CN106589085B

CN106589085B - 一种植物淀粉合成相关蛋白OsFLO8及其编码基因与应用

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Publication number: CN106589085B
Application number: CN201611014137.8A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 张文伟; 尤小满; 蔡跃; 江玲; 王益华; 刘世家; 刘喜; 田云录; 陈亮明; 赵志刚; 刘裕强
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2036-11-18
Also published as: CN106589085A

Abstract

本发明涉及一种植物淀粉合成相关蛋白OsFLO8及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与淀粉合成相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。本发明的植物淀粉合成相关蛋白影响植物胚乳中淀粉的合成。将所述蛋白的编码基因导入淀粉合成异常的植物中，可以培育淀粉合成正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种植物淀粉合成相关蛋白OsFLO8及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物淀粉合成相关蛋白OsFLO8及其编码基因与应用。

背景技术

在植物中，淀粉是主要的储能物质，其合成途径中的许多合成酶和调控因子都已经被很好地鉴定和研究。淀粉是稻米籽粒最主要的组成成分，其含量和特性直接影响稻米的各项品质指标及最终适口性，同时淀粉的积累水平还可能影响水稻的产量，因此，深入研究水稻这一单子叶模式植物淀粉合成途径中的关键因子及调控网络具有重要的理论意义与应用价值。

水稻胚乳水不溶的淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成。支链淀粉占75％以上，它由分支的α-1,6糖苷键连接，而占少量的直链淀粉线性的α-1,4糖苷键连接。植物中大量参与淀粉合成的关键酶已经被研究。直链淀粉由颗粒结合型淀粉合酶I(GBSSI)合成，它由Waxy基因编码。支链淀粉的合成由淀粉合酶(SSs)，淀粉分支酶(BEs)和淀粉去分支酶(DBEs)。植物中SSs，BEs，DBEs存在多种异构体SSI-IV，BEI-II，DBE1-3和DBE。在水稻中这些基因的突变，都会是胚乳淀粉表现异常特征。BEIIb突变表现心白胚乳，支链淀粉结构，淀粉颗粒的糊化特性都发生改变。ALK编码一个预测为可溶淀粉合酶IIa的基因，SSIIa关键氨基酸的改变导致籼稻和粳稻支链淀粉结构和淀粉特性的差异。

除了合成酶之外，水稻中一些其它因子间接地参与淀粉的合成。参与内质网中蛋白成熟的类二硫键异构酶(PDIL-1)基因功能丧失同样影响淀粉的合成，突变体表现粉质胚乳和淀粉颗粒变小。MADS29是水稻MADS-BOX家族的成员，参与降解珠心和珠心突起。抑制MADS29的表达减少淀粉的合成和形成异常的胚乳。因此发现并克隆淀粉合成和调控相关基因，将有助于我们通过基因工程的手段来对稻米进行改良。

发明内容

本发明的目的是提供一种淀粉合成相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的淀粉合成相关蛋白(OsFLO8)，来源于稻属水稻(Oryza sativavar.W017)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与淀粉合成相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.1由350个氨基酸残基组成，氨基端29-149和161-276为Glyoxalase家族结构域。

为了使(a)中的OsFLO8便于纯化和研究在水稻细胞的亚细胞位置，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如SEQ ID NO.8所示的MBP标签和SEQ ID NO.9所示的GFP标签。

上述(b)中的OsFLO8可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsFLO8的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述淀粉合成相关蛋白的基因(OsFLO8)也属于本发明的保护范围。

所述基因OSFSE可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码调控淀粉合成相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

SEQ ID NO.2由1053个核苷酸组成，为OsFLO8的CDS。

SEQ ID NO.3由5990个核苷酸组成，为OsFLO8的DNA序列。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为在pCUBi1390载体的多克隆位点KpnI和BamHI之间重组插入所述基因(OsFLO8)得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCUBi1390–OsFLO8；所述pCUBi1390-OsFLO8是由OsFLO8基因组编码序列通过重组技术插入到pCUBi1390多克隆位点HindIII和BamHI之间得到的(Clontech公司，Infusion重组试剂盒)。

将含有OsFLO8的pCUBi1390命名为pCUBi1390-OsFLO8。

含有以上任一所述基因(OsFLO8)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(OsFLO8)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育淀粉合成正常的转基因植物的方法。

本发明提供的培育淀粉合成正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入淀粉合成异常的植物中，得到淀粉合成正常的转基因植物；所述淀粉合成异常植物为胚乳表现为粉质表型的植物；所述淀粉合成正常的转基因植物为胚乳表现透明非粉质的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入淀粉合成异常植物中；所述淀粉合成异常植物可为flo8-2。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

有益效果：

本发明的淀粉合成相关蛋白影响水稻胚乳中谷淀粉合成的过程。将所述蛋白的编码基因导入淀粉合成异常的粉质胚乳植物中，可以得到胚乳透明非粉质的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1为野生型W017和突变体flo8-2的籽粒表型。A图为W017成熟种子整体和横断面的扫描图；B图为flo8-2成熟种子整体和横断面的扫描图.

图2为野生型W017和突变体flo8-2的籽粒扫描电镜观察。

图3为野生型W017和突变体flo8-2胚乳半薄切片观察。

图4为野生型W017和突变体flo8-2灌浆速率及千粒重对比。

图5为野生型W017和突变体flo8-2理化性质比较。

图6为突变基因在第5染色体上的精细定位。

图7为转pCUBi1390-OsFLO8的T₀代植株的T₁籽粒表型。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、植物淀粉合成相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻淀粉合成突变体flo8-2表型分析及其遗传分析

粳稻品种W017经MNU诱变突变体库中筛选出种子粉质不透明突变体flo8-2。

图1A图为W017成熟种子整体和横断面的扫描图，表现为胚乳完全透明的表型，B图为flo8-2成熟种子整体和横断面的扫描图，表现为胚乳心白的表型。

图2为W017和flo8-2扫描电镜分析图。越光的成熟种子扫描电镜表现为淀粉颗粒排列紧密，大小均一，而flo8-2中淀粉颗粒排列松散，使得颗粒之间存在间隙。因此在光线通过时会发生散射，导致flo8-2籽粒外观呈现不透明表型。

利用半薄切片后的I₂-KI染色来观察W017和flo8-2复合淀粉颗粒的形态(图3)。在野生型越光胚乳里层细胞中，每个造粉体内部产生多个独立存在的淀粉颗粒，这是水稻典型的复合淀粉颗粒结构，淀粉颗粒排列紧密(图3)。进一步观察突变体flo8-2，发现其胚乳里层细胞的胞质中，存在许多小的、零散分布的单粒淀粉颗粒，而且淀粉颗粒之间排列不紧密，会有空泡，并且淀粉颗粒差生异常融合，表明突变体中淀粉发育不正常，而且较野生型相比滞后。(图3)。

在整个种子发育过程中，flo8-2突变体的灌浆速率明显低于野生型(图4)。从开花后5天开始，突变体的干物质积累开始显著低于野生型，并且这个差异一直维持到灌浆结束。与灌浆速率明显降低相对应的结果是，成熟的flo8-2突变体种子千粒重明显低于W017(图4)。

flo8-2突变体的种子具有较低含量的脂肪，同时淀粉含量较野生型显著降低(图6)。相应地，直链淀粉含量显著降低(图5)。

二、突变基因定位

1、突变基因初步定位

用突变体flo8-2与南京11杂交，在flo8-2/南京11的F₂分离群体中随机选取籽粒粉质的种子，发芽后，分别将各株的叶片等量混合后提取DNA。首先，用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物在W017和南京11之间进行多态性分析，之后每间隔10cM挑选一对在两个亲本间有多态的引物。两个亲本DNA连同群体DNA共计三个DNA样本，利用挑选好的覆盖12条染色体的且具有多态的引物进行分析，最后将淀粉合成关键基因OsFLO8定位在第5染色体SSR标记J5-19和N5-18之间。

上述SSR标记分析的方法如下所述：

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。

②加入660μl提取液(含100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/mlCTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。

③加入40μl 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μl 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μl 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μl 1×TE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μl电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Bechman InstrumentInc.U.S.A)。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μl，作为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(10μl)：DNA(20ng/ul)1ul，上游引物(2pmol/ul)1ul，下游引物(2pmol/ul)1ul，10xBuffer(MgCl₂free)1ul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl₂(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)0.1ul，ddH₂O 5.1ul，共10ul。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。

(3)SSR标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

2、突变基因精细定位

根据初步定位的结果，在突变位点所在区域间隔一定区段自行开发SSR标记，以便在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体位点。从W017/南京11杂交组合获得的F₂分离群体中挑出确认为突变表型的F₂种子，用于突变位点的精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、Indel分子标记对突变位点进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变位点，具体方法如下：

(1)SSR标记开发

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSR Hunter(李强等，遗传，2005，27(5):808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用PrimerPremier 5.0软件设计SSR引物,并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在W017和南京11之间的多态性，表现多态者用作精细定位OsFLO8基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表3。

表3用于精细定位的分子标记

标记	正向引物	反向引物	物理距离bp	类型
					J5-019	TGGCTGGCTCCGTGGGTAGCTG	TCCCGTTGCCGTTCATCCCTCC	7497975	SSR
N5-18	GGCGTAAAGGTTTTGCATGT	ATGATGCCATGAAGGTCAGC	10755704	SSR
					N5-15	TTCCATGGCACACAAGCC	CTGTGCACGAACTTCCAAAG	7787137	InDel
5-026	CACTTTGATGCCCTTGTAGC	TGCACAGGTCTGGCTTTTC	8038751	InDel
					5-009	CACCATTAACGGTAAGCAGG	GACAAGCAATCTCGCTCAAG	8252362	InDel
5-011	TCTATTCCACGGTTCTTTATGC	GAATTGTTGCCACAGGTCTT	8755458	InDel
					5-016	CGCTACTGACCCTTTCTTCC	GGATACTTTGGTCACTTCATGC	7852741	InDel
5-020	ATGTTTGGCGAACTGGAGAT	CCAAGAGCCATGAGACTTTAAC	7939300	InDel
					5-023	TCAATTGTTCCTTGTTATCGC	CTCCCAAAGTCCCAATTCTATA	7959545	InDel
5-025	CTGAAGGCAGAATCCGTAGG	ATCCAAGGGTGGCTCAAG	8016474	InDel
					5-026	CACTTTGATGCCCTTGTAGC	TGCACAGGTCTGGCTTTTC	8038751	InDel

根据F₂群体中胚乳粉质单株的分子数据和表型数据，按照Zhang等报道的“隐性极端个体基因作图”方法，最终把OsFLO8基因精细定位在5-023和5-025之间，物理距离约为57kb(图6)。候选区段基因组测序显示，在flo8-2中，基因Os05g0230900中存在一个碱基的突变，由G突变为A，导致蛋白翻译提前终止。

(3)突变基因的获得

根据定位的位点设计引物，序列如下所述：

primer1：5'-ATGGCTCGCCTCCTCCT-3'(SEQ ID NO.4)

primer2：5'-TCATTCTTCCAACTCCTTGAGA-3'(SEQ ID NO.5)

以primer1和primer2为引物，以W017的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因,扩增产物为1053bp的目的片段。

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃2min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后克隆到载体pEASY(北京全式金公司)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码350个氨基酸残基组成的蛋白质(从ATG到TGA)(见序列表的SEQ ID NO.1)。将SEQID NO.1所示的蛋白命名为OsFLO8(即为基因定位中所述的OsFLO8基因)，将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名OsFLO8。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

以W017的cDNA为模板，进行PCR扩增获得OsFLO8基因的编码序列，PCR引物序列如下：

primer3：

5'TTACTTCTGCACTAGGTACCACACGACAGGAAAAAGGAGATT 3'(SEQ ID NO.6)

primer4：

5'GAATTCCCGGGGATCCCAAGGGGAAAAACCTCTGAATC 3'(SEQ ID NO.7)

上述引物分别位于SEQ ID NO.2所示基因的ATG上游到TGA下游结束，扩增产物包含了该基因的全部编码区部分，将PCR产物回收纯化。采用Infusion重组试剂盒(Clontech)将PCR产物克隆到载体pCUBi1390中，构建成pCUBi1390-OsFLO8；重组反应体系(10.0μL)：PCR产物5.4μL(50-100ng)，pCUBi1390载体1.6μL(30-50ng)，5×Infusion buffer 2.0μL，Infusion enzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴0.5h以上，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。

37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ IDNO.3所示基因的重组表达载体，将含有OsFLO8的pCUBi1390命名为pCUBi1390–OsFLO8,OsFLO8基因插入在多克隆位点KpnI和BamHI之间。

二、重组农杆菌的获得

用电击法将pCUBi1390–OsFLO8转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为pCUBi1390–OsFLO8。

三、转基因植物的获得

将pCUBi1390–OsFLO8转化突变体flo8-2具体方法为：

(1)28℃培养pCUBi1390–OsFLO8培养16小时，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L乙酰丁香酮的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的flo8-2水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L巴龙霉素(Phyto TechnologyLaboratories公司)的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；得到分化成苗的T₀代阳性植株。

四、转基因植株的鉴定

1、潮霉素抗性鉴定

本研究中利用1‰浓度的潮霉素溶液鉴定转基因植株。具体方法：将新鲜的转基因植株叶片(没有转基因植株叶片做阴性对照)放在培养皿中，用新配的1‰的潮霉素溶液浸泡，放在28℃培养箱中暗培养48小时，与对照比较，叶片坏死的表明不抗，没有坏死的表明抗，将抗潮霉素的家系命名为pCUBi1390–OsFLO8。

2、表型鉴定

分别将T₀代转pCUBi1390–OsFLO8的阳性植株，越光和flo8-2种植在南京农业大学牌楼试验基地。对T1代种子进行表型鉴定，发现在T1代显示出(透明：粉质＝3:1)的表型，透明籽粒的表型与越光相同，不透明籽粒的表型与W59相同(图7)，说明导致flo8-2突变体表型确实是OsFLO8基因控制的，即该OsFLO8基因为淀粉合成相关基因。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京农业大学

<120> 一种植物淀粉合成相关蛋白OsFLO8及其编码基因与应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 350

<212> PRT

<213> 稻属水稻（Oryza sativa var. W017）

<400> 1

Met Ala Arg Leu Leu Leu Pro Leu Pro Ile Ala Ala Ala Ala Ala Ser

1 5 10 15

Arg Leu Arg Leu Pro Val Leu Ser Ser Ser Val Ala Arg Arg Glu Ala

20 25 30

Leu Leu Phe Gly Gly Arg Val Ala Ala Ala Arg Ala Pro Val Arg Leu

35 40 45

Ala Arg Arg Gly Val Ser Ala Gly Ala Glu Ala Gly Gly Ser Ser Ser

50 55 60

Ala Ala Ala Ala Ala Gln Val Ile Gly Gln Asp Glu Ala Val Glu Trp

65 70 75 80

Val Lys Lys Asp Arg Arg Arg Met Leu His Val Val Tyr Arg Val Gly

85 90 95

Asp Leu Asp Lys Thr Ile Lys Phe Tyr Thr Glu Cys Leu Gly Met Lys

100 105 110

Leu Leu Arg Lys Arg Asp Ile Pro Glu Glu Arg Tyr Thr Asn Ala Phe

115 120 125

Leu Gly Tyr Gly Pro Glu Asp Ser His Phe Val Val Glu Leu Thr Tyr

130 135 140

Asn Tyr Gly Val Glu Ser Tyr Asp Ile Gly Thr Ala Phe Gly His Phe

145 150 155 160

Gly Ile Ala Val Glu Asp Val Ala Lys Thr Val Asp Leu Ile Lys Ala

165 170 175

Lys Gly Gly Thr Val Thr Arg Glu Pro Gly Pro Val Lys Gly Gly Lys

180 185 190

Ser Val Ile Ala Phe Ile Glu Asp Pro Asp Gly Tyr Lys Phe Glu Leu

195 200 205

Ile Glu Arg Gly Pro Thr Pro Glu Pro Leu Cys Gln Val Met Leu Arg

210 215 220

Val Gly Asp Leu Asp His Ala Ile Asn Phe Tyr Glu Lys Ala Phe Gly

225 230 235 240

Met Glu Leu Leu Arg Lys Arg Asp Asn Pro Gln Tyr Lys Tyr Thr Ile

245 250 255

Ala Met Met Gly Tyr Gly Pro Glu Asp Lys Asn Ala Val Leu Glu Leu

260 265 270

Thr Tyr Asn Tyr Gly Val Lys Glu Tyr Asp Lys Gly Asn Ala Tyr Ala

275 280 285

Gln Ile Ala Ile Ser Thr Asp Asp Val Tyr Lys Thr Ala Glu Val Ile

290 295 300

Arg Gln Asn Gly Gly Gln Ile Thr Arg Glu Pro Gly Pro Leu Pro Gly

305 310 315 320

Ile Asn Thr Lys Ile Thr Ala Cys Thr Asp Pro Asp Gly Trp Lys Thr

325 330 335

Val Phe Val Asp Asn Val Asp Phe Leu Lys Glu Leu Glu Glu

340 345 350

<210> 2

<211> 1053

<212> DNA

<213> 稻属水稻（Oryza sativa var. W017）

<400> 2

atggctcgcc tcctcctccc cctccccatc gccgccgccg ccgcctcccg cctccgcctc 60

cccgtcctct cctcctccgt ggcgcggcgt gaggcgctgc tcttcggggg gagggtggcg 120

gcggcgaggg cgccggtgag gctggcgagg agaggggtga gcgccggggc ggaggcgggc 180

gggtcgtcgt cggccgccgc ggcagcgcag gtgatcgggc aggacgaggc ggtggagtgg 240

gtcaagaagg accggaggcg catgctccat gtcgtctacc gcgtcggcga cctcgacaag 300

acgatcaagt tttacaccga gtgcttgggg atgaagctgt tgcgcaagcg cgacattccg 360

gaggagaggt ataccaatgc ttttctcggg tacgggcctg aggactcgca ttttgttgtg 420

gagctcactt acaattatgg tgtggaaagt tatgatatcg ggactgcttt cggtcacttc 480

gggattgctg tcgaggacgt tgcaaaaaca gtagatctca ttaaagccaa gggaggaacg 540

gtaacaagag aaccaggacc tgtaaaaggt ggaaagtctg taattgcttt tattgaagat 600

cctgatggtt acaaatttga gcttatagaa agaggtccta cacctgagcc tttatgccag 660

gtaatgcttc gagtgggaga tcttgatcat gctatcaatt tctatgagaa ggcatttggc 720

atggaacttc tccggaaacg agacaatccc caatacaagt atactattgc aatgatggga 780

tatggtcctg aagacaaaaa tgctgtactg gagttgacct acaactatgg tgtcaaggaa 840

tatgataaag gaaatgctta tgcacagatt gctattagca cagatgatgt ctacaagact 900

gcggaagtca ttagacaaaa tggtggacaa ataactcgtg aacctggccc attacctgga 960

attaatacga agataactgc ttgcacagat ccagatggct ggaaaacagt atttgttgat 1020

aatgtagatt ttctcaagga gttggaagaa tga 1053

<210> 3

<211> 5990

<212> DNA

<213> 稻属水稻（Oryza sativa var. W017）

<400> 3

atggctcgcc tcctcctccc cctccccatc gccgccgccg ccgcctcccg cctccgcctc 60

cccgtcctct cctcctccgg tacgccgacc tcctatcatc cccccctctc catgttcccc 120

gttcgtgtgg gagggcctct gttttcattg ggtttgtttg tttttttttt tgattggttt 180

gcagtggcgc ggcgtgaggc gctgctcttc ggggggaggg tggcggcggc gagggcgccg 240

gtgaggctgg cgaggagagg ggtgagcgcc ggggcggagg cgggcgggtc gtcgtcggcc 300

gccgcggcag cgcaggtgat cgggcaggac gaggcggtgg agtgggtcaa gaaggaccgg 360

aggcgcatgc tccatgtcgt ctaccgcgtc ggcgacctcg acaagacgat caagtataga 420

aaacgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactaca acccgtatag ttgttaatta aaagagtaga 480

tttcacttgg ggtcaccttt tattaccgat gttttggatc atcttttaac cgatgttttc 540

actttggatg gggtaatctt acctttatgc cactttgggg tactttggtt agaaggttat 600

acaaagcgaa acttcggtaa taaaaggtgg cccaaaatga aatttactcc caactaaaat 660

ttgctctggc gtctaccata gtgttagcct tgaattgatt tgctgttctg caggttttac 720

accgagtgct tggggatgaa gctgttgcgc aagcgcgaca ttccggagga gaggtatacc 780

aatgcttttc tcgggtacgg gcctgaggac tcgcattttg ttgtggagct cacttacagt 840

aagcttctac agtccaaatg ctgttatcat atgtttatac ctcacatagt gtgcgttatc 900

tgttgtatcc gtgcaagacc cctgatgtac atctattggc agattatggt gtggaaagtt 960

atgatatcgg gactgctttc ggtcacttcg ggattgctgt cgaggacgta agattctgct 1020

gcttatctta gtatttttgt tgagtagttg agttgtttga cattcagccc tgtgtgtata 1080

actgccactt ccttcaactg ggcatgcttt ttttcttttt ggctactcaa aaagatacta 1140

gtcccttttg cttgtagaat ttcaagctag ttcccactgg tttttaggct taaatttttt 1200

accagaccta tccatgtatc atccagataa gatttctctc aggggttgtg acttaataat 1260

acactttttt tcttatattt tgatgcctac aactaattgg cttgcttagt tacgtagggg 1320

ttagtgtgat tcttgagtgc cataaaacct taaaccaggt gatctggctt aaattgcttt 1380

gtccaaattt tcattgaacc atgtagtagg gaactagttg aaaacaaata gcctttttag 1440

gatgctagat tttggcatga ttaatctcat catgccaaac cccatacaat gccttctttt 1500

cttccatgga gatggcataa aaggtttttc ataacataac aataacttac tcatgttttc 1560

agttcacaca ttgagggata atcttccctt tttcattaat agtggtaaaa aatgttactc 1620

tggtcatgca aacatccaag aataatgtaa tctatttttg tgcactggat aagactagag 1680

ttttaaacat gccatcagtt agtaatgtat ctgattatag gttttaatat tttgcctttg 1740

caaagatgga tatgtgcttg gttgattgat aagtttcatt acaaaaaact tgtaggttgc 1800

aaaaacagta gatctcatta aagccaaggg aggaacggta acaagagaac caggacctgt 1860

aaaaggtgga aagtctgtaa ttgcttttat tgaagatcct gatggttaca aatttgagct 1920

tatagaaaga ggtcctacac ctgagccttt atgccaggta atgcttcgag tgggagatct 1980

tgatcatgct atcaatttct atgagaaggt aaacttattg tctttaactt gtagtatttg 2040

gtatttatca taattattca ttcagcaact aatctgtact atattttcat cataaggcat 2100

ttggcatgga acttctccgg aaacgagaca atccccaata caaggttggt acttttcaaa 2160

accattgcat ggatttacct cgtgacactc atggcttctg tttgccctga tgctttctaa 2220

tgttatgctc tactacaaag tactagaaaa acattcaaaa gagcttccat caatgtacct 2280

catcacctcc attgctatga cttctgtttg tcctcatggc ttctgtttgc cctgatgctt 2340

tctaatctga tccttgctta agtgagataa ggaaaaacat gcactactac ctcgaaatat 2400

gagaacatgt taaatgcact ttttgtttgt aaactatttg cttagttcca tatcttatac 2460

agtggtatcc tgacttacgg agaacatgtt aaatgtagct attatggttg tatcctgatt 2520

tttgctacat tcatacactg ggttcagact tcagacttgg gtagtaggca tggtattgat 2580

aaaaccgaag tgatagcaag ttccgcatgt gcatttactg gttgtttcat tatacatgcc 2640

attgtttctt atatttcttt ctagagatgg gaacttcatt gtttttaggc atcattttct 2700

ggtgttgaca agcctttttc ttttcttttg aaatcttagt ctcaagcatg ttgtgccatc 2760

tggttttctg gtaccttgtg catagggttg atcacaaact ttgtctgttc tctgtcagga 2820

tatcttgtgt catgtttgtc ttattcttcg tattcactca tgaatctgga aacaaaatat 2880

acttctctgg cacagttgct atccaagcta tggataaggg tcactgtcaa aaggactaga 2940

accctgtgat ccgatattat tacagtccaa atgcttgtta actttcttct gatgagttat 3000

tatgccactc attcgtgaaa caaagtttca gattaccttt ttttccctat attactcatc 3060

tatatgcatt gaacaaatat caaatttcta aaaatataag ggattttggc cctgttcgtt 3120

tgtccacaaa tataaggggt tttgagaacc cggggagtga actacagcag acaaactcag 3180

ccttgcattc aatcccctta cctttttgca cttttattat cctgaaatgt tgccaatcca 3240

aacttgtccc ccaccttttt taggggcaca tgtctttttg tttctacctt aatttctgct 3300

aaacttggca aaatcaaatt gtggaggaag ggagtatatc ttaagttcta aacttacaaa 3360

tgtaaaagtg attgtctttt aatctagaaa ctctgatgca taatttacac tggatatgca 3420

actacagata caaatgatgc aagacttaac aaaaaaaagg aaaaaaaatc cattttactc 3480

cctcaaacta tttcaccgga gcatttaatc ctctgaagta ttttttttta ctcattttac 3540

ctcctgaact actaaaatcg acctacttta ctccttacca atgtttctct attttgtttc 3600

tccttataca aaacaatagt caaatacccg tgcattgcag cagattatag aaataaaaat 3660

attgagtcca ttttctgaaa aaaagaactt gtttgcttct gtttggttga aacaaaacgc 3720

ttcatcttta agaaacaaaa agaaaatgta catgtttata ggattgttgt tttccaaagt 3780

gagacataaa accttcaatg cattttgaca tgaataatga aacacgtatt aataataaat 3840

tgtgcagtga actactaata aaactaaaat gtccttgagt ttttcacttg aatcaaggtg 3900

aaaaagaagc aaactattag agacaacaca gtgagcatag cactcatttg tgtactggtc 3960

tcatagcctg gtggccccat acatcaggct gtcaggctgt gagaccagta aggggccata 4020

gccaccacca ccaccaccaa gcaatataga tgtgttaagt tgtaatttca taataagtat 4080

atatgacaac ataaccttgc aatttcatag aagcatatat gatagcgaaa cctatgttaa 4140

aaaatatttt cacttttttt tcatgacagt ccacacaggg ttttagagaa tatgctacag 4200

ctgcttggcg ttagtcatgt caaattgatg cacgtataac aaataaaaaa tagacctcaa 4260

agtattttct gttactggtt ttcaccacaa caggttttgt ctgtcttgaa tgatcttgat 4320

atatactccc tccgtttcat aatgtaagac tttttagcat tgctcatatt catatagatg 4380

ttaatgaatc tagacacacg tatatgctta gatttattaa catttatatg aatatggaca 4440

atgctagaaa gacttgcatt atgaaacgga ggaagtatta tttttgttat atctagatgc 4500

ttacaatttt gtctgttaat attttgcaac caaatctgca tgtacctaac ccttttggtc 4560

atagcctatg atttccttat gtgatttata actattagaa atctaattgt atcttttctc 4620

tagtatacta ttgcaatgat gggatatggt cctgaagaca aaaatgctgt actggagttg 4680

acctacaact atggtgtcaa ggaatatgat aaaggaaatg cttatgcaca ggtatattat 4740

atttgagtgt ttagattgga tttggaagtt tctcttctat actgtgttag taataaaaaa 4800

ggatctatgt ggaaatttct gattgaatat gatctaaaca acggggatca cttgccattc 4860

gttggttact agaagcatcc gaaagggttt gggtcaaata tgagtataat aggagtttca 4920

tttcatgagg gttcatccct cgtatttaca ttacagtcgt ggagtttaat ttttttaccc 4980

ttccagattg ctattagcac agatgatgtc tacaagactg cggaagtcat tagacaaaat 5040

ggtggacaaa taactcgtga acctggccca ttacctggaa ttaatacgaa gataactgct 5100

tgcacagatc cagatggctg gaaaacagta tgtactattt ctttttgttt gagaatcaca 5160

gctctctcgt gcatgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtagat aagggggtca taatttttgc 5220

taaaggttgt ttgttcttgg ctgtttctga ctgctccata tgagcttttt ctgggccatt 5280

tacactttat ggcgataaac tttccatgat aactaaactt ggaagaaatt tgttgctatt 5340

ttgttggtgt gtcttgaata atacatacgc accataaaat ctttagtgat tctcactgcc 5400

ctagaaaaaa ggatatccaa ttagtttatt accatgtata cagtaaaggc atatttaaga 5460

aaattaacat tattctttgt gtaatttgag aacagaaatt gtacttcctc cgtttcacaa 5520

tgtaagtcat tctagcattt cccacattca tattgatgct aatgaatcta gatatatgtc 5580

tagattcatt agcatcaata tgaatgtagg aaatgctaga atgacttata ttgtgaaacg 5640

gagggagtag tagttttttt ttattgtact gtgtacaata atgatgaatt agaccaagtc 5700

aactgttctg ctgacctgcc atgaatattc cccatcttga aacaagtatg tgaagtagtc 5760

gtacatgtct tctgtgcgat tttatgatct tcagaataat aatactccta agtacatttg 5820

tcagaaaaaa aagtatatgc atatgcatta ttagtctgtt gcattacata ttttgtgcca 5880

tgcctctatt ttcatgaaga acccgcagtt tcttccgtct gatacattaa ttaccataat 5940

tgcaggtatt tgttgataat gtagattttc tcaaggagtt ggaagaatga 5990

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggctcgcc tcctcct 17

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcattcttcc aactccttga ga 22

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttacttctgc actaggtacc acacgacagg aaaaaggaga tt 42

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaattcccgg ggatcccaag gggaaaaacc tctgaatc 38

<210> 8

<211> 387

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys

1 5 10 15

Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

20 25 30

Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

35 40 45

Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

50 55 60

His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile

65 70 75 80

Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

85 90 95

Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

100 105 110

Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

115 120 125

Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

145 150 155 160

Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

180 185 190

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

195 200 205

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

210 215 220

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser

245 250 255

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

260 265 270

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

275 280 285

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

290 295 300

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

305 310 315 320

Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln

325 330 335

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

340 345 350

Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn

355 360 365

Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile

370 375 380

Glu Gly Arg

385

<210> 9

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Phe Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Arg Ser

225 230 235 240

Claims

1.编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因、含有编码SEQ ID NO.1所示基因的重组表达载体、表达盒或重组菌中的至少一种在培育淀粉合成正常的转基因水稻中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因是如下1）或2）所示的DNA分子：

1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子。

3.一种培育淀粉合成正常的转基因植物的方法，是将编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因导入淀粉合成异常水稻中，得到淀粉合成正常的转基因水稻；所述淀粉合成异常的水稻为胚乳表现为粉质表型的水稻；所述淀粉合成正常的转基因水稻为胚乳表现透明非粉质的转基因水稻。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述的编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因是如下1）或2）所示的DNA分子：

1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因通过含有该基因的重组表达载体导入淀粉合成异常的植物中。