CN106680248B - 基于金丝桃素与1-芘丁酸作用的dna荧光分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于金丝桃素与1‑芘丁酸之间π‑π堆积作用的DNA荧光分析方法，将共价连接到链霉亲和素磁珠表面的吗啉寡核苷酸作为捕获探针，与目标DNA片段杂交后，利用锆离子的配位作用，将1‑芘丁酸连接到DNA骨架上，再用金丝桃素与1‑芘丁酸之间的π‑π堆积作用引入荧光较强的金丝桃素。本发明通过过渡金属离子的配位作用及芳香环之间的π‑π堆积作用引入荧光探针，方法简便，荧光探针结合效果好，测得的荧光强度与目标DNA呈相关关系，通过荧光分析的方法实现对DNA片段的高灵敏度、高选择性检测，可应用于分子识别、临床诊断、环境监测及食品安全等领域中DNA样品的检测。

Description

基于金丝桃素与1-芘丁酸作用的DNA荧光分析方法

技术领域

本发明属于荧光分析应用领域，具体涉及一种基于Hyp与PBA之间π-π堆积作用的DNA荧光分析方法。

背景技术

高灵敏度高特异性的DNA检测技术在疾病诊断、药物开发、食品安全、环境监测等方面得到了广泛的应用，近年来，DNA检测技术趋于微型化与简便化，灵敏度、特异性、检测速率的提高，成本的降低以及更简便的过程控制是目前DNA检测技术发展的趋势。与早期的DNA检测技术如比色法、凝胶电泳、紫外光谱等检测方法相比，采用荧光法的DNA传感器由于其高灵敏度、低成本及便携性等特点受到了越来越多的关注。

文献1(李宏业，范树国、刘玉乐、陈刚、王寰宇，改良聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA，细胞生物学杂志，1999,21,201-202。)利用改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳法，用30％丙烯酰胺，10×TBE，TEMED，10％过硫酸铵配制成10mL的3.5％凝胶，灌胶后采用15V/cm的电压梯度电泳，利用银染法对拟南芥基因组DNA为模板的PCR产物及其克隆于pGEM7Z上的重组质粒限制酶切产物进行检测，DNA片段得到很好的分离，条带显示清晰。目前，这种聚丙烯酰胺凝胶电泳法对于DNA的检测技术已经发展成熟，然而此法需要制胶、聚合酶链式反应，电泳、染色等一系列的过程，消耗时间长，劳动强度大，染料毒性大，银染的DNA片段不能直接回收纯化，且无法用于痕量及突变DNA的检测，因此具有很大的局限性。

文献2(Fernando Patolsky,Yossi Weizmann,Itamar Willner.Redox-ActiveNucleic-Acid Replica for the Amplified Bioelectrocatalytic Detection of ViralDNA.JACS.2002,124,770-772.)将短链DNA探针固定于金电极表面，其与待测的环状M13￠病毒DNA部分杂交，在聚合酶的作用下，以长链上未杂交部分的DNA作为母链进行DNA复制，复制原料中的dUTP标记有电活性物质羧酸二茂铁，从而得到具有二茂铁标记的寡聚核苷酸修饰电极，在电极上引入电信号。为了获得放大的检测信号，用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化来加速电子传递。该实验通过测定峰电流的变化，达到特异性的检测M13￠病毒DNA的目的。目前，利用二茂铁的电活性来对DNA进行检测的方法已经得到了广泛的应用，然而电化学法背景噪音大，重现性差，且难以用于单核苷酸多态性检测，此法中所用的DNA杂交探针的杂交效率相对肽核酸、吗啉寡核苷酸等探针较低，不适用于碱基错配的DNA检测。

发明内容

本发明的目的是为了检测痕量的DNA片段，包括完全互补、单碱基错配、三碱基错配和对照序列，提供了一种高灵敏度高选择性DNA荧光分析方法。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于Hyp与PBA之间π-π堆积作用的DNA荧光分析方法，包括如下步骤：

步骤一、将链霉亲和素磁珠(SA-MB)悬浮在PBS缓冲液中，加入3’端修饰生物素的吗啉寡核苷酸探针(MO)，反应结束后进行磁分离，并用PBS缓冲液清洗多次；

步骤二、加入待测DNA片段溶液，杂交反应结束后进行磁分离，并用Tris-HCl缓冲液清洗多次；

步骤三、加入ZrOCl₂溶液，配位反应结束后进行磁分离，并用60wt％乙醇清洗多次；

步骤四、加入1-芘丁酸(PBA)溶液，反应结束后进行磁分离，并用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)清洗多次；

步骤五、再加入金丝桃素(Hyp)溶液，反应结束后进行磁分离,并用二甲基亚砜(DMSO)清洗多次，最后复悬在DMSO中测紫外和荧光光谱。

步骤一中，所述的链霉亲和素磁珠的浓度为0.1～1.0mg/mL，吗啉寡核苷酸的浓度为0.5～1.5μM，序列为5’-AAC CAT ACA ACC TAC TAC CTC A-Biotin-3’，反应时间为40～80min。

步骤二中，所述的待测DNA片段溶液的溶剂为TE缓冲液，DNA浓度为1nM～100nM，DNA片段选用序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的完全互补的DNA片段，序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TGT GGT T-3’的单碱基错配的DNA片段，序列为5’-TGA GGTATT AGA TTG TGT GGT T-3’的三碱基错配的DNA片段或序列为5’-ACT TAC CTT TGC TCATTG ACG A-3’的对照DNA片段，反应时间为40～80min。

步骤三中，所述的ZrOCl₂溶液的溶剂为60wt％乙醇，Zr⁴⁺的浓度为4mM，反应时间为20～40min。

步骤四中，所述的PBA溶液的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，PBA浓度为2mM，反应时间为20～40min。

步骤五中，所述的Hyp溶液的溶剂为二甲基亚砜，Hyp浓度为0.1～0.3mM，反应时间为10～80min。

本发明与现有技术相比，其显著优点是：

1、以磁性微球为载体并通过荧光光谱分析的方法能更有效地实现DNA高灵敏检测，且背景噪声小、成本低、方法简便、分析时间短。

2、以吗啉寡核苷酸作为捕获探针，选择性及特异性高，能有效区分目标DNA与单碱基错配、三碱基错配及对照DNA片段。

3、利用过渡金属离子的配位作用及芳香环之间的π-π堆积作用引入荧光探针，方法简便，荧光探针结合效果好。

4、检测灵敏度高，对于目标DNA(tDNA)浓度在1nM～100nM的范围内，荧光强度具有很好的线性响应。

附图说明

图1是本发明基于Hyp与PBA之间π-π堆积作用的DNA荧光分析过程示意图。

图2是本发明实施例1中的紫外和荧光光谱表征图(其中，a为紫外可见光谱，b为荧光光谱)。

图3是本发明实施例2中Hyp与PBA之间π-π堆积作用时间优化图(其中，a为荧光光谱的变化，b为峰值的变化)。

图4是本发明实施例3中含水量对π-π堆积作用的影响结果图(其中，a为荧光光谱的比较，b为峰值的比较)。

图5是本发明实施例4中的对不同浓度tDNA片段的检测特性图(其中，a为荧光光谱的比较，b为峰值的比较)。

图6是本发明实施例5中的对不同序列DNA片段的检测特性图(其中，a为荧光光谱的比较，b为峰值的比较)。

具体实施方式

下面通过过施例对本发明作进一步的说明，其目的是为更好理解本发明的内容，但所举的过施例并不限制本发明的保护范围：

实施例1：通过锆离子的配位作用及Hyp与PBA之间的π-π堆积作用在SA-MB表面引入荧光探针的紫外和荧光光谱表征。

采用本发明所述的基于Hyp与PBA之间π-π堆积作用的DNA荧光分析，将0.5mg/mL的SA-MB悬浮在PBS缓冲液中，加入1μM的3’端修饰生物素的MO，序列为5’-AAC CAT ACA ACCTAC TAC CTC A-Biotin-3’，反应60min后进行磁分离并用PBS缓冲液清洗多次，再加入100nM的tDNA(溶于TE缓冲液)，序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’，杂交60min后进行磁分离并用Tris-HCl缓冲液清洗多次，再加入4mM的ZrOCl₂·8H₂O溶液(溶于60％乙醇)，配位反应30min后进行磁分离并用60％乙醇清洗多次，再加入2mM的PBA溶液(溶于N,N-二甲基甲酰胺，DMF)，反应30min后进行磁分离并用DMF清洗多次，再加入0.2mM的Hyp溶液(溶于二甲基亚砜，DMSO)，反应90min后进行磁分离并用DMSO清洗多次，最后复悬在DMSO中测紫外和荧光光谱。荧光激光波长为554nm。紫外和荧光光谱的结果如附图2所示，其中，a是紫外可见光谱，b是554nm激发下的发射光谱及604nm发射波长下的激发光谱，由图可见，Hyp成功连接到DNA骨架上，且该荧光分析方法具有可行性及高效性。

实施例2：Hyp与PBA之间π-π堆积作用的时间优化。

采用本发明所述的基于Hyp与PBA之间π-π堆积作用的DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，选用100nM序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的tDNA片段作为目标分析物，改变π-π堆积作用时间依次为10、20、30、40、50、60、70、80min，分析反应时间对本发明DNA荧光分析结果的影响，其分析结果如附图3所示，其中，a为荧光光谱的变化，b为峰值的变化，由图可知，π-π堆积作用时间为10、20、30、40、50min时，随着时间的增加，荧光强度显著增强，而在反应50min之后，随着时间的增加，荧光强度维持稳定，因此在之后的检测过程中，选用50min作为适宜的π-π堆积作用时间。

实施例3：含水量对π-π堆积作用的影响。

采用本发明所述的基于Hyp与PBA之间π-π堆积作用的DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，选用100nM序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的tDNA片段作为目标分析物，改变π-π堆积反应中水的含量依次为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，分析含水量对π-π堆积作用的影响，其分析结果如附图4所示，其中，a为荧光光谱的比较，b为峰值的比较，由图可知，随着含水量的增加，荧光强度显著降低，含水量超过80％后，荧光强度几乎降为零，因此在实际检测过程中，需保持π-π堆积反应在无水环境下。

实施例4：基于Hyp与PBA之间π-π堆积作用的DNA荧光分析对不用浓度tDNA片段的荧光响应特性。

采用本发明所述的基于Hyp与PBA之间π-π堆积作用的DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，选用序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的tDNA片段作为目标分析物，浓度分别为1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100nM，分析对不同浓度tDNA片段的荧光响应特性，分析结果如附图5所示，由图可知，在该检测浓度范围内，荧光强度随着tDNA浓度的增加而增加，具有良好的线性关系，检测极限为2.2nM，荧光响应特性较好且灵敏度较高。

实施例5：基于Hyp与PBA之间π-π堆积作用的DNA荧光分析对不用序列DNA片段的荧光响应特性。

采用本发明所述的基于Hyp与PBA之间π-π堆积作用的DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，以完全互补(5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’)、单碱基错配(5’-TGA GGT AGT AGG TTG TGT GGT T-3’)、三碱基错配(5’-TGA GGT ATT AGA TTG TGTGGT T-3’)、对照(5’-ACT TAC CTT TGC TCA TTG ACG A-3’)的DNA片段作为目标分析物，对不同序列DNA片段进行荧光分析，分析结果如附图6所示，由图可知，本发明的DNA荧光分析方法可以有效区分单核苷酸多态性，具有高特异性和选择性。

Claims (6)

1.一种DNA荧光分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将链霉亲和素磁珠悬浮在PBS缓冲液中，加入3’端修饰生物素的吗啉寡核苷酸探针，反应结束后进行磁分离，并用PBS缓冲液清洗多次；

步骤二、加入待测DNA片段溶液，杂交反应结束后进行磁分离，并用Tris-HCl缓冲液清洗多次；

步骤三、加入ZrOCl₂溶液，配位反应结束后进行磁分离，并用60wt％乙醇清洗多次；

步骤四、加入1-芘丁酸溶液，反应结束后进行磁分离，并用N,N-二甲基甲酰胺清洗多次；

步骤五、再加入金丝桃素溶液，反应结束后进行磁分离,并用二甲基亚砜清洗多次，最后复悬在DMSO中测紫外和荧光光谱。

2.如权利要求1所述的DNA荧光分析方法，其特征在于，步骤一中，链霉亲和素磁珠的浓度为0.1～1.0mg/mL，吗啉寡核苷酸探针的浓度为0.5～1.5μM，吗啉寡核苷酸探针的序列为5’-AAC CAT ACA ACC TAC TAC CTC A-Biotin-3’，反应时间为40～80min。

3.如权利要求1所述的DNA荧光分析方法，其特征在于，步骤二中，所述的待测DNA片段溶液的溶剂为TE缓冲液，DNA浓度为1nM～100nM，DNA片段选用序列为5’-TGA GGT AGT AGGTTG TAT GGT T-3’的完全互补的DNA片段，序列为5’-TGA GGT AGT AGG TTG TGT GGT T-3’的单碱基错配的DNA片段，序列为5’-TGA GGT ATT AGA TTG TGT GGT T-3’的三碱基错配的DNA片段或序列为5’-ACT TAC CTT TGC TCA TTG ACG A-3’的对照DNA片段，反应时间为40～80min。

4.如权利要求1所述的DNA荧光分析方法，其特征在于，步骤三中，所述的ZrOCl₂溶液的溶剂为60wt％乙醇，Zr⁴⁺的浓度为4mM，反应时间为20～40min。

5.如权利要求1所述的DNA荧光分析方法，其特征在于，步骤四中，所述的1-芘丁酸溶液的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，1-芘丁酸浓度为2mM，反应时间为20～40min。

6.如权利要求1所述的DNA荧光分析方法，其特征在于，步骤五中，所述的金丝桃素溶液的溶剂为二甲基亚砜，金丝桃素浓度为0.1～0.3mM，反应时间为10～80min。