CN106701682A - 由脐血分离造血干细胞并扩增cd34阳性细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由脐血分离造血干细胞并扩增CD34阳性细胞的方法。具体包括如下步骤：脐血造血干细胞的分离；纯化；Ficoll分离液分离；流式细胞仪进行CD34阳性细胞计数、稀释、接种、培养；换液培养；分板培养；评估细胞扩增效果。还涉及包括该方法制得的CD34阳性细胞的细胞制品，以及它们的用途。本发明方法具有如说明书所述优异技术效果。

Description

由脐血分离造血干细胞并扩增CD34阳性细胞的方法

技术领域

本发明属于采用细胞生物学技术治疗临床疾病的领域。具体而言，本发明涉及一种以脐血造血干细胞为起始材料来制备CD34⁺细胞的方法。

背景技术

干细胞介导再生和遗传信息至后来细胞世代的传递。它们可自我更新和产生分化的后代。近年来，在我们对干细胞与它们的组织微生态环境之间的相互作用背后的分子机制的理解中已取得了进步。这已导致对在干细胞中起作用的分子调控机制有了更好的理解。

虽然基因疗法仍然是试验性方法，但该技术有希望对人健康产生重大影响。在过去数年中，基因疗法的范围和定义已发生了变化并且得到扩展。除了矫治遗传的遗传性障碍例如囊性纤维化、血友病和其他疾病外，基因治疗法还已发展至抵抗获得性疾病例如癌症、AIDS、慢性血管局部缺血、骨关节炎、糖尿病、帕金森病和阿尔茨海默病。

目前，种系基因疗法由于其复杂技术性质和伦理考虑而未被涉及。然而，只对单个个体有益的(不能代代相传的)体细胞基因疗法是干细胞研究的主要焦点。从至鼠类造血干细胞内的成功基因转移的最初描述至先天患有x-连锁联合免疫缺陷(SCID)和腺苷脱氨酶缺陷(ADA)-缺陷的患者中的第一例明确成功的临床试验花费了15年以上的时间。干细胞疗法的许多方面正在研究中。例如，逆转录病毒载体在许多情况下已被用于将基因转移入干细胞中以修复突变的或不完善的基因。此类情况包括严重联合免疫缺陷、范可尼贫血和其他血红蛋白病。

干细胞工程的中心议题是用于将治疗性基因导入祖细胞的特殊方法学。因为逆转录病毒倾向于插入活性基因(据认为凝缩的染色质在这些区域是打开的)，有人提出，它们的使用还可能增加癌症的风险，因为逆转录病毒载体插入参与细胞增殖的基因附近在理论上可产生前体癌干细胞。然而，该类型事件的总体风险难以确定。现在有许多在慢性肉芽肿病(CGD)患者中取得完全成功的实例，其中NADPH氧化酶的活性在输注经遗传改变的血液干细胞后得到恢复。

富有成效的基因疗法的最低要求是在矫治生物学背景中治疗性基因产物的持续产生，同时有害副作用最小。为了达到该目的，基因疗法中干细胞的应用将需要发展调节治疗性基因表达的新策略以及用于将外源基因有效递送至干细胞的方法。通过在确定的组织环境中分化干细胞来选择性控制治疗性基因的表达是干细胞工程的重要目标。该方法可以例如帮助控制干细胞分化成特定的谱系、维持它们的未分化状态以待日后移植、增殖，以及调控治疗性基因例如自杀基因、细胞因子或生长因子在确定的组织环境中的表达。

间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、免疫调节和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。

MSC在骨髓中蕴含丰富，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髓MSC的临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。

近期的研究显示，脐带组织和脐血中也含有间充质干细胞并且能成功分离，其中脐血来源的干细胞通常称为造血干细胞。这种来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因足以令脐带间充质干细胞成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。

外周动脉病变(peripheral arterial disease，PAD)，尤其是下肢动脉病变往往由动脉硬化闭塞症和血栓闭塞性脉管炎导致的肢体动脉狭窄闭塞和糖尿病所引起。PAD主要体现为严重的肢体缺血，尤其是下肢缺血。

目前，临床上对于远端流出道通畅者，常以介入支架和外科手术治疗。PAD患者常表现为以下两种情况：

管腔狭窄早期：主要表现为以行走时出现疼痛为特征的间歇性跛行；

随着狭窄的加重，可出现静息痛，甚至丧失行走能力和伴随组织坏死与溃疡发生为特点的危重肢体缺血(critical limb ischaemia，CLI)。

CLI的预后极差，5年生存率仅为50％或更低。CLI的治疗不仅仅是缓解症状、改善受累肢体的功能和防止截肢，还要防止全身动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的进展，以预防心脑血管事件发生。目前主要的治疗手段为：控制高血糖、高血压、血脂异常；去除危险因素，如吸烟；强制性运动锻炼；抗血小板药物和扩血管药物；以及循环重建手术，如外科手术(如旁路移植术或动脉内膜切除术)、血管内介入技术(如支架置入或球囊扩张术)。

经过上述治疗后，约40％的CLI患者仍不能改善预后。对于这部分患者来说，截肢目前被认为是挽救生命所做出的最后治疗选择。但截肢后的总死亡率大约为25％-50％；截肢术围手术期的死亡率为5％-20％；二次截肢率大约为30％。到目前为止，CLI的治疗选择仍然有限，大约40％的患者不符合进行循环重建的指征，或进行循环重建不能得到有益的反应。对于这些“没有其它治疗选择”的患者，药物治疗对延缓病情进展和预防截肢的作用十分有限。

因此，探索缺血肢体血液循环重建的新治疗策略对于减少患者截肢和提高患者生活质量具有非常重要的临床意义。这促使研究者将研究重点转向寻求具有分化潜能的干细胞移植治疗PAD，研究者们希望在病变局部能够使干细胞被诱导为血管上皮细胞来修复损坏的血管。

基础研究发现，能分化为血管内皮细胞的干细胞类型有血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPCs)、骨髓源性单核细胞(bone marrow mononuclearcell，BMMNC)和外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMNC)。但这些干细胞受组织来源的限制，提取和扩增的数量有限。致使这种疗法目前尚处于临床前研究阶段。

已有实验证明，人CD34⁺细胞(CD34是成熟血管的标志物)可以缓解CLI的症状、改善受累肢体的功能和防止截肢。但由于其在脐带沃尔通氏胶(Wharton's jelly)中含量仅为5％-10％左右，因此，如何高效地生产该细胞就成为其能否获得广泛应用的重要前提。

截至目前，对脐带血中CD34⁺细胞的分离通常采取Ficoll分离法、羟乙基淀粉分离法和明胶自然沉降分离法，并在随后用免疫磁珠吸附法(MACS)进一步纯化所获得的CD34⁺细胞以获得符合要求的CD34⁺细胞。上述方法直接从人脐带血中分离并纯化原代CD34⁺细胞，鉴于人脐带血的供应量有限，利用上述方法所能获取的CD34⁺细胞的数量也极其有限。

因此，本领域仍然需要一种能够以相对简便的方法从人脐血生产大量CD34⁺细胞的方法。

发明内容

本发明的在于提供一种从脐带血来制备CD34⁺细胞的方法。已经出人意料地发现，使用本发明方法制备CD34⁺细胞，已经呈现出例如本发明上下文所述优异的技术效果。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种由脐血造血干细胞制备CD34⁺细胞的方法，该方法包括如下步骤：

(1).脐血造血干细胞的分离：新鲜的脐带血采集完成后，分离脐血造血干细胞以获得有核细胞(本发明在此亦可称为脐血造血干细胞)；

(2).用一次性无菌注射器将步骤(1)所得脐血造血干细胞5ml转移至50ml无菌离心管中；点滴法加入等体积的无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，再次加入40ml无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，接着用15-20倍体积的PBS缓冲液(pH7.2)重悬细胞沉淀；

(3).Ficoll分离液分离：在50ml无菌离心管中加入25ml的Ficoll分离液，然后沿着管壁缓慢加入15ml的细胞悬液，离心处理，离心分离后，吸取白膜层单个核细胞，再用PBS缓冲液(pH7.2)清洗2遍，弃上清，用PBS缓冲液(pH7.2)定容至悬液体积为5ml；

(4).采用流式细胞仪(例如FC500型流式细胞仪)进行CD34⁺细胞(即表面标志物CD34阳性细胞)计数，再根据CD34⁺检测结果用造血干细胞培养体系稀释至CD34⁺细胞浓度为5*10^4个细胞/ml；将稀释的细胞接种至低贴附涂层6孔板，接种密度为1*10^5个CD34⁺细胞/孔(2ml)，然后放入5％CO2、37℃培养箱中进行培养；

(5).分别在培养的第2、4、6天进行换液，单孔换液照如下操作：将细胞转移至15ml无菌离心管中，以300g离心5分钟，弃上清，用2ml造血干细胞培养体系重悬，将2ml悬液接种到6孔板，在5％CO2、37℃条件下进行培养；

(6).培养第4天，进行CD34⁺细胞计数，当达到4～6*10^5个细胞时按照1*10^5个CD34⁺细胞/孔时进行分板处理；

(7).培养第6天，根据CD34⁺细胞计数情况，决定是否分板处理；若达到4～6*10^5个CD34⁺细胞则进行分板处理并再培养3天后收获CD34⁺细胞，若少于4*10^5个CD34⁺细胞则不进行分板处理并在次日(即培养第7天)收获CD34⁺细胞；

(8).采用采用流式细胞仪进行CD34⁺计数，并评估CD34⁺细胞扩增效果。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(1)中，对所述脐血进行脐血造血干细胞的分离是采用AXP全自动分离系统进行分离的。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(1)中，对所述脐血进行脐血造血干细胞的分离是采用AXP全自动分离系统进行分离的，所述AXP全自动分离系统AXP Auto Xpress^TM Platform。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(1)中，经AXP处理后的脐血样本，其红细胞去除率通常在80％以上。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述的PBS缓冲液是磷酸钠盐缓冲液，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH7.2。该磷酸钠盐缓冲液可以使用磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠配制，并任选地结合磷酸或氢氧化钠来调节pH值，这种配制方法是本领域技术人员公知的。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(3)中，所述离心处理的条件是：1800rpm离心20min，升速1，降速0。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述流式细胞仪是FC500型流式细胞仪或者其它本领域常用型号的流式细胞仪。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述造血干细胞培养体系的组成为：人低密度脂蛋白(Human LDL)25～75μg/ml、促红细胞生成素(EPO)5～15ng/ml、白介素3(IL-3)500～1500IU/ml、干细胞因子(SCF)25～75ng/ml、无动物成份培养基(StemSpan-ACF)适量加至配液体积全量。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述造血干细胞培养体系的组成为：人低密度脂蛋白(Human LDL)50μg/ml、促红细胞生成素(EPO)10ng/ml、白介素3(IL-3)1000IU/ml、干细胞因子(SCF)50ng/ml、无动物成份培养基(StemSpan-ACF)适量加至配液体积全量。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述扩增效果的评价参数例如可以是扩增倍数、集落形成单位(其例如可以是CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM等)。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(1)中，分离获得的脐血造血干细胞还任选的经历冻存和复苏处理，然后再将其用于步骤(2)的处理。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(1)中，分离获得的脐血造血干细胞经历如下冻存处理：向经分离获得的脐血造血干细胞中加入细胞冻存液，经降温后存储于-196℃深低温气态液氮存储罐中。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(1)中，经冻存处理的脐血造血干细胞经历如下复苏处理：将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中解冻。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(1)中，经冻存处理的脐血造血干细胞经历如下复苏处理：将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中，在1分钟内完成解冻过程。以此种速度解冻能够最大程度地保持细胞活率。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中经分离获得的脐血造血干细胞中加入的细胞冻存液包含：约65份的DMEM-F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述PBS缓冲液是磷酸的钠盐和/或钾盐配制的，其pH为5.0-8.0，优选pH为5.5-7.6，优选pH为6.0-7.5。在一个实施方案中，所述PBS缓冲液中磷酸根的浓度为0.01-0.5M，优选0.02-0.1M。在本发明下文试验中，所用PBS缓冲液是磷酸钠盐，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH为7.2。需要说明的是，本发明人发现，在上述范围内的PBS缓冲液浓度和pH值对于本发明方法的效果影响不大。

根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述造血干细胞培养体系中还包含0.02～0.05μmol/L己二酸二钠和0.05～0.15％(w/v)麦芽糖。已经出人意料地发现，向造血干细胞培养体系中添加此两种试剂可以大大提高CD34⁺细胞的扩增倍数，并且CD34⁺细胞性能不受影响。

进一步的，本发明第二方面提供了一种细胞制品，其包括根据本发明第一方面任一实施方案所述方法制备的CD34⁺细胞和可药用载体。

或者，进一步的，本发明第二方面提供了一种细胞制品，其包括CD34⁺细胞和可药用载体，该细胞制品是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1).脐血造血干细胞的分离：新鲜的脐带血采集完成后，分离脐血造血干细胞以获得有核细胞(本发明在此亦可称为脐血造血干细胞)；

(2).用一次性无菌注射器将步骤(1)所得脐血造血干细胞5ml转移至50ml无菌离心管中；点滴法加入等体积的无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，再次加入40ml无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，接着用15-20倍体积的PBS缓冲液(pH7.2)重悬细胞沉淀；

(3).Ficoll分离液分离：在50ml无菌离心管中加入25ml的Ficoll分离液，然后沿着管壁缓慢加入15ml的细胞悬液，离心处理，离心分离后，吸取白膜层单个核细胞，再用PBS缓冲液(pH7.2)清洗2遍，弃上清，用PBS缓冲液(pH7.2)定容至悬液体积为5ml；

(4).采用流式细胞仪(例如FC500型流式细胞仪)进行CD34⁺细胞(即表面标志物CD34阳性细胞)计数，再根据CD34⁺检测结果用造血干细胞培养体系稀释至CD34⁺细胞浓度为5*10^4个细胞/ml；将稀释的细胞接种至低贴附涂层6孔板，接种密度为1*10^5个CD34⁺细胞/孔(2ml)，然后放入5％CO2、37℃培养箱中进行培养；

(5).分别在培养的第2、4、6天进行换液，单孔换液照如下操作：将细胞转移至15ml无菌离心管中，以300g离心5分钟，弃上清，用2ml造血干细胞培养体系重悬，将2ml悬液接种到6孔板，在5％CO2、37℃条件下进行培养；

(6).培养第4天，进行CD34⁺细胞计数，当达到4～6*10^5个细胞时按照1*10^5个CD34⁺细胞/孔时进行分板处理；

(7).培养第6天，根据CD34⁺细胞计数情况，决定是否分板处理；若达到4～6*10^5个CD34⁺细胞则进行分板处理并再培养3天后收获CD34⁺细胞，若少于4*10^5个CD34⁺细胞则不进行分板处理并在次日(即培养第7天)收获CD34⁺细胞；

(8).采用采用流式细胞仪进行CD34⁺计数，并评估CD34⁺细胞扩增效果；

(9).将所收获的CD34⁺细胞与可药用载体混合，制成细胞制品。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中步骤(1)中，对所述脐血进行脐血造血干细胞的分离是采用AXP全自动分离系统进行分离的。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中步骤(1)中，对所述脐血进行脐血造血干细胞的分离是采用AXP全自动分离系统进行分离的，所述AXP全自动分离系统AXP Auto Xpress^TM Platform。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中步骤(1)中，经AXP处理后的脐血样本，其红细胞去除率通常在80％以上。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中所述的PBS缓冲液是磷酸钠盐缓冲液，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH7.2。该磷酸钠盐缓冲液可以使用磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠配制，并任选地结合磷酸或氢氧化钠来调节pH值，这种配制方法是本领域技术人员公知的。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中步骤(3)中，所述离心处理的条件是：1800rpm离心20min，升速1，降速0。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中所述流式细胞仪是FC500型流式细胞仪或者其它本领域常用型号的流式细胞仪。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中所述造血干细胞培养体系的组成为：人低密度脂蛋白(Human LDL)25～75μg/ml、促红细胞生成素(EPO)5～15ng/ml、白介素3(IL-3)500～1500IU/ml、干细胞因子(SCF)25～75ng/ml、无动物成份培养基(StemSpan-ACF)适量加至配液体积全量。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中所述造血干细胞培养体系的组成为：人低密度脂蛋白(Human LDL)50μg/ml、促红细胞生成素(EPO)10ng/ml、白介素3(IL-3)1000IU/ml、干细胞因子(SCF)50ng/ml、无动物成份培养基(StemSpan-ACF)适量加至配液体积全量。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中所述扩增效果的评价参数例如可以是扩增倍数、集落形成单位(其例如可以是CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM等)。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中步骤(1)中，分离获得的脐血造血干细胞还任选的经历冻存和复苏处理，然后再将其用于步骤(2)的处理。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中步骤(1)中，分离获得的脐血造血干细胞经历如下冻存处理：向经分离获得的脐血造血干细胞中加入细胞冻存液，经降温后存储于-196℃深低温气态液氮存储罐中。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中步骤(1)中，经冻存处理的脐血造血干细胞经历如下复苏处理：将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中解冻。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中步骤(1)中，经冻存处理的脐血造血干细胞经历如下复苏处理：将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中，在1分钟内完成解冻过程。以此种速度解冻能够最大程度地保持细胞活率。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中经分离获得的脐血造血干细胞中加入的细胞冻存液包含：约65份的DMEM-F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中所述PBS缓冲液是磷酸的钠盐和/或钾盐配制的，其pH为5.0-8.0，优选pH为5.5-7.6，优选pH为6.0-7.5。在一个实施方案中，所述PBS缓冲液中磷酸根的浓度为0.01-0.5M，优选0.02-0.1M。在本发明下文试验中，所用PBS缓冲液是磷酸钠盐，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH为7.2。需要说明的是，本发明人发现，在上述范围内的PBS缓冲液浓度和pH值对于本发明方法的效果影响不大。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中所述造血干细胞培养体系中还包含0.02～0.05μmol/L己二酸二钠和0.05～0.15％(w/v)麦芽糖。已经出人意料地发现，向造血干细胞培养体系中添加此两种试剂可以大大提高CD34⁺细胞的扩增倍数，并且CD34⁺细胞性能不受影响。

根据本发明第二方面任一实施方案所述的细胞制品，其中所述的可药用载体选自注射用水、氯化钠、甘露醇、乳糖、蔗糖等。

本发明的细胞制品可以根据本领域常规方法胃肠外施用。目前临床应用中细胞制品的施用途径包括但不限于局部注射移植、循环注射移植。根据本发明的细胞制品可以制备成任何适合施用的形式。例如制备成适合通过微量泵将含有CD34⁺细胞的细胞制品泵入目标区域的形式；或者制备成适合通过穿刺针将将含有CD34⁺细胞的细胞制品注入目标区域的形式。根据移植方式、治疗目的的不同，本领域技术人员可以确定自行选择适当的可药用载体。在一些实施方式中，可药用载体是生理盐水。

进一步的，本发明第三方面提供了本发明第一方面任一实施方案所述方法制备的CD34⁺细胞在制备用于缓解或改善血管病变的药物中的用途。

或者，进一步的，本发明第三方面提供了CD34⁺细胞在制备用于缓解或改善血管病变的药物中的用途，所述药物是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1).脐血造血干细胞的分离：新鲜的脐带血采集完成后，分离脐血造血干细胞以获得有核细胞(本发明在此亦可称为脐血造血干细胞)；

(2).用一次性无菌注射器将步骤(1)所得脐血造血干细胞5ml转移至50ml无菌离心管中；点滴法加入等体积的无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，再次加入40ml无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，接着用15-20倍体积的PBS缓冲液(pH7.2)重悬细胞沉淀；

(3).Ficoll分离液分离：在50ml无菌离心管中加入25ml的Ficoll分离液，然后沿着管壁缓慢加入15ml的细胞悬液，离心处理，离心分离后，吸取白膜层单个核细胞，再用PBS缓冲液(pH7.2)清洗2遍，弃上清，用PBS缓冲液(pH7.2)定容至悬液体积为5ml；

(4).采用流式细胞仪(例如FC500型流式细胞仪)进行CD34⁺细胞(即表面标志物CD34阳性细胞)计数，再根据CD34⁺检测结果用造血干细胞培养体系稀释至CD34⁺细胞浓度为5*10^4个细胞/ml；将稀释的细胞接种至低贴附涂层6孔板，接种密度为1*10^5个CD34⁺细胞/孔(2ml)，然后放入5％CO2、37℃培养箱中进行培养；

(5).分别在培养的第2、4、6天进行换液，单孔换液照如下操作：将细胞转移至15ml无菌离心管中，以300g离心5分钟，弃上清，用2ml造血干细胞培养体系重悬，将2ml悬液接种到6孔板，在5％CO2、37℃条件下进行培养；

(6).培养第4天，进行CD34⁺细胞计数，当达到4～6*10^5个细胞时按照1*10^5个CD34⁺细胞/孔时进行分板处理；

(7).培养第6天，根据CD34⁺细胞计数情况，决定是否分板处理；若达到4～6*10^5个CD34⁺细胞则进行分板处理并再培养3天后收获CD34⁺细胞，若少于4*10^5个CD34⁺细胞则不进行分板处理并在次日(即培养第7天)收获CD34⁺细胞；

(8).采用采用流式细胞仪进行CD34⁺计数，并评估CD34⁺细胞扩增效果；

(9).将所收获的CD34⁺细胞与可药用载体混合，制成药物。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中步骤(1)中，对所述脐血进行脐血造血干细胞的分离是采用AXP全自动分离系统进行分离的。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中步骤(1)中，对所述脐血进行脐血造血干细胞的分离是采用AXP全自动分离系统进行分离的，所述AXP全自动分离系统AXP Auto Xpress^TM Platform。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中步骤(1)中，经AXP处理后的脐血样本，其红细胞去除率通常在80％以上。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中所述的PBS缓冲液是磷酸钠盐缓冲液，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH7.2。该磷酸钠盐缓冲液可以使用磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠配制，并任选地结合磷酸或氢氧化钠来调节pH值，这种配制方法是本领域技术人员公知的。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中步骤(3)中，所述离心处理的条件是：1800rpm离心20min，升速1，降速0。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中所述流式细胞仪是FC500型流式细胞仪或者其它本领域常用型号的流式细胞仪。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中所述造血干细胞培养体系的组成为：人低密度脂蛋白(Human LDL)25～75μg/ml、促红细胞生成素(EPO)5～15ng/ml、白介素3(IL-3)500～1500IU/ml、干细胞因子(SCF)25～75ng/ml、无动物成份培养基(StemSpan-ACF)适量加至配液体积全量。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中所述造血干细胞培养体系的组成为：人低密度脂蛋白(Human LDL)50μg/ml、促红细胞生成素(EPO)10ng/ml、白介素3(IL-3)1000IU/ml、干细胞因子(SCF)50ng/ml、无动物成份培养基(StemSpan-ACF)适量加至配液体积全量。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中所述扩增效果的评价参数例如可以是扩增倍数、集落形成单位(其例如可以是CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM等)。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中步骤(1)中，分离获得的脐血造血干细胞还任选的经历冻存和复苏处理，然后再将其用于步骤(2)的处理。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中步骤(1)中，分离获得的脐血造血干细胞经历如下冻存处理：向经分离获得的脐血造血干细胞中加入细胞冻存液，经降温后存储于-196℃深低温气态液氮存储罐中。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中步骤(1)中，经冻存处理的脐血造血干细胞经历如下复苏处理：将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中解冻。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中步骤(1)中，经冻存处理的脐血造血干细胞经历如下复苏处理：将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中，在1分钟内完成解冻过程。以此种速度解冻能够最大程度地保持细胞活率。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中经分离获得的脐血造血干细胞中加入的细胞冻存液包含：约65份的DMEM-F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中所述PBS缓冲液是磷酸的钠盐和/或钾盐配制的，其pH为5.0-8.0，优选pH为5.5-7.6，优选pH为6.0-7.5。在一个实施方案中，所述PBS缓冲液中磷酸根的浓度为0.01-0.5M，优选0.02-0.1M。在本发明下文试验中，所用PBS缓冲液是磷酸钠盐，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH为7.2。需要说明的是，本发明人发现，在上述范围内的PBS缓冲液浓度和pH值对于本发明方法的效果影响不大。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中所述造血干细胞培养体系中还包含0.02～0.05μmol/L己二酸二钠和0.05～0.15％(w/v)麦芽糖。已经出人意料地发现，向造血干细胞培养体系中添加此两种试剂可以大大提高CD34⁺细胞的扩增倍数，并且CD34⁺细胞性能不受影响。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中所述的可药用载体选自注射用水、氯化钠、甘露醇、乳糖、蔗糖等。

根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中所述血管病变为肢体动脉狭窄闭塞或糖尿病引起的外周动脉病变(peripheral arterial disease，PAD)；优选肢体动脉狭窄闭塞或糖尿病引起的下肢动脉病变。

下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过引用并入本文。

在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。

在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围。

在本发明中，术语“脐带”是指新生儿脐带，特别是指产后4小时之内的脐带。

在本发明中，术语“脐血”是指新生儿脐血，特别是指产后4小时之内的脐血。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymal stem cells.JOrthop Res.1991,9∶641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。

目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每10⁵～10⁶个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的脐带是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。

最新的研究表明脐带中含有丰富的干细胞，从脐带中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。

现有的分离干细胞从而建立干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如CN 101270349A(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的发明；CN 101693884A(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。

可以从脐带中大量分离间充质干细胞，并可利用这种方法保存脐带间充质干细胞并建立脐带干细胞库。可以在分离培养间充质干细胞的基础上，利用组织消化酶消化脐带组织块，结合贴壁培养法，成功自脐带中分离得到大量间充质干细胞。本发明方法得到的间充质干细胞纯度高、数量多，具有与骨髓间充质干细胞相同的生物学特性，能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞等分化。由于脐带中干细胞较成体干细胞幼稚，含量丰富，在临床上具有广泛的应用前景，我们运用常规的细胞冻存方法将间充质干细胞像脐血一样冻存起来，建立脐带干细胞库，为以后干细胞的深入研究和临床治疗奠定基础。

由于脐血中含有丰富的造血干细胞，人们建立脐血库把脐血造血干细胞这一重要的生物资源储存起来，为多种血液系统疾病和免疫系统疾病提供一种治疗手段。同样脐带间充质干细胞作为一种更加重要的干细胞资源，我们运用常规的细胞冻存方法将其冷冻在-196摄氏度的深低温液氮中长期保存，建立脐带干细胞库，为日后的干细胞治疗保存种子。

本发明对脐带血先采用AXP全自动分离系统例如AXP Auto Xpress^TM Platform全自动干细胞分离系统进行分离。此类AXP全自动分离系统具有非常优异的细胞分离性能：其设计了卫生封闭的离心装置，从脐带血中全自动纯化出单一的脐血干细胞组分，分离过程中干细胞体积减少到设计规定体积，同时脐血中其他组分分离到不同袋中；AXP全自动干细胞分离系统能够在40分钟内从脐带血中精确分离得到20毫升，回收率＞97％单核淋巴细胞，大大提高有核细胞的数量；AXP全自动干细胞分离系统带有计算机芯片及流路控制阀门和光学传感器，条形码自动采集血袋编码及离心过程中操作的数据，符合cGTP规程保证产品质量。与传统手工处理相比，传统手工处理时间为约2-4小时，而AXP全自动干细胞分离系统仅需约40分钟；传统手工处理要靠技术员经验及主观判断处理，处理时间长，增加受细菌感染机会，干细胞回收率会因技术员的经验而有所偏差；而采用AXP全自动干细胞分离系统时，由分离、采集至存储干细胞的过程均在密封式环境进行，独立电脑系统记录处理资料，稳定性及回收率高，加快处理速度，增加活性，密封式环境，严格避免细菌感染，可应需要同时处理多个样本，资料记录完善，方便查核。

本发明操作简单，方便实用，能得到大量的脐血造血干细胞特别是CD34⁺细胞，这种细胞分化性能好，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等细胞分化的能力。本发明谅法简便易行，且由于脐带与脐血一样，细胞成份较幼稚，来源广泛，方便易得，因此本发明的方法在干细胞的临床应用上将具有广泛的前景。

附图说明

图1描绘了通过本发明方法扩增CD34⁺细胞前后的比较图，图中表明CD34⁺细胞有显著量的扩增。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、由脐血造血干细胞制备CD34阳性细胞

本实施例使用的造血干细胞培养体系的配方为：人低密度脂蛋白(Human LDL)75μg/ml、促红细胞生成素(EPO)5ng/ml、白介素3(IL-3)1500IU/ml、干细胞因子(SCF)25ng/ml、无动物成份培养基(StemSpan-ACF)适量加至配液体积全量。

本实施例将采集的脐血在分离得到造血干细胞后先进行冻存和复苏操作，然后再进行CD34⁺细胞的扩增，这样经历冻存-复苏处理不会损失/损害脐血造血干细胞，并且在某些情况下可以收集大量脐血样本而根据需要在必要的时候再进行CD34⁺细胞的扩增。

1、脐血造血干细胞冻存

新鲜的脐带血采集完成后，经过AXP全自动分离系统(AXP Auto Xpress^TMPlatform)，获得有核细胞，然后向其中加入细胞冻存液(65份的DMEM-F12、10份的二甲基亚砜、15份的人血白蛋白)，经降温后存储于-196℃深低温气态液氮存储罐中(经AXP处理后的脐血样本，其红细胞去除率为91％)；

2、脐血造血干细胞复苏及体外扩增

(1).将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中解冻(在1分钟内完成解冻过程，从而能够最大程度地保持细胞活率)；

(2).用一次性无菌注射器将复苏后的脐血快速转移至50ml无菌离心管中；点滴法加入等体积无菌PBS缓冲液(该PBS缓冲液是用磷酸二氢钠配制，用氢氧化钠调节pH值，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，再次加入40ml无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，接着用15倍体积的PBS缓冲液(pH7.2)重悬细胞沉淀；

(3).Ficoll分离液分离：在50ml无菌离心管中加入25ml的Ficoll分离液，然后沿着管壁缓慢加入15ml细胞悬液，离心处理(1800rpm离心20min，升速1，降速0)，离心分离后，吸取白膜层单个核细胞，再用PBS缓冲液(pH7.2)清洗2遍，弃上清，用PBS缓冲液(pH7.2)定容至悬液体积为5ml；

(4).采用流式细胞仪(FC500型流式细胞仪)进行CD34⁺细胞(即表面标志物CD34阳性细胞)计数，再根据CD34⁺检测结果用造血干细胞培养体系稀释至CD34⁺细胞浓度为5*10^4个细胞/ml；将稀释的细胞接种至低贴附涂层6孔板，接种密度为1*10^5个CD34⁺细胞/孔(2ml)，然后放入5％CO₂、37℃培养箱中进行培养；

(5).分别在培养的第2、4、6天进行换液，单孔换液照如下操作：将细胞转移至15ml无菌离心管中，以300g离心5分钟，弃上清，用2ml造血干细胞培养体系重悬，将2ml悬液接种到6孔板，在5％CO₂、37℃条件下进行培养；

(6).培养第4天，进行CD34⁺细胞计数，当达到4-6*10^5个细胞时按照1*10^5个CD34⁺细胞/孔时进行分板处理；

(7).培养第6天，根据CD34⁺细胞计数情况，决定是否分板处理；若达到4～6*10^5个CD34⁺细胞则进行分板处理并再培养3天后收获CD34⁺细胞，若少于4*10^5个CD34⁺细胞则不进行分板处理并在次日(即培养第7天)收获CD34⁺细胞；

(8).采用采用流式细胞仪(FC500型流式细胞仪)进行CD34⁺计数，并评估CD34⁺细胞扩增效果。扩增效果评价参数例如可以是扩增倍数、集落形成单位(其例如CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM等)。

(9).含有CD34⁺细胞的细胞制品的制备：在无菌条件下，将前述收获的CD34⁺细胞加入到0.9％生理盐水溶液中，制成悬浮液备用。该悬浮液可以通过注射器和立体定位架注射至患者的损伤区域，或者采用其它方式应用于临床。

(10)方法评价

(101)CD34⁺细胞数的增加倍数：

根据扩增前以及扩增后的CD34⁺细胞计数，计算扩增前后的CD34⁺细胞增加倍数，本实施例的结果为6.3倍。图1描绘了通过本实施例方法扩增CD34⁺细胞前后的比较图，图中表明CD34⁺细胞有显著量的扩增。

(102)集落形成单位测试：通过本测试证明扩增后的造血干细胞具有自我增殖和分化的能力。测试项目选择CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM四者，结果见表1，从表中结果可见，本发明扩增后的造血干细胞具有优异的自我增殖和分化的能力，平均集落总数高达15.5。

表1：集落形成单位测试结果：

实施例2、由脐血造血干细胞制备CD34阳性细胞

本实施例使用的造血干细胞培养体系的配方为：人低密度脂蛋白(Human LDL)25μg/ml、促红细胞生成素(EPO)15ng/ml、白介素3(IL-3)500IU/ml、干细胞因子(SCF)75ng/ml、无动物成份培养基(StemSpan-ACF)适量加至配液体积全量。

本实施例不进行冻存和复苏操作，而是将采信的脐血在分离得到造血干细胞后直接进行CD34⁺细胞的扩增。

(1).脐血造血干细胞的分离：新鲜的脐带血采集完成后，分离脐血造血干细胞以获得有核细胞；

(2).用一次性无菌注射器将步骤(1)所得脐血造血干细胞5ml转移至50ml无菌离心管中；点滴法加入等体积的无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，再次加入40ml无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，接着用20倍体积的PBS缓冲液(pH7.2)重悬细胞沉淀；

(3).Ficoll分离液分离：在50ml无菌离心管中加入25ml的Ficoll分离液，然后沿着管壁缓慢加入15ml的细胞悬液，离心处理，离心分离后，吸取白膜层单个核细胞，再用PBS缓冲液(pH7.2)清洗2遍，弃上清，用PBS缓冲液(pH7.2)定容至悬液体积为5ml；

(4).采用流式细胞仪(例如FC500型流式细胞仪)进行CD34⁺细胞(即表面标志物CD34阳性细胞)计数，再根据CD34⁺检测结果用造血干细胞培养体系稀释至CD34⁺细胞浓度为5*10^4个细胞/ml；将稀释的细胞接种至低贴附涂层6孔板，接种密度为1*10^5个CD34⁺细胞/孔(2ml)，然后放入5％CO2、37℃培养箱中进行培养；

(5).分别在培养的第2、4、6天进行换液，单孔换液照如下操作：将细胞转移至15ml无菌离心管中，以300g离心5分钟，弃上清，用2ml造血干细胞培养体系重悬，将2ml悬液接种到6孔板，在5％CO2、37℃条件下进行培养；

(6).培养第4天，进行CD34⁺细胞计数，当达到4～6*10^5个细胞时按照1*10^5个CD34⁺细胞/孔时进行分板处理；

(7).培养第6天，根据CD34⁺细胞计数情况，决定是否分板处理；若达到4～6*10^5个CD34⁺细胞则进行分板处理并再培养3天后收获CD34⁺细胞，若少于4*10^5个CD34⁺细胞则不进行分板处理并在次日(即培养第7天)收获CD34⁺细胞；

(8).采用采用流式细胞仪进行CD34⁺计数，并评估CD34⁺细胞扩增效果。

(9).含有CD34⁺细胞的细胞制品的制备：在无菌条件下，将前述收获的CD34⁺细胞加入到0.9％生理盐水溶液中，制成悬浮液备用。该悬浮液可以通过注射器和立体定位架注射至患者的损伤区域，或者采用其它方式应用于临床。

(10)方法评价

(101)CD34⁺细胞数的增加倍数：

根据扩增前以及扩增后的CD34⁺细胞计数，计算扩增前后的CD34⁺细胞增加倍数，本实施例的结果为6.6倍，与实施例1结果基本相同。

(102)集落形成单位测试：通过本测试证明扩增后的造血干细胞具有自我增殖和分化的能力。测试项目选择CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM四者，具体结果与实施例1结果基本相同，例如平均集落总数高达16.1，表明本发明扩增后的造血干细胞具有优异的自我增殖和分化的能力。

实施例3、由脐血造血干细胞制备CD34阳性细胞

本实施例使用的造血干细胞培养体系的配方为：人低密度脂蛋白(Human LDL)50μg/ml、促红细胞生成素(EPO)10ng/ml、白介素3(IL-3)1000IU/ml、干细胞因子(SCF)50ng/ml、无动物成份培养基(StemSpan-ACF)适量加至配液体积全量。

本实施例将采集的脐血在分离得到造血干细胞后先进行冻存和复苏操作，然后再进行CD34⁺细胞的扩增。

1、脐血造血干细胞冻存

新鲜的脐带血采集完成后，经过AXP全自动分离系统(AXP Auto Xpress^TMPlatform)，获得有核细胞，然后向其中加入细胞冻存液(65份的DMEM-F12、10份的二甲基亚砜、15份的人血白蛋白)，经降温后存储于-196℃深低温气态液氮存储罐中(经AXP处理后的脐血样本，其红细胞去除率为91％)；

2、脐血造血干细胞复苏及体外扩增

(1).将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中解冻(在1分钟内完成解冻过程，从而能够最大程度地保持细胞活率)；

(2).用一次性无菌注射器将复苏后的脐血快速转移至50ml无菌离心管中；点滴法加入等体积无菌PBS缓冲液(该PBS缓冲液是用磷酸二氢钠配制，用氢氧化钠调节pH值，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，再次加入40ml无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，接着用17.5倍体积的PBS缓冲液(pH7.2)重悬细胞沉淀；

(3).Ficoll分离液分离：在50ml无菌离心管中加入25ml的Ficoll分离液，然后沿着管壁缓慢加入15ml细胞悬液，离心处理(1800rpm离心20min，升速1，降速0)，离心分离后，吸取白膜层单个核细胞，再用PBS缓冲液(pH7.2)清洗2遍，弃上清，用PBS缓冲液(pH7.2)定容至悬液体积为5ml；

(4).采用流式细胞仪(FC500型流式细胞仪)进行CD34⁺细胞(即表面标志物CD34阳性细胞)计数，再根据CD34⁺检测结果用造血干细胞培养体系稀释至CD34⁺细胞浓度为5*10^4个细胞/ml；将稀释的细胞接种至低贴附涂层6孔板，接种密度为1*10^5个CD34⁺细胞/孔(2ml)，然后放入5％CO₂、37℃培养箱中进行培养；

(5).分别在培养的第2、4、6天进行换液，单孔换液照如下操作：将细胞转移至15ml无菌离心管中，以300g离心5分钟，弃上清，用2ml造血干细胞培养体系重悬，将2ml悬液接种到6孔板，在5％CO₂、37℃条件下进行培养；

(6).培养第4天，进行CD34⁺细胞计数，当达到4-6*10^5个细胞时按照1*10^5个CD34⁺细胞/孔时进行分板处理；

(7).培养第6天，根据CD34⁺细胞计数情况，决定是否分板处理；若达到4～6*10^5个CD34⁺细胞则进行分板处理并再培养3天后收获CD34⁺细胞，若少于4*10^5个CD34⁺细胞则不进行分板处理并在次日(即培养第7天)收获CD34⁺细胞；

(8).采用采用流式细胞仪进行CD34⁺计数，并评估CD34⁺细胞扩增效果。

(9).含有CD34⁺细胞的细胞制品的制备：在无菌条件下，将前述收获的CD34⁺细胞加入到0.9％生理盐水溶液中，制成悬浮液备用。该悬浮液可以通过注射器和立体定位架注射至患者的损伤区域，或者采用其它方式应用于临床。

(10)方法评价

(101)CD34⁺细胞数的增加倍数：

根据扩增前以及扩增后的CD34⁺细胞计数，计算扩增前后的CD34⁺细胞增加倍数，本实施例的结果为6.4倍，与实施例1结果基本相同。

(102)集落形成单位测试：通过本测试证明扩增后的造血干细胞具有自我增殖和分化的能力。测试项目选择CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM四者，具体结果与实施例1结果基本相同，例如平均集落总数高达15.9，表明本发明扩增后的造血干细胞具有优异的自我增殖和分化的能力。

以上实施例1～3的造血干细胞培养体系的配方中，未添加己二酸二钠和麦芽糖。本发明人在下面实施例4～6的造血干细胞培养体系的配方中，额外分别添加了0.035μmol/L己二酸二钠和0.1％(w/v)麦芽糖、0.02μmol/L己二酸二钠和0.15％(w/v)麦芽糖、0.05μmol/L己二酸二钠和0.05％(w/v)麦芽糖，具体结果见下文。结果表明，实施例1-3的CD34⁺细胞增加倍数平均值为6.4倍，而实施例4-6的CD34⁺细胞增加倍数平均值为11.1倍，相对于造血干细胞培养体系中未添加两种试剂的情形，CD34⁺细胞增加倍数增加了73％，这种增加对于CD34⁺细胞这种特殊细胞具有极其重要的临床应用价值，因为通过这样的方案可以将有限的脐血造血干细胞扩增到更大量的子代细胞，解决临床应用时细胞不足的问题。另外，通过补充的试验已经发现，如果在上述培养液中只增添己二酸二钠或者只增添麦芽糖(而不是同时增添己二酸二钠和麦芽糖)，则CD34⁺细胞增加倍数平均值仅在6.3～6.9范围，不能明显CD34⁺细胞增加倍数显著地增加。

实施例4、由脐血造血干细胞制备CD34阳性细胞

本实施例将采集的脐血在分离得到造血干细胞后先进行冻存和复苏操作，然后再进行CD34⁺细胞的扩增，这样经历冻存-复苏处理不会损失/损害脐血造血干细胞，并且在某些情况下可以收集大量脐血样本而根据需要在必要的时候再进行CD34⁺细胞的扩增。

1、脐血造血干细胞冻存

新鲜的脐带血采集完成后，经过AXP全自动分离系统(AXP Auto Xpress^TMPlatform)，获得有核细胞，然后向其中加入细胞冻存液(65份的DMEM-F12、10份的二甲基亚砜、15份的人血白蛋白)，经降温后存储于-196℃深低温气态液氮存储罐中(经AXP处理后的脐血样本，其红细胞去除率为91％)；

2、脐血造血干细胞复苏及体外扩增

(1).将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中解冻(在1分钟内完成解冻过程，从而能够最大程度地保持细胞活率)；

(2).用一次性无菌注射器将复苏后的脐血快速转移至50ml无菌离心管中；点滴法加入等体积无菌PBS缓冲液(该PBS缓冲液是用磷酸二氢钠配制，用氢氧化钠调节pH值，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，再次加入40ml无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，接着用15倍体积的PBS缓冲液(pH7.2)重悬细胞沉淀；

(3).Ficoll分离液分离：在50ml无菌离心管中加入25ml的Ficoll分离液，然后沿着管壁缓慢加入15ml细胞悬液，离心处理(1800rpm离心20min，升速1，降速0)，离心分离后，吸取白膜层单个核细胞，再用PBS缓冲液(pH7.2)清洗2遍，弃上清，用PBS缓冲液(pH7.2)定容至悬液体积为5ml；

(4).采用流式细胞仪(FC500型流式细胞仪)进行CD34⁺细胞(即表面标志物CD34阳性细胞)计数，再根据CD34⁺检测结果用造血干细胞培养体系稀释至CD34⁺细胞浓度为5*10^4个细胞/ml；将稀释的细胞接种至低贴附涂层6孔板，接种密度为1*10^5个CD34⁺细胞/孔(2ml)，然后放入5％CO₂、37℃培养箱中进行培养；

(5).分别在培养的第2、4、6天进行换液，单孔换液照如下操作：将细胞转移至15ml无菌离心管中，以300g离心5分钟，弃上清，用2ml造血干细胞培养体系重悬，将2ml悬液接种到6孔板，在5％CO₂、37℃条件下进行培养；

(6).培养第4天，进行CD34⁺细胞计数，当达到4-6*10^5个细胞时按照1*10^5个CD34⁺细胞/孔时进行分板处理；

(7).培养第6天，根据CD34⁺细胞计数情况，决定是否分板处理；若达到4～6*10^5个CD34⁺细胞则进行分板处理并再培养3天后收获CD34⁺细胞，若少于4*10^5个CD34⁺细胞则不进行分板处理并在次日(即培养第7天)收获CD34⁺细胞；

(8).采用采用流式细胞仪进行CD34⁺计数，并评估CD34⁺细胞扩增效果。

(9).含有CD34⁺细胞的细胞制品的制备：在无菌条件下，将前述收获的CD34⁺细胞加入到0.9％生理盐水溶液中，制成悬浮液备用。该悬浮液可以通过注射器和立体定位架注射至患者的损伤区域，或者采用其它方式应用于临床。

(10)方法评价

(101)CD34⁺细胞数的增加倍数：

根据扩增前以及扩增后的CD34⁺细胞计数，计算扩增前后的CD34⁺细胞增加倍数，本实施例的结果为11.2倍。

(102)集落形成单位测试：通过本测试证明扩增后的造血干细胞具有自我增殖和分化的能力。测试项目选择CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM四者，具体结果与实施例1结果基本相同，例如平均集落总数高达17.2，表明本发明扩增后的造血干细胞具有优异的自我增殖和分化的能力。

实施例5、由脐血造血干细胞制备CD34阳性细胞

本实施例不进行冻存和复苏操作，而是将采信的脐血在分离得到造血干细胞后直接进行CD34⁺细胞的扩增。

(1).脐血造血干细胞的分离：新鲜的脐带血采集完成后，分离脐血造血干细胞以获得有核细胞；

(2).用一次性无菌注射器将步骤(1)所得脐血造血干细胞5ml转移至50ml无菌离心管中；点滴法加入等体积的无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，再次加入40ml无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，接着用20倍体积的PBS缓冲液(pH7.2)重悬细胞沉淀；

(3).Ficoll分离液分离：在50ml无菌离心管中加入25ml的Ficoll分离液，然后沿着管壁缓慢加入15ml的细胞悬液，离心处理，离心分离后，吸取白膜层单个核细胞，再用PBS缓冲液(pH7.2)清洗2遍，弃上清，用PBS缓冲液(pH7.2)定容至悬液体积为5ml；

(4).采用流式细胞仪(例如FC500型流式细胞仪)进行CD34⁺细胞(即表面标志物CD34阳性细胞)计数，再根据CD34⁺检测结果用造血干细胞培养体系稀释至CD34⁺细胞浓度为5*10^4个细胞/ml；将稀释的细胞接种至低贴附涂层6孔板，接种密度为1*10^5个CD34⁺细胞/孔(2ml)，然后放入5％CO2、37℃培养箱中进行培养；

(5).分别在培养的第2、4、6天进行换液，单孔换液照如下操作：将细胞转移至15ml无菌离心管中，以300g离心5分钟，弃上清，用2ml造血干细胞培养体系重悬，将2ml悬液接种到6孔板，在5％CO2、37℃条件下进行培养；

(6).培养第4天，进行CD34⁺细胞计数，当达到4～6*10^5个细胞时按照1*10^5个CD34⁺细胞/孔时进行分板处理；

(7).培养第6天，根据CD34⁺细胞计数情况，决定是否分板处理；若达到4～6*10^5个CD34⁺细胞则进行分板处理并再培养3天后收获CD34⁺细胞，若少于4*10^5个CD34⁺细胞则不进行分板处理并在次日(即培养第7天)收获CD34⁺细胞；

(8).采用采用流式细胞仪进行CD34⁺计数，并评估CD34⁺细胞扩增效果。

(9).含有CD34⁺细胞的细胞制品的制备：在无菌条件下，将前述收获的CD34⁺细胞加入到0.9％生理盐水溶液中，制成悬浮液备用。该悬浮液可以通过注射器和立体定位架注射至患者的损伤区域，或者采用其它方式应用于临床。

(10)方法评价

(101)CD34⁺细胞数的增加倍数：

根据扩增前以及扩增后的CD34⁺细胞计数，计算扩增前后的CD34⁺细胞增加倍数，本实施例的结果为10.4倍。

(102)集落形成单位测试：通过本测试证明扩增后的造血干细胞具有自我增殖和分化的能力。测试项目选择CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM四者，具体结果与实施例1结果基本相同，例如平均集落总数高达16.8，表明本发明扩增后的造血干细胞具有优异的自我增殖和分化的能力。

实施例6、由脐血造血干细胞制备CD34阳性细胞

本实施例将采集的脐血在分离得到造血干细胞后先进行冻存和复苏操作，然后再进行CD34⁺细胞的扩增。

1、脐血造血干细胞冻存

新鲜的脐带血采集完成后，经过AXP全自动分离系统(AXP Auto Xpress^TMPlatform)，获得有核细胞，然后向其中加入细胞冻存液(65份的DMEM-F12、10份的二甲基亚砜、15份的人血白蛋白)，经降温后存储于-196℃深低温气态液氮存储罐中(经AXP处理后的脐血样本，其红细胞去除率为91％)；

2、脐血造血干细胞复苏及体外扩增

(1).将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中解冻(在1分钟内完成解冻过程，从而能够最大程度地保持细胞活率)；

(2).用一次性无菌注射器将复苏后的脐血快速转移至50ml无菌离心管中；点滴法加入等体积无菌PBS缓冲液(该PBS缓冲液是用磷酸二氢钠配制，用氢氧化钠调节pH值，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，再次加入40ml无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，接着用17.5倍体积的PBS缓冲液(pH7.2)重悬细胞沉淀；

(3).Ficoll分离液分离：在50ml无菌离心管中加入25ml的Ficoll分离液，然后沿着管壁缓慢加入15ml细胞悬液，离心处理(1800rpm离心20min，升速1，降速0)，离心分离后，吸取白膜层单个核细胞，再用PBS缓冲液(pH7.2)清洗2遍，弃上清，用PBS缓冲液(pH7.2)定容至悬液体积为5ml；

(4).采用流式细胞仪(FC500型流式细胞仪)进行CD34⁺细胞(即表面标志物CD34阳性细胞)计数，再根据CD34⁺检测结果用造血干细胞培养体系稀释至CD34⁺细胞浓度为5*10^4个细胞/ml；将稀释的细胞接种至低贴附涂层6孔板，接种密度为1*10^5个CD34⁺细胞/孔(2ml)，然后放入5％CO₂、37℃培养箱中进行培养；

(5).分别在培养的第2、4、6天进行换液，单孔换液照如下操作：将细胞转移至15ml无菌离心管中，以300g离心5分钟，弃上清，用2ml造血干细胞培养体系重悬，将2ml悬液接种到6孔板，在5％CO₂、37℃条件下进行培养；

(6).培养第4天，进行CD34⁺细胞计数，当达到4-6*10^5个细胞时按照1*10^5个CD34⁺细胞/孔时进行分板处理；

(7).培养第6天，根据CD34⁺细胞计数情况，决定是否分板处理；若达到4～6*10^5个CD34⁺细胞则进行分板处理并再培养3天后收获CD34⁺细胞，若少于4*10^5个CD34⁺细胞则不进行分板处理并在次日(即培养第7天)收获CD34⁺细胞；

(8).采用采用流式细胞仪进行CD34⁺计数，并评估CD34⁺细胞扩增效果。

(9).含有CD34⁺细胞的细胞制品的制备：在无菌条件下，将前述收获的CD34⁺细胞加入到0.9％生理盐水溶液中，制成悬浮液备用。该悬浮液可以通过注射器和立体定位架注射至患者的损伤区域，或者采用其它方式应用于临床。

(10)方法评价

(101)CD34⁺细胞数的增加倍数：

根据扩增前以及扩增后的CD34⁺细胞计数，计算扩增前后的CD34⁺细胞增加倍数，本实施例的结果为11.7倍。

(102)集落形成单位测试：通过本测试证明扩增后的造血干细胞具有自我增殖和分化的能力。测试项目选择CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM四者，具体结果与实施例1结果基本相同，例如平均集落总数高达16.9，表明本发明扩增后的造血干细胞具有优异的自我增殖和分化的能力。

本发明的方法不仅操作简便，且使得能够大量生产CD34⁺细胞，为满足临床需求提供了可能。

本发明实际施用给患者的CD34⁺细胞的量可以根据多种相关因素(包括疾病的严重程度、施用途径、患者的体重、年龄和性别等)由临床操作者自行确定。根据治疗目的，细胞制品中还可以添加细胞因子和/或药物。

本发明方法制备的CD34⁺细胞单独使用、或者配合传统治疗方案(如控制高血糖、高血压、血脂异常；去除危险因素如吸烟；强制性的运动锻炼；施用抗血小板药物和扩血管药物；循环重建手术)联合使用，从而促进局部微循环形成，以提高、巩固治疗效果。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.由脐血制备CD34阳性细胞的方法，该方法包括如下步骤：

(1).脐血造血干细胞的分离：新鲜的脐带血采集完成后，分离脐血造血干细胞以获得有核细胞；

(2).用一次性无菌注射器将步骤(1)所得脐血造血干细胞5ml转移至50ml无菌离心管中；点滴法加入等体积的无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，再次加入40ml无菌PBS缓冲液(pH7.2)，1200rpm离心5min，去除上清，接着用15-20倍体积的PBS缓冲液(pH7.2)重悬细胞沉淀；

(3).Ficoll分离液分离：在50ml无菌离心管中加入25ml的Ficoll分离液，然后沿着管壁缓慢加入15ml的细胞悬液，离心处理，离心分离后，吸取白膜层单个核细胞，再用PBS缓冲液(pH7.2)清洗2遍，弃上清，用PBS缓冲液(pH7.2)定容至悬液体积为5ml；

(4).采用流式细胞仪进行CD34阳性细胞)计数，再根据CD34⁺检测结果用造血干细胞培养体系稀释至CD34⁺细胞浓度为5*10^4个细胞/ml；将稀释的细胞接种至低贴附涂层6孔板，接种密度为1*10^5个CD34⁺细胞/孔(2ml)，然后放入5％CO2、37℃培养箱中进行培养；

(5).分别在培养的第2、4、6天进行换液，单孔换液照如下操作：将细胞转移至15ml无菌离心管中，以300g离心5分钟，弃上清，用2ml造血干细胞培养体系重悬，将2ml悬液接种到6孔板，在5％CO2、37℃条件下进行培养；

(6).培养第4天，进行CD34⁺细胞计数，当达到4～6*10^5个细胞时按照1*10^5个CD34⁺细胞/孔时进行分板处理；

(7).培养第6天，根据CD34⁺细胞计数情况，决定是否分板处理；若达到4～6*10^5个CD34⁺细胞则进行分板处理并再培养3天后收获CD34⁺细胞，若少于4*10^5个CD34⁺细胞则不进行分板处理并在次日收获CD34⁺细胞；

(8).采用采用流式细胞仪进行CD34⁺计数，并评估CD34⁺细胞扩增效果。

2.根据权利要求1方法，其特征在于：

步骤(1)中，对所述脐血进行脐血造血干细胞的分离是采用AXP全自动分离系统进行分离的；

步骤(1)中，对所述脐血进行脐血造血干细胞的分离是采用AXP全自动分离系统进行分离的，所述AXP全自动分离系统AXP Auto Xpress^TMPlatform；

步骤(1)中，经AXP处理后的脐血样本，其红细胞去除率在80％以上；和/或

所述的PBS缓冲液是磷酸钠盐缓冲液，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH7.2。

3.根据权利要求1方法，其特征在于：

步骤(3)中，所述离心处理的条件是：1800rpm离心20min，升速1，降速0；和/或

所述流式细胞仪是FC500型流式细胞仪或者其它本领域常用型号的流式细胞仪。

4.根据权利要求1方法，其特征在于：

所述造血干细胞培养体系的组成为：人低密度脂蛋白(Human LDL)25～75μg/ml、促红细胞生成素(EPO)5～15ng/ml、白介素3(IL-3)500～1500IU/ml、干细胞因子(SCF)25～75ng/ml、无动物成份培养基(StemSpan-ACF)适量加至配液体积全量；

所述造血干细胞培养体系的组成为：人低密度脂蛋白(Human LDL)50μg/ml、促红细胞生成素(EPO)10ng/ml、白介素3(IL-3)1000IU/ml、干细胞因子(SCF)50ng/ml、无动物成份培养基(StemSpan-ACF)适量加至配液体积全量；和/或

所述扩增效果的评价参数例如可以是扩增倍数、集落形成单位。

5.根据权利要求1方法，其特征在于：

步骤(1)中，分离获得的脐血造血干细胞还任选的经历冻存和复苏处理，然后再将其用于步骤(2)的处理；

步骤(1)中，分离获得的脐血造血干细胞经历如下冻存处理：向经分离获得的脐血造血干细胞中加入细胞冻存液，经降温后存储于-196℃深低温气态液氮存储罐中；

步骤(1)中，经冻存处理的脐血造血干细胞经历如下复苏处理：将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中解冻；和/或

步骤(1)中，经冻存处理的脐血造血干细胞经历如下复苏处理：将冻存的脐血造血干细胞从液氮罐中取出，放入40℃水浴锅中，在1分钟内完成解冻过程。

6.根据权利要求1方法，其特征在于：经分离获得的脐血造血干细胞中加入的细胞冻存液包含：约65份的DMEM-F12、约10份的二甲基亚砜、约15份的人血白蛋白。

7.根据权利要求1方法，其特征在于：

所述PBS缓冲液是磷酸的钠盐和/或钾盐配制的，其pH为5.0-8.0，优选pH为5.5-7.6，优选pH为6.0-7.5；

所述PBS缓冲液中磷酸根的浓度为0.01-0.5M，优选0.02-0.1M；

所用PBS缓冲液是磷酸钠盐，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH为7.2；和/或

所述造血干细胞培养体系中还包含0.02～0.05μmol/L己二酸二钠和0.05～0.15％(w/v)麦芽糖。

8.一种细胞制品，其包括根据权利要求1-7任一项所述方法制备的CD34阳性细胞和可药用载体；例如，所述的可药用载体选自注射用水、氯化钠、甘露醇、乳糖、蔗糖等。

9.权利要求1-7任一项所述方法制备的CD34阳性细胞在制备用于缓解或改善血管病变的药物中的用途。

10.根据权利要求9的用途，其中所述血管病变为肢体动脉狭窄闭塞或糖尿病引起的外周动脉病变；优选肢体动脉狭窄闭塞或糖尿病引起的下肢动脉病变。