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CN106718920A - 提高罗汉果甜苷v含量的方法 - Google Patents

提高罗汉果甜苷v含量的方法 Download PDF

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CN106718920A CN201611247647.XA CN201611247647A CN106718920A CN 106718920 A CN106718920 A CN 106718920A CN 201611247647 A CN201611247647 A CN 201611247647A CN 106718920 A CN106718920 A CN 106718920A
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Abstract

本发明公开了一种提高罗汉果甜苷V含量的方法，包括以下步骤：步骤一、将茉莉酸甲酯溶于体积分数为20％的乙醇水溶液中，配制成浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液；将茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液；步骤二、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，其中，在制作固体培养基时将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中，使茉莉酸甲酯的最终浓度为50～400μmol/L；步骤三、将组培苗移栽至田间，在罗汉果授粉后50～60d，每天早、中、晚各喷洒一次茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d。本发明能有效地提高罗汉果甜苷V的产量，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等特征，能满足罗汉果甜苷V的大规模生产。

Description

提高罗汉果甜苷V含量的方法
技术领域
本发明涉及一种罗汉果的种植方法。更具体地说，本发明涉及一种提高罗汉果甜苷V含量的方法。
背景技术
罗汉果为中国特有的珍贵药用和甜料植物。其果实性凉、味甘，具有清热润肺，利咽开音，滑肠通便和抗癌等功效，活性成分甜苷V为世界上最强的非糖甜味物质之一，是蔗糖甜度的300～400倍，广泛应用于食品、保健品和药品中，是糖尿病人、肥胖者和高血压患者的理想糖替代品。然而，甜苷V只存在占果重不足15％的果肉内，且含量仅为1％左右，严重制约了罗汉果产业的健康发展。
茉莉酸甲酯作为植物信号诱导子能够安全有效地激发植物次生代谢物的产生和积累。因此，优选合适的茉莉酸甲酯施用时间和浓度，可以最大限度地提高药用植物活性成分的含量。现有技术中未见有茉莉酸甲酯提高罗汉果甜苷V含量的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高罗汉果甜苷V含量的方法，其能有效地提高罗汉果甜苷V的产量，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等特征，能满足罗汉果甜苷V的大规模生产。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种提高罗汉果甜苷V含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、将茉莉酸甲酯溶于体积分数为20％的乙醇水溶液中，配制成浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，备用；将茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，备用；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，在相对湿度为60～66％、光照强度为1400lux、光照时间为8h/d、培养温度为23±2℃的条件下培养30d，其中，固体培养基的制作方法为：在制作固体培养基时将步骤一中制得的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为50～400μmol/L后，将固体培养基灭菌，冷却至24～26℃；固体培养基还包含：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭；
步骤三、将步骤二中培养后的组培苗移栽至田间，在罗汉果授粉后50～60d，每天早、中、晚各喷洒一次步骤一中制得的茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d。
优选的是，所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤一中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，还包括用孔径为0.22μm的微孔滤膜对茉莉酸甲酯的乙醇母液进行灭菌的步骤。
优选的是，所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤二中将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中后，向固体培养基中加入质量比为2:1的保水剂和牡蛎壳粉，每升固体培养基中，保水剂和牡蛎壳粉的总质量为30～50g，当固体培养基凝固时，保水剂和牡蛎壳粉全部均匀浸入固体培养基中。
优选的是，所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤二中将罗汉果组培苗接种在固体培养基中后，每天向固体培养基的表面均匀喷洒温度为40～45℃的杀菌剂，所述杀菌剂由以下重量份数的组分混合后制成：溶菌酶1～2份、溶壁酶2～3份、木醋液200～300倍液4～5份和水5～10份。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过在罗汉果组培苗和种植罗汉果时施加茉莉酸甲酯，以诱导罗汉果甜苷V代谢关键酶(如葡萄糖基转移酶和细胞色素P450酶等)基因的高表达，从而在短期内快速提高了罗汉果甜苷V的含量。
由于固体培养基干化较快，培养物周边容易堆积代谢产物，导致培养基的营养成分分布不均匀，也不利于培养物吸收有效成分。本发明在固体培养基中加入了保水剂和牡蛎壳粉，保水剂是一种吸水能力特别强的功能高分子材料，在固体培养基没有凝固时，能吸收培养基中的有效成分，活化后的牡蛎壳粉具有微孔结构，也能吸附很多培养基中的有效成分，这样能有效地保持营养成分，使营养成分的分布比较均匀，被保水剂和牡蛎壳粉吸收和吸附的营养成分能缓慢释放出来，有利于培养物长效地吸收有效成分，从而能促进罗汉果组培苗的生长，有利于提高罗汉果甜苷V的含量。
本发明将罗汉果组培苗接种在固体培养基中后，向固体培养基的表面均匀喷洒或涂抹杀菌剂，其中，溶菌酶能水解细菌的细胞壁，使细菌溶解，与病毒结合后能使病毒失活；溶壁酶能水解真菌的细胞壁，使真菌失活；木醋液具有杀菌、促进植物生长等作用，杀菌剂能起到屏障作用，能防止培养环境中的细菌、病毒和真菌影响罗汉果组培苗的生长，也能降低对培养环境的要求。
本发明操作简便，成本低，对环境友好，适于规模化生产，具有较强的实用性和推广价值。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本发明提供一种提高罗汉果甜苷V含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、将茉莉酸甲酯溶于体积分数为20％的乙醇水溶液中，配制成浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，备用；将茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成浓度为50μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，备用；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，在相对湿度为60％、光照强度为1400lux、光照时间为8h/d、培养温度为21℃的条件下培养30d，其中，固体培养基的制作方法为：在制作固体培养基时将步骤一中制得的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为50μmol/L后，将固体培养基灭菌，冷却至24℃，即降至室温使固体培养基凝固；固体培养基还包含：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭；即在制作固体培养基时，在琼脂凝固前将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中，混合均匀，琼脂凝固后茉莉酸甲酯能均匀地存在于固体培养基中。
步骤三、将步骤二中培养后的组培苗移栽至田间，在罗汉果授粉后50d，每天早、中、晚各喷洒一次步骤一中制得的茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d，待果柄变为黄褐色、果皮转成淡黄色时采样，采用HPLC法进行罗汉果甜苷V含量检测。
所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤一中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，还包括用孔径为0.22μm的微孔滤膜对茉莉酸甲酯的乙醇母液进行灭菌的步骤。能防止茉莉酸甲酯的乙醇母液携带细菌，影响组培苗的生长。
所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤二中将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中后，琼脂凝固前，向固体培养基中加入质量比为2:1的保水剂和牡蛎壳粉，每升固体培养基中，保水剂和牡蛎壳粉的总质量为30g，当固体培养基凝固时，保水剂和牡蛎壳粉全部均匀浸入固体培养基中。由于固体培养基干化较快，培养物周边容易堆积代谢产物，导致培养基的营养成分分布不均匀，也不利于培养物吸收有效成分。在固体培养基中加入了保水剂和牡蛎壳粉，保水剂是一种吸水能力特别强的功能高分子材料，在固体培养基没有凝固时，能吸收培养基中的有效成分，活化后的牡蛎壳粉具有微孔结构，也能吸附很多培养基中的有效成分，这样能有效地保持营养成分，使营养成分的分布比较均匀，被保水剂和牡蛎壳粉吸收和吸附的营养成分能缓慢释放出来，有利于培养物长效地吸收有效成分，从而能促进罗汉果组培苗的生长，有利于提高罗汉果甜苷V的含量。
所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤二中将罗汉果组培苗接种在固体培养基中后，每天向固体培养基的表面均匀喷洒温度为40℃的杀菌剂，所述杀菌剂由以下重量份数的组分混合后制成：溶菌酶1份、溶壁酶2份、木醋液200倍液4份和水5份。
将罗汉果组培苗接种在固体培养基中后，向固体培养基的表面均匀喷洒或涂抹杀菌剂，其中，溶菌酶能水解细菌的细胞壁，使细菌溶解，与病毒结合后能使病毒失活；溶壁酶能水解真菌的细胞壁，使真菌失活；木醋液具有杀菌、促进植物生长等作用，杀菌剂能起到屏障作用，能防止培养环境中的细菌、病毒和真菌影响罗汉果组培苗的生长，也能降低对培养环境的要求。
实施例2
本发明提供一种提高罗汉果甜苷V含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、将茉莉酸甲酯溶于体积分数为20％的乙醇水溶液中，配制成浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，备用；将茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成浓度为400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，备用；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，在相对湿度为66％、光照强度为1400lux、光照时间为8h/d、培养温度为25℃的条件下培养30d，其中，固体培养基的制作方法为：在制作固体培养基时将步骤一中制得的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为400μmol/L后，将固体培养基灭菌，冷却至26℃，即降至室温使固体培养基凝固；固体培养基还包含：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭；即在制作固体培养基时，在琼脂凝固前将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中，混合均匀，琼脂凝固后茉莉酸甲酯能均匀地存在于固体培养基中。
步骤三、将步骤二中培养后的组培苗移栽至田间，在罗汉果授粉后60d，每天早、中、晚各喷洒一次步骤一中制得的茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d，待果柄变为黄褐色、果皮转成淡黄色时采样，采用HPLC法进行罗汉果甜苷V含量检测。
所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤一中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，还包括用孔径为0.22μm的微孔滤膜对茉莉酸甲酯的乙醇母液进行灭菌的步骤。能防止茉莉酸甲酯的乙醇母液携带细菌，影响组培苗的生长。
所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤二中将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中后，向固体培养基中加入质量比为2:1的保水剂和牡蛎壳粉，每升固体培养基中，保水剂和牡蛎壳粉的总质量为50g，当固体培养基凝固时，保水剂和牡蛎壳粉全部均匀浸入固体培养基中。由于固体培养基干化较快，培养物周边容易堆积代谢产物，导致培养基的营养成分分布不均匀，也不利于培养物吸收有效成分。在固体培养基中加入了保水剂和牡蛎壳粉，保水剂是一种吸水能力特别强的功能高分子材料，在固体培养基没有凝固时，能吸收培养基中的有效成分，活化后的牡蛎壳粉具有微孔结构，也能吸附很多培养基中的有效成分，这样能有效地保持营养成分，使营养成分的分布比较均匀，被保水剂和牡蛎壳粉吸收和吸附的营养成分能缓慢释放出来，有利于培养物长效地吸收有效成分，从而能促进罗汉果组培苗的生长，有利于提高罗汉果甜苷V的含量。
所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤二中将罗汉果组培苗接种在固体培养基中后，每天向固体培养基的表面均匀喷洒温度为45℃的杀菌剂，所述杀菌剂由以下重量份数的组分混合后制成：溶菌酶2份、溶壁酶3份、木醋液300倍液5份和水10份。
将罗汉果组培苗接种在固体培养基中后，向固体培养基的表面均匀喷洒或涂抹杀菌剂，其中，溶菌酶能水解细菌的细胞壁，使细菌溶解，与病毒结合后能使病毒失活；溶壁酶能水解真菌的细胞壁，使真菌失活；木醋液具有杀菌、促进植物生长等作用，杀菌剂能起到屏障作用，能防止培养环境中的细菌、病毒和真菌影响罗汉果组培苗的生长，也能降低对培养环境的要求。
实施例3
本发明提供一种提高罗汉果甜苷V含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、将茉莉酸甲酯溶于体积分数为20％的乙醇水溶液中，配制成浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，备用；将茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成浓度为220μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，备用；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，在相对湿度为63％、光照强度为1400lux、光照时间为8h/d、培养温度为23℃的条件下培养30d，其中，固体培养基的制作方法为：在制作固体培养基时将步骤一中制得的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为220μmol/L后，将固体培养基灭菌，冷却至25℃，即降至室温使固体培养基凝固；固体培养基还包含：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭；即在制作固体培养基时，在琼脂凝固前将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中，混合均匀，琼脂凝固后茉莉酸甲酯能均匀地存在于固体培养基中。
步骤三、将步骤二中培养后的组培苗移栽至田间，在罗汉果授粉后55d，每天早、中、晚各喷洒一次步骤一中制得的茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d，待果柄变为黄褐色、果皮转成淡黄色时采样，采用HPLC法进行罗汉果甜苷V含量检测。
所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤一中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，还包括用孔径为0.22μm的微孔滤膜对茉莉酸甲酯的乙醇母液进行灭菌的步骤。能防止茉莉酸甲酯的乙醇母液携带细菌，影响组培苗的生长。
所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤二中将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中后，向固体培养基中加入质量比为2:1的保水剂和牡蛎壳粉，每升固体培养基中，保水剂和牡蛎壳粉的总质量为40g，当固体培养基凝固时，保水剂和牡蛎壳粉全部均匀浸入固体培养基中。由于固体培养基干化较快，培养物周边容易堆积代谢产物，导致培养基的营养成分分布不均匀，也不利于培养物吸收有效成分。在固体培养基中加入了保水剂和牡蛎壳粉，保水剂是一种吸水能力特别强的功能高分子材料，在固体培养基没有凝固时，能吸收培养基中的有效成分，活化后的牡蛎壳粉具有微孔结构，也能吸附很多培养基中的有效成分，这样能有效地保持营养成分，使营养成分的分布比较均匀，被保水剂和牡蛎壳粉吸收和吸附的营养成分能缓慢释放出来，有利于培养物长效地吸收有效成分，从而能促进罗汉果组培苗的生长，有利于提高罗汉果甜苷V的含量。
所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法中，所述步骤二中将罗汉果组培苗接种在固体培养基中后，每天向固体培养基的表面均匀喷洒温度为42℃的杀菌剂，所述杀菌剂由以下重量份数的组分混合后制成：溶菌酶2份、溶壁酶2份、木醋液250倍液4份和水7份。
将罗汉果组培苗接种在固体培养基中后，向固体培养基的表面均匀喷洒或涂抹杀菌剂，其中，溶菌酶能水解细菌的细胞壁，使细菌溶解，与病毒结合后能使病毒失活；溶壁酶能水解真菌的细胞壁，使真菌失活；木醋液具有杀菌、促进植物生长等作用，杀菌剂能起到屏障作用，能防止培养环境中的细菌、病毒和真菌影响罗汉果组培苗的生长，也能降低对培养环境的要求。
对比例1
本发明一种罗汉果的种植方法，包括以下步骤：
步骤一、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，在相对湿度为60％、光照强度为1400lux、光照时间为8h/d、培养温度为21℃的条件下培养30d；固体培养基包含：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭，不含有茉莉酸甲酯；
步骤三、将步骤二中培养后的组培苗移栽至田间，移栽后按常规方法种植，其他培养条件与实施例1～3相同，但不喷施茉莉酸甲酯溶液。
实施例1～3和对比例1中，待果柄变为黄褐色、果皮转成淡黄色时采样，采用HPLC法进行罗汉果甜苷V含量检测，结果见表1，表1中甜苷V含量指甜苷V含量占果实含量的百分数。
表1实施例1～3和对比例1罗汉果甜苷V含量的检测结果
实施例 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
甜苷V含量 1.04％ 1.35％ 1.16％ 0.77％
由表1可知，采用实施例1～3的方法与对比例1的方法相比，实施例1～3均能显著提高罗汉果甜苷V的含量，说明在罗汉果组培苗和种植罗汉果时施加茉莉酸甲酯能有效地提高罗汉果甜苷V的含量，该方法见效快、成本低、操作简单、方便实施，能为罗汉果甜苷V的大规模生产提供新思路。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (4)

1.一种提高罗汉果甜苷V含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将茉莉酸甲酯溶于体积分数为20％的乙醇水溶液中，配制成浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯的乙醇母液，备用；将茉莉酸甲酯溶于乙醇中，配制成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，备用；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在固体培养基中，在相对湿度为60～66％、光照强度为1400lux、光照时间为8h/d、培养温度为23±2℃的条件下培养30d，其中，在制作固体培养基时将步骤一中制得的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为50～400μmol/L后，将固体培养基灭菌，冷却至24～26℃；固体培养基还包含：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和1.0g/L活性炭；
步骤三、将步骤二中培养后的组培苗移栽至田间，在罗汉果授粉后50～60d，每天早、中、晚各喷洒一次步骤一中制得的茉莉酸甲酯溶液，至叶面滴水为止，连续喷洒10d。
2.如权利要求1所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法，其特征在于，所述步骤一中在制得茉莉酸甲酯的乙醇母液后，还包括用孔径为0.22μm的微孔滤膜对茉莉酸甲酯的乙醇母液进行灭菌的步骤。
3.如权利要求1所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法，其特征在于，所述步骤二中将茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到固体培养基中后，向固体培养基中加入质量比为2:1的保水剂和牡蛎壳粉，每升固体培养基中，保水剂和牡蛎壳粉的总质量为30～50g，当固体培养基凝固时，保水剂和牡蛎壳粉全部均匀浸入固体培养基中。
4.如权利要求1所述的提高罗汉果甜苷V含量的方法，其特征在于，所述步骤二中将罗汉果组培苗接种在固体培养基中后，每天向固体培养基的表面均匀喷洒温度为40～45℃的杀菌剂，所述杀菌剂由以下重量份数的组分混合后制成：溶菌酶1～2份、溶壁酶2～3份、木醋液200～300倍液4～5份和水5～10份。
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