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CN106636432A - 糯玉米淀粉峰值黏度主效qtl位点的分子标记及应用 - Google Patents

糯玉米淀粉峰值黏度主效qtl位点的分子标记及应用 Download PDF

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CN106636432A CN201710059366.XA CN201710059366A CN106636432A CN 106636432 A CN106636432 A CN 106636432A CN 201710059366 A CN201710059366 A CN 201710059366A CN 106636432 A CN106636432 A CN 106636432A
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Abstract

本发明提供一种糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记，其特异性检测玉米SNP位点PZE‑104141018和PZE‑104141424。较佳地，包括第一分子标记和第二分子标记，分别特异性检测玉米SNP位点PZE‑104141018和PZE‑104141424。更佳地，第一分子标记是第一CAPS分子标记，其包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一引物对，第二分子标记是第二CAPS分子标记，其包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的第二引物对。还包括相关应用。本发明的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记可以检测糯玉米淀粉峰值黏度的高低，从而可以对糯玉米的淀粉峰值黏度的高低进行有效选择，还可以用于淀粉高峰值黏度糯玉米的分子标记辅助育种，加速糯玉米优良品质育种的进程，且设计巧妙，检测简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。

Description

糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及玉米育种技术领域，特别涉及糯玉米淀粉分子标记技术领域，具体是指一种糯玉米淀粉峰值黏度(Peak Viscosity，PV)主效QTL位点的分子标记及应用。
背景技术
糯玉米含有丰富的营养成份，在中国和东南亚国家主要用作鲜食，因而品质是决定糯玉米经济价值高低的重要因素之一。淀粉黏度性状(RVA(rapid visco-analysis)黏度谱值，通过快速黏度分析仪测定)已被证明可广泛应用于评价谷类作物的籽粒品质，包括糯玉米。籽粒淀粉黏度性状中的峰值黏度、终值黏度、崩解值与糯玉米食味品质呈显著或极显著正相关，特别是峰值黏度对鲜食糯玉米的食味品质有重要的决定作用。淀粉黏度性状是经典的数量性状，由涉及许多淀粉相关基因的复杂遗传系统调节，同时还受到非遗传和环境因素的影响。由于这种数量遗传特性，糯玉米育种者很难通过常规方法有效地进行糯玉米籽粒品质的改良。
随着现代生物技术的发展，特别是分子生物学的发展，使剖析作物重要性状的多基因遗传行为成为可能，有利于推动传统的“经验育种”向高效的“精确分子育种”转变。利用玉米基因组学和生物信息学的最新研究成果，构建实用、经济、高效的分子育种技术体系，高效改良目标性状，已经成为现代育种的重要研究方向。
大量与淀粉RVA黏度谱相关的QTL研究已经在多种作物中有所报道，包括水稻(Bao等2000；Bao等2002；Hsu等2014；Xu等2015；Yacouba等2013；Yan等2014；Zhang等2013)，大麦(Wang等2010)和小麦(Liang等2009)。然而，目前尚无与糯玉米淀粉黏度特性遗传机制相关的研究报道。因此，开展糯玉米食味品质显著相关的淀粉峰值黏度的遗传基础研究，鉴定基因组中调控淀粉峰值黏度性状的主效QTL位点，挖掘优异等位变异，开发靶标分子标记，对于选育优质糯玉米品种具有极其重要的意义。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记，其可以检测糯玉米淀粉峰值黏度的高低，从而可以对糯玉米的淀粉峰值黏度的高低进行有效选择，还可以用于淀粉高峰值黏度糯玉米的分子标记辅助育种，加速糯玉米优良品质育种的进程，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记的应用，其可以用于检测糯玉米淀粉峰值黏度的高低，从而可以用于对糯玉米的淀粉峰值黏度的高低进行有效选择，还可以用于淀粉高峰值黏度糯玉米的分子标记辅助育种，加速糯玉米优良品质育种的进程，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记的应用，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供一种糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记，其特点是，所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记特异性检测玉米SNP位点PZE-104141018和玉米SNP位点PZE-104141424。
较佳地，所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记包括第一分子标记和第二分子标记，所述第一分子标记特异性检测所述玉米SNP位点PZE-104141018，所述第二分子标记特异性检测所述玉米SNP位点PZE-104141424。
更佳地，所述第一分子标记是第一CAPS分子标记，所述第一CAPS分子标记包括SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一引物对，所述第二分子标记是第二CAPS分子标记，所述第二CAPS分子标记包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的第二引物对。
在本发明的第二方面，提供了一种利用分子标记检测糯玉米淀粉峰值黏度高低的方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)提取待测糯玉米的基因组DNA；
(2)采用上述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记对所述基因组DNA进行检测；
(3)当检测到所述玉米SNP位点PZE-104141018为G且检测到所述玉米SNP位点PZE-104141424为A时，所述待测糯玉米为淀粉高峰值黏度糯玉米，否则，所述待测糯玉米为淀粉低峰值黏度糯玉米。
较佳地，在所述步骤(2)中，采用CAPS分子标记对所述基因组DNA进行检测的步骤具体包括：
(21)对所述基因组DNA采用所述第一引物对进行PCR扩增获得第一扩增产物，采用EaeI酶切所述第一扩增产物；
(22)对所述基因组DNA采用所述第二引物对进行PCR扩增获得第二扩增产物，采用HinfI酶切所述第二扩增产物，
在所述步骤(3)中，若所述第一扩增产物酶切得到196bp和65bp的产物则表明检测到所述玉米SNP位点PZE-104141018为G，若所述第二扩增产物酶切得到132bp和40bp的产物则表明检测到所述玉米SNP位点PZE-104141424为A。
在本发明的第三方面，提供了一种利用分子标记辅助淀粉高峰值黏度糯玉米育种的方法，其特点是，包括以下步骤：
(A)提取待测糯玉米的基因组DNA；
(B)采用上述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记对所述基因组DNA进行检测；
(C)当检测到所述玉米SNP位点PZE-104141018为G且检测到所述玉米SNP位点PZE-104141424为A时，所述待测糯玉米为淀粉高峰值黏度糯玉米，将所述淀粉高峰值黏度糯玉米应用于糯玉米品质育种。
较佳地，在所述步骤(B)中，采用CAPS分子标记对所述基因组DNA进行检测的步骤具体包括：
(B1)对所述基因组DNA采用所述第一引物对进行PCR扩增获得第一扩增产物，采用EaeI酶切所述第一扩增产物；
(B2)对所述基因组DNA采用所述第二引物对进行PCR扩增获得第二扩增产物，采用HinfI酶切所述第二扩增产物，
在所述步骤(C)中，若所述第一扩增产物酶切得到196bp和65bp的产物则表明检测到所述玉米SNP位点PZE-104141018为G，若所述第二扩增产物酶切得到132bp和40bp的产物则表明检测到所述玉米SNP位点PZE-104141424为A。
在本发明的第四方面，提供了上述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记在检测糯玉米淀粉峰值黏度的高低中的应用。
在本发明的第五方面，提供了上述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记在对糯玉米的淀粉峰值黏度的高低进行选择中的应用。
在本发明的第六方面，提供了上述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记在淀粉高峰值黏度糯玉米的分子标记辅助育种中的应用。
本发明的有益效果主要在于：
1、本发明的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记特异性检测玉米SNP位点PZE-104141018和玉米SNP位点PZE-104141424，当检测到玉米SNP位点PZE-104141018为G且检测到玉米SNP位点PZE-104141424为A时，待测糯玉米为淀粉高峰值黏度糯玉米，否则，为淀粉低峰值黏度糯玉米，因此，其可以检测糯玉米淀粉峰值黏度的高低，从而可以对糯玉米的淀粉峰值黏度的高低进行有效选择，还可以用于淀粉高峰值黏度糯玉米的分子标记辅助育种，加速糯玉米优良品质育种的进程，适于大规模推广应用。
2、本发明的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记特异性检测玉米SNP位点PZE-104141018和玉米SNP位点PZE-104141424，当检测到玉米SNP位点PZE-104141018为G且检测到玉米SNP位点PZE-104141424为A时，待测糯玉米为淀粉高峰值黏度糯玉米，否则，为淀粉低峰值黏度糯玉米，因此，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
3、本发明的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记的应用可以用于检测糯玉米淀粉峰值黏度的高低，从而可以用于对糯玉米的淀粉峰值黏度的高低进行有效选择，还可以用于淀粉高峰值黏度糯玉米的分子标记辅助育种，加速糯玉米优良品质育种的进程，适于大规模推广应用。
4、本发明的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记的应用可以用于检测糯玉米淀粉峰值黏度的高低，从而可以用于对糯玉米的淀粉峰值黏度的高低进行有效选择，还可以用于淀粉高峰值黏度糯玉米的分子标记辅助育种，加速糯玉米优良品质育种的进程，设计巧妙，检测简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明、附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。
附图说明
图1是本发明中利用RIL群体定位糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL qPV4-1的遗传图谱，其中，1为13PV，2为14PV，3为15PV。
图2为dCAPS标记PvdCAPS1在重组自交系中PCR扩增及酶切后的8％聚丙烯凝胶电泳图。
图3为dCAPS标记PvdCAPS2在重组自交系中PCR扩增及酶切后的8％聚丙烯凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示一种糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记，利用其可以有效地对糯玉米籽粒品质进行高效改良。
本发明的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记特异性检测玉米SNP位点PZE-104141018和玉米SNP位点PZE-104141424。
所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记可以是单个标记，可以同时检测玉米SNP位点PZE-104141018和玉米SNP位点PZE-104141424，也可以是两个标记，分别检测玉米SNP位点PZE-104141018和玉米SNP位点PZE-104141424，较佳地，所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记包括第一分子标记和第二分子标记，所述第一分子标记特异性检测所述玉米SNP位点PZE-104141018，所述第二分子标记特异性检测所述玉米SNP位点PZE-104141424。
所述第一分子标记可以是任何合适的分子标记，所述第二分子标记可以是任何合适的分子标记，更佳地，所述第一分子标记是第一CAPS分子标记，所述第一CAPS分子标记包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一引物对，所述第二分子标记是第二CAPS分子标记，所述第二CAPS分子标记包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的第二引物对。
本发明还提供了一种利用分子标记检测糯玉米淀粉峰值黏度高低的方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)提取待测糯玉米的基因组DNA；
(2)采用上述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记对所述基因组DNA进行检测；
(3)当检测到所述玉米SNP位点PZE-104141018为G且检测到所述玉米SNP位点PZE-104141424为A时，所述待测糯玉米为淀粉高峰值黏度糯玉米，否则，所述待测糯玉米为淀粉低峰值黏度糯玉米。
既然可以确定所述待测糯玉米是否为淀粉高峰值黏度糯玉米，则上述方法显然还可以用于对糯玉米的淀粉峰值黏度的高低进行选择。
在所述步骤(2)中，采用CAPS分子标记对所述基因组DNA进行检测的步骤具体包括：
(21)对所述基因组DNA采用所述第一引物对进行PCR扩增获得第一扩增产物，采用EaeI酶切所述第一扩增产物；
(22)对所述基因组DNA采用所述第二引物对进行PCR扩增获得第二扩增产物，采用HinfI酶切所述第二扩增产物，
在所述步骤(3)中，若所述第一扩增产物酶切得到196bp和65bp的产物则表明检测到所述玉米SNP位点PZE-104141018为G，若所述第二扩增产物酶切得到132bp和40bp的产物则表明检测到所述玉米SNP位点PZE-104141424为A。
本发明还提供了一种利用分子标记辅助淀粉高峰值黏度糯玉米育种的方法，其是在上述获得淀粉高峰值黏度糯玉米的情况下，将该淀粉高峰值黏度糯玉米应用于糯玉米品质育种。
本发明还提供了上述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记在检测糯玉米淀粉峰值黏度的高低中的应用。
本发明还提供了上述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记在对糯玉米的淀粉峰值黏度的高低进行选择中的应用。
本发明还提供了上述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记在淀粉高峰值黏度糯玉米的分子标记辅助育种中的应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点qPV4-1的定位
1.试验材料
通系5(母本，高淀粉峰值黏度)和衡白522(父本，低淀粉峰值黏度)两亲本杂交后采用单粒传法构建了包含198个家系的重组自交系(RIL)群体(由江苏沿江地区农业科学研究所提供)。
2.性状测定
供试RIL群体于2013-2015年在江苏南通进行田间试验，所有家系及两亲本的籽粒淀粉黏度性状采用澳大利亚Newport Scientific仪器公司生产的3-D型快速黏度分析仪(Rapid visco analyzer，RVA仪)进行测定。
3.基因分型与QTL定位
本发明利用包含56000个SNP标记的CGMB50KSNP芯片(由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司提供，http://cgmb.com.cn/)对所有家系及其两个亲本进行基因型分析，CGMB50KSNP芯片及群体基因分型由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司完成。
应用JoinMap 4.0软件构建遗传连锁图谱(参数设置为默认值)，获得包含2703个SNPs(bin markers)的糯玉米高密度遗传图谱，该图谱总图距1876.20cM，标记间平均距离为0.73cM。
基于全部家系的表现型(其中，13PV表示2013年淀粉峰值黏度，14PV表示2014年淀粉峰值黏度、15PV表示2015年淀粉峰值黏度)和基因型数据，采用QTLIcimapping软件的ICIM加性作图方法进行QTL定位(参数设置为默认值)。
QTL定位结果表明，在糯玉米第4染色体上检测到一个在所有环境中均能稳定表达的调控糯玉米峰值黏度的主效QTL位点，命名为qPV4-1(请参见图1)。该位点介于SNP标记PZE-104141018(http://www.maizegdb.org/data_center/locus/2802067)与SNP标记PZE-104141424(http://www.maizegdb.org/data_center/locus/2802070)之间(两个标记间遗传距离为0.198cM(～475.4kb)，qPV4-1与两标记间的遗传距离分别约为0.12cM和0.078cM)，可解释总表型变异11.82％-15.51％，其平均加性效应为221.8cP，增效基因来自母本自交系通系5。其中，PZE-104141018的等位变异为A/G，优异等位变异为G；PZE-104141424的等位变异为A/C，优异等位变异为A(表1)。
表1 198个RIL家系PZE-104141018和PZE-104141424等位基因型
Lines PZE-104141018 PZE-104141424 Lines PZE-104141018 PZE-104141424
NT-1 GG AA NT-41 AA CC
NT-2 AA CC NT-42 GG AA
NT-3 AA CC NT-43 GG AA
NT-4 GG AA NT-44 GG AA
NT-5 AA CC NT-45 AA CC
NT-6 AA CC NT-46 GG AA
NT-7 GG AA NT-47 AA CC
NT-8 GG AA NT-48 GG AA
NT-9 AA CC NT-49 AA CC
NT-10 GG CC NT-50 AA CC
NT-11 GG CC NT-51 AA CC
NT-12 AA CC NT-52 AA CC
NT-13 AA CC NT-53 AA CC
NT-14 AA CC NT-54 GG AA
NT-15 GG AA NT-55 GG AA
NT-16 AA CC NT-56 GG AA
NT-17 GG AA NT-57 AA CC
NT-18 GG AA NT-58 GG CC
NT-19 AA CC NT-59 GG AA
NT-20 GG AA NT-60 AA CC
NT-21 AA CC NT-61 GG AA
NT-22 GG CC NT-62 GG AA
NT-23 GG AA NT-63 AA CC
NT-24 AA CC NT-64 GG AA
NT-25 GG AA NT-65 GG AA
NT-26 AA CC NT-66 GG AA
NT-27 GG CC NT-67 GG CC
NT-28 GG AA NT-68 AA CC
NT-29 GG CC NT-69 AA CC
NT-30 GG AA NT-70 GG AA
NT-31 GG CC NT-71 AA CC
NT-32 GG AA NT-72 GG CC
NT-33 AA CC NT-73 GG AA
NT-34 AA CC NT-74 AA CC
NT-35 GG AA NT-75 AA CC
NT-36 GG AA NT-76 GG AA
NT-37 GG AA NT-77 AA CC
NT-38 AA CC NT-78 GG AA
NT-39 AA CC NT-79 GG AA
NT-40 AA CC NT-80 GG AA
(续表1)
Lines PZE-104141018 PZE-104141424 Lines PZE-104141018 PZE-104141424
NT-81 GG AA NT-121 GG AA
NT-82 AA CC NT-122 AA CC
NT-83 AA CC NT-123 AA CC
NT-84 GG CC NT-124 GG AA
NT-85 GG AA NT-125 AA CC
NT-86 AA CC NT-126 GG AA
NT-87 AA CC NT-127 GG AA
NT-88 AA CC NT-128 AA CC
NT-89 GG AA NT-129 AA CC
NT-90 GG AA NT-130 GG AA
NT-91 AA CC NT-131 AA CC
NT-92 AA CC NT-132 GG AA
NT-93 AA CC NT-133 AA CC
NT-94 AA CC NT-134 GG AA
NT-95 GG AA NT-135 GG AA
NT-96 GG AA NT-136 AA CC
NT-97 GG AA NT-137 GG AA
NT-98 GG AA NT-138 GG AA
NT-99 GG AA NT-139 GG AA
NT-100 AA CC NT-140 AA CC
NT-101 GG AA NT-141 GG CC
NT-102 GG AA NT-142 AA CC
NT-103 GG AA NT-143 GG AA
NT-104 GG AA NT-144 AA CC
NT-105 GG AA NT-145 GG AA
NT-106 GG AA NT-146 GG AA
NT-107 GG AA NT-147 GG AA
NT-108 AA CC NT-148 GG AA
NT-109 GG AA NT-149 AA CC
NT-110 AA CC NT-150 AA CC
NT-111 GG AA NT-151 AA CC
NT-112 AA CC NT-152 AA CC
NT-113 GG AA NT-153 GG AA
NT-114 AA CC NT-154 AA CC
NT-115 GG AA NT-155 AA CC
NT-116 AA CC NT-156 GG AA
NT-117 AA CC NT-157 AA CC
NT-118 GG AA NT-158 GG AA
NT-119 GG CC NT-159 GG CC
NT-120 GG AA NT-160 GG AA
(续表1)
Lines PZE-104141018 PZE-104141424 Lines PZE-104141018 PZE-104141424
NT-161 AA CC NT-180 GG AA
NT-162 AA CC NT-181 GG AA
NT-163 AA CC NT-182 AA CC
NT-164 GG AA NT-183 GG AA
NT-165 GG AA NT-184 GG AA
NT-166 GG AA NT-185 GG AA
NT-167 AA CC NT-186 AA CC
NT-168 AA CC NT-187 AA CC
NT-169 AA CC NT-188 AA CC
NT-170 GG AA NT-189 AA CC
NT-171 AA CC NT-190 AA CC
NT-172 GG AA NT-191 AA CC
NT-173 AA CC NT-192 GG AA
NT-174 GG AA NT-193 GG AA
NT-175 AA CC NT-194 AA CC
NT-176 AA CC NT-195 AA CC
NT-177 AA CC NT-196 GG AA
NT-178 AA CC NT-197 GG AA
NT-179 GG AA NT-198 AA CC
实施例2、基于糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点qPV4-1紧密连锁的SNP位点开发dCAPS标记
根据检测到的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点qPV4-1紧密连锁的SNP位点PZE-104141018和SNP位点PZE-104141424相关序列信息，从玉米基因组数据库(http://www.maizegdb.org)分别下载上述SNP位点两侧各延伸500bp的碱基序列，所得序列总长度1000bp左右。利用Primer 5.0软件设计PCR引物，要求扩增产物必须含有SNP位点的核苷酸，产物大小100-300bp。
然后根据PZE-104141018和PZE-104141424的ID序列信息，利用在线工具dCAPSFinder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)选择限制性内切酶。经过对所设计的PCR引物及选择的限制性内切酶进行PCR体系研究与优化、扩增及酶切产物测序验证后，获得两个理想的dCAPS标记，分别为PvdCAPS1和PvdCAPS2。
两标记PvdCAPS1和PvdCAPS2的引物对序列、限制性内切酶、PCR扩增产物及限制性酶切产物大小见表2。
表2两个dCAPS标记、引物、限制性内切酶及扩增片段信息
上述方法中，PCR扩增反应体系为25μL反应体系：10×Buffer 2.5μL；dNTP(10mM/mL)2μL；正反向引物(20μL)各0.5μL；Taq酶(5U/μL)0.2μL；DNA(200ng/μL)2.5μL；ddH2O16.8μL。
PCR反应程序：94℃5min，94℃30s，55℃40s，72℃40s；35个循环，72℃10min，4℃保存。
其中采用PvdCAPS1引物扩增的DNA片段长261bp，在该扩增片段序列197位点处存在A与G的单核苷酸多态性位点(AGCCC/GGCCC)，限制性内切酶EaeI可以识别GGCC；PCR扩增产物经EaeI酶切后，含G位点的DNA片段(SEQ ID NO:5)被酶切成196bp和65bp的两个片段，而含有A位点的DNA片段不能被EaeI酶切(图2)。
其中采用PvdCAPS2引物扩增的DNA片段长172bp，在该扩增片段序列133位点处存在A与C的单核苷酸多态性位点(ACTG/CCTG)，限制性内切酶HinfI可以识别ACTG；PCR扩增产物经HinfI酶切后，含A位点的DNA片段(SEQ ID NO:6)被酶切成132bp和40bp的两个片段，而含有C位点的DNA片段不能被HinfI酶切(图3)。
实施例3、利用dCAPS标记进行糯玉米淀粉峰值黏度选择应用
利用开发出的PvdCAPS1和PvdCAPS2的PCR引物对及对应的限制性内切酶对通系5×衡白522杂交后衍生的198份RIL家系(即实施例1的重组自交系(RIL)群体)进行PCR扩增与酶切反应。
图2和图3分别为PvdCAPS 1和PvdCAPS2在重组自交系中PCR扩增及酶切后的8％聚丙烯凝胶电泳图的部分截图。
198份RIL家系中，能被PvdCAPS 1和PvdCAPS2的引物对PCR，扩增产物能被对应的限制性内切酶EaeI和HinfI酶切，分别产生196bp、65bp和132bp、40bp DNA片段的家系有94个；能被PvdCAPS1和PvdCAPS2的引物对PCR，但扩增产物不能被EaeI和HinfI酶切的家系有91个；能被PvdCAPS1和PvdCAPS2的引物对PCR，并且扩增产物只能被EaeI酶切的家系有13个(表3)。
表3两个SNP位点的基因型对应的家系数及其淀粉峰值黏度评价
注：G和A分别为PZE-104141018和PZE-104141424优异等位变异。
结合各家系籽粒淀粉峰值黏度性状测定数据表明(表3)，同时能被EaeI和HinfI酶切(具有与糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点qPV4-1紧密连锁的SNP位点PZE-104141018和PZE-104141424的优异等变异G和A)的家系，其籽粒淀粉峰值黏度值较其他家系高，比不能被两种限制性内切酶酶切家系高出241.25cP(高15.5％)，比仅能被EaeI酶切的家系高158.04cP(高9.6％)。因此在育种中同时选择两个标记的优异等位变异，即利用PvdCAPS1标记引物PCR得到的扩增产物经EaeI酶切后得到196bp和65bp的DNA片段，并且利用PvdCAPS2标记引物PCR得到的扩增产物经HinfI酶切后得到132bp和40bp的DNA片段，则可显著提高淀粉峰值黏度，待测糯玉米种质为候选高峰值黏度的优质糯玉米。
该候选高峰值黏度的优质糯玉米可以进一步用于糯玉米品质育种。
因此，本发明通过QTL分析，在糯玉米第4号染色体上检测到一个淀粉峰值黏度主效QTL位点qPV4-1，可解释总表型变异11.82％～15.51％，其加性效应为221.8cP。该主效QTL位于SNP标记PZE-104141018、SNP标记PZE-104141424之间；根据上述两个与主效QTL位点紧密连锁的SNP标记开发的dCAPS标记PvdCAPS1和PvdCAPS2可以对糯玉米籽粒的淀粉峰值黏度进行有效选择，同时可用于糯玉米籽粒淀粉高峰值黏度的分子标记辅助育种，加速糯玉米优良品质育种的进程。
综上，本发明的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记可以检测糯玉米淀粉峰值黏度的高低，从而可以对糯玉米的淀粉峰值黏度的高低进行有效选择，还可以用于淀粉高峰值黏度糯玉米的分子标记辅助育种，加速糯玉米优良品质育种的进程，且设计巧妙，检测简便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。
序列表
<110> 江苏沿江地区农业科学研究所
<120> 糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记及应用
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 扩增玉米SNP位点PZE-104141018的上游引物
<400> 1
caaccagcag gaagattgaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 扩增玉米SNP位点PZE-104141018的下游引物
<400> 2
cagcctaacc gttaagcatt 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(25)
<223> 扩增玉米SNP位点PZE-104141424的上游引物
<400> 3
cctgtgtgta tggtagtcaa atcaa 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(25)
<223> 扩增玉米SNP位点PZE-104141424的下游引物
<400> 4
cccttaataa ttctcctgtt cgtag 25
<210> 5
<211> 261
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays L.）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(261)
<223> 采用PvdCAPS1的引物对扩增玉米的基因组DNA的扩增序列
<400> 5
caaccagcag gaagattgaa aattccaacg ttgcgcgatt tacgcaagaa aataagaaac 60
aacttatgtt tacagttgta ggcacgcatc cgctgatgcc ggcagaagac atctctgcca 120
aatcatctat ggttcgaggg tggtaaatgc accatatgac agtctatttg aagacgtggg 180
ttctaggtta taccgtggcc cagcagtgca tcaaccaaag taaagctatt taaatccata 240
taatgcttaa cggttaggct g 261
<210> 6
<211> 172
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays L.）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(172)
<223> 采用PvdCAPS2的引物对扩增玉米的基因组DNA的扩增序列
<400> 6
cctgtgtgta tggtagtcaa atcaagcgct tgactgtgca caggtagcta tgctacgggt 60
gccaccactt tgtgagggcc tagatcatta gcattttgat atgatgcagc gtgtcacctt 120
tgtctgctaa tgactgtcgc tgacacccta cgaacaggag aattattaag gg 172

Claims (10)

1.一种糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记，其特征在于，所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记特异性检测玉米SNP位点PZE-104141018和玉米SNP位点PZE-104141424。
2.如权利要求1所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记，其特征在于，所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记包括第一分子标记和第二分子标记，所述第一分子标记特异性检测所述玉米SNP位点PZE-104141018，所述第二分子标记特异性检测所述玉米SNP位点PZE-104141424。
3.如权利要求2所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记，其特征在于，所述第一分子标记是第一CAPS分子标记，所述第一CAPS分子标记包括SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的第一引物对，所述第二分子标记是第二CAPS分子标记，所述第二CAPS分子标记包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的第二引物对。
4.一种利用分子标记检测糯玉米淀粉峰值黏度高低的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测糯玉米的基因组DNA；
(2)采用根据权利要求1至权利要求3任一项所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记对所述基因组DNA进行检测；
(3)当检测到所述玉米SNP位点PZE-104141018为G且检测到所述玉米SNP位点PZE-104141424为A时，所述待测糯玉米为淀粉高峰值黏度糯玉米，否则，所述待测糯玉米为淀粉低峰值黏度糯玉米。
5.如权利要求4所述的利用分子标记检测糯玉米淀粉峰值黏度高低的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，采用根据权利要求3所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记对所述基因组DNA进行检测的步骤具体包括：
(21)对所述基因组DNA采用所述第一引物对进行PCR扩增获得第一扩增产物，采用EaeI酶切所述第一扩增产物；
(22)对所述基因组DNA采用所述第二引物对进行PCR扩增获得第二扩增产物，采用HinfI酶切所述第二扩增产物，
在所述步骤(3)中，若所述第一扩增产物酶切得到196bp和65bp的产物则表明检测到所述玉米SNP位点PZE-104141018为G，若所述第二扩增产物酶切得到132bp和40bp的产物则表明检测到所述玉米SNP位点PZE-104141424为A。
6.一种利用分子标记辅助淀粉高峰值黏度糯玉米育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)提取待测糯玉米的基因组DNA；
(B)采用根据权利要求1至权利要求3任一项所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记对所述基因组DNA进行检测；
(C)当检测到所述玉米SNP位点PZE-104141018为G且检测到所述玉米SNP位点PZE-104141424为A时，所述待测糯玉米为淀粉高峰值黏度糯玉米，将所述淀粉高峰值黏度糯玉米应用于糯玉米品质育种。
7.如权利要求6所述的利用分子标记辅助淀粉高峰值黏度糯玉米育种的方法，其特征在于，在所述步骤(B)中，采用根据权利要求3所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记对所述基因组DNA进行检测的步骤具体包括：
(B1)对所述基因组DNA采用所述第一引物对进行PCR扩增获得第一扩增产物，采用EaeI酶切所述第一扩增产物；
(B2)对所述基因组DNA采用所述第二引物对进行PCR扩增获得第二扩增产物，采用HinfI酶切所述第二扩增产物，
在所述步骤(C)中，若所述第一扩增产物酶切得到196bp和65bp的产物则表明检测到所述玉米SNP位点PZE-104141018为G，若所述第二扩增产物酶切得到132bp和40bp的产物则表明检测到所述玉米SNP位点PZE-104141424为A。
8.根据权利要求1至权利要求3任一项所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记在检测糯玉米淀粉峰值黏度的高低中的应用。
9.根据权利要求1至权利要求3任一项所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记在对糯玉米的淀粉峰值黏度的高低进行选择中的应用。
10.根据权利要求1至权利要求3任一项所述的糯玉米淀粉峰值黏度主效QTL位点的分子标记在淀粉高峰值黏度糯玉米的分子标记辅助育种中的应用。
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