CN106617227B - 一种制备β-胡萝卜素微胶囊的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用环糊精葡萄糖基转移酶即CGTase催化淀粉的产物制备β‑胡萝卜素微胶囊的方法，将菌株嗜碱芽孢杆菌Alkalophilic Bacillus sp.G‑825‑6的γ‑CGTase用于催化淀粉，催化条件优选为淀粉浓度4％，加酶量4U/g，50℃反应24h，催化后的产物直接用于包埋β‑胡萝卜素，包埋条件为主客体的质量比为4:1，反应温度50℃，反应时间3h。在最佳包埋条件下对β‑胡萝卜素的包埋率为51％，与文献报道的β‑环糊精包埋效果相当，本发明的方法简便易行，CGTase修饰产物的水溶性是β‑环糊精的二十多倍，对β‑胡萝卜素增溶倍数高，适用范围更加广泛，生产成本大大降低。
Description
技术领域
本发明属于微胶囊制备的技术领域，具体涉及一种通过γ-CGTase催化淀粉产物用作壁材制备β-胡萝卜素微胶囊的方法。
背景技术
据报道环糊精因具有环内疏水、环外亲水的性质，能够对疏水性物质发生包埋而起到稳定作用，作为一种良好的壁材越来越广泛地应用于微胶囊的技术领域。环糊精多来源于淀粉的酶解，即通过环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)，将淀粉转化为环糊精，目前大多数的CGTase作用淀粉生成的产物均为α、β、γ三种环糊精的混合物。但CGTase催化淀粉的效率通常不高，一般小于50％，即50％的非环状成分作为副产物在反应后期被分离出去，这不仅造成了原料利用率低，而且剩余的副产物很难被直接再利用，从而进一步加大了环糊精的成本，严重地限制了环糊精行业的发展。仅有少量报道利用环糊精复合物作为包埋主体发挥了较好的包埋作用。
现已发现，来自于菌株AlkalophilicBacillus sp.G-825-6的γ-CGTase能够催化淀粉产生β-CD及γ-CD，不产生α-CD，且β-CD与γ-CD的比例为1:1左右。然而，目前没有关于来自嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.G-825-6菌株的γ-CGTase修饰淀粉产物直接利用的相关报道，也没有利用环糊精葡萄糖基转移酶催化淀粉的产物不经过分离、纯化直接用于微胶囊的包埋的相关报道。综上，如何进一步简化生产工艺、降低生产成本、实现资源的充分利用成为本领域急需解决的一大难题。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明人提供了一种通过CGTase催化淀粉产物用作壁材制备β-胡萝卜素微胶囊的方法。
具体技术方案如下所述：
本发明提供了一种制备β-胡萝卜素微胶囊的方法，利用γ-环糊精葡萄糖基转移酶即γ-CGTase对淀粉底物进行催化反应，将催化后的所有产物直接用于β-胡萝卜素的包埋反应，反应结束后进行冷冻干燥，从而制备得到β-胡萝卜素微胶囊；
其中，γ-CGTase来自于嗜碱芽孢杆菌Alkalophilic Bacillus sp.G-825-6菌株，所述淀粉为木薯淀粉、土豆淀粉或者玉米淀粉；
上述催化反应的具体步骤如下：取淀粉作为底物，加入去离子水加热糊化，制成浓度为1％-4％(w/v)的溶液，冷却到室温，取1mL底物加入2-8U/g的γ-CGTase恒温反应，反应结束后采用沸水浴进行灭酶处理，离心，取上清液进行冷冻干燥；
优选地，上述淀粉溶液的浓度为4％，加酶量为4U/g；
优选地，所述恒温反应的时间为23-25h，沸水浴处理的时间为10-12min，更优选地，恒温反应置于恒温震荡混匀器上进行；
优选地，所述离心的条件是转速为5000-5200rpm，时间为10-12min。
优选地，冷冻干燥是在冷冻干燥机中干燥48h，然后收集样品稍研磨，保存于4℃的环境中，例如存于自封袋中在4℃的冰箱中保存；优选地，所述的包埋反应是按照质量比为1:1-4:1称取催化反应后的酶解产物与β-胡萝卜素，以酶解产物作为壁材，以β-胡萝卜素作为芯材，加水溶解使固形物含量为24-26％，充氮气保护，超声处理，混匀后反应，反应结束后冷却，冷冻干燥得到微胶囊。
优选地，所述超声处理的条件为200-230W超声8-12min。
优选地，混匀后反应的条件是在45-55℃下反应1-5h，较优选地，反应时间为3h，更优选地，混匀是置于震荡混匀器中进行，转速为800rpm。
本发明有益的技术效果在于：
现有技术中在进行微胶囊制备的工艺过程中，通常会选择环糊精或者淀粉，没有任何使用酶催化产物的操作步骤；本发明所提供的制备β-胡萝卜素微胶囊的方法打破传统思维，使CGTase催化淀粉后的所有产物不经过分离纯化、直接用于包埋，因此利用率接近100％。
本发明利用特殊菌株产的酶即Alkalophilic Bacillus sp.G-825-6菌株的γ-CGTase催化淀粉，酶解后的产物为β-CD、γ-CD与非环状成分的混合物，其中γ-CD的产率约为20％左右，其余非环状成分主要为分子量约105的糊精。淀粉经酶催化后转化成环糊精和糊精，这两种物质都有包埋效果，但在单独使用时，糊精由于链长太短无法完全形成包合物，故包埋效果不好；而环糊精中β-CD的水溶性太差，不能满足产品性能要求，γ-CD分离纯化步骤难，从而导致包埋成本太高。采用本发明所提供的方法省去了γ-CD分离纯化的步骤，综合了环糊精和糊精两者共同的优势，能够降低环糊精的生产成本，同时发挥环糊精的包埋作用，用该方法制备的β-胡萝卜素微胶囊成本低，微胶囊化效果与β-CD相当，微胶囊化成本低，微胶囊产品的水溶性更好。
附图说明
图1为实施例1中γ-CGTase催化淀粉产物分子量测定的凝胶色谱图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施方式，对本发明的技术方案进一步具体的描述。
实施例1
(1)取木薯淀粉做为底物，加入去离子水加热糊化，制成浓度为1％(w/v)的溶液，冷却到室温，取1mL底物加入2U/g CGTase，置于恒温震荡混匀器上反应24h，结束后沸水浴灭酶10min。然后5000r/min离心10min，放入冷冻干燥机中干燥48h，样品收集后，稍研磨存于自封袋中4℃冰箱保存。
(2)按照质量比为1:1称量酶解产物、β-胡萝卜素，然后加入水溶解，使固形物含量为25％，充氮气保护，200W超声10min，置于震荡混匀器中800r/min，50℃反应1h后冷却，冷冻干燥后得到微胶囊。
步骤(1)中CGTase催化淀粉产物后采用凝胶色谱的方法测定分子量，具体结果如图1所示；经分析计算得知产物重均分子量为4.9×105Da，即催化后的产物除了γ-CD主要是糊精。
图1为γ-CGTase催化淀粉产物分子量测定的凝胶色谱图，其测定的具体条件为：取样品配制1mg/mL的溶液，用0.45μm的膜过滤器(水系统)过滤，然后采用HPSEC-MALLS-RI系统分析分子量，流动相为溶解0.02％NaN3溶液的0.3M的硝酸钠溶液，保持在50℃下以0.5毫升/分钟的流速。测定结果使用ASTRA软件(version 5.3.4，Wyatt Technology，SantaBarbara，CA，USA)来计算样品的重均分子量(Mw)。
实施例2
(1)取木薯淀粉做为底物，加入去离子水加热糊化，制成浓度为2％(w/v)的溶液，冷却到室温，取1mL底物加入8U/g CGTase，置于恒温震荡混匀器上反应24h，结束后沸水浴灭酶10min。然后5000r/min离心10min，放入冷冻干燥机中干燥48h，样品收集后，稍研磨存于自封袋中4℃冰箱保存。
(2)按照质量比为2:1称量酶解产物、β-胡萝卜素，然后加入水溶解，使固形物含量为25％，充氮气保护，200W超声10min，置于震荡混匀器中800r/min，50℃反应5h后冷却，冷冻干燥后得到微胶囊。
实施例3
(1)取木薯淀粉做为底物，加入去离子水加热糊化，制成浓度为4％(w/v)的溶液，冷却到室温，取1mL底物加入4U/g CGTase，置于恒温震荡混匀器上反应24h，结束后沸水浴灭酶10min。然后5000r/min离心10min，放入冷冻干燥机中干燥48h，样品收集后，稍研磨存于自封袋中4℃冰箱保存。
(2)按照质量比为4:1称量酶解产物、β-胡萝卜素，然后加入水溶解，使固形物含量为25％，充氮气保护，200W超声10min，置于震荡混匀器中800r/min，50℃反应3h后冷却，冷冻干燥后得到微胶囊。
对上述实施例1-3步骤(1)中制备获得的酶解产物进行溶解度的测定，并对步骤(2)中制备获得的微胶囊产品进行包埋率的测定，具体测定方法与结果分析如下所示：
1、溶解度的测定
参照中国药典原料药溶解度的测定方法进行溶解度的测定。
2、包埋率的测定
包合物中的β-胡萝卜素量＝产品中β-胡萝卜素总量-产品表面β-胡萝卜素量
产品中β-胡萝卜素总量的测定：称取0.02g包埋产物用少量水溶解，加入丙酮：石油醚(1:1)溶液200W超声10min，使胡萝卜素转移至有机相中，用无水硫酸钠脱水离心，然后定容，至330nm测定吸光值。
产品表面β-胡萝卜素量的测定：称取0.02g包埋产物加入5mL左右正己烷，震荡1min左右离心取上清液，重复洗涤2-3次至上层清液变为淡黄色或无色，然后将上层清液合并，用氮气吹干，将β-胡萝卜素复溶于丙酮：石油醚(1:1)溶液中，定容测定吸光值。
测定结果如表1所示，其中对照例选择β-环糊精为壁材进行微胶囊的包埋，测定了β-环糊精的溶解度以及β-胡萝卜素微胶囊的包埋率，对照例的具体实验方法和结果测定参见参考文献：陈发河，吴光斌，陈志辉.天然胡萝卜素β-环糊精微胶囊制备工艺的研究[J].中国食品学报，2006，6(1)：110-115。
表1壁材的溶解度与微胶囊包埋率的测定结果
| 工艺方法 | 溶解度(单位：g/100ml) | 包埋率(单位：％) |
| 实施例1 | 27 | 47.63 |
| 实施例2 | 27 | 50.08 |
| 实施例3 | 28 | 51.15 |
| 对照例 | 1.89 | 43.40 |
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种制备β-胡萝卜素微胶囊的方法，其特征在于，利用γ-环糊精葡萄糖基转移酶即γ-CGTase对淀粉底物进行催化反应，将催化后的所有产物直接用于β-胡萝卜素的包埋反应，反应结束后进行冷冻干燥，从而制备得到β-胡萝卜素微胶囊；
所述γ-CGTase来自于菌株Alkalophilic Bacillus sp.G-825-6；
所述催化反应的具体步骤如下：取淀粉作为底物，加入去离子水加热糊化，制成质量体积比的浓度为1％-4％的溶液，冷却到室温，取1mL底物加入2-8U/g的γ-CGTase恒温反应，反应结束后采用沸水浴进行灭酶处理；离心，取上清液进行冷冻干燥；
所述的包埋反应是按照质量比为1:1-4:1称取催化反应后的酶解产物与β-胡萝卜素，以酶解产物作为壁材，以β-胡萝卜素作为芯材，加水溶解使固形物含量为24-26％，充氮气保护，超声处理，混匀后反应，反应结束后冷却，冷冻干燥得到微胶囊。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述淀粉为木薯淀粉、土豆淀粉或者玉米淀粉。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述恒温反应的时间为23-25h，沸水浴处理的时间为10-12min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离心的条件是转速为5000-5200rpm，时间为10-12min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，冷冻干燥之后的样品收集之后进行研磨，然后保存于4℃的环境中。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理的条件为200-230W超声8-12min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，混匀后反应的条件是在45-55℃下反应1-5h。
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