CN106581691B

CN106581691B - 还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束、其制备方法与应用

Info

Publication number: CN106581691B
Application number: CN201611099081.0A
Authority: CN
Inventors: 钟志远; 程茹; 钟平
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2016-12-04
Filing date: 2016-12-04
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2036-12-04
Also published as: CN110339368B; CN110339368A; CN106581691A

Abstract

本发明公开了一种还原响应的靶向聚乙二醇‑聚碳酸酯美登素前药胶束、其制备方法与应用。由两亲性聚乙二醇‑聚碳酸酯美登素前药聚合物和末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇‑聚碳酸酯美登素前药聚合物在缓冲液中自组装得到还原响应的靶向聚乙二醇‑聚碳酸酯美登素前药胶束；胶束的粒径为30～150纳米，美登素的载药量为2～60 wt.%。本发明提供的还原响应的靶向聚碳酸酯美登素前药胶束具有靶向性，两亲性和生物可降解性，由其可制备纳米药物，能够显著提高药物的水溶性、增强药物在循环过程中的稳定性、改善药物药代动力学行为以及提高药物生物利用度；可在制备恶性肿瘤如黑色素瘤靶向治疗药物中应用。

Description

还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束、其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种聚合物前药及其应用，具体涉及一种还原响应的靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药、其制备方法及在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用，属于医药材料领域。

背景技术

恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的主要杀手，其发病率和死亡率正呈逐年上升的趋势。目前肿瘤治疗方法主要包括外科手术切除、辐射治疗和化疗。这些治疗手段存在明显的不足：治疗过程中会对机体正常组织造成不可逆转的损害，产生严重的毒副作用，给患者带来极大的痛苦。美登素是一强效的微管蛋白抑制剂，对很多恶性肿瘤如乳腺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤以及肺癌均有很强的杀伤能力。曲妥珠单抗-美登素抗体偶联物（T-DM1）在2013年获得FDA批准用于晚期HER2阳性乳腺癌的治疗。目前已经有接近十种基于美登素的抗体药物偶联物进入不同阶段的临床试验研究。尽管抗体药物偶联物具有很优异的肿瘤靶向能力和抗肿瘤治疗效果，但要进一步市场化还是遭遇到了一些根本性的挑战，如很难规模化生产，成本过高，肿瘤细胞摄取效率低，潜在的免疫反应以及抗癌药物含量过低等。此外，T-DM1也可能导致一些不良反应如恶心、肌肉骨骼疼痛、肝毒性、心脏损害和间质性肺疾病。

在过去的几十年中，聚合物前药从被提出至今已发展为一种被科学家们广泛认可的能够有效用于肿瘤治疗的纳米药物。值得注意的是，目前已经有一些高分子前药进入到了不同阶段的临床试验，如聚谷氨酸衍生化的紫杉醇（Xyotax，Opaxio）以及聚甲基丙烯酸羟丙酯衍生化的多柔比星（PK1，PK2）等。但是，上述聚合物前药由于缺乏对肿瘤的特异性选择以及抗癌药物释放过慢，其临床试验治疗效果并不如人意，导致无法临床应用。因此，开发具有肿瘤靶向性、能在肿瘤部位快速释放抗癌药物，并且具有良好生物可降解性的聚合物前药对肿瘤治疗研究意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束及其制备方法，具有靶向性，两亲性和生物可降解性，由其可制备纳米药物，能够显著提高药物的水溶性、增强药物在循环过程中的稳定性、改善药物药代动力学行为以及提高药物生物利用度；可在制备恶性肿瘤比如黑色素瘤靶向治疗药物中应用。

为达到上述目的，本发明具体的技术方案为：一种还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束，由两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药和末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药在缓冲液中自组装得到；

所述两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药的化学结构式如下：

其中，R2选自以下基团中的一种：

；

所述末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药的化学结构式如下：

其中，R1选自以下基团中的一种：

；

R2选自以下基团中的一种：

；

所述n为68～454，x为20～80，y为3～15；

R为靶向分子，选自抗体分子（Rituximab、trastuzumab、cetuximab、 bevacizumab等）、多肽分子（cRGD、iRGD、GE11、cNGQ等）、糖分子（半乳糖、透明质酸等）或者生物小分子（叶酸、生物素等）。

本发明中，由两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药和末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药在磷酸缓冲液（10 mM, pH 7.4）中自组装得到还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束；末端键合靶向分子的两亲性生物可降解聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药在整个胶束中的比例范围为0～60 wt.%，不包括0；采用两种聚合物前药混合得到的胶束对肿瘤具有良好的靶向性能。

上述技术方案中，两亲性生物可降解的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药、末端键合靶向分子的两亲性生物可降解聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物中，R2单元和二硫吡啶碳酸酯单元呈无规排列。两种聚合物的分子量范围均为9500～28000 g/mol；为了增加胶束稳定性，提高药物组装水平以及释放效率，两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药与末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药除了末端键合的靶向分子外链段组成一致，两者按一定比例自组装得到还原响应的靶向聚碳酸酯美登素前药胶束。

上述技术方案中，所述还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束的粒径为30～150纳米，美登素的载药量约为2～60 wt.%。

上述技术方案中，还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束的制备方法，包括以下步骤：

（1）在聚乙二醇引发剂存在下，开环共聚合二硫吡啶碳酸酯和含有R2基团的碳酸酯得到两亲性生物可降解聚乙二醇-聚碳酸酯；然后两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯与巯基化的美登素进行巯基-二硫交换反应得到两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药；R2选自以下基团中的一种：

；

（2）在官能化聚乙二醇引发剂存在下，开环共聚合二硫吡啶碳酸酯和含有R2基团的碳酸酯单体得到末端官能化的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；然后将末端官能化的聚乙二醇-聚碳酸酯采用溶剂置换法制备得到末端官能化的聚乙二醇-聚碳酸酯胶束，接着将末端官能化的聚乙二醇-聚碳酸酯胶束与靶向分子进行加成反应得到末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；最后末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯与巯基化的美登素进行巯基-二硫交换反应得到末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药；R2选自以下基团中的一种：

；

（3）将两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药和末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药在缓冲液中自组装得到还原响应的带有靶向分子的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束。

上述技术方案中，步骤（1）具体为，在氮气环境中，二硫吡啶碳酸酯、含有R2基团的碳酸酯和大分子聚乙二醇引发剂溶解在第一溶剂中，然后加入第一催化剂，于密闭反应器中，进行开环共聚合反应，得到两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；在氮气环境中，将两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯和巯基化美登素溶解在第二溶剂中，加入第二催化剂，在密封反应器中，进行巯基-二硫交换反应，然后透析得到两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药；

步骤（2）具体为，在氮气环境中，二硫吡啶碳酸酯、含有R2基团的碳酸酯和官能化大分子引发剂溶解在第三溶剂中，并向其中加入第三催化剂，于密闭反应器中，进行开环共聚合反应，得到末端官能化的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯，接着采用溶剂置换法得到末端官能化的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯胶束；然后在氮气环境中，将靶向分子加入末端官能化的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯胶束水溶液中反应，然后透析、干燥得到末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；然后在氮气环境中，将末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯和巯基化美登素溶解在第四溶剂中，加入第四催化剂，在密封反应器中，进行巯基-二硫交换反应，然后透析得到末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药；

步骤（3）具体为将两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药与末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药分别溶解于第五溶剂中，混合后滴加缓冲液，然后透析得到还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束。

上述技术方案中，步骤（1）中，大分子引发剂为一端为甲氧基，另一端为羟基的聚乙二醇，第一催化剂为双（双三甲基硅基）胺锌；第一溶剂为二氯甲烷；开环共聚合反应温度为40℃，时间为24 h；第二催化剂为冰醋酸；第二溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或者二甲亚砜；巯基-二硫交换反应温度为40℃，时间为48 h。

上述技术方案中，步骤（2）中，所述官能化大分子引发剂为末端双官能化的聚乙二醇，第三催化剂为双（双三甲基硅基）胺锌；第三溶剂为二氯甲烷；开环共聚合反应温度为40℃，时间为24 h；第四溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或者二甲亚砜；接枝反应温度为35℃，时间为24h；第四催化剂为冰醋酸；第四溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或者二甲亚砜；巯基-二硫交换反应温度为40℃，时间为48 h；所述靶向分子为其中的一种：抗体分子（Rituximab,trastuzumab, cetuximab, bevacizumab等），多肽分子（cRGD, iRGD, GE11, cNGQ等），糖类分子（半乳糖、透明质酸等）以及生物小分子（叶酸、生物素等）；所述官能化聚乙二醇的化学结构式为：

其中，R1选自以下基团中的一种：

比如在靶向聚合物前药的制备过程中采用马来酰亚胺官能团与cRGD-SH多肽分子反应，可以在两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯的一端键合上cRGD靶向分子，使最终制备得到的胶束具有相应的靶向性能。其反应条件温和，在水溶液中即可高效完全反应。

上述技术方案中，步骤（3）中，第五溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或者二甲亚砜；末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药占胶束总质量的0～60%，且不为0；所述缓冲液为磷酸缓冲液。优选的，第五溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药与末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药在第五溶剂中的浓度一样，滴加缓冲液的时间为5～30min。

上述技术方案中，步骤（1）中，共聚合反应完成后，反应液经无水乙醚沉淀、抽真空过滤和真空干燥滤饼得到两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；二硫-巯基交换反应结束后，反应液依次在N,N-二甲基甲酰胺和去离子水中透析（MWCO 7000），然后冷冻干燥，得到两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药，可保存于-20℃冰箱中。

上述技术方案中，步骤（2）中，共聚合反应完成后，反应液经无水乙醚沉淀、抽真空过滤和真空干燥滤饼得到末端官能化的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；利用透析法将末端官能化的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯在水溶液中自组装形成表面带有官能团的聚乙二醇-聚碳酸酯胶束；该胶束在水溶液中与靶向分子键合，反应液在去离子水中透析，然后冻干得到末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；通过二硫-巯基交换反应键合上美登素分子，反应结束后反应液依次在N,N-二甲基甲酰胺和去离子水中透析（MWCO 7000），然后冷冻干燥，得到末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药，可保存于-20℃冰箱中。

上述技术方案中，步骤（3）中，在PB缓冲液中透析12 h（MWCO 7000），得到还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束。

本发明的还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束的亲水段PEG的末端可以化学偶联特异性靶向分子如cRGD多肽，从而具备肿瘤特异靶向性，同时具备双亲性、生物相容性；这样的聚合物前药胶束具有很好的稳定性同时能够特异性地主动靶向到肿瘤，比如黑色素瘤。

本发明公开的还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束，动态光散射粒度仪（DLS）测得粒径为30～150 nm，透射电镜观察结果显示胶束均匀分布，胶束中美登素的载药量约为2～60 wt.%。该前药胶束在体内稳定，循环时间长，可通过被动和主动靶向增加在肿瘤部位的富集和肿瘤细胞的摄取，且进入癌细胞后在细胞内强还原性环境下，二硫键快速断裂，快速释放出药物，高效杀死肿瘤细胞。因此本发明还公开了上述还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明还公开了一种抗肿瘤纳米药物，包括上述还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束。

本发明还公开了一种还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药，其化学结构式为以下化学结构式中的一种：

其中，R1选自以下基团中的一种：

；

R2选自以下基团中的一种

；

所述n为68～454，x为20～80，y为3～15；

R为靶向分子。

本发明进一步公开了上述还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束在肿瘤治疗中的应用。

本发明还公开了一种聚合物前药胶束，由还原响应性两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药自组装制备得到；

所述还原响应性两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药的化学结构式如下：

其中，R2选自以下基团中的一种：

；

所述n为68～454，x为20～80，y为3～15。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1. 本发明公开的还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束，由两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药和末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药在缓冲液中自组装得到，开环聚合、迈克尔加成反应和巯基-二硫交换反应可控，整个合成过程步骤简单，反应条件温和，保持了抗癌药物活性，有很好的重现性。

2. 本发明公开的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药和末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药可以到达生产级合成，解决了现有抗体药物偶联物很难达到规模化生产、成本过高等问题，具有良好的生物可降解性和生物相容性，利于药物产业化。

3. 本发明公开的还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束，动态光散射粒度仪（DLS）测得粒径为30～150 nm，透射电镜观察结果显示胶束均匀分布，胶束中美登素的载药量约为2～60 wt.%，解决了现有抗体药物偶联物中抗癌药物含量过低的问题。

4. 本发明公开的还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束通过二硫键与两亲性生物可降解聚合物主链连接，能够自组装形成胶束，二硫键被很好地保护在胶束内，在肿瘤细胞外环境中药物分子美登素足够稳定，不易于泄露，而肿瘤细胞内的高浓度的谷胱甘肽会促使药物分子美登素快速地释放出来，同时能够完整地保留原有的美登素的分子结构，很好地保留药物的抗肿瘤活性，实现了药物循环损失小、病兆部位释放多和药效高的效果。

5. 本发明公开的还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束表面通过修饰靶向分子比如cRGD多肽增强胶束在肿瘤部位的富集和穿透，增强肿瘤细胞对药物的摄取能力，这不仅增加了药物的利用率，还可以降低药物对其他组织的毒副作用。

6. 本发明公开的还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束，与自由美登素相比，能够明显提高美登素的最大耐受量；在肿瘤部位的富集率高，对肿瘤细胞具有很强的杀伤力，参见本发明实施例，本发明公开的还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束在对荷肿瘤C57BL/6黑鼠体内治疗过程中对肿瘤生长有很好的抑制。

附图说明

图1为实施例一中聚合物PEG-P(TMC-co-PDSC)的核磁氢谱图；

图2为实施例二中PEG-P(TMC-g-SSDM1)的核磁氢谱图；

图3为实施例三中聚合物MAL-PEG-P(TMC-co-PDSC)的核磁氢谱图；

图4为实施例四中聚合物cRGD-PEG-P(TMC-co-PDSC)的核磁氢谱图；

图5为实施例五中cRGD-PEG-P(TMC-g-SSDM1)的核磁氢谱图；

图6为实施例六中还原响应的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束的粒径及透射电镜图；

图7为实施例七中还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束的粒径及透射电镜图；

图8为实施例七中还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束在10%胎牛血清和DMEM培养基中稳定性研究图；

图9为实施例七中还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束的还原响应测试图；

图10为实施例十中聚乙二醇聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP、MMP）在谷胱甘肽触发下的体外释放结果图；

图11为实施例十一中自由美登素（free DM1），还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP）以及还原响应的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（MMP）对B16F10细胞的毒性测试结果图；

图12为实施例十二中聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP、MMP）对B16F10细胞的流式分析细胞摄取图；

图13为实施例十三中聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP、MMP）对B16F10细胞的共聚焦显微镜观察细胞摄取图；

图14为实施例十四中聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP、MMP）在小鼠体内血液循环结果图；

图15为实施例十五中还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP）在正常小鼠体内的最大耐受量结果图；

图16为实施例十六中还原响应的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（MMP）在正常小鼠体内的最大耐受量结果图；

图17为实施例十六中各组荷B16F10肿瘤C57BL/6黑鼠体内肿瘤生长体积变化图；

图18为实施例十六中各组荷B16F10肿瘤C57BL/6黑鼠的肿瘤大小图片结果图；

图19为实施例十六中各组荷B16F10肿瘤C57BL/6黑鼠的肿瘤大小重量结果图；

图20为实施例十六中各组荷B16F10肿瘤C57BL/6黑鼠的存活率结果图；

图21为实施例十六中各组荷B16F10肿瘤C57BL/6黑鼠的相对体重变化结果图。

具体实施方式

实施例一聚合物（PEG-P(TMC-co-PDSC)）的合成

在氮气环境下，86.7 mg（0.32 mmol）二硫吡啶碳酸酯单体（PDSC）和81.6 mg（0.8mmol）的三亚甲基碳酸酯（TMC）溶在2 mL二氯甲烷中，加入密封反应器里，然后加入0.1 g（0.02 mmol）CH₃O-PEG-OH (5 K) 和0.5 mL的催化剂双（双三甲基硅基）胺锌的二氯甲烷溶液（0.1 mol/L），密封好反应器，转移出手套箱，40 ℃油浴中反应24小时后，冰乙酸终止反应，冰乙醚中沉淀，最终经过过滤、真空干燥得到聚合物PEG-P(TMC-co-PDSC)。产率为81.5%。核磁图见附图1，¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): TMC moieties：δ (ppm) 2.05, 4.23，PEG moieties：δ (ppm) 3.37，3.65，PDSC moieties：δ (ppm) 1.12, 3.01, 4.11, 7.09,7.65, 8.46。核磁计算得到分子量为11.8 kg/mol，TMC和PDSC的聚合度分别为39和10.5。

采用上述类似的方法可制备多种PEG-P(TMC-co-PDSC)，原料比例及表征见表1。

表1 聚合物PEG-P(TMC-co-PDSC)的制备条件、产物核磁及GPC表征结果

实施例二两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物（PEG-P(TMC-g-SSDM1)）的合成

氮气保护下，于100mL的三口烧瓶中依次加入溶解在10mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中的聚合物PEG-P(TMC-co-PDSC)（100 mg, 0.088 mmol 二硫吡啶官能团），同时向其中加入催化量的（100 μL）冰醋酸，接着向三口瓶中逐滴加入25 mL 巯基功能化的美登素（DM1）(97.8 mg, 0.135 mmol)的DMF溶液，反应器放置在35℃的油浴中，搅拌反应48小时后，依次在DMF及水中透析（Spectra/Pore, MWCO 7000），冻干，产率75%。核磁结果表明其结构为两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物，美登素的载药量为40 wt.%。核磁图见附图2，¹H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆): PEG: δ 3.37, 3.64; TMC: δ 4.24, 2.04; DM1: δ5.22-7.24, 0.71-1.52, and 3.25-3.55。核磁计算得到分子量为18.1 kg/mol。

实施例三聚合物（Mal-PEG-P(TMC-co-PDSC)）的合成

在氮气环境下，86.7 mg（0.32 mmol）二硫吡啶碳酸酯单体（PDSC）和81.6 mg（0.8mmol）的三亚甲基碳酸酯（TMC）溶在2 mL二氯甲烷中，加入密封反应器里，然后加入0.1 g（0.02 mmol）MAL-PEG-OH (5 K) 和0.5 mL的催化剂双（双三甲基硅基）胺锌的二氯甲烷溶液（0.1 mol/L），密封反应器，转移出手套箱，40℃油浴反应24小时后，冰乙酸终止反应，冰乙醚中沉淀，最终经过过滤、真空干燥得到聚合物MAL-PEG-P(TMC-co-PDSC)。产率为82.3%。核磁图见附图3，¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): PEG moieties: δ 3.63; TMC moieties: δ4.23, 2.05; PDSC moieties: δ 8.46, 7.65, 7.09, 4.10, 3.01, 1.12, Maleimidegroup: δ 6.71。核磁计算得到分子量为12 kg/mol，TMC和PDSC的聚合度分别为39和11。

采用上述类似的制备方法可以制备多种Mal-PEG-P(TMC-co-PDSC)，见表2。

表2 聚合物Mal-PEG-P(TMC-co-PDSC)的制备条件、产物核磁及GPC表征结果

实施例四 cRGD多肽端基键合的聚合物（cRGD-PEG-P(TMC-co-PDSC)）的合成

将MAL-PEG-P(TMC-co-PDSC) （50 mg，3.84 μmol）的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（2.5mL）的溶液通过溶剂交换法制备得MAL-PEG-P(TMC-co-PDSC)的胶束，所得聚合物胶束浓度约为3 mg/mL，而后对胶束转移至100 mL的三口瓶中，并适当鼓泡保证氮气环境，随后向其中加入cRGD-SH（4 mg，5.76 μmol），置于35 ℃油浴锅中搅拌24 h，而后在去离子水中透析（Spectra/Pore, MWCO 3500），冻干，并保存于-20℃冰箱中。产率78%。核磁图见附图4，¹HNMR (400 MHz, DMSO-d ₆): PEG: δ 3.37, 3.64; TMC: δ 4.24, 2.04; PDSC: δ 8.46,7.65, 7.09, 4.10, 3.01, 1.12; cRGD: δ 6.83-7.60。核磁结果显示马来酰亚胺的核磁特征峰完全消失，且cRGD特征峰的出现表明cRGD反应完全。同时聚合物中二硫吡啶特征峰的积分值并没减少，表明cRGD-SH并未与二硫吡啶发生硫硫交换副反应。

本发明靶向聚合物前药在制备中先将MAL-PEG-P(TMC-co-PDSC)聚合物制备成胶束是将聚合物链中二硫吡啶官能团保护在胶束内核中，避免cRGD-SH与二硫吡啶发生副反应，将cRGD-SH与MAL-PEG-P(TMC-co-PDSC)聚合物胶束带有的马来酰亚胺官能团反应后，透析除去未反应的多肽，而后冷冻干燥收集得到cRGD-PEG-P(TMC-co-PDSC)聚合物。

实施例五 cRGD多肽端基键合的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物（cRGD-PEG-P(TMC-g-SSDM1)）的合成

氮气保护下，于50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在3mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中的cRGD多肽端基键合的聚合物MAL-PEG-P(TMC-co-PDSC)（40 mg, 0.036 mmol 二硫吡啶官能团），同时向其中加入催化量的（30 μL）冰醋酸，接着向三口瓶中逐滴加入10 mL 巯基功能化的美登素（DM1）(39.9 mg, 0.054 mmol)的DMF溶液，反应器放置在35℃的油浴中，搅拌反应48小时后，依次在DMF及水中透析（Spectra/Pore, MWCO 7000），冻干，产率73%。核磁结果表明其结构为cRGD多肽端基键合的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物，美登素的载药量为40.2 wt.%。核磁图见附图5，¹H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆): PEG: δ 3.37,3.64; TMC: δ 4.24, 2.04; DM1: δ 5.22-7.24, 0.71-1.52, and 3.25-3.55, cRGD: δ6.83-7.60。核磁计算得到分子量为18.6 kg/mol。

以表1第3组聚合物以及表2第3组聚合物为例，进行进一步研究。

实施例六还原响应的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（MMP）的制备

还原响应的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（MMP）通过溶剂置换方法制备得到，用于进一步分析研究。800 μL磷酸盐缓冲溶液（PB，10 mM，pH 7.4）逐滴滴加到200 μL实施例二中合成的PEG-P(TMC-g-SSDM1)的DMF溶液（5 mg/mL）中，然后装入透析袋（MWCO7000）中透析12 h，至少换五次水，透析介质为PB（10 mM，pH 7.4）。得到的胶束尺寸由动态光散射粒度分析仪（DLS）测得为 39 nm，粒径分布很窄PDI为0.09，见图6，由图可知，TEM测得纳米药物粒子分布均匀，且尺寸与动态光散射法测得的相近。

实施例七 cRGD靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP）的制备

还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP）由实施例二中合成的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物（PEG-P(TMC-g-SSDM1)）和实施例五中合成的cRGD多肽端基键合的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物（cRGD-PEG-P(TMC-g-SSDM1)）通过溶剂置换方法制备得到，用于进一步分析研究。800 μL磷酸盐缓冲溶液（PB，10 mM，pH 7.4）逐滴滴加到160 μL的PEG-P(TMC-g-SSDM1) 的DMF溶液（5 mg/mL）和40 μL的cRGD-PEG-P(TMC-g-SSDM1) 的DMF溶液（5 mg/mL）混合液中，然后装入透析袋（MWCO 7000）中透析12 h，至少换五次水，透析介质为PB（10 mM，pH 7.4）。得到的纳米药物尺寸由动态光散射粒度分析仪（DLS）测得为 45 nm，粒径分布很窄PDI为0.09，见图7，由图可知，TEM测得纳米药物粒子分布均匀，且尺寸与动态光散射法测得的相近。上述还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP）在10%的胎牛血清和DMEM培养基存在下均保持不变的粒径和粒径分布，参见图8，但在模拟肿瘤细胞还原环境下二硫键快速断裂，参见图9。

实施例八荧光DOX包载聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（DOX-MMP）的制备

荧光阿霉素（DOX）包载的还原响应的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（DOX-MMP）通过溶剂置换方法制备得到。800 μL磷酸盐缓冲溶液（PB，10 mM，pH 7.4）逐滴滴加到200 μL实施例二中合成的PEG-P(TMC-g-SSDM1) 的DMF溶液（5 mg/mL）和20 μL的DOX的DMF溶液（5 mg/mL）的混合液中，然后装入透析袋（MWCO 7000）中透析12 h，至少换五次水，透析介质为PB（10 mM，pH 7.4）。得到的纳米药物尺寸由动态光散射粒度分析仪（DLS）测得为 44nm，粒径分布很窄PDI为0.12。

实施例九荧光DOX包载的还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（DOX-cRGD-MMP）的制备

荧光DOX包载的还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（DOX-cRGD-MMP）由实施例二中合成的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物（PEG-P(TMC-g-SSDM1)）和实施例五中合成的cRGD多肽端基键合的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物（cRGD-PEG-P(TMC-co-PDSC)）通过溶剂置换方法制备得到。800 μL磷酸盐缓冲溶液（PB，10 mM，pH 7.4）逐滴滴加到160 μL的PEG-P(TMC-g-SSDM1) 的DMF溶液（5 mg/mL）、40 μL的cRGD-PEG-P(TMC-g-SSDM1) 的DMF溶液（5 mg/mL）和20 μL的DOX的DMF溶液（5mg/mL）混合液中，然后装入透析袋（MWCO 7000）中透析12 h，至少换五次水，透析介质为PB（10 mM，pH 7.4）。得到的纳米药物尺寸由动态光散射粒度分析仪（DLS）测得为 49 nm，粒径分布很窄PDI为0.19。

实施例十还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP）和还原响应的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（MMP）体外释放行为研究

通过溶剂置换法制备得到cRGD-MMP以及MMP纳米药物溶液，胶束浓度为0.8 mg/mL。两胶束对药物的释放实验于37℃下在两种不同的释放介质中进行，包括PB (pH 7.4,10 mM)和10 mM GSH的PB (pH 7.4, 10 mM)溶液。将0.5 mL的cRGD-MMP和MMP纳米药物溶液装入透析袋 (MWCO 12000)中，并置于30 mL相应的释放介质中。在每个设定的时间点，取出5 mL的释放介质，并补加相应5 mL的新鲜介质。美登素 (DM1) 的释放量以及纳米药物中剩余量通过高效液相色谱进行测定，每个释放实验平行进行三次，最终现实的是实验所得的平均值。附图10为美登素 (DM1) 累积释放量与时间的关系，从图中可以看出，加入模拟肿瘤细胞内GSH后，其释放明显要快于没加GSH的样本，说明无论靶向还是不靶向的纳米药物在10 mM的GSH的存在下，均能有效释放药物。

实施例十一 MTT法测自由美登素 (DM1)、还原响应的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（MMP）和还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP）对B16F10黑色素瘤细胞的毒性

实验所采用的细胞主要为αvβ3受体过量表达的黑色素瘤细胞（B16F10），该细胞从中科院上海细胞库所购得。B16F10细胞所使用的培养液为DMEM培养液，同时含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。培养箱环境为5%二氧化碳和37℃恒温。

实验过程中自由美登素（DM1）、MMP和cRGD-MMP的浓度范围均为0.001μg DM1equiv./mL 到 10μg DM1 equiv./mL。具体步骤如下：先把80µL B16F10细胞液铺于96孔板培养板中，且细胞的最终密度为3×10³个/孔，而后置于培养箱中过夜，细胞的单层覆盖率达到80%左右。随后向每孔中加入20 µL稀释好的不同浓度的自由美登素（DM1）、MMP和cRGD-MMP纳米药物溶液，置于培养箱中培养4 h后,移除原有的培养基并向每孔中加入100 µL新鲜培养液。继续置于培养箱中培养68 h后，向每孔中加入20µL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的PBS溶液(5mg/mL)，继续培养4 h后移除上清液，并采用150μLDMSO溶解紫色甲瓒结晶，溶解完全后使用酶标仪(BioTek)测定每个孔在490 nm处的吸收值。每组实验平行进行四次，最终所得实验结果为四次所得平均值。细胞相对存活率是实验组与空白细胞对照组在490 nm处的吸收值相比得到。

细胞存活率(%)=(OD490nm样品/OD490nm对照)×100%

图11为自由美登素（DM1）、MMP和cRGD-MMP对B16F10黑色素瘤肿瘤细胞的毒性测试结果图，结果表明，本发明的聚碳酸酯美登素前药具有更好地抗肿瘤细胞效果，尤其cRGD-MMP具有明显更优异的细胞杀伤能力。

实施例十二采用流式分析仪（FACS）观察聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP、MMP）对B16F10黑色素瘤细胞细胞內吞行为研究

其具体步骤如下：先把1mL B16F10细胞液铺于6孔板培养板中，且细胞的最终密度为4×10⁵个/孔，而后置于培养箱中过夜，细胞的单层覆盖率达到80%左右。随后将包载荧光DOX的cRGD-MMP（DOX-cRGD-MMP）的溶液（DOX浓度：10μg/mL）加入到每孔中，在培养箱中培养4小时后，移除培养液并用含0.03 % (w/v) EDTA的胰蛋白酶消化细胞，随后重复操作离心PBS洗涤两次，最后将将细胞液均匀分散于500 µLPBS中；DOX –MMP一样操作。图12为MMP和cRGD-MMP对B16F10黑色素瘤肿瘤细胞的內吞行为流式结果图，结果表明本发明的聚碳酸酯美登素前药具有良好的细胞內吞能力；尤其是cRGD-MMP具有明显更优异的细胞內吞能力。

实施例十三采用共聚焦显微镜（CLSM）观察聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP、MMP）对B16F10黑色素瘤细胞细胞內吞行为研究

激光共聚焦实验的具体步骤如下：先把400µL B16F10细胞液铺于24孔板培养板中，且细胞的最终密度为3×10⁴个/孔，而后置于培养箱中过夜，细胞的单层覆盖率达到80%左右。随后将包载荧光DOX的cRGD-MMP（DOX-cRGD-MMP）的溶液（DOX浓度：10μg/mL）加入到每孔中，在培养箱中培养1或4小时后，移除培养液并用PBS重复清洗3次。随后用4%的多聚甲醛室温固定细胞 15 min，PBS重复清洗3次；接着用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核染色10 min，PBS重复清洗3次；DOX –MMP一样操作。图13为MMP和cRGD-MMP对B16F10黑色素瘤肿瘤细胞的内吞行为CLSM结果图，结果表明本发明的聚碳酸酯美登素前药具有良好的细胞内吞能力；尤其是cRGD-MMP具有明显更优异的细胞内吞能力。

实施例十四还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP）和还原响应的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（MMP）在小鼠体内的药物动力学研究

所有动物实验操作符合苏州大学动物实验中心和苏州大学动物保护和使用委员会的批准规定，选用的实验动物均为C57BL/6黑鼠，雌性，5周龄，体重为16~18克。在体内血液循环实验中，cRGD-MMP和MMP纳米药物均是通过尾静脉注射到昆明鼠体内，每组各有3只实验动物。两组纳米药物动物采血时间设定为0.05、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24 h，每个时间点的采血量均为30 μL。取血结束后将血样称重，通过差量法准确计算血液重量，向每个血样中200 µL 甲醇溶液，超声使其充分裂解，后再加入0.6 mL二甲亚砜，置于摇床中放置过夜，然后离心（13000 r.p.m. × 20 min）后，取上层清液，并向上层清液中加入过量的DTT，最后将样品采用高效液相色谱法（HPLC）进行测量。

%ID/g=（FL样品×(V曲拉通+V二甲亚砜)）/（M血×FL标样×V标样×标样稀释倍数）×100%。

图14为MMP和cRGD-MMP纳米药物在老鼠体内的药物动力学结果图，结果发现本发明的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药纳米药物均具有较长的循环时间。

实施例十五还原响应的cRGD多肽靶向的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP）和还原响应的聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（MMP）在小鼠体内的最大耐受剂量研究

将cRGD-MMP和MMP纳米药物通过单次尾静脉注射到老鼠体内，两组纳米药物的给药剂量依次为4，6，8 mg DM1 equiv./kg，此外还有一组老鼠通过注射生理盐水作为对照。随后在接下来的10天内记录老鼠体重和生存率变化，同时还观察老鼠是否出现显著的病理性特征，如行动变迟缓，背部变佝偻，粪便及眼睛分泌物异常，皮肤是否有异常变化等等。最大耐受剂量定义为在给药10天观察期内没有发生死亡或重大生理药物毒副作用或小鼠体重减少不超过原体重15%。

图15和图16分别为cRGD-MMP和MMP纳米药物在老鼠体内的最大耐受剂量结果图。结果发现两组纳米药物的最大耐受剂量均为6 mg DM1 equiv./kg，高于现有测得的自由美登素的最大耐受剂量（1 mg DM1 equiv./kg）。

实施例十六聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束（cRGD-MMP、MMP）对荷B16F10黑色素瘤老鼠的抗肿瘤研究

cRGD-MMP纳米药物对荷B16F10黑色素瘤老鼠的抗肿瘤研究实验中，选用肿瘤大小为30~50 mm³的动物开始实验，建模方法如下：在荷瘤小鼠造模中，我们首先用戊巴比妥钠（80 mg/kg）经腹腔注射麻醉动物，然后将B16F10细胞悬液（50 μL，含有8×10⁶个细胞）经皮下注射到小鼠背部靠下位置。

共设有六组，分别是cRGD-MMP纳米药物（2.4 mg DM1 equiv./kg），cRGD-MMP纳米药物（1.6 mg DM1 equiv./kg），cRGD-MMP纳米药物（0.8 mg DM1 equiv./kg），MMP纳米药物（2.4 mg DM1 equiv./kg），自由美登素药物（0.8 mg/kg），和生理盐水组（PBS），每组各有8只动物。给药频次为：每2天给药一次，总共给药3次，其中第一次给药的时间定义为第0天。治疗过程中，每1-2天测量小鼠的体重和肿瘤体积，肿瘤体积的测量方法为：用游标卡尺分别测量肿瘤的长度（L）、宽度（W）和厚度（H）,则肿瘤的体积（V）可计算为：V＝（L×W×H）/2。相对肿瘤体积是通过V/V₀（V₀为第0天测定的肿瘤体积）计算得到的，而相对体重变化是通过M/M₀（M₀为第0天称量的裸鼠体重）计算得到的。实验考察过程中，小鼠出现自然死亡或肿瘤体积超过1000 mm³即判定为实验终点。到10天治疗结束时，从每组中取出3只老鼠，剩余的5只老鼠观察荷瘤老鼠的存活时间，对取出所有老鼠的肿瘤进行拍照和称重，肿瘤抑制率的计算方法为：

肿瘤抑制率（%）=（（生理盐水组肿瘤平均体重-各个实验组肿瘤平均体重）/生理盐水组肿瘤平均体重）× 100

治疗结束后，将每组中肿瘤体积处于中等大小的动物处死一只，解剖剥下肿瘤，并取出主要脏器（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏），做组织切片分析。具体方法是：将各组织在福尔马林溶液中固定48小时后，进行石蜡包埋切片，用苏木精和伊红（H&E）染色。最后使用光学显微镜（Olympus BX41 microscope）进行观察拍照。

图17到图21为各组荷B16F10黑色素瘤老鼠的抗肿瘤研究结果图。结果显示生理盐水组的肿瘤生长最快，自由美登素组有一定的抗肿瘤活性，cRGD-MMP纳米药物（2.4 mg DM1equiv./kg）具有最强的抗肿瘤活性，其肿瘤抑制率达到97.5%，比MMP纳米药物的肿瘤抑制率（87.5%）明显要高；同时发现随着剂量的增加，肿瘤的抑制效果越好；老鼠存活时间结果也显示cRGD-MMP纳米药物具有最长的存活时间；同时所有组的老鼠在治疗过程中体重并没有发生很大的变化。

实施例十七聚合物（PEG-P(CL-co-PDSC)）的合成

在氮气环境下，86.7 mg（0.32 mmol）二硫吡啶碳酸酯单体（PDSC）和91.2 mg（0.8mmol）的己内酯（CL）溶在2 mL二氯甲烷中，加入密封反应器里，然后加入0.1 g（0.02 mmol）CH₃O-PEG-OH (5 K) 和0.5 mL的催化剂双（双三甲基硅基）胺锌的二氯甲烷溶液（0.1 mol/L），接着把反应器密封好，转移出手套箱，40 ℃油浴中反应24小时后，冰乙酸终止反应，冰乙醚中沉淀，最终经过过滤、真空干燥得到聚合物PEG-P(TMC-co-PDSC)。产率为85.5%。核磁计算得到分子量为11.8 kg/mol，CL和PDSC的聚合度分别为40和10.2。

实施例十八两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物（PEG-P(CL-g-SSDM1)）的合成

氮气保护下，于100mL的三口烧瓶中依次加入溶解在10mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中的聚合物PEG-P(CL-co-PDSC)（100 mg, 0.088 mmol 二硫吡啶官能团），同时向其中加入催化量的（100 μL）冰醋酸，接着向三口瓶中逐滴加入25 mL 巯基功能化的美登素（DM1）(97.8 mg, 0.135 mmol)的DMF溶液，反应器放置在35℃的油浴中，搅拌反应48小时后，依次在DMF及水中透析（Spectra/Pore, MWCO 7000），冻干，产率79%。核磁计算得到分子量为18.1 kg/mol。

实施例十九聚合物（Mal-PEG-P(CL-co-PDSC)）的合成

在氮气环境下，86.7 mg（0.32 mmol）二硫吡啶碳酸酯单体（PDSC）和91.2 mg（0.8mmol）的己内酯（CL）溶在2 mL二氯甲烷中，加入密封反应器里，然后加入0.1 g（0.02 mmol）MAL-PEG-OH (5 K) 和0.5 mL的催化剂双（双三甲基硅基）胺锌的二氯甲烷溶液（0.1 mol/L），接着把反应器密封好，转移出手套箱，40 ℃油浴中反应24小时后，冰乙酸终止反应，冰乙醚中沉淀，最终经过过滤、真空干燥得到聚合物MAL-PEG-P(TMC-co-PDSC)。产率为85.5%。核磁计算得到分子量为12 kg/mol，CL和PDSC的聚合度分别为40和11.1。

实施例二十叶酸端基键合的聚合物（FA-PEG-P(CL-co-PDSC)）的合成

将MAL-PEG-P(CL-co-PDSC) （50 mg，3.84 μmol）的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（2.5mL）的溶液通过溶剂交换法制备得MAL-PEG-P(CL-co-PDSC)的胶束，所得聚合物胶束浓度约为3 mg/mL，而后对胶束转移至100 mL的三口瓶中，并适当鼓泡保证氮气环境，随后向其中加入FA-SH（2.9 mg，5.76 μmol），置于35 ℃油浴锅中搅拌24 h，而后在去离子水中透析（Spectra/Pore, MWCO 3500），冻干，并保存于-20℃冰箱中。产率78%。核磁结果显示马来酰亚胺的核磁特征峰完全消失，且FA特征峰的出现表明叶酸反应完全。同时聚合物中二硫吡啶特征峰的积分值并没减少，表明FA-SH并未与二硫吡啶发生硫硫交换副反应。

实施例二十一叶酸端基键合的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物（FA-PEG-P(TMC-g-SSDM1)）的合成

氮气保护下，于50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在3mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中的叶酸端基键合的聚合物FA-PEG-P(CL-co-PDSC)（40 mg, 0.036 mmol 二硫吡啶官能团），同时向其中加入催化量的（30 μL）冰醋酸，接着向三口瓶中逐滴加入10 mL 巯基功能化的美登素（DM1）(39.9 mg, 0.054 mmol)的DMF溶液，反应器放置在35℃的油浴中，搅拌反应48小时后，依次在DMF及水中透析（Spectra/Pore, MWCO 7000），冻干，产率73%。核磁结果表明其结构为叶酸端基键合的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物，美登素的载药量为40.6 wt.%。

实施例二十二半乳糖端基键合的聚合物（Gal-PEG-P(CL-co-PDSC)）的合成

将MAL-PEG-P(CL-co-PDSC) （50 mg，3.84 μmol）的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（2.5mL）的溶液通过溶剂交换法制备得MAL-PEG-P(CL-co-PDSC)的胶束，所得聚合物胶束浓度约为3 mg/mL，而后对胶束转移至100 mL的三口瓶中，并适当鼓泡保证氮气环境，随后向其中加入Gal-SH（2.5 mg，5.76 μmol），置于35 ℃油浴锅中搅拌24 h，而后在去离子水中透析（Spectra/Pore, MWCO 3500），冻干，并保存于-20℃冰箱中。产率78%。核磁结果显示马来酰亚胺的核磁特征峰完全消失，且Gal特征峰的出现表明叶酸反应完全。同时聚合物中二硫吡啶特征峰的积分值并没减少，表明Gal-SH并未与二硫吡啶发生硫硫交换副反应。

实施例二十一半乳糖端基键合的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物（FA-PEG-P(TMC-g-SSDM1)）的合成

氮气保护下，于50mL的三口烧瓶中依次加入溶解在3mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中的半乳糖端基键合的聚合物Gal-PEG-P(CL-co-PDSC)（40 mg, 0.036 mmol 二硫吡啶官能团），同时向其中加入催化量的（30 μL）冰醋酸，接着向三口瓶中逐滴加入10 mL 巯基功能化的美登素（DM1）(39.9 mg, 0.054 mmol)的DMF溶液，反应器放置在35℃的油浴中，搅拌反应48小时后，依次在DMF及水中透析（Spectra/Pore, MWCO 7000），冻干，产率73%。核磁结果表明其结构为叶酸端基键合的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药聚合物，美登素的载药量为40.6 wt.%。

改变不同类型的靶向分子或含有靶向分子的聚合物，以此为基础，根据上述实施例的制备方法，可以制备多种还原响应的靶向聚碳酸酯美登素前药胶束，具体应用结果见表3-5，比例为表1聚合物与表2聚合物的质量比。

表3还原响应的cRGD靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束对荷黑色素瘤小鼠的抗肿瘤活性研究

表4还原响应的叶酸靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束对荷KB细胞瘤小鼠的抗肿瘤活性研究

表5还原响应的半乳糖靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束对荷HepG2细胞瘤小鼠的抗肿瘤活性研究

本发明公开的还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束具有以下几个优点：大大增强了美登素在水中的溶解性；胶束具有的EPR效应和主动靶向性使得其在病灶部位的浓度得到很大的提高，进而提高了药物的生物利用度；在血液循环过程中足够的稳定，极大地降低了非特异性的释药行为；载药量很大水平地提高并且可控；尤其是本发明中靶向多功能性的聚合物前药胶束既包含了聚合物前药的优点又囊括了胶束的优点。相比普通的聚合物前药，它显著地提高了在肿瘤部位的富集和穿透能力，提高了被肿瘤细胞的摄取能力，且药物分子在肿瘤细胞内可快速有效地释放。

Claims

1.一种还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束，由两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药和末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药在缓冲液中自组装得到；其特征在于，所述还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束的制备方法包括以下步骤：

（1）在聚乙二醇引发剂存在下，使二硫吡啶碳酸酯和含有R2基团的碳酸酯单体开环共聚合得到两亲性生物可降解聚乙二醇-聚碳酸酯；然后两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯与巯基化的美登素进行巯基-二硫交换反应得到两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药；所述R2基团选自以下基团中的一种：

；

（2）在官能化聚乙二醇引发剂存在下，使二硫吡啶碳酸酯和含有R2基团的碳酸酯单体开环共聚合得到末端官能化的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；然后将末端官能化的聚乙二醇-聚碳酸酯采用溶剂置换法制备得到末端官能化的聚乙二醇-聚碳酸酯胶束，接着将末端官能化的聚乙二醇-聚碳酸酯胶束与靶向分子进行加成反应得到末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；最后末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯与巯基化的美登素进行巯基-二硫交换反应得到末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药；所述R2基团选自以下基团中的一种：

；

2.根据权利要求1所述还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束，其特征在于：所述还原响应的靶向聚碳酸酯美登素前药胶束中，末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药的质量百分数大于0小于等于60%；所述缓冲液为磷酸缓冲液；所述还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束的粒径为30～150纳米；所述还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束中，美登素的载药量为2～60 wt.%。

3.根据权利要求1所述还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束，其特征在于：

步骤（1）具体为，在氮气环境中，二硫吡啶碳酸酯、含有R2基团的碳酸酯和聚乙二醇溶解在第一溶剂中，然后加入第一催化剂，于密闭反应器中，进行开环共聚合反应，得到两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；在氮气环境中，将两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯和巯基化美登素溶解在第二溶剂中，加入第二催化剂，在密封反应器中，进行巯基-二硫交换反应，然后透析得到两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药；

步骤（2）具体为，在氮气环境中，二硫吡啶碳酸酯、含有R2基团的碳酸酯和官能化聚乙二醇溶解在第三溶剂中，并向其中加入第三催化剂，于密闭反应器中，进行开环共聚合反应，得到末端官能化的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；在氮气环境中，将靶向分子加入末端官能化的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯胶束水溶液中进行加成反应，然后透析、干燥得到末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯；然后在氮气环境中，将末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯和巯基化美登素溶解在第四溶剂中，加入第四催化剂，在密封反应器中，进行巯基-二硫交换反应，然后透析得到末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药；

步骤（3）具体为，将两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药与末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药分别溶解于第五溶剂中，混合后滴加缓冲液，然后透析得到还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束。

4.根据权利要求3所述还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束，其特征在于：

步骤（1）中，第一催化剂为双（双三甲基硅基）胺锌；第一溶剂为二氯甲烷；开环共聚合反应的温度为40℃，时间为24 h；第二催化剂为冰醋酸；第二溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或者二甲亚砜；巯基-二硫交换反应的温度为40℃，时间为48 h；

步骤（2）中，第三催化剂为双（双三甲基硅基）胺锌；第三溶剂为二氯甲烷；开环共聚合反应温度为40℃，时间为24 h；第四溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或者二甲亚砜；加成反应的温度为35℃，时间为24h；第四催化剂为冰醋酸；第四溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或者二甲亚砜；巯基-二硫交换反应的温度为40℃，时间为48 h；所述靶向分子为抗体分子、多肽分子、糖分子或者生物小分子；所述官能化聚乙二醇的化学结构式为：

其中，R1为以下基团：

步骤（3）中，第五溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或者二甲亚砜；末端键合靶向分子的两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药占胶束质量的0～60%，不包括0；所述缓冲液为磷酸缓冲液。

5.权利要求1所述还原响应的靶向聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药胶束在制备肿瘤治疗药物中的应用。

6.一种纳米药物，包括权利要求1所述还原响应的靶向聚碳酸酯美登素前药胶束。

7.一种两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药，其特征在于：所述两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药的制备方法包括以下步骤：

；

。

8.权利要求7所述两亲性聚乙二醇-聚碳酸酯美登素前药在制备肿瘤治疗药物中的应用。