Manual表达重组VP1融合蛋白，并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白，显示重组VP1蛋白主要以包涵体形式表达(图2),其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

5)重组蛋白的纯化：使用His标签蛋白纯化试剂盒(Novagen公司产品)，参照使用说明书，对重组VP1蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE电泳检测，见图3，结果表明重组VP1蛋白获得纯化。

实施例2检测PSV抗体的ELISA试剂盒的制备

1)抗体检测板条：每个试剂盒包含2块ELISA板，每块板含可拆卸的已包被检测抗原的ELISA板条，规格为8孔×12条。

ELISA板条(抗原板)的制备：用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释实施例1中得到的纯化的VP1融合蛋白，用方阵法确定最佳包被浓度为2.5μg/ml，取可拆96孔酶标板，每孔加入100μl，4℃包被24小时后用含0.05％吐温-20(体积比)的PBS(pH7.4)洗涤液(PBST)洗涤2次，用5％脱脂奶粉(质量体积比)37℃封闭1小时，用PBST充分洗涤，室温风干。

2)阴、阳性对照血清(各1.5mL)：阴性血清为没有感染PSV的健康猪血清，阳性血清为接种PSV病毒后采集的猪血清。

3)血清稀释液(60mL)：1％BSA，由10g牛血清白蛋白BSA加800mL PBST溶解，加灭菌水至1000mL配制成。

4)酶标二抗(30mL)：将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG用含1％BSA的PBST稀释10000倍，做为直接使用浓度的酶标二抗。

5)洗涤液(75mL)：10倍浓缩的含0.5％吐温-20的1M PBS(pH7.4)。

6)底物显色液(15mL)：以双蒸水定容至1000ml，配置显色液A。称取9.33g柠檬酸、14.6g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)、6.4ml 0.75％过氧化氢尿素，混匀，调pH值到5.0-5.4，加双蒸水定容至1000ml，配制显色液B。显色液A、B等体积混合，即为底物显色液。

7)终止液(15mL)：2M H₂SO₄。

实施例3PSV抗体检测试剂盒的使用

a.将待检血清样品用血清稀释液100倍稀释后，取100μl加至抗体检测板，阳性和阴性对照血清不用稀释，直接加100μl，且重复两孔，置37℃孵育30分钟后弃去孔内液体，每孔用250-300μl洗涤液洗涤4次。

b.每孔加入100μl的酶标二抗,将酶标板置于37℃孵育30分钟后弃去孔内液体，每孔用250-300μl洗涤液洗涤4次。

c.加入底物显色液，每孔50μl，37℃避光显色15分钟。

d.加入终止液，每孔50μl，终止显色。

e.用酶标仪在450nm波长下读取OD值，并计算样品的S/P值，S/P值＝(样品OD₄₅₀值―阴性对照平均OD₄₅₀值)/(阳性对照平均OD₄₅₀值―阴性对照平均OD₄₅₀值)。根据判定标准确定待检样品的阴、阳性结果。

PSV抗体检测试剂盒的判定标准：用PSV抗体检测试剂盒检测40份阴性血清，计算其平均S/P值(X)为0.183，标准差(SD)为0.039,根据统计学原理，确定阴、阳性结果的临界值＝X+3SD＝0.3，即当S/P≥0.3，样品为抗PSV抗体阳性，当S/P＜0.3，样品为抗PSV抗体阴性。

实施例4应用本试剂盒对临床样品进行抗体检测

应用本发明的PSV抗体检测试剂盒对来自湖南省8个猪场的368份临床猪血清样品进行检测，结果见表1。该检测结果显示临床上A～H 8个猪场的抗体阳性率在29.17％～62.50％之间，平均抗体阳性率52.17％，表明本试剂盒能用于大批量PSV抗体的快速检测。

表1 A-H猪场血清样品检测结果

猪场	检测样品数(份)	阳性数(份)	阳性率
				A	24	11	45.83％
B	24	7	29.17％
				C	48	27	56.25％
D	40	15	37.50％
				E	48	22	45.83％
F	40	25	62.50％
				G	48	26	54.17％
H	96	59	61.46％
				共计	368	192	52.17％

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南农业大学；湖南康保特生物科技有限公司

<120> 一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 318

<212> PRT

<213> 合成

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Gly Asp Ile Lys Glu Val Val Gln Ala His Ile Asn Asn Thr

35 40 45

Leu Gln Ser Ala Leu Thr Thr Arg Pro Gln Gln Glu Gln Val Ser Asn

50 55 60

Gly Ile Met Ile Asn Gln Gly Asp Ala Pro Ala Leu Gly Ala Ala Glu

65 70 75 80

Thr Gly Glu Ser Asp Thr Asn Ser Gly Gly Ser Thr Met Glu Leu Gln

85 90 95

Ala Thr Asn Cys Val Phe Ser Leu Arg Glu Thr Asp Leu Glu Tyr Leu

100 105 110

Met Ser Arg Tyr Ser Leu Met Tyr Glu Asp Ile Leu Asp Tyr Thr Ser

115 120 125

Ser Thr Gly Arg Arg His Leu Val Tyr Asn Val Asp Phe Arg Thr Ile

130 135 140

Gly Lys Ser Gly Ser Asp Ile Thr Lys Phe Arg Ala Phe Thr Tyr Trp

145 150 155 160

Arg Phe Asp Leu Asp Val Val Val Met Met Leu Glu Asp Lys Ala Ser

165 170 175

Lys Val Ser Asn Val Met Phe Gln Val Leu Phe Thr Pro His Gly Gly

180 185 190

Ala Val Pro Gly Thr His Asn Thr Ala Ile Trp Asn Ala Pro Asn Ser

195 200 205

Thr Ser Ile Tyr Thr Arg Val Gly Asn Ala Pro Ala Ser Phe Arg Ile

210 215 220

Pro Phe Met Ser Val Cys Asn Tyr Tyr Thr Ser Phe Tyr Asp Gly Asp

225 230 235 240

Gly Asn Phe Asp Arg Asn Gly Ala Ser Tyr Gly Ile Asn Pro Gly Asn

245 250 255

Phe Ile Gly Thr Ile Ser Ile Arg Met Ala Asn Asp Phe Gln Thr Asp

260 265 270

Ala Thr Thr Gly Ala Phe Arg Ala Lys Ile Phe Leu Arg Pro Val Asn

275 280 285

Ile Glu Ala Tyr Met Pro Arg Pro Leu Ile Ser Tyr Lys Ala Asn Gly

290 295 300

Thr Ala Arg Glu Asp Ser Ser Arg Tyr Tyr Pro Ala Thr Gln

305 310 315

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cgcggatccg gggatataaa agaagtggtg ca 32

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cccaagcttc tattgagttg cagggtaata tct 33

Claims

1.一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内含有猪萨佩罗病毒VP1抗原蛋白，该猪萨佩罗病毒VP1抗原蛋白为纯化的利用重组原核表达载体质粒pET-28a-VP1表达的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；具体制备过程如下：

1)提取猪萨佩罗病毒RNA，反转录成cDNA；

2)根据猪萨佩罗病毒的基因序列设计SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的引物，以反转录成的cDNA为模板进行扩增；

3)将扩增产物与pET28-a(+)载体进行连接，构建重组原核表达载体质粒pET28a-VP1，表达后进行纯化。

2.如权利要求1所述的一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内设有猪萨佩罗病毒抗体检测板条，该检测板条为包被猪萨佩罗病毒VP1抗原蛋白的96孔酶标板。

3.如权利要求1所述的一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内还设有阴性对照血清、阳性对照血清、血清稀释液、酶标二抗、洗涤液、底物显色液及终止液。

4.如权利要求3所述的一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述阴性对照血清为没有感染猪萨佩罗病毒的健康猪血清，阳性血清为接种猪萨佩罗病毒后采集的猪血清。

5.如权利要求3所述的一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG。