CN106596692B - 一种弯曲毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分析领域，涉及一种利用弯曲毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法。将毛细管电泳所用的毛细管分别弯曲成不同个数的半圆，固定后，先进样荧光染料标记的多肽，间隔5‑20s后进样抗体，一定时间后，抗体追赶上多肽，并在弯曲毛细管内充分混合，经荧光光谱仪检测复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度。上述技术方案操作简单，可重复性高，建立了一种新的高灵敏抗体多肽相互作用检测技术。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析领域，具体涉及一种弯曲利用毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法。
背景技术
FLAG多肽被广泛用作融合标签来纯化和检测重组蛋白，单克隆anti-FLAG M2抗体能够特异性识别FLAG多肽，所以可以通过免疫印迹，免疫沉淀和免疫组织化学等方法高灵敏检测FLAG融合蛋白。
研究抗原抗体相互作用的常用方法有表面等离子共振、酶联免疫吸附试验、等温量热法和高性能尺寸排阻色谱法等。这些方法操作较繁琐，耗费的样品多，而且不能达到较好的分离效果。
电泳是电介质中带电粒子在电场作用下以不同速度向电荷极性相反的电极方向迁移的现象，利用这种现象对化学或生物样品组分进行分离分析的技术称为电泳技术。毛细管电泳技术是20世纪80年代中后期发展起来的一种分离分析技术。毛细管电泳优势很多：设备简单，分析快速，样品微量，现已发展成为一种有效的分离手段，被广泛应用于生物、环境、制药、毒理学、临床、食品分析等领域。毛细管电泳与荧光检测相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管电泳的应用。利用毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法，克服了已有方法存在的缺陷，但这种方法同时存在精确性不高及稳定性不好的缺点。
发明内容
本发明的目的：针对目前研究抗原抗体相互作用方法存在精确性不高、稳定性不好等问题，本发明提供了一种利用弯曲毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法，研究了毛细管弯曲程度对抗体多肽相互作用的影响。
本发明的技术方案：所用的弯曲毛细管为石英毛细管，先进样荧光染料标记的多肽，间隔5-20s后进样抗体，经荧光光谱仪检测抗体多肽复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度。
作为优选，所述的弯曲毛细管的内径为75μm，外径为365μm，弯曲的半圆个数为1-4个，弯曲的直径为2-5cm。
作为优选，所述的弯曲毛细管为180°等宽圆弧弯曲毛细管。
作为优选，所述的荧光染料标记的多肽进样时间为5-40s，所述的抗体进样时间为5-40s，所述的抗体进样间隔为10s，其中间隔为多肽完全进样后再进样抗体的时间间隔。
作为优选，所述的荧光染料为FAM、TAMRA、Cy5中的一种。
作为优选，所述的多肽序列为DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。
作为优选，所述的抗体为anti-FLAG M2。
本发明的技术效果：目前对弯曲毛细管电泳的研究很少，一篇论文(陈国强.弯曲微通道中样品电泳输送特性的研究【D】.大连：大连理工大学，2005:1-1)研究的是微流控电泳芯片分析技术，但其设计复杂，操作繁琐。其中提到的弯曲微通道的宽度为80μm，收缩比为31％，以避免“弯曲效应”对分离造成的不利影响。本发明使用的毛细管为宽度75μm的180°等宽圆弧弯曲毛细管，最大限度地发挥了弯曲毛细管的“弯曲效应”，以提高多肽和抗体的混合程度。在狭小的毛细管内，分子的布朗运动表现明显，特别是在完全弯曲毛细管的拐角处，由于在高压作用下，多肽和抗体处于高速运动，特别是达到拐角处发生碰撞，分子的无规则运动尤为突出，达到了分子级别的融合，这样形成的多肽和抗体复合物混合充分、相态均一；另外，弯曲毛细管增加了多肽和抗体在毛细管中停留的时间，有利于提高多肽和抗体之间的相互作用，因此检测的结果稳定性更好，精确性和灵敏度更高，操作简单，进一步拓展了毛细管电泳在生物分析领域的应用。
附图说明
图1：FAM-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK(以下简称FAM-DYKD)与M2抗体在毛细管内相互作用的示意图。
图2：FAM-DYKD与M2抗体在毛细管内相互作用的电泳图。其中：A是直毛细管；B是弯曲1个半圆；C是弯曲2个半圆；D是弯曲4个半圆。a是FAM-DYKD；b是FAM-DYKD:M2＝1:2；c是FAM-DYKD:M2＝1:4；d是FAM-DYKD:M2＝1:8。M2抗体浓度是4μm，激发光源λex＝480nm。FAM-DYKD和M2的比例均为摩尔比。
具体实施方式
本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。
实施例1
本发明所述的方法采用常规的固相Fmoc法，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸。
1、基本材料：
(1)树脂与连接分子：固相Fmoc法选择的树脂为Rink树脂。这种树脂具有非常好的溶胀性，可以使肽链之间更好地进行缩合反应，且有足够的网络空间满足不断增长的肽链。采用HBTU和HOBt作为连接分子，将多肽分子固定到树脂上。
(2)单体：合成所用单体为经化学修饰的α-氨基酸。
2、反应步骤：
第一步，将第一个氨基酸共价连接到树脂上
加入适当的缩合剂如HBTU和HOBt，使被保护氨基酸羧基端与树脂形成共脂以完成氨基酸的固定；
第二步，去保护
采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。
第三步，激活和交联
采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基，与树脂上的氨基交联，形成肽键。
第四步，重复第二步和第三步，反复循环添加单体氨基酸，按照FAM-DYKD序列的顺序从右到左合成，直到合成完成。
第五步，染料标记
采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。EDC/FAM/DIEA/HOBT按比例溶于DMF，加入树脂中避光过夜反应。
3、合成后处理：
(1)洗脱和脱保护：用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从树脂上洗脱下来，并脱除保护基。
(2)HPLC分析纯化，冻干保存。
通过上述方法，合成多肽序列FAM-DYKD。
4、M2抗体和FAM-DYKD在毛细管内相互作用研究：
分别在直毛细管以及毛细管弯曲成1、2或4个直径3cm的半圆情况下，在毛细管内，先进样FAM-DYKD20s，间隔10s，再进样M2抗体20s。实验发现357s处出现一个新峰，且随着多肽/抗体比例的减小，新峰面积逐渐增大。由此，可以推断出此新峰是FAM-DYKD-M2复合物的峰。而且在相同的多肽/抗体比例下，随着半圆个数的增加，复合物形成的比例也在增加。
测试条件：
FAM-DYKD与M2的相互作用过程利用荧光毛细管电泳检测，电泳条件：25mM硼酸缓冲液(pH 9.3)，电压为20kV。
实施例2
将FAM-DYKD用四甲基罗丹明(TAMRA)标记，其他步骤同实施例1。
实施例3
将FAM-DYKD用近红外菁类染料(Cy5)标记，其他步骤同实施例1。
按照实施例1的方法将实施例2～3得到的多肽序列分别与M2抗体用毛细管电泳分析，检测条件与实施例1相同。
通过上述三个实施例、复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度(图2)可以看出：在半圆个数一定的情况下，改变多肽/抗体比例，在357s处出现新峰，为FAM-DYKD-M2复合物峰，面积较直管毛细管均增加了，说明FAM-DYKD-M2复合物含量增加。由此说明弯曲毛细管有利于FAM-DYKD多肽和M2抗体之间的混合，提高了FAM-DYKD-M2复合物的含量，进而提高了检测的稳定性和精确度。
Claims (7)
1.一种弯曲毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法，其特征在于，所述的弯曲毛细管为石英毛细管，先进样荧光染料标记的多肽，间隔5-20s后进样抗体，经荧光光谱仪检测抗体多肽复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度；所述弯曲毛细管为直毛细管，且在直毛细管中部形成有至少一个弯曲的半圆，当半圆个数超过2个时，半圆连续设置且相邻2个半圆的圆弧开口方向相反。
2.如权利要求1 所述的弯曲毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法，其特征在于，所述的弯曲毛细管的内径为75μm，外径为365μm，弯曲的半圆个数为1-4个，弯曲的直径为2-5cm。
3.如权利要求1 所述的弯曲毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法，其特征在于，所述的弯曲毛细管为180°等宽圆弧弯曲毛细管。
4.如权利要求1 所述的弯曲毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法，其特征在于，所述多肽的进样时间为5-40s，所述抗体的进样时间为5-40s，所述的抗体进样间隔为10s。
5.如权利要求1 所述的弯曲毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法，其特征在于，所述的荧光染料为FAM、TAMRA、Cy5 中的一种。
6.如权利要求1 所述的弯曲毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法，其特征在于，所述的多肽序列为DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。
7.如权利要求1 所述的弯曲毛细管电泳检测抗体多肽相互作用的方法，其特征在于，所述的抗体为anti-FLAG M2。
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