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CN106573976A - 抗cd84抗体、包含所述抗体的组合物及其用途 - Google Patents

抗cd84抗体、包含所述抗体的组合物及其用途 Download PDF

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CN106573976A CN201580018065.1A CN201580018065A CN106573976A CN 106573976 A CN106573976 A CN 106573976A CN 201580018065 A CN201580018065 A CN 201580018065A CN 106573976 A CN106573976 A CN 106573976A
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Abstract

一种包含抗原识别结构域的分离的抗体，其特异性结合CD84和(i)减量调节基质细胞对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞的抗凋亡活性；和/或(ii)诱导CLL细胞移动出骨髓。亦提供包含抗原识别结构域的抗体及其用途，所述抗原识别结构域包含如所示的互补决定区。

Description

抗CD84抗体、包含所述抗体的组合物及其用途
发明领域和背景
本发明在其一些实施方案中涉及抗CD84抗体、包含所述抗体的组合物及其用途。
在正常个体中，外周淋巴细胞群在大小上为恒定的。淋巴样稳态（lymphoidhomeostasis）的控制是淋巴细胞产生、存活和增殖之间的非常好的平衡的结果。已显示存活因子在维持淋巴细胞稳态上起极其重要的作用。
慢性淋巴细胞性白血病，为西方世界最常见的白血病，以CD5+小型成熟淋巴细胞在外周血、淋巴样器官和骨髓中的进行性蓄积为特征。所述疾病的标志为凋亡减少，导致这些恶性细胞蓄积。尽管近几年在认识所述疾病的生物学和病理生理学以及开发更好的治疗形式上有重大进展，但CLL在大多数患者中仍为不可治愈的，甚至控制所述疾病需要具有显著副作用的侵略性治疗。对涉及所述疾病的发病机制和进展的细胞事件的更好认识，应导致更多靶向且更少毒性的疗法，连同在处于风险中的患者中的早期治疗，可能使其能够治愈。
CD84为细胞表面分子的免疫球蛋白超家族的CD2亚群。其为具有199 aa胞外部分的单链细胞表面蛋白，所述胞外部分含有四个可能的N-糖基化位点。跨膜区由25 aa组成，以及83 aa胞质尾含有四个酪氨酸[delaFuente等，Blood. 1997；90:2398-2405]。所述人CD84与鼠CD84有57.3%一致性。CD84主要通过B细胞、T细胞、血小板、单核细胞、树突细胞(DC)表达，以及CD84亦在血细胞生成早期表达[Calpe等，Advances in Immunology (免疫学进展)，第97卷. 2008；97:177-250]。
本发明人先前已显示，CD84的表达从所述疾病的早期显著升高，并且通过巨噬细胞移动抑制因子及其受体CD74调节。细胞表面CD84的激活引发增强CLL细胞存活的信号级联。减量调节CD84表达及其免疫介导的阻断二者在体外及体内诱导细胞死亡。此外，来源于正在进行的临床试验的样品分析显示经milatuzumab处理的细胞中CD84信使RNA和蛋白质水平减少，所述临床试验中使用人源化抗CD74 (milatuzumab)处理人受试者。此减量调节与Bcl-2和Mcl-1表达减少相关。因此，CD84在CLL中的过表达为重要的生存机制，其似乎为所述疾病的发病机制中的早期事件(Binsky-Ehrenreich等，2013年2月25日电子出版，Oncogene)。
WO2010/035259教导作为调节蛋白的CD84，其对于CLL细胞的生存而言为必需的。基于此研究结果，WO2010/035259的发明人已提出将CD84作为用于B-CLL治疗的靶标以及作为用于所述疾病的标志物的用途。
另外涉及的文献：
美国专利申请号20050027114，公开通过抵制或对抗（agonizing and antagonizing）CD84样多肽的活性来治疗诸如慢性白血病等疾病的方法。
美国专利申请号20050025789公开使用表达协同刺激多肽(例如CD84)的肿瘤细胞以产生用于增加NK细胞的细胞溶解活性的疫苗，治疗或预防患者中的肿瘤。
发明概述
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种包含抗原识别结构域的分离抗体，其特异性结合CD84和：
(i)减量调节基质细胞对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞的抗凋亡活性；和/或
(ii)诱导CLL细胞移动（mobilization）出骨髓。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含抗原识别结构域的分离抗体，所述抗原识别结构域包含如在SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6中所述的互补决定区(B4)，其中所述抗体特异性结合CD84。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含抗原识别结构域的分离抗体，所述抗原识别结构域包含如在SEQ ID NO: 7、8、9、10、11和12中所述的互补决定区(B1)，其中所述抗体特异性结合CD84。
根据本发明的一些实施方案，所述分离的抗体减量调节基质细胞对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞的抗凋亡活性。
根据本发明的一些实施方案，所述分离的抗体抑制CCL3从CLL细胞中分泌。
根据本发明的一些实施方案，所述分离的抗体抑制BCL-2在CLL和基质细胞中表达。
根据本发明的一些实施方案，所述分离的抗体抑制基质Bcl-2表达，从而减小基质对CLL的抗凋亡作用。
根据本发明的一些实施方案，所述分离的抗体减少基质细胞中支持CLL生存的细胞因子样IL-6和IL-8的表达。
根据本发明的一些实施方案，所述分离的抗体诱导CLL细胞移动出骨髓。
根据本发明的一些实施方案，所述分离的抗体为IgG。
根据本发明的一些实施方案，所述抗体为人源化抗体或嵌合抗体。
根据本发明的一些实施方案，所述抗体为双特异性抗体。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种药物组合物，其包含所述分离的抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供在患有B细胞恶性肿瘤的受试者的B细胞中诱导凋亡的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗上有效量的所述抗体，从而在所述受试者的B细胞中诱导凋亡。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供在有需要的受试者中治疗B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗上有效量的所述抗体，从而治疗所述B细胞恶性肿瘤。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供所述抗体在制备经鉴定用于治疗B细胞恶性肿瘤的药剂中的用途。
根据本发明的一些实施方案，所述B细胞恶性肿瘤选自淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。
根据本发明的一些实施方案，所述B细胞恶性肿瘤选自Hodgkin淋巴瘤、非Hodgkin淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)/慢性淋巴系白血病(chronic lymphoid leukemia, CLL)、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)、结外边缘区B细胞淋巴瘤-粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、毛细胞白血病、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(Lymphoplasmocyticlymphoma)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性成淋巴细胞性前B细胞白血病、浆细胞白血病、前B细胞白血病、早期前B细胞白血病和前B急性成淋巴细胞样白血病。
根据本发明的一些实施方案，所述B细胞恶性肿瘤为B-CLL。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供在有需要的受试者中诊断B-CLL的方法，所述方法包括：
(a)使所述受试者的生物样品与权利要求1-12中任一项的抗体在这样的条件下接触，所述条件允许在CD84同种型C (SEQ ID NO: 14)和所述抗体之间形成免疫复合物；和
(b)确定所述生物样品中所述免疫复合物的水平，其中所述免疫复合物水平的增加关于来自健康个体的生物样品中的所述免疫复合物的水平超过预定阈值表示B-CLL。
根据本发明的一些实施方案，在蛋白质水平上实现所述测定。
根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括使用诊断测定法证实所述诊断，所述诊断测定法选自CD84同种型c特有的表面标志物表达、核型分析和种系突变。
根据本发明的一些实施方案，分离的多核苷酸包含编码所述抗体的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，所述分离的多核苷酸如在SEQ ID NO: 26或27中所述。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供鉴定对抗B细胞恶性肿瘤的假定药物的方法，所述方法包括：
(a)使用试验物质处理具有B细胞恶性肿瘤的模型动物；和
(b)检测如在(a)中处理的所述模型动物的周缘组织中B细胞恶性肿瘤细胞相对于骨髓中的B细胞恶性肿瘤细胞，其中与所述处理之前的所述比率相比在所述比率上的增加表示所述试验物质为对抗B细胞恶性肿瘤的假定药物。
根据本发明的一些实施方案，所述试验物质为抗CD84抗体。
根据本发明的一些实施方案，所述模型动物选自通过在小鼠中移植人CLL诱导的异种移植模型和Eu-TCL1鼠模型。
除非另有规定，否则本文所使用的所有技术和/或科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管类似或等同于本文所述方法和材料的方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方案，但仍在下文描述示例性的方法和/或材料。如有冲突，以本专利说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅为说明性的，并非意图其为必要限制。
附图简述
参考附图在本文中阐述本发明的一些实施方案，其仅作为实例。现在详细地具体参考附图，强调的是，所示详情仅作为实例，且以说明性论述本发明的实施方案为目的。在这点上，带有附图的描述使本发明的实施方案可如何实施对于本领域技术人员而言为显而易见的。
在附图中：
图1A-D显示杂交瘤B4的阻断性抗CD84抗体诱导CLL细胞死亡的能力的散点图。图1A-B-使1×107个CLL细胞与来自B4杂交瘤的抗CD84 (5 μg/ml)或对照抗体(IgG2a)一起孵育。24h之后，通过膜联蛋白7AAD染色分析CLL细胞死亡。显示的是10个独立试验中的代表性图。图1C-D-在存在或不存在来自B4杂交瘤的抗CD84 (5 μg/ml)或对照抗体的情况下，将1.6×106个CLL细胞与1×105个M210B4共培养。48 h之后，使用膜联蛋白7AAD染色确定CLL细胞死亡。显示的是3个独立试验中的代表性图。
图2A-C为显示来自B4杂交瘤的抗CD84在共培养物中介导对M210B4骨髓基质细胞的抗凋亡作用的能力的条形图。此外，在CLL细胞和基质细胞上表达的CD84的嗜同性相互作用（homophilic interaction）导致从基质中分泌细胞因子，以进一步支持CLL细胞的生存。在存在或不存在来自B4杂交瘤的抗CD84或同种型对照抗体的情况下，将M210B4细胞(1×105个)与CLL细胞共培养。48 h之后，收集细胞并通过qRT-PCR分析Bcl-2、IL-6和VCAM-1mRNA水平。所示结果为n个独立试验的概述，并表达为与阻断CD84的共培养细胞以及与M210B4细胞(仅基质，将其定义为1)相比在共培养的M210B4细胞中的表达上的变化倍数。(图2A)在Bcl-2表达上的变化倍数，n=4，P=0.037。(图2B)在IL6表达上的变化倍数，n=5，P=0.037。(图2C)在VCAM-1表达上的变化倍数，n=6，P=0.25。
图3为显示CD84调节共培养物中的CCL3分泌的条形图。在存在或不存在来自B4杂交瘤的抗CD84或同种型对照抗体(5 µg/ml)的情况下，将1.6×106个CLL细胞与1×105个M210B4细胞一起培养。48 h之后，通过ELISA分析条件培养基(conditioned medium)中的CCL3水平。图表显示CD84阻断之后在CCL3水平上的变化倍数。所述图表概述了6个试验，*P=0.02。
图4A-H显示，与F8抗体相比，本发明的一些实施方案的抗体在杀伤B-CLL细胞上更有优势，如通过Magic Red凋亡测定法所确定。图4A-D-用补充以10% FSC、2 mM谷氨酸盐、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI培养基(含或不含来源于抗CD84杂交瘤(F8/B1/B4)或对照杂交瘤的上清液)以1×107个细胞/孔的密度在24孔板中将纯化的CLL细胞培养24 h。根据制造商说明书，将细胞离心、洗涤并于37℃与Magic Red (ImmunochemistryTechnology)一起孵育1 h。然后，通过FACS分析测量Magic Red染色。图4E-H-用补充以10%FSC、2 mM谷氨酸盐、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI培养基(含或不含来源于抗CD84杂交瘤(F8/B1/B4)或对照杂交瘤的上清液)以1×107个细胞/孔在24孔板中将Ramos细胞培养24 h。根据制造商说明书，将细胞离心、洗涤并于37℃与Magic Red(Immunochemistry Technology)一起孵育1 h。然后，通过FACS分析测量Magic Red染色。
图5A-B为显示CD84KO小鼠的BM中CLL细胞数量减少的散点图。将1×107个CLL细胞用CFSE染色并静脉内注射到C57BL/6 WT或CD84KO小鼠中。1 h (图5B)和4 h (图5A)之后，将小鼠处死并通过FACS分析脾和BM中的CLL细胞数量。所述图表显示从各组的16只小鼠(图5A，*P=0.0005)或各组的6只小鼠(图5B，组间无统计学显著差异)的BM中回收的标记细胞与从脾中回收的细胞数量的比率。
图6A-M显示，B1和B4抗体识别来源于TCL-1小鼠的鼠细胞。图6A为显示在来源于TCL-1小鼠的B220+CD5+细胞上的CD84表达(黑线)或用匹配同种型的对照抗体染色(灰线)的直方图；图6B-D为显示来源于18、11和6月龄TCL-1小鼠的脾细胞中的B220+CD5+的百分数的散点图；和图6E-M为散点图。使来源于脾TCL-1小鼠的1×107个B220+CD5+细胞与B1或B4或匹配同种型的对照抗体(IgG2a)一起孵育。48 h之后，通过膜联蛋白-7AAD染色分析细胞死亡。
图7A-D显示B1和B4抗体在不同肿瘤细胞系中的治疗潜力的评价。图7A阐述了在不同实体瘤中分析的CD84和肌动蛋白的mRNA水平：MDA435 (人乳腺癌)、PC-3 (人前列腺癌)、Hela (人子宫颈癌)、A375 (人恶性黑素瘤)、A549 (人肺腺癌)、PAC1 (人胰腺癌)和N87(人胃癌)；图7B为显示在Daudi细胞上的CD84表达(黑线)或用匹配同种型的抗体染色(灰线)的直方图；图7C-D显示与B1或B4抗体或者对照抗体(IgG2a)一起孵育的1×107个Daudi细胞。48 h之后，通过膜联蛋白-7AAD染色分析细胞死亡。所述图表概述了7个独立试验，显示相比于与匹配同种型的对照抗体一起孵育的Daudi细胞，在膜联蛋白阳性细胞上的变化倍数。
图8A-F显示CLL细胞中CD84的表达升高。(图8A)将来源于健康受试者(正常；N=4)以及早期(N=6)和晚期(N=6) CLL患者的B细胞纯化并检测CD84表达。通过RT-PCR分析CD84和肌动蛋白mRNA；(图8B)使用针对CD84和RP-2的引物进行qRT-PCR。结果表达为与正常B细胞(将其定义为1)相比在CLL细胞的CD84 mRNA上的倍数变化。所述图表概述了三个正常供者和七个CLL患者的结果；(图8C-E)显示正常B细胞和CLL细胞中的CD84表达(灰线)或仅用第二Ab染色(虚线)的直方图。所述图表以百分数或MFI概述了4个正常供者和18个CLL患者的结果；(图8F)散点图显示在CD19阳性细胞正常细胞(N=3)和CLL细胞(N=4)上的CD84和CD5表达。
图9A-J显示，B1和B4抗体不会在正常B细胞中诱导凋亡。将来源于6、8和11月龄C57BL/6小鼠的1×107个B220+脾细胞与B1或B4抗体或者对照抗体(IgG2a)一起孵育。48 h之后，通过膜联蛋白-7AAD染色分析细胞死亡。图表概述了3个独立试验，显示在与B1、B4或匹配同种型的对照抗体一起孵育的B220+活细胞上的变化倍数。
图10A-B显示CD84在基质细胞上表达。(图10A)将CLL、NLC和M210B4细胞纯化并检测CD84表达。通过RT-PCR分析CD84和肌动蛋白mRNA；(图10B)直方图显示CLL、NLC和M210B4细胞中的CD84表达(黑线)或仅用第二Ab的染色(灰线)。
图11A-G显示，在基质细胞上表达的CD84调节CLL细胞的生存。(图11A-C)在存在或不存在抗CD84 B4杂交瘤(5 µg/ml)或对照抗体的情况下，将1.6×106个CLL细胞与1×105个M210B4共培养。24 h之后，使用膜联蛋白7AAD染色确定CLL细胞死亡。显示的为3个独立试验中的代表性图；(图11D-G)将针对CD84的siRNA (ON-TARGETplus SMARTpool，人CD84 (NM_003874)，Dharmacon)或对照乱序(scrambled) siRNA转染到0.625×105个M210B4细胞中。18 h之后，向培养物中加入1×106个CLL细胞。48 h之后，收集CLL细胞。显示代表性散点图。图表概述了显示相对的CLL活细胞(平均数+标准误差)的9个独立试验。*P= 0.04，**P=3.1*10-10。
图12A-D显示，使用B1和B4抗体阻断基质上的CD84减少CLL细胞的存活。使0.625×105个M210B4细胞与B1或B4抗体或者对照抗体(IgG2a)一起孵育。1 h之后，洗涤所述抗体并添加1×106个CLL细胞。48 h之后，通过膜联蛋白-7AAD染色测量细胞存活。所述图表概述了3个独立试验，其显示相比于与同种型对照抗体处理的基质一起孵育的CLL细胞，在CLL活细胞上的变化倍数。
本发明具体实施方案详述
本发明在其一些实施方案中涉及抗CD84抗体、包含所述抗体的组合物及其用途。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解的是，本发明在其应用上不必须限于下列详述中所述或实施例所举例说明的详情。本发明能够有其它实施方案或者以多种方式实践或实施。
慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以CD5+ B淋巴细胞在外周血、淋巴样器官或骨髓中的蓄积为特征。所述疾病的主要特征为因凋亡减少所致的恶性细胞蓄积。CD84属于免疫受体的信号转导淋巴细胞激活分子家族，并且在CLL细胞中具有未知的功能。本发明人先前已证明，CD84的表达从所述疾病的早期显著升高，并且通过巨噬细胞移动抑制因子及其受体CD74调节。细胞表面CD84的激活引发增强CLL细胞生存的信号级联。减量调节CD84表达及其免疫介导的阻断二者在体外及体内诱导细胞死亡。此外，来源于正在进行的临床试验的样品分析显示经milatuzumab处理的细胞中CD84信使RNA和蛋白质水平减少，所述临床试验中使用人源化抗CD74 (milatuzumab)处理人受试者。此减量调节与Bcl-2和Mcl-1表达减少相关。因此，CD84在CLL中的过表达为重要的生存机制，其似乎为所述疾病的发病机制中的早期事件(Binsky-Ehrenreich等，2013年2月25日电子出版，Oncogene，WO2010/035259)。这些研究结果提示基于阻断该CD84依赖性生存途径的新治疗策略。
本发明人目前认识到，在B-CLL细胞和基质细胞中表达的CD84之间的嗜同性相互作用在癌细胞中诱导生存信号并独立地使所述细胞保留在骨髓的基质环境中(参见图5A-B)。本发明人进一步揭示的是，CD84在多种类型的淋巴细胞上(图7B和图10A)以及在不同类型的基质细胞上表达。这表明CD84可能涉及CLL细胞与其微环境之间的细胞-细胞相互作用(参见图10A)。
因此，在筛选阻断CLL的CD84依赖性生存途径并诱导CLL细胞移动出骨髓的新抗体的同时，本发明人亦鉴定了诱导CLL细胞凋亡并保护其免受与之一起共培养的基质细胞的抗凋亡活性和粘附活性的新抗体。来源于B1和B4杂交瘤的抗体能够减量调节CCL3从CLL分泌(实施例4)，以及与WO2010/035259中描述的先前分离的抗CD84抗体相比，以更有优势的方式诱导纯化的CLL细胞和Ramos细胞凋亡(实施例5)。这些结果将本发明抗体列为对抗CLL的重要免疫疗法。
因此，根据本发明的一方面，提供鉴定对抗B细胞恶性肿瘤(例如B-CLL)的假定药物的方法，所述方法包括：
(a)使用试验物质处理具有B细胞恶性肿瘤(例如B-CLL)的模型动物；和
(b)检测如在(a)中处理的所述模型动物的周缘组织中B细胞恶性肿瘤细胞（例如B-CLL）相对于骨髓中的B细胞恶性肿瘤细胞（例如B-CLL），其中与所述处理之前的所述比率相比在所述比率上的增加表示所述试验物质为对抗B细胞恶性肿瘤的假定药物。
本文所用的“具有B细胞恶性肿瘤的模型动物”是指显示出包括B-CLL在内的B细胞恶性肿瘤的临床表现的哺乳动物，例如非人类哺乳动物。所述模型可以是自发性模型、其中移植人B细胞恶性肿瘤细胞(例如B-CLL细胞)的转基因模型或异种移植模型。
Kurtova等，Blood. 2009年11月12日；114(20):4441-50 (通过引用结合到本文中)描述了用于B-CLL的数个转基因小鼠模型。对这些小鼠模型的研究显示，对三个途径(Tcl1-Akt途径、TNF-NF-kB途径和Bcl2-介导的抗凋亡途径)解除控制，导致B-CLL形成。仅对TCL1解除控制在小鼠中导致B-CLL表型，而Bcl2的过表达需要反常地激活的TNF-NF-kB途径信号转导以产生所述疾病表型。
根据一个具体的实施方案，所述模型动物选自通过在小鼠中移植人CLL的异种移植模型和Eu-TCL1鼠模型。
本文所用的“试验物质”是指减少CD84表达或活性的分子。所述试验物质可以是小分子、核酸沉默剂(例如siRNA或反义RNA)、抗体或肽(例如干扰CD84嗜同性相互作用的可溶性CD84分子，如描述于WO2010/035259)。
根据一个具体的实施方案，所述试验物质为抗CD84抗体。
恶性B细胞(例如B-CLL细胞)的检测可使用本领域众所周知的方法进行并主要取决于所使用的模型。
因此，当使用异种移植模型时，监测移动可通过检测小鼠器官中的人源部分来进行。实例包括但不限于分析细胞表面标志物(人CD19)或预染(CFSE+)细胞。
备选地或另外地，可在移植之前将人恶性B细胞(例如B-CLL细胞)染色（例如，通过荧光，放射性同位素染色）以易于检测。
其中可监测恶性B细胞(例如B-CLL细胞)的量的周缘组织的实例包括但不限于脾、腹膜腔、外周血、淋巴结和骨髓(Durig J等，Cancer Res 2007；67: 8653-8661)。
将周缘组织中恶性B细胞(例如B-CLL细胞)相对于骨髓中的恶性B细胞(例如B-CLL细胞)的比率与对照动物进行比较。对照动物可以是处理之前相同的动物或者是用对照物质(例如PBS或盐水)处理的相同的动物，所述对照物质不会影响恶性B细胞(例如B-CLL)移动。
本文所用的“增加”是指统计学上显著的增加。因此所述增加可达至少2，5%、10%、20%、50%或更多。
使用本发明方法，抗CD84抗体可以是分离的。
因此，根据本发明的一方面，提供一种包含抗原识别结构域的分离抗体，其特异性结合CD84和，
(i)减量调节基质细胞对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞的抗凋亡活性；和/或(即另外地或备选地)
(ii)诱导CLL细胞从骨髓中移动出(至周缘器官/组织)。
本文所用的“减量调节”是指统计学上显著的减少。因此所述减少可达至少2，5%、10%、20%、50%或更多。
本文所用的“基质细胞”是指驻留于骨髓中的粘附细胞，亦称为“骨髓基质细胞”。骨髓基质细胞系和原代基质细胞系的实例在下文及上述Kurtova等中提供。
基质细胞抗凋亡活性的降低可通过诸如IL-6 (基质中)、IL-8 (基质中)和Bcl-2(B-CL-2，其在基质和CLL中均减少)等存活因子的减少来检测。
因此，根据本发明的一方面，提供包含抗原识别结构域的分离的抗体，所述抗原识别结构域包含如在SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6中所述的互补决定区(CDR) (B4)，其中所述抗体特异性结合CD84。
根据一个具体的实施方案，所述分离的抗体包含SEQ ID NO: 4 (CDR1)、5 (CDR2)和6 (CDR3) (从N至C序贯排列在所述蛋白质的轻链上)以及1 (CDR1)、2 (CDR2)和3(CDR3) (从N至C序贯排列在所述蛋白质的重链上) (克隆B4)。
或者，提供包含抗原识别结构域的分离的抗体，所述抗原识别结构域包含如在SEQID NO: 7、8、9、10、11和12中所述的互补决定区(B1)，其中所述抗体特异性结合CD84。
根据一个具体的实施方案，所述分离的抗体包含SEQ ID NO: 10 (CDR1)、11(CDR2)和12 (CDR3) (从N至C序贯排列在所述蛋白质的轻链上)以及7 (CDR1)、8 (CDR2)和9 (CDR3) (从N至C序贯排列在所述蛋白质的重链上) (克隆B1)。
具有上述CDR的本发明的抗体，统称为“本发明的抗CD84抗体”。
本文所用的术语“CD84”是指CD84基因的表达同种型。实例包括但不限于Q9UIB8-1、Q9UIB8-2、Q9UIB8-3、Q9UIB8-4、Q9UIB8-5、Q9UIB8-6和Q9UIB8-7。
根据一个具体实施方案，所述CD84是指CD84同种型C，其为分配以登记号AF054815.1 NP_003865.1 (NM_003874，Q9UIB8-3)或者为SEQ ID NO: 13或14的CD84同种型。
所述抗CD84抗体的一般亲和力优选高于约10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M并由此在生理(例如体内)条件下为稳定的。
根据一个具体的实施方案，所述亲和力优选高于(即，至少为)约10-8 M或10-9 M，例如1-50×10-9 M、1-100×10-9 M、0.5-50×10-9 M或0.5-100×10-9 M。
本文所用的术语“分离的”是指使本发明的蛋白质在制剂中为占优势形式(例如大于50%)的纯度水平。换言之，以对CD84有低亲和力或无亲和力(超过上数值)为特征的其它抗体，总共以少于所述制剂的所有抗体分子的50%存在于所述制剂中。根据一个具体的实施方案，所述抗CD84分离自生理性实施方案，例如分离自躯体(例如人或动物)。根据一个具体的实施方案，术语分离的亦意指从文库分离，例如噬菌体展示文库或者杂交瘤细胞系或文库。
本发明的抗体通常与CD84的胞外部分(SEQ ID NO: 15)结合。
本文所用的术语“表位”是指抗体互补位（paratope）与之结合的抗原上的任何抗原决定簇。
表位决定簇通常由诸如氨基酸或碳水化合物侧链等分子的化学活性表面簇组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
用于本发明的术语“抗体”包括完整的分子及其功能性片段，例如能够与巨噬细胞结合的Fab、F(ab')2和Fv。这些功能性抗体片段定义如下：(1) Fab为包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其可通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体以得到一条完整轻链和一条重链的一部分来产生；(2) Fab'为这样的抗体分子的片段，其可通过用胃蛋白酶处理整个抗体接着还原以得到一条完整轻链和一部分重链来获得；每个抗体分子得到两个Fab'片段；(3) (Fab')2为这样的抗体片段，其可通过用木瓜蛋白酶处理整个抗体无需后续还原来获得；F(ab')2为通过两个二硫键使两个Fab'片段结合在一起的二聚体；(4) Fv定义为一种遗传改造的片段，其含有作为两条链表达的轻链的可变区和重链的可变区；和(5)单链抗体(“SCA”)为一种遗传改造的分子，其含有轻链的可变区和重链的可变区，所述轻链的可变区和重链的可变区通过合适的多肽接头连接成遗传融合的单链分子。
产生多克隆和单克隆抗体及其片段的方法为本领域众所周知(参见例如Harlow和Lane，Antibodies: A Laboratory Manual (抗体：实验室指南)，Cold Spring HarborLaboratory，New York，1988，通过引用结合到本文中)。
根据本发明的抗体片段可通过抗体的蛋白水解或者通过在大肠杆菌(E. coli)或哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白质表达系统)中表达编码所述片段的DNA来制备。抗体片段可通过常规方法经由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体来获得。例如，抗体片段可通过使用胃蛋白酶酶促裂解抗体以提供表示F(ab')2的5S片段来产生。该片段可使用巯基还原剂，以及任选用于因裂解二硫键所得的巯基的封闭基团，进一步裂解以产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促裂解直接产生两个单价Fab'片段和Fc片段。这些方法例如通过Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647及其中所包含的参考文献描述，所述专利通过引用以其整体结合到本文中。亦参见Porter，R. R.[Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]。亦可使用裂解抗体的其它方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段、进一步裂解片段或者其它酶学、化学或遗传学技术，只要所述片段与完整抗体识别的抗原结合便可。
Fv片段包含VH和VL链的缔合。此缔合可以是非共价的，如描述于Inbar等，[Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720]。或者，所述可变链可通过分子间二硫键连接或者通过诸如戊二醛等化学物质交联。优选所述Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。这些结合单链抗原的蛋白质(sFv)通过构建结构基因来制备，所述结构基因包含通过寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列。将所述结构基因插入表达载体中，随后将所述表达载体引入诸如大肠杆菌等宿主细胞中。所述重组宿主细胞合成带有接头肽的单个多肽链，所述接头肽将两个V结构域桥接。用于产生sFv的方法例如通过以下描述：Whitlow和Filpula，Methods 2: 97-105 (1991)；Bird等，Science 242:423-426 (1988)；Pack等，Bio/Technology 11:1271-77 (1993)；和美国专利号4,946,778，其通过引用以其整体结合到本文中。
抗体片段的另一种形式为编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单元”)可通过构建编码目标抗体的CDR的基因来获得。所述基因例如通过使用聚合酶链反应从抗体产生细胞的RNA合成所述可变区来制备。参见例如Larrick和Fry [Methods，2: 106-10 (1991)]。
根据一个具体的实施方案，所述抗体为任何亚型的单克隆抗体，例如IgG、IgM、IgA等。根据一个具体的实施方案，所述抗体为IgG1或IgG4。
根据一个具体的实施方案，所述抗体为IgG2a (例如B4、B1)或IgG1 (例如B1)。非人类(例如鼠)抗体的人源化形式为免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)的嵌合分子，其含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自所述受者的互补决定区(CDR)的残基被替换成来自诸如小鼠、大鼠或兔等非人类物种(供者抗体)的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR的残基。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被替换成相应的非人类残基。人源化抗体亦可包含既不存在于受者抗体中又不存在于引入的CDR或框架序列中的残基。一般而言，所述人源化抗体应包括基本上全部的至少一个以及通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的CDR区均对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本上全部的FR区均为人免疫球蛋白共有序列的FR区。所述人源化抗体最好也会包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区[Jones等，Nature，321:522-525 (1986)；Riechmann等，Nature，332:323-329 (1988)；和Presta，Curr. Op.Struct. Biol.，2:593-596 (1992)]。
用于人源化非人类抗体的方法为本领域众所周知。一般而言，人源化抗体具有引入其中的来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常常称为引入残基，其通常获自引入的可变结构域。人源化可基本上遵循Winter及合作者的方法进行[Jones等，Nature，321:522-525 (1986)；Riechmann等，Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等，Science，239:1534-1536 (1988)]，通过将啮齿类动物CDRs或CDR序列替换用于人抗体的相应序列而进行。因此，所述人源化抗体为嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于一个完整的人可变结构域被替换成来自非人类物种的相应序列。实际上，人源化抗体通常为这样的人抗体，其中将一些CDR残基以及可能一些FR残基替换成来自啮齿类动物抗体中的类似位点的残基。
人抗体亦可使用本领域已知的多种技术产生，其包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter，J. Mol. Biol.，227:381 (1991)；Marks等，J. Mol. Biol.，222:581 (1991)]。Cole等和Boerner等的技术亦可用于制备人单克隆抗体(Cole等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy (单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R. Liss，第77页(1985)和Boerner等，J. Immunol.，147(1):86-95 (1991)]。类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物来制备，所述动物例如其中内源免疫球蛋白基因已被部分或完全失活的小鼠。激发之后，观察到人抗体产生，其在各方面均非常类似于在人类中见到的抗体产生，包括基因重排、装配和抗体谱。此方法描述于例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016以及描述于下列科学出版物：Marks等，Bio/Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg等，Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison，Nature 368 812-13 (1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14: 826 (1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern. Rev. Immunol. 13，65-93 (1995)。
应理解的是，本文所述的CDR序列可以双特异性抗体构型实施。
本文所用的“双特异性的”或“双功能的”抗体是指具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过包括杂交瘤融合在内的多种方法产生。参见例如Songsivilai和Lachmann (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-321；Kostelny等，(1992) J. Immunol. 148:1547-1553。所述双特异性抗体可结合CD84和另一个靶标，所述靶标预期在诸如凋亡等生物过程中与CD84协作，或者可增加对恶性B细胞(例如B-CLL)的特异性。所述靶标的实例包括但不限于CD74、CD19、CD5、SLAM家族受体(例如NTB-A；SLAMF7)。备选地或另外地，所述双特异性抗体可在与B1或B4抗体结合的表位不同的表位结合CD84(Alternatively or additionally, the bispecific antibody may bindCD84 at an epitope, which is distinctive of the epitope to which the B1 or B4antibodies bind)。备选地或另外地，所述双特异性抗体可包含B1和B4 CDR。
根据一个具体的实施方案，所述抗体抑制CD84嗜同性相互作用。
本文所用的“CD84嗜同性相互作用”是指CD84与亚微摩尔级与Kd强烈自缔合（self-accociate）的能力；所述缔合通过Ig-V结构域驱动，形成正交的嗜同性二聚体。根据一个具体的实施方案，所述嗜同性相互作用是在CLL上的CD84与基质细胞上的CD84之间的，以及在CLL细胞上的CD84之间的。
确定CD84嗜同性相互作用的方法包括但不限于基质上的CD84的siRNA，敲除小鼠CD84。所述CD84嗜同性相互作用先前在[Yan等，PNAS 2007]中证实。
先前已表明的是，CLL细胞能够主动控制其微环境[Binder M等，PLoS One.2012.5(12):e15992，Neil E Kay等，Leuk Res. 2007年7月；31(7): 899-906]。具体而言，已显示CLL细胞在培养物中诱导对其基质配对细胞（stromal counterpart）的抗凋亡作用。所述CLL基质细胞相互作用诱导特异性细胞因子(即IL-6、IL-8)从基质中表达及分泌，并诱导如ICAM-1等特异性粘附分子表达，而其它粘附分子的表达保持不变(即VCAM-1)[Plander M等，Annals of Hematology. 2011.90(12):1381-90]。
根据一个备选的或另外的实施方案，所述抗体能够减量调节基质细胞对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞的抗凋亡活性以及CLL细胞对基质细胞的抗凋亡活性。
如在下列实施例部分中所示，在存在或不存在本发明的一些实施方案的CD84抗体的情况下，与基质细胞一起培养的CLL细胞显示抗凋亡基因Bcl-2 (图2A)和细胞因子IL-6(图2B)复制(repeats)的减少。与CLL细胞一起孵育提高基质细胞中的Bcl-2和IL-6 mRNA水平，但未观察到在VCAM-1信息上的变化。
令人关注的是，CD84阻断降低Bcl-2 (图2A)和IL-6 (图2B)信息水平，但VCAM-1水平不受该阻断影响(图2C)。鉴定在基因表达(mRNA水平)或蛋白质合成/分泌上的变化可使用本领域众所周知的方法进行。mRNA表达可通过RT-PCR或实时定量PCR进行定量，细胞因子的分泌可在培养基中使用ELISA检测。
本文所用的术语“抑制”或“减少”是指在基因表达(例如Bcl-2)或蛋白质分泌(例如IL-6、IL-8或CCL3)上达至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、80 %或更多的统计学上显著的减少。
因其结合CD84并抑制其功能(以至少一种上述模式)的能力所致，本发明的一些实施方案中的抗CD84抗体亦称为“阻断抗体”或“中和抗体”并因此可用于治疗应用。
因此，根据本发明的一个方面，提供在患有B细胞恶性肿瘤(例如B-CLL)的受试者的B细胞中诱导凋亡的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗上有效量的如本文所述的抗CD84抗体，从而在所述受试者的B细胞中诱导凋亡。
因此，本教导亦考虑在CLL细胞中诱导凋亡的方法。所述方法包括使CLL细胞与本发明的抗体(上述)接触，从而诱导CLL细胞凋亡。
根据本发明的此方面的一个实施方案，所述方法在体内实现。
根据本发明的此方面的一个实施方案，所述方法离体实现。
根据本发明的此方面的一个实施方案，所述方法在体外实现。
本文所用的“诱导凋亡”是指使处理细胞中的凋亡水平增加达至少2 %、5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、70 %乃至更多。
确定凋亡的方法包括但不限于膜联蛋白染色以及magic red染色。所述方法的详情描述于下列实施例部分。
根据另一方面，提供在有需要的受试者中治疗B-CLL的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗上有效量的如本文所述的抗CD84抗体，从而治疗B-CLL。
根据另一方面，亦提供如本文所述的抗CD84抗体在制备经鉴定用于治疗B细胞恶性肿瘤的药剂中的用途。
本文所用的术语“受试者”或“有需要的受试者”是指经诊断患有B细胞恶性肿瘤的处于任何年龄的雄性或雌性哺乳动物，例如人受试者。
本文所用的术语“B细胞恶性肿瘤”是指涉及任何亚型或分化阶段的B淋巴细胞(例如早期前B细胞、前B细胞、成熟B细胞、浆细胞)的造血组织或淋巴组织的恶性肿瘤。
根据一个实施方案，所述B细胞恶性肿瘤包括淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。
所述疾病包括但不限于Hodgkin淋巴瘤、非Hodgkin淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)/慢性淋巴系白血病(CLL)、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)、结外边缘区B细胞淋巴瘤-粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、毛细胞白血病、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病(亦称为急性成淋巴细胞性白血病或ALL)、急性成淋巴细胞性前B细胞白血病、浆细胞白血病、前B细胞白血病(例如前B ALL)、早期前B细胞白ALL（例如早期前B ALL)和前B急性成淋巴细胞样白血病。
根据一个实施方案，所述B细胞恶性肿瘤为B-CLL。
本文所用的术语“B-CLL”或“CLL”是指B细胞的异常瘤性增殖。CLL被认为是等同于称为小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)的疾病，为主要存在于淋巴结中的一种非Hodgkin淋巴瘤。世界卫生组织认为CLL和SLL呈现相同疾病的不同阶段[Chiorazzi N、Rai KR、Ferrarini M(2005). “Chronic lymphocytic leukemia (慢性淋巴细胞性白血病)”. N. Engl. J. Med. 352 (8): 804–15]。
本文所用的术语“处理”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学症状或者基本上防止病况的临床或美学症状出现。
本发明的抗体可以其本身或以药物组合物给予受试者，在所述药物组合物中将其与合适的载体或赋形剂混合。
本文所用的“药物组合物”是指一种或多种本文所述的活性成分与诸如生理学上合适的载体和赋形剂等其它化学组分的制剂。药物组合物的目的为利于将化合物给予生物。
本文中的术语“活性成分”是指负责生物效应(即减量调节CD84活性或表达)的物质。
下文中的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”可交换使用，是指不引起对生物的显著刺激并且不消除给予化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。辅剂包含在这些术语内。
本文的术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步利于活性成分给予的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖及多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于配制和给予药物的技术可在“Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington药物科学)，”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版中找到，其通过引用结合到本文中。
合适的给予途径可例如包括口服、直肠、透粘膜具体而言经鼻、肠内或胃肠外递送，其包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内注射到例如右心室腔或左心室腔中、注射到普通（common）冠状动脉中、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
或者，可以局部而非全身的方式给予所述药物组合物，例如经由将所述药物组合物直接注射到患者的组织区域中。
术语“组织”是指由具有相似结构和/或共同功能的细胞集合体组成的生物的部分。实例包括但不限于脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织脑组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。
本发明的药物组合物可通过本领域众所周知的过程制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研碎、乳化、装胶囊、包埋（entrapping）或冻干过程。
因此，用于依照本发明使用的药物组合物可使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括赋形剂和辅料，其利于将活性成分加工成可制药上使用的制剂。适当的配方取决于所选择的给予途径。
对于注射，所述药物组合物的活性成分可用含水溶液配制，优选用生理上相容的缓冲液中配制，所述缓冲液例如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。对于透粘膜给予，将适于待透过屏障的渗透剂用于所述配方。所述渗透剂通常为本领域已知。
对于口服给予，所述药物组合物可通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体组合来容易地配制。所述载体使所述药物组合物能够配制成用于患者口服摄取的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等。用于口服使用的药物制剂可使用固体赋形剂制备，需要时在加入合适的辅料之后任选研磨所得混合物并加工所述颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核。合适的赋形剂具体而言为填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠（sodiumcarbomethylcellulose）；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者海藻酸或其盐，如海藻酸钠。
糖衣丸核与合适的包被物一起提供。对于此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选包括阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可向片剂或糖衣丸包被物中加入染料或色素用于鉴定或用以表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推合胶囊剂(push-fit capsules)以及由明胶和诸如甘油或山梨糖醇等增塑剂制成的密封软胶囊剂。所述推合胶囊剂可含有与诸如乳糖等填充剂、诸如淀粉等粘合剂、诸如滑石粉或硬脂酸镁等润滑剂以及任选稳定剂混合的活性成分。在软胶囊剂中，可将所述活性成分溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可添加稳定剂。用于口服给予的所有制剂均应为适于所选给予途径的剂量。
对于经颊给予，所述组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于经鼻吸入给予，用于根据本发明使用的活性成分以来自加压包装的气雾剂喷雾表现形式或者以使用合适推进剂的喷雾器的形式常规递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供阀以递送计量的量来确定。可配制例如用于分配器的明胶的胶囊剂和药筒，其含有所述化合物的粉末混合物和合适的粉末基质，例如乳糖或淀粉。
本文所述的药物组合物可进行配制以用于胃肠外给予，例如通过推注或连续输注。用于注射的制剂可以单位剂型存在于例如安瓿中或多剂量容器中，任选添加防腐剂。所述组合物可以是油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可包含配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外给予的药物组合物包括呈水溶性形式的所述活性制剂的含水溶液。此外，所述活性成分的混悬剂可制备成合适的油基或水基注射混悬剂。合适的亲脂溶剂或溶媒包括脂肪油，例如麻油，或者合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬剂可包含增加所述混悬剂的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选，所述混悬剂亦可包含合适的稳定剂或增加所述活性成分的溶解性以允许制备高浓缩溶液的物质。
或者，所述活性成分可以是粉末形式的，用于临用前使用合适的溶媒，例如无菌无热原水基溶液重构。
本发明的药物组合物亦可配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，其使用例如常规栓剂基质，如可可脂或其它甘油酯。
适用于本发明文段的药物组合物包括其中所述活性成分以有效实现预期目的的量包含在内的组合物。更具体而言，治疗上有效的量意指有效预防、缓和或改善病症(例如B细胞恶性肿瘤，包括B-CLL)的症状或者延长正被治疗的受试者的生存的量。在一个具体的实施方案中，所述治疗上有效的量足以诱导B细胞恶性肿瘤的B细胞凋亡(例如，诱导B-CLL细胞的凋亡)。
治疗上有效量的确定完全在本领域技术人员的能力之内，特别是按照本文所提供的详述的公开内容。
对用于本发明方法的任何制剂，所述治疗上有效的量或剂量最初可从体外和细胞培养测定评价。例如，可在动物模型中配制剂量以实现所需浓度或滴度。所述信息可用于更准确地确定在人中的有用剂量。
本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可通过标准制药程序在体外、在细胞培养物或实验动物中确定。
诸如前述NOD-SCID小鼠嵌合体的B-CLL动物模型[Shimoni A、Marcus H、Canaan A等，A model for human B-chronic lymphocytic leukemia in human/mouse radiationchimera: evidence for tumor-mediated suppression of antibody production inlow-stage disease (用于人/小鼠辐射嵌合体中的人B慢性淋巴细胞性白血病的模型：低级阶段疾病中的抗体产生的肿瘤介导的阻抑的证据). Blood. 1997；89:2210-2218]，可用于在体内确定本发明的抗体的治疗功效。通过腹膜内注射转移来自处于疾病的不同阶段的B-CLL患者的人外周血单核细胞。该系统支持人肿瘤细胞的长期生存。使用本发明的抗体将嵌合小鼠处理不同时间，之后评价对细胞移植及生存的作用。
获自这些体外和细胞培养测定及动物研究的数据可用于配制用于人的一系列剂量。所述剂量可根据采用的剂型和使用的给予途径而不同。确切的配方、给予途径和剂量可通过各医师考虑患者的病况来选择(参见例如Fingl等，1975，“The PharmacologicalBasis of Therapeutics (治疗的药理学基础)”，第1章第1页)。
可针对个体调节给药量和给药间隔以提供足以诱导或阻抑生物效应的所述活性物质的(组织)水平(最低有效浓度，MEC)。虽然对于各制剂的MEC将不同，但可从体外数据来估计。达到MEC所需的剂量将取决于个体特征和给予途径。可使用检测测定法来确定血浆浓度。
根据待治疗病况的严重性和应答性，给药可以是单次给予或多次给予的，疗程持续数天至数周或者直至实现治愈或实现疾病状态的降低。
待给予组合物的量无疑将取决于待治疗的受试者、病痛的严重性、给予方式、处方医师的判断等。
需要时，本发明的组合物可存在于包装或分配装置，例如FDA获准的试剂盒中，其可包含含有所述活性成分的一个或多个单位剂型。所述包装可例如包括金属箔或塑料箔，例如泡罩包装。所述包装或分配装置可随附用于给予的说明书。所述包装或分配器亦可供应（accommodated by）由管理药物制造、使用或销售的政府机构所规定形式的容器随附的注意事项(notice)，所述注意事项反映所述组合物或者人或兽医给予的形式获得所述机构批准。所述注意事项例如可以是经美国食品与药物管理局获准用于处方药的标记或者为获准的产品插页。包含配制在相容的药物载体中本发明制剂的组合物亦可制备、放置于适当容器中，并标记用于指定病况的治疗，如在上文中进一步详述。
为了改善治疗功效，本发明的抗体可进一步连同用于B细胞恶性肿瘤(例如用于B-CLL)的常规疗法一起给予，所述常规疗法例如化疗、放疗、生物疗法，例如免疫疗法或骨髓移植。
以下为用于B-CLL的常规疗法的非限制性的实例列表。
嘌呤类似物——通常在此治疗类别中使用氟达拉滨或苯丁酸氮芥。单克隆抗体——通常在此治疗类别中使用诸如阿仑单抗(针对CD52)和利妥昔单抗(针对CD20)等单克隆抗体。
联合化疗——通常在新诊断的CLL和复发CLL中使用联合化疗选项。近来，随机试验显示，嘌呤类似物(氟达拉滨)与烷化剂(环磷酰胺)的组合比单一物质产生更高的应答率和更长的无进展生存：例如FC (氟达拉滨与环磷酰胺)；FR (氟达拉滨与利妥昔单抗)；FCR(氟达拉滨、环磷酰胺和利妥昔单抗)；CHOP (环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙)。
同种异源骨髓(干细胞)移植——因其风险所致，很少用作B细胞恶性肿瘤(例如CLL)的一线治疗。对使用降低强度的同种异源干细胞移植有越来越多的关注，其为具有合适供者的所选患者提供治愈前景。
本发明的抗体结合表达CD84的B-CLL细胞的能力促进（prompts）其在诊断应用中的用途。
因此，根据本发明的一个方面，提供在有需要的受试者中诊断B细胞恶性肿瘤(例如B-CLL)的方法，所述方法包括：
(a)使所述受试者的生物样品与权利要求1-8中任一项的抗体在这样的条件下接触，所述条件允许在CD84同种型C (SEQ ID NO: 14)和所述抗体之间形成免疫复合物；和
b)确定所述生物样品中所述免疫复合物的水平，其中所述免疫复合物水平的增加关于来自健康个体的生物样品中的所述免疫复合物的水平超过预定阈值表示B细胞恶性肿瘤（例如B-CLL）。
本文所用的术语“诊断”或“诊断的”是指把病理分类(例如癌症，如诸如白血病等B细胞恶性肿瘤，例如慢性淋巴系白血病(CLL)，如B-CLL)。
根据本发明的该方面，术语“受试者”或“有需要的受试者”是指常规体检或筛查为所述病理的哺乳动物例如人受试者，以及是指例如因家族史、环境因素而处于患有所述病理的风险的受试者和/或表现出所述病理的疑似临床体征的受试者。包括B-CLL在内的B细胞恶性肿瘤的一些临床体征包括但不限于易于反复感染的体质，所述感染例如肺炎、唇单纯性疱疹和带状疱疹；淋巴结肿大；可能与脾肿大相关的早饱和/或腹部不适；可能因血小板减少所致的粘膜皮肤出血和/或瘀点；因贫血继发的疲倦和疲劳；发热、寒战以及盗汗和体重减轻；自身免疫性溶血性贫血。
本文所用的短语“CD84同种型C”是指分配以登记号AF054815.1 NP_003865.1 (NM003874，Q9UIB8-3)的CD84同种型。SEQ ID NO: 13、14。
“生物样品”的实例包括但不限于全血、血清、血浆、脑脊液、尿、淋巴液以及呼吸道、肠道和生殖泌尿道的各种外分泌物、眼泪、唾液、乳汁以及白细胞、组织、细胞培养物，例如原代培养物。根据一个具体的实施方案，所述生物样品包含B细胞。
恶性B细胞(例如B-CLL细胞)可获自血、骨髓、脾和/或淋巴结。
CD84同种型C水平可在蛋白质水平(表达和/或活性的水平)或者在mRNA水平(例如RT-PCR、实时RCR等)确定。
以下为使用本发明的抗体确定CD84C水平的方法的非限制性实例的列表。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)：此方法包括酶和底物之间的反应。将包含CD84C的生物样品放入微孔板中。施用与酶连接的CD84特异性抗体并允许其与底物结合。然后利用与抗体结合的酶通过比色反应检测和定量所述抗体的存在。通常用于此方法的酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。如果经良好的标准化（calibrated）且在反应的线性范围之内，则存在于所述样品中的底物的量与产生颜色的量成比例。通常使用底物标准品来改善定量准确性。
蛋白质印迹：此方法包括借由丙烯酰胺凝胶从其它蛋白质中分离底物，接着将所述底物转移到膜(例如尼龙或PVDF)。然后通过对所述底物特异的抗体(使用本文所述的抗CD84抗体)检测所述底物的存在，所述抗体继而通过抗体结合试剂检测。抗体结合试剂可以是例如蛋白A或其它抗体。抗体结合试剂可以是放射性标记的或酶联的，如上所述。检测可通过放射自显影、比色反应或化学发光进行。此方法允许定量底物的量并同时通过膜上的相对位置确定其特性（identity），所述相对位置表明电泳期间在丙烯酰胺凝胶上的迁移距离。
放射免疫测定法(RIA)：在一种版本中，此方法包括使用如本文所述的CD84特异性抗体将所需蛋白质(即底物)沉淀，并对固定在诸如琼脂糖珠粒等可沉淀载体上的抗体结合蛋白进行放射性标记(例如用I125标记蛋白A)。沉出的沉淀物中计数的量与底物的量成比例。
在一个备选的RIA版本中，使用标记的底物和未标记的抗体结合蛋白。以不同的量添加含有未知量底物的样品。来自标记底物的沉淀计数上的减少与添加样品中底物的量成比例。
荧光激活细胞分选术(FACS)：此方法包括通过底物特异性抗体(即CD84抗体)在细胞中原位检测底物。使底物特异性抗体与荧光基团连接。检测通过细胞分选机进行，所述细胞分选机读取各细胞在其通过光束时发出的光的波长。此方法可同时使用两种或更多种抗体。
免疫组织化学分析：此方法包括通过底物特异性抗体(即本文所述的抗CD84抗体)在固定细胞中原位检测底物。所述底物特异性抗体可以是酶联的或者与荧光基团连接。检测通过显微术以及主观或自动评价进行。如果使用酶联抗体，则可能需要比色反应。应理解的是，免疫组织化学常常接着使用例如Hematoxyline或Giemsa染色剂的细胞核复染。
如所提及的，在CD84C水平上的增加关于来自健康个体的类似样品中的CD84C水平超过预定阈值表示疾病(例如B-CLL)。
本文所用的短语“来自健康个体的生物样品”是指获自健康受试者(已知未患有B细胞恶性肿瘤，如B-CLL)或获自B细胞恶性肿瘤例如B-CLL发作之前的相同受试者(即健康的)的未受影响的对照样品。因为生物特征尤其取决于物种和年龄，所以优选所述对照唾液来自相同物种、年龄的受试者。或者，对照数据可获自数据库和文献。要理解的是，所述对照样品亦可获自处于特定时间点的患病受试者，以分析所述疾病的进展(即监测)。
根据具体的实施方案，术语“增加”应为统计学上显著的。
一旦作出诊断，受试者可被告知所述疾病，即存在或不存在所述疾病以及用于B细胞恶性肿瘤如B-CLL的可能的疗法。
为改善测定法灵敏性，所述方法可进一步包括使用诊断测定法确证所述诊断，所述诊断测定法选自所述CD84同种型c特有的表面标志物表达、核型分析和种系突变。
以下为可用于确证B细胞恶性肿瘤如B-CLL的诊断的非限制性的所述测定法/标志物的列表。
细胞表面标志物——B-CLL淋巴细胞通常显示B细胞表面抗原，如通过CD19、CD20、CD21和CD23单克隆抗体证实。此外，其表达更典型存在于T细胞上的CD5。因为正常CD5+ B细胞存在于淋巴样滤泡的外套层(MZ)，所以B-CLL最可能是基于MZ的致力于产生多反应性天然自身抗体的无变应性自身反应性细胞亚群的恶性肿瘤。B-CLL细胞表达极低水平的膜表面免疫球蛋白，最常常为免疫球蛋白M (IgM)或IgM/IgD和IgD。此外，其亦表达极低水平的单独的免疫球蛋白轻链(κ或λ)。
遗传分析——在患有CLL的大多数患者中观察到异常核型。最常见的异常为13q缺失，其存在于大于50%的患者中。显示13q14异常的个体具有相对良性的疾病，其通常表现为稳定或缓慢进展的分离独的淋巴细胞增多（isolated lymphocytosis）。
在15%的患者中观察到的三体性12的存在与非典型形态学和进行性疾病相关。染色体17的短臂缺失与CLL中的快速进展、短暂缓解和总生存期减少相关。17p13缺失与肿瘤抑制基因p53的功能丧失有关。在19%的患者中观察到的条带11q22-q23的缺失与广泛的淋巴结转移、侵略性疾病和较短的生存期相关。
更灵敏的技术已证实染色体12的异常。40-50%的患者在常规细胞遗传学研究中证实无染色体异常。然而，80%的患者将具有可通过荧光原位杂交(FISH)检出的异常。约2-5%的患有B-CLL的患者表现出T细胞表型。
研究亦鉴定出许多高风险遗传特征和标志物，其包括种系免疫球蛋白可变重链(IgVH)、IgVH V3-21基因使用、增加的CD38表达、增加的Zap70表达、升高的血清β-2-微球蛋白水平、增加的血清胸苷激酶活性、短暂的淋巴细胞倍增时间(<6 mo)和可溶性CD23增加的血清水平。这些特征与患有B-CLL的患者中的快速进展、短暂缓解、耐受治疗和缩短的总生存期相关。
种系突变——已显示种系IgVH表明不良预后。研究已显示这些患者在用化疗治疗之后亦具有更早的B-CLL进展。某些IgVH基因(V3-21)的使用亦与不良预后有关而不论IgVH突变状态。
对于任何上述临床目的(诊断或治疗目的)，可将本发明的抗CD84抗体与制药物质结合(缀合或连接)。
因此，可将所述抗体与制药物质连接。
本文所用的制药物质可以是药物(用于治疗)或可检测部分。
可将多种类型的可检测部分或报告部分与本发明的蛋白质缀合。这些包括但不限于放射性同位素(例如[125]碘)、发磷光的化学物质、化学发光的化学物质、荧光化学物质(荧光基团)、酶、荧光多肽、亲和标签以及可通过正电子发射断层扫描(PET)或磁共振成像(MRI)检测的分子(对比剂)。
合适荧光基团的实例包括但不限于藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy-铬、罗丹明、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、德克萨斯红、PE-Cy5等。对于有关荧光基团选择、将荧光基团与多种类型的分子连接的方法的其它指导，参见Richard P.Haugland，“Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals 1992–1994 (分子探针：荧光探针和研究化学物质手册1992-1994)”，第5版，Molecular Probes，Inc. (1994)；Oncoimmunin Inc.的美国专利号6,037,137；Hermanson，“Bioconjugate Techniques(生物共轭体技术)”，Academic Press New York，N.Y.(1995)；Kay M.等，1995. Biochemistry 34:293；Stubbs等，1996. Biochemistry 35:937；Gakamsky D.等，“Evaluating Receptor Stoichiometry by Fluorescence ResonanceEnergy Transfer (通过荧光共振能量转移评价受体化学计量学)”，在“Receptors: APractical Approach (受体：实用方法)”中，第2版，Stanford C.和Horton R. (编辑)，Oxford University Press，UK. (2001)；Targesome, Inc.的美国专利号6,350,466。可用于检测当与荧光可检测部分缀合时的抗体的荧光检测法包括例如荧光激活流式细胞术(FACS)、免疫荧光共聚焦显微术、荧光原位杂交(FISH)和荧光共振能量转移(FRET)。
可将多种类型的酶与本发明的抗体连接[例如辣根过氧化物酶(HPR))、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶(AP)]以及酶缀合抗体的检测可使用以下方法进行：ELISA (例如在溶液中)、酶联免疫组织化学测定法(例如在固定组织中)、酶联化学发光测定法(例如在电泳分离的蛋白质混合物中)或者本领域已知的其它方法[参见例如Khatkhatay MI.和Desai M.，1999. J Immunoassay 20:151-83；Wisdom GB.，1994. Methods Mol Biol. 32:433-40；Ishikawa E.等，1983. J Immunoassay 4:209-327；Oellerich M.，1980. J Clin ChemClin Biochem. 18:197-208；Schuurs AH.和van Weemen BK.，1980. J Immunoassay 1:229-49]。
亲和标签(或者结合对的一个构件)可以是可通过相应抗体[例如通过抗-DIG抗体鉴定的洋地黄毒苷(DIG)]或对所述标签具有高亲和力的分子[例如链霉抗生物素和生物素]鉴定的抗原。可将结合所述亲和标签的抗体或分子进行荧光标记或与酶缀合，如上所述。
可使用本领域广泛实践的多种方法将链霉抗生物素或生物素分子与本发明的抗体连接。例如，可经由生物素蛋白连接酶(例如BirA)的识别序列将生物素分子与本发明的抗体连接，如描述于随附的实施例部分以及描述于Denkberg, G.等，2000. Eur. J.Immunol. 30:3522-3532。或者，可将链霉抗生物素分子与抗体片段(例如单链Fv)连接，基本上如描述于Cloutier SM.等，2000. Molecular Immunology 37:1067-1077；Dubel S.等，1995. J Immunol Methods 178:201；Huston JS.等，1991. Methods in Enzymology203:46；Kipriyanov SM.等，1995. Hum Antibodies Hybridomas 6:93；Kipriyanov SM.等，1996. Protein Engineering 9:203；Pearce LA.等，1997. Biochem Molec Biol Intl42:1179-1188)。
与链霉抗生物素缀合的功能部分(例如荧光基团)可市购获自基本上所有的免疫荧光流式细胞术试剂的主要供应商(例如Pharmingen或Becton-Dickinson)。
本文所用的“药物”是指在治疗上活性的成分，例如小分子(如化疗)、毒素、蛋白质、脂质、碳水化合物或其组合。
备选地或另外地，可将所述蛋白质与增加其在循环中的半寿期和生物利用度的非蛋白质部分连接(或缀合)。
本文所用的短语“非蛋白质部分”是指与上述蛋白质连接的不包含肽键合氨基酸的分子。可根据本教导使用的示例性非蛋白质的且优选非毒性的部分包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、苯乙烯马来酸酐共聚物(SMA)以及二乙烯醚马来酸酐共聚物(DIVEMA)。
所述分子为高度稳定的(很可能因非蛋白质部分提供的位阻而耐受体内蛋白水解活性)并且可使用常用的固相合成法产生，所述方法廉价且高效，如在下文中进一步描述。然而，将理解的是，仍可使用重组技术，借此使重组肽产物经历体外修饰(例如PEG化，如在下文中进一步阐述)。
因此，亦可将所述非蛋白质的非毒性部分与上文提及的蛋白质连接以促进所述分子的稳定性和可能促进其溶解性。
所述非蛋白质部分的生物缀合(例如PEG化)可以给蛋白氨基酸序列提供稳定性(例如对抗蛋白酶活性)和/或溶解性(例如在诸如血、消化液等生物流体中)，同时保留其生物活性并延长其半寿期。
特别是在表现出短的半寿期并从血液中快速清除的治疗性蛋白质情况下，生物缀合为有利的。生物缀合的蛋白质在血浆中的半寿期增加，是因为蛋白质缀合物的大小增加(限制其肾小球过滤)以及因聚合物位阻所致的蛋白质水解减少。一般而言，每个蛋白质连接的聚合物链越多，半寿期延长越久。然而，采取措施以使本发明蛋白质的特异活性不会降低(例如结合CD84)。
蛋白质与PEG的生物缀合(即PEG化)可使用PEG衍生物实现，所述PEG衍生物例如PEG羧酸的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、单甲氧基PEG2-NHS、羧甲基化PEG的琥珀酰亚胺酯(SCM-PEG)、PEG的苯并三唑碳酸酯衍生物、PEG的缩水甘油醚、PEG对硝基苯基碳酸酯(PEG-NPC，如甲氧基PEG-NPC)、PEG醛、PEG-原吡啶基-二硫化物、羰基二咪唑基激活的PEGs、PEG巯基、PEG马来酰亚胺。各种分子量的所述PEG衍生物均市售可得[参见例如Catalog，Polyethylene Glycol and Derivatives (聚乙二醇及衍生物)，2000 (ShearwaterPolymers，Inc.，Huntsville，Ala.)]。需要时，许多的上述衍生物可以单官能单甲氧基PEG(mPEG)形式获得。一般而言，添加到本发明的CCL1氨基酸序列中的PEG，范围应为数百道尔顿至约100 kDa (例如介于3-30 kDa之间)的分子量(MW)。虽然可使用更大MV PEG，但可能导致PEG化肽产率的某种程度的损失。亦应注意较大PEG分子的纯度，因为可能难以获得与较低MV PEG可获得的同样高的纯度的较大PEG分子。优选使用至少85%纯度的PEG，以及更优选至少90%纯度、95%纯度或更高纯度。分子的PEG化进一步论述于例如Hermanson，Bioconjugate Techniques (生物缀合技术)，Academic Press San Diego，Calif.(1996)，第15章和Zalipsky等，“Succinimidyl Carbonates of Polyethylene Glycol (聚乙二醇的琥珀酰亚胺碳酸酯)，”Dunn和Ottenbrite编辑，Polymeric Drugs and DrugDelivery Systems (聚合药物和药物递送系统)，American Chemical Society，Washington，D.C. (1991)。
可使用活化PEG的多种缀合化学反应，所述活化PEG例如PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜(VS)、PEG-丙烯酸酯(AC)、PEG-原吡啶基二硫化物。制备活化PEG分子的方法为本领域已知。例如，在氩气下通过使PEG-OH的二氯甲烷(DCM)溶液与NaH反应并随后与二乙烯基砜反应(摩尔比：OH 1: NaH 5:二乙烯基砜50，在0.2克PEG/mL DCM下)，可制备PEG-VS。在氩气下通过使PEG-OH的DCM溶液与丙烯酰氯和三乙胺反应来制备PEG-AC (摩尔比：OH 1:丙烯酰氯1.5:三乙胺2，在0.2克PEG/mL DCM下)。可将所述化学基团与线性化的，2臂、4臂或8臂PEG分子连接。要理解的是，本发明的抗体可使用重组DNA技术(其中将编码本发明抗体的多核苷酸引入合成所述抗体的适当宿主细胞中。示例性序列提供于SEQ ID NO: 26和27)或通过化学合成，例如通过固相技术而产生。
本文所用的术语“大约”是指±10 %。
术语“包括”、“包括的”、“包含”、“包含的”、“具有的”及其组合意指“包括但不限于”。
术语“由……组成”意指“包括且限于”。
术语“基本上由……组成”意指所述组合物、方法或结构可包含另外的成分、步骤和/或部分，但仅在所述另外的成分、步骤和/或部分不会实质性改变权利要求的组合物、方法或结构的基本特征和新特征的情况下。
除非文段另有明确指示，否则本文所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”亦包括复数所指。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
在本申请各处，本发明的各个实施方案可以范围形式存在。应理解的是，以范围形式描述仅为了方便和简洁起见，并且不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，描述一个范围应认为是具体公开所述范围内的所有可能的子范围以及各个数值。例如，描述诸如1-6的范围应认为具有具体公开诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范围以及所述范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。不论范围的宽度，这均适用。
每当本文中显示数值范围时，意图其包括所示范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“范围介于第一指示数和第二指示数之间”和“范围从第一指示数到第二指示数”在本文中可交换使用，并且意图其包括所述第一和第二指示数以及在其之间的所有分数和整数数字。
本文所用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的或者容易从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
当引用具体序列表时，所述引用理解为亦包括这样的序列，其因包含较小序列变异而基本上对应于其互补序列，所述序列变异源自例如测序误差、克隆错误或者导致碱基置换、碱基缺失或碱基添加的其它变异，前提是所述变异的频率小于1/50核苷酸，或者小于1/100核苷酸，或者小于1/200核苷酸，或者小于1/500核苷酸，或者小于1/1000核苷酸，或者小于1/5,000核苷酸，或者小于1/10,000核苷酸。
要理解的是，为清晰起见，在独立的实施方案的文段中所述的本发明的某些特征，亦可在单个实施方案中以组合提供。反之，为简洁起见，在单个实施方案的文段中所述的本发明的多个特征，亦可独立提供或者以任何合适的亚组合提供或者适当时以本发明所述的任何其它实施方案提供。在各个实施方案的文段中所述的某些特征，并不认为是所述实施方案的必要特征，除非所述实施方案在缺少所述成分时为无效的。
如上文所述和在下文权利要求部分中所要求的本发明的各个实施方案和方面，在下列实施例中得到实验支持。
实施例
现在参考下列实施例，所述实施例连同上文详述一起以非限制性方式阐述本发明的一些实施方案。
一般而言，本文所用的术语和本发明所利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。所述技术在文献中充分说明。参见例如“Molecular Cloning: Alaboratory Manual (分子克隆：实验室指南)”，Sambrook等，(1989)；“Current Protocolsin Molecular Biology (分子生物学现行方案)”第I-III卷，Ausubel，R. M.，编辑(1994)；Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学现行方案)”，JohnWiley和Sons，Baltimore，Maryland (1989)；Perbal，“A Practical Guide to MolecularCloning (分子克隆实用指南)”，John Wiley & Sons，New York (1988)；Watson等，“Recombinant DNA (重组DNA)”，Scientific American Books，New York；Birren等(编辑)，“Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (基因组分析：实验室指南系列)”，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York (1998)；如在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法；“CellBiology: A Laboratory Handbook (细胞生物学：实验室手册)”，第I-III卷，Cellis，J.E.，编辑(1994)；“Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique (动物细胞培养-基本技术手册)”，Freshney，Wiley-Liss，N. Y. (1994)，第三版；“CurrentProtocols in Immunology (免疫学现行方案)”，第I-III卷，Coligan J. E.编辑(1994)；Stites等(编辑)，“Basic and Clinical Immunology (基础和临床免疫学)”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT (1994)；Mishell和Shiigi (编辑)，“Selected Methodsin Cellular Immunology (细胞免疫学中选用的方法)”，W. H. Freeman及Co.，New York(1980)；可使用的免疫测定法广泛描述于专利和科学文献中，参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)”，Gait，M. J.，编辑(1984)；“NucleicAcid Hybridization (核酸杂交)”，Hames，B. D.和Higgins S. J.编辑(1985)；“Transcription and Translation (转录和翻译)”，Hames，B. D.和Higgins S. J.编辑(1984)；“Animal Cell Culture (动物细胞培养)”，Freshney，R. I.编辑(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes (固定化细胞和酶)”，IRL Press，(1986)；“APractical Guide to Molecular Cloning (分子克隆实用指南)”，Perbal，B.(1984)和“Methods in Enzymology (酶学方法)”第1-317卷，Academic Press；“PCR Protocols: AGuide To Methods And Applications (PCR方案：方法和应用指南)”，Academic Press，San Diego，CA (1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification andCharacterization - A Laboratory Course Manual (蛋白质纯化和表征策略-实验室课程手册)”，CSHL Press (1996)；所述文献均通过引用结合，如同在本文中完整阐述。其它常用参考文献在本文档各处提供。认为其中的程序为本领域众所周知并且提供所述程序以方便读者。其中包含的所有信息均通过引用结合到本文中。
实施例1
材料和实验程序
分泌CD84-ECD的转染和蛋白质表达：对于表达和分泌CD84-ECD蛋白(SEQ ID NO: 15)，在转染之前24 h将HEK 293T细胞接种到175 cm3细胞培养皿中至75%的最终汇合度。对于转染，使用30 mL完全DMEM培养基和3 mL的含DNA沉淀物的溶液。在转染之后将培养物再培养24小时，并随后将培养基更换成无血清DMEM达2天。收集所述条件培养基（conditonedmedium）；高速离心1 h以去除细胞和碎片，用0.2 µm过滤装置过滤并使用FLPC (镍亲和色谱法)进行从条件培养基纯化蛋白质。在所述蛋白质与Ni2+柱结合之后，使用高浓度咪唑对其清洗和洗脱，所述咪唑与His6-标签竞争并置换所述蛋白质。纯化之后，通过SDS-PAGE接着蛋白质印迹和凝胶的考马斯染色来分析来自各纯化步骤和来自不同峰的浓缩样品。
大小排阻色谱法(凝胶过滤)：通过注射到FPLC系统中，将Ni2+亲和色谱的合并的浓缩流分加载到16/60 Superdex 200柱(制备级)。用PBS以5 mL/min的流速洗脱蛋白质。根据UV吸收和洗脱物的pH变化收集流分。在合并且浓缩不同峰流分之后，通过SDS-PAGE接着蛋白质印迹和考马斯染色来分析样品。
通过ESI-MS/MS鉴定蛋白质：为了验证所述CD84-ECD蛋白的特性，切下考马斯亮蓝染色凝胶的假定条带并通过蛋白水解消化接着电喷雾电离质谱法分析。所述程序通过Weizmann研究所的生物服务部门实施。
杂交瘤方案：从来源于转染CD84-ECD构建体的293细胞的条件培养基(conditioned medium)中纯化(如前所述) CD84-ECD蛋白。在3个月的时期内用纯化的CD84-ECD将小鼠免疫。在取血用于针对CD84-ECD的抗体的阳性ELISA测试之后(平板涂覆有纯化的ECD-CD84)，取出脾脏；分离淋巴细胞(用HBSS)并与NSO细胞(1:5的比率)连同聚乙二醇(polyethilenglycol, PEG)一起融合。用HAT (次黄嘌呤氨基蝶呤胸苷)培养基挑选杂交瘤并使用ELISA测定法对其上清液分析CD84-ECD的识别[Ho MK，Springer TA. MethodsEnzymol 1984；108: 313-324]。
用于杂交瘤亚类检测的ELISA：通过商售ELISA试剂盒显示杂交瘤为IgM k类。简单地说，从杂交瘤收集无细胞培养上清液，并根据制造商说明书使用ELISA法确定IgM、IgG3、IgG1、αb、αa、∆、λ、κ水平(BD Bioscience)。
杂交瘤激活/阻断：向生长于含10% (v/v) FCS的RPMI培养基中的CLL细胞中添加杂交瘤B1/B4/F8，在有或没有MIF刺激的情况下，于37℃孵育18 h (用于RNA提取)和24 h(用于蛋白质提取)。
CLL患者群体：从健康受试者(正常/对照)和处于所述疾病的不同阶段的CLL患者二者的外周血中获得B淋巴细胞，所述CLL患者符合对于CLL的诊断和免疫表型标准。细胞由Kaplan医疗中心血液学研究所和Sourasky医疗中心提供，其遵循所述医院的IRB，如前所述[Haran M等，Leukemia. 2004；18:1948-1950]。CLL诊断是基于标准准则，并根据Rai分阶段系统对患者进行分阶段[Hallek M等，Blood. 2008；111:5446-5456]。
细胞纯化：如前所述使用RosettSep抗体混合物(StemCell Vancouver，BC，Canada)纯化B淋巴细胞[Lantner F等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007；104:13408-13413]。简单地说，该方法是基于阴性挑选B细胞。向每毫升全血中加入含有靶定非B细胞抗原(CD3、CD2、CD16、CD56和CD14)的二价抗体的50 µl混合物。孵育20 min之后，向所述混合物中加入等量的PBS并将所述细胞置于聚蔗糖梯度（Ficoll gradient）上，离心并通过PBS洗涤从聚蔗糖中分离。细胞新鲜使用或者可存活地冷冻于胎牛血清(FCS)加10%二甲亚砜(DMSO)中以用于在液氮中储存。使冷冻细胞在含10% FCS和抗生素的RPMI中于5% CO2培养过夜。
M210B4细胞：M2-10B4细胞购自ATCC (ATCC® CRL-1972TM)。该细胞系为来源于(C57BL/6J X C3H/HeJ)F1小鼠的骨髓基质细胞的克隆。使细胞生长在补充以10% FSC和青霉素-链霉素-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中，并于37℃、5% CO2培养。
实体瘤细胞：MDA435 (人乳腺癌)、PC-3 (人前列腺癌)、Hela (人子宫颈癌)、A375(人恶性黑素瘤；CRL 1619)、A549 (人肺腺癌)、PAC1 (人胰腺癌；39532)和NCL-N87 (人胃癌)购自ATCC。使细胞生长在DMEM培养基中，补充以10% FSC和青霉素-链霉素-谷氨酰胺并于37℃、5% CO2培养。
Daudi细胞：Burkitt淋巴瘤细胞系Daudi购自ATCC (ATCC® CCL-213TM)。在含10%FCS的RPMI培养基中，使1×106个Daudi细胞与不同浓度的抗CD84抗体B1或B4或者与对照抗体一起培养。48小时之后，使用膜联蛋白(Annexing)染色检查细胞存活(如下所述)。
抗体：对于FACS染色，抗CD84-PE (CD84.1.21 Bio Legend)。对于阻断：LEAFTM纯化的抗人CD84抗体(CD84.1.21 Bio Legend)。
流式细胞术：如前所述进行CLL细胞染色[Binsky I等，Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 2007；104:13408-13413]。使用下列抗体：CD-19 (MiltenyiBiotec，Auburn，CA)、抗CD74 (Santa Cruz)、IgG1κ同种型对照(MOPC-21，BD Biosciences)、CD49d (9F10，BDBiosciences)、抗CD84 (Ab-2，152-1D5 Labvision)，接着PE抗鼠第二抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories)或者抗CD84-PE (CD84.1.21 Bio Legend)、PE抗人CCR1/CCR5抗体(BioLegend)、PE抗鼠IgM抗体、RMM-1 (BioLegend)、APC抗鼠/人CD45R/B220抗体、RA3-6B2 (BioLegend)、抗鼠CD5 eFluor®、450 53-7.3 (eBioscience)。通过FACSCanto(BD Biosciences)分析染色。
Bcl-2胞内染色：在室温下使用BioLegend’s FOXP3 Fix/Perm溶液将细胞透化处理并固定20分钟，然后用细胞染色缓冲液洗涤两次以及再用BioLegend’s FOXP3 Fix/Perm缓冲液洗涤。接着，将细胞用BioLegend’s FOXP3 Fix/Perm缓冲液于黑暗中孵育15分钟，并随后用抗PE抗Bcl-2抗体(BCL/10C-4，Biolegend)或抗同种型对照于冰上染色30 min。用FACSCanto流式细胞仪(BD Biosciences)评价细胞染色。
细胞死亡检测：膜联蛋白和PI/7AAD染色：在补充以10% FCS、含或不含1.5-2 μg的抗CD84(ab-3202 Abcam/ 152-1D5 Thermo)的RPMI培养基中，以1×107个细胞/孔在24孔板中培养纯化的CLL细胞，接着用0.5 μg的抗Fab (Jackson)或IgG同种型对照抗体(MOPC-21BioLegend)培养24和48 h。将细胞离心、洗涤并用膜联蛋白(BD Biosciences)染色，以及在黑暗中于室温加入碘化丙啶(PI；25μg/ml) (Sigma)或7AAD (BD Biosciences)达15 min。通过FACSCanto (BD Biosciences)分析膜联蛋白+PI/7AAD染色的程度。
Magic Red凋亡检测试剂盒：根据制造商说明书将107个CLL细胞/ml与Magic Red(用于半胱天冬酶3和7 MR-(DEVD)2免疫化学技术的Magic Red半胱天冬酶检测试剂盒)一起于37℃孵育1 h。然后，通过FACSCalibur (BD Biosciences)分析测量Magic Red染色。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)：如前所述使CLL细胞与抗CD84激动剂或阻断抗体或B4杂交瘤一起培养48-72 h。如前所述使用拮抗剂抗体或阻断杂交瘤B4对CLL细胞和NLC/M210B4细胞的共培养物阻断CD84。
然后收集无细胞培养物上清液并根据制造商说明书使用ELISA法测定hCCL3和mIL6水平(人CCL3/小鼠IL6 ELISA DuoSet R&D系统)。
在CLL和M210B4的共培养物中阻断CD84：将1×105个基质细胞接种24孔板的每个孔。18小时之后，在存在或不存在抗CD84阻断抗体(5 µg/µl)或B4杂交瘤(2.5-5 µg/µl)或同种型对照的情况下，向各孔中加入1.6×106个CLL细胞，并共培养另48小时用于CLL细胞的生存力测定或者72 h用于CCL3的ELISA。
CD84阻断：如前所述进行[Binsky-Ehrenreich等，2013年2月25日电子出版，Oncogene]。简单地说，在含0.1 % (v/v) FCS的RPMI培养基中，将1×107个CLL细胞于37℃培养3 h。接着，用含2.5 μg抗CD84 (CD84.1.21 BioLegend)或B4杂交瘤2.5-5 μg (参见材料与方法)的培养基使细胞重悬浮，并于37℃孵育18 h (用于RNA提取)和24-72 h (用于蛋白质提取、胞内染色和ELISA)。
实时逆转录-PCR分析：使用Light-Cycler仪器(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)通过定量实时RT-PCR分析人CD84、Rp2、Bcl-2、CCL3、IL6和VCAM的mRNA水平。反应体积(10 µl)包含3 mM MgCl2、LightCycler HotStart DNA SYBR Green I混合物(RocheDiagnostics)、特异性引物对和2.5 µl的cDNA。用于PCR的条件如下：95℃ 10分钟，接着40-60个循环的95℃ 15秒，60℃ 15秒，和72℃ 15秒。如前所述一式两份进行PCR [Luger D等，J. Clin. Immunol. 2004；24:579-590]。
引物序列如下：
hBcl-2：5’GGATCAGGGAGTTGGAAG 3’GCACTGCCAAACGGAG (分别为SEQ ID NO: 16-17)。
hCCL3：5’CGAGCAGCCAGTGCTCCAAGC 3’GGCTGTTTGGCAACAACCAGTCCA (分别为SEQID NO: 18-19)。
小鼠Bcl-2：5’ GCTACCGTCGTGACTT 3’GCCGGTTCAGGTACTC (分别为SEQ ID NO:20-21)。
IL6小鼠：5’CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA 3’GCAAGTGCATCATCGTTGTTCATAC (分别为SEQ ID NO: 22-23)。
VCAM1小鼠：5’TACCAGCTCCCAAAATCCTG 3’TCTGCTAATTCCAGCCTCGT (分别为SEQ IDNO: 24-25)。
使用RP-2水平将样品标准化以用于计算其它基因的相对表达水平。
CD84：5’TTGTTCCGTTTGTTCAAGAG 3’CGGAATAAACTGTGTTCACTGh (分别为SEQ IDNO: 28-29)。
通过siRNA减量调节CD84：将ON-TARGETplus SMARTpool，人CD84 (NM_003874)，Dharmacon用于减量调节CD84。
小鼠：所有动物程序均获Weizmann研究所动物研究委员会批准。
TCL1小鼠作为用于慢性淋巴细胞性白血病的模型：确定各年龄的TCL-1小鼠中恶性群体的百分数。脾细胞获自18、11和6月龄TCL-1小鼠并通过FACSCanto (BD Bioscience)分析其B220+CD5+群体。
然后在含2% FCS的Iscove’s培养基中，将脾B细胞与抗CD84 (B1或B4)或者匹配同种型的对照抗体一起孵育48 h。通过膜联蛋白-7AAD染色分析细胞存活(如上所述)。
用于CLL的异种移植模型：使用5 μM二醋酸羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Anaspec)将CLL细胞于37℃标记5 min。CFSE在在整个实验中对细胞存活无影响。然后将1×107个细胞静脉内注射到对照C57BL/6和CD84 KO小鼠中。1 h和4 h之后通过FACS分析来自组织的分离细胞来确定CLL细胞靶向脾、BM和PB。
正常B细胞：脾B细胞获自6、8和11月龄C57BL/6小鼠。分离细胞并用5 µg/ml抗CD84B1或B4抗体刺激，以及与匹配同种型的对照抗体的作用进行比较。
用于CLL的Eμ-TCL1模型：如前所述通过监测CD5+ B淋巴细胞增殖，使用Eμ-TCL1转基因小鼠跟踪CLL进展[Bichi R等，Proc Natl Acad Sci U S A. 2002.99: 6955-6960]。通过用来自Eµ-TCL1小鼠的5×106个BM细胞移植WT和CD84 KO小鼠来产生嵌合小鼠。4、6、8和13个月之后，将受体小鼠的腹膜腔、PB、脾和BM取出（sacrificed）并提取细胞，针对CD5(450 53-7.3 (eBioscience)、IgM (RMM-1 BioLegend)和B220 (RA3-6B2 (BioLegend)染色并通过FACSCanto (BD Bioscience)分析。
实施例2
B4抗体在CLL细胞中诱导凋亡
本发明人确定了根据本发明教导生成的B4抗体是否能够在原代人CLL细胞中诱导凋亡。如在图1A-D中所示，杂交瘤来源的B4抗体在单独培养的CLL细胞中诱导细胞死亡(图1A-B)。如前所示，不同类型的基质细胞例如原代人滋养样细胞(NLC)和骨髓基质细胞(MSC)(细胞系M210B4，CRL-1972TM)在共培养物中保护CLL细胞免受凋亡，并且为CLL微环境的必要组成部分（integral part）(Burger JA等，Blood. 2009.114:3367-3375，Kurtova AV等，Blood. 2009.114:4441-4450)。令人关注的是，当与M210B4细胞共培养时，B4杂交瘤来源的抗体克服基质的保护作用并诱导CLL死亡(图1C-D)。因此B4杂交瘤可用作阻断抗体。凋亡的测量包括所有膜联蛋白阳性细胞(单个和双个)，膜联蛋白阳性总群体从46.18%增加到55.75%。
实施例3
CD84调节对骨髓基质细胞-B4的抗凋亡作用
先前已表明CLL细胞能够主动操纵其微环境[Binder M等，PLoS One. 2012.5(12):e15992，Neil E Kay等，Leuk Res. 2007年7月；31(7): 899-906]。具体而言，最近显示CLL细胞在培养物中诱导对其基质配对细胞的抗凋亡作用。所述CLL-基质细胞相互作用诱导特异性细胞因子(即IL-6、IL-8)从基质表达和分泌以及诱导特异性粘附分子如ICAM-1表达，同时其它粘附分子的表达保持不变(即VCAM-1) [Plander M等，Annals of Hematology.2011.90(12):1381-90]。
为了确定CD84介导的CLL-基质细胞相互作用是否在基质中诱导类似的级联，如上所述在存在或不存在CD84阻断杂交瘤(B4)的情况下将CLL细胞与M210B4基质细胞一起培养(图1C-D)，并监测抗凋亡基因Bcl-2 (图2A)、细胞因子IL-6 (图2B)和VCAM-1 (图2C)在M210B4细胞中的表达。与CLL细胞一起孵育提高M210B4细胞中的Bcl-2和IL-6 mRNA水平，同时未观察到VCAM-1信息上的变化。
令人关注的是，CD84阻断降低Bcl-2 (图2A)和IL-6 (图2B)信息水平，同时VCAM-1水平不受此阻断影响(图2C)。
实施例4
CD84调节共培养物-B4中的CCL3表达
先前显示，CLL细胞能够主动募集细胞并经由分泌CCL3产生支持性微环境[ZucchettoA等，Cancer Res. 2009.69(9):4001-4009。Burger JA等，2009.113:3050-3058]。CLL细胞上表达的CD84的刺激诱导CCL3表达和分泌(我们未公布的结果)。为了直接证明CD84在CLL-基质细胞共培养物中在CCL3介导的分泌上的调节作用，在来源于CLL-基质细胞共培养物的上清液中分析分泌的CCL3水平，所述共培养物在存在或不存在CD84阻断杂交瘤(B4)或同种型对照抗体的情况下孵育。如在图3中所示，在CLL-M210B4共培养物中阻断CD84，减量调节来源于CLL细胞、分泌到条件培养基（conditioned medium）中的人CCL3水平，如通过ELISA检测(图3)。
类似地，分析了从在存在或不存在抗CD84阻断抗体的情况下与NLC细胞共培养的CLL细胞中分泌的CCL3。阻断CD84显著减量调节CCL3从CLL细胞分泌到条件培养基（conditioned medium）中(未显示数据)。然而，鉴于NLC为人源的，所以其进一步证实CD84特异性调节CCL3从这些共培养物的CLL细胞中分泌。因此在与NLC细胞一起培养的CLL细胞中分析CCL3 mRNA水平并证明CLL细胞中CCL3信息的表达减少(未显示数据)。
因此，CCL微环境相互作用通过CD84介导，其促进CCL3从CLL细胞分泌。
实施例5
F8、B1和B4抗体之间的比较
如在图4A-H和下表1中所示，本发明的一些实施方案的抗体(B1和B4)能够优势性杀死纯化的CLL细胞，如通过与文献中所述的阻断抗体(F8，PCT公布号WO2010/035259)相比有更高的凋亡细胞百分数 (图4A-D)和Ramos (RA-1) Burkitt's淋巴细胞百分数(ATCC CRL-1596TM，图4E-H)所证实。
表1：通过F8、B1和B4抗体的CLL细胞凋亡对比
实施例6
CD84KO小鼠显示其BM中人CLL细胞的数量减少
为了研究人CLL细胞在移植小鼠的不同区室中的存活和分布，用CFSE荧光标记人原代CLL细胞。然后将所述细胞注射到CD84KO和WT小鼠中。4小时之后，将存在于不同区室中的细胞数量进行比较，并计算各小鼠的BM和脾中的细胞数量之间的比率。如在图5A-B中所示，在对照小鼠的BM中测得的CLL细胞的比率，在CD84KO小鼠中显著降低(图5A)。为了确定此现象是因为CLL细胞未能到达（impaied arrival）CD84KO小鼠的BM区室，或由于其未能在此区室中停留或存活，将CLL细胞注射到CD84KO或WT小鼠中并在注射之后1小时跟踪细胞向BM的移动。如在图5B中所示，在WT和CD84KO小鼠中，CLL细胞在1小时之后靶向BM为类似的(图5B)。此结果可表明，CLL细胞通常靶向的BM，所述BM在微环境中缺乏CD84表达。在较晚时间点在BM中测得的细胞数量减少，很可能是由于在没有CD84信号的情况下，所述细胞不能在BM微环境中停留或存活。
实施例7
种交叉反应性的评价
使用CLL疾病的转基因小鼠模型Eµ-TCL1。在Eµ-TCL1转基因小鼠中，在小鼠的腹膜腔、外周血、骨髓和淋巴样器官中蓄积了B220低IgM + CD5 + B淋巴细胞。所述IgM + CD5+ B淋巴细胞在其表面上表达CD84 (图6A)。
然后确定使用B1和B4抗体阻断CD84活性是否诱导细胞死亡。首先，确定不同年龄的TCL-1小鼠中恶性群体的百分数。通过FACS对来源于18、11和6月龄TCL-1小鼠的脾细胞分析其B220+CD5+群体。尽管来自18和11月龄TCL-1小鼠的大部分脾细胞为恶性细胞(B220+CD5+)，但在来源于6月龄TCL-1小鼠的脾中难以测得B220+CD5+群体(图6B-D)。接着，跟踪所述抗体对细胞存活的作用。在含2% FCS的Iscove’s培养基中，使恶性脾B细胞与抗CD84 (B1或B4)或匹配同种型的对照抗体一起孵育。48 h之后，通过膜联蛋白-7AAD染色分析细胞存活。如可见于图6E-M，用B1和B4抗体阻断CD84在恶性B220+CD5+群体中诱导凋亡。出人意料的是，外周非恶性B220+CD5- B细胞群体的生存不受此处理影响(如在图9A-J中所述)。这些结果表明，所述抗人CD-84抗体B1和B4可阻断恶性小鼠细胞上的鼠CD84并减少其存活。
实施例8
分析肿瘤上的CD84表达
多个细胞系表达CD84，如在网站www.broadinstitute.org/ccle/中所阐述。虽然大部分所述细胞系属于造血来源，但是亦选择一些实体瘤分析CD84表达。从不同的实体瘤细胞系提取mRNA：MDA435 (人乳腺癌)、PC-3 (人前列腺癌)、Hela (人子宫颈癌)、A375 (人恶性黑素瘤)、A549 (人肺腺癌)、PAC1 (人胰腺癌)和NCL-N87 (人胃癌)。通过RT-PCR分析CD84信息。如可见于图7A，未在这些细胞的任一种中测得CD84 mRNA。
表达CD84的造血肿瘤细胞中的CD84诱导的级联的分析，在Burkitt’s淋巴细胞系Daudi中进行。如可见于图7B，Daudi细胞在其细胞表面表达CD84。
接着，确定所述抗CD84 B1和B4抗体在Daudi细胞中对凋亡诱导的作用。使Daudi细胞与不同浓度的抗CD84抗体B1或B4或者与对照抗体一起培养。48小时后，使用膜联蛋白染色检查细胞存活。阻断CD84诱导Daudi细胞的死亡(在图7C中显示代表性浓度)。
实施例9
正常组织中的CD84表达和功能的分析
多个正常组织表达CD84，如在网站www.gtexportal.org/home/中所阐述。如本文所示，CD84主要在EBV转化细胞上和在脾中表达。
分析CD84在正常组织中作为存活受体的作用。将健康细胞和来自处于不同疾病阶段的患者的CLL细胞中的CD84表达水平进行比较。对来自健康受试者的纯化B细胞以及早期和晚期CLL细胞分析CD84 mRNA的存在(靶向所有同种型共有的区段)。如在图8A-B中所示，在正常B细胞中测得低水平的CD84 mRNA，同时在所有CLL患者中均观察到升高水平的CD84mRNA，而不论疾病阶段。
此外，在与全部正常B细胞(图8C-E)或CD5+正常B细胞(图8F)相比时，所有CLL细胞中的CD84细胞表面水平均显著更高。因此，正常B细胞以更低水平表达CD84。
接着，评价了抗CD84 B1和B4抗体对正常B细胞存活的作用。将来源于6、8和11月龄C57BL/6小鼠的脾B细胞分离并用5 µg/ml抗CD84 B1或B4抗体刺激，并与匹配同种型的对照抗体的作用进行比较。如可见于图9A-J，B1和B4二者均对外周正常B细胞的生存力无影响。这些结果表明，虽然B1和B4抗体可阻断恶性小鼠细胞上的鼠CD84活性并减少细胞存活(图6C)，但其不会在正常B细胞中诱导凋亡。
实施例10
肿瘤微环境中CD84表达的分析
跟踪存在于肿瘤微环境中的骨髓基质细胞(MSC)和滋养样细胞(NLC)上的CD84表达。对于MSC，使用来源于CLL患者的原代骨髓MSC，将这些细胞分离并如前所述培养[Kay等，Leukemia Research 31，899-906 (2007)]，亦使用鼠MSC系(M210B4) F1小鼠。这些细胞系显示保护CLL细胞免受自发性凋亡和药物诱导的凋亡[Kurtova等，Blood 114，4441-4450(2009)]。将NLC分离并如前所述培养[Burger等，Blood 96，2655-2663 (2000)]。
如前所示在CLL细胞中检测CD84 mRNA (图10A)。此外，在M210B4细胞以及在NLC中检测CD84 mRNA (图10A)。接着，分析这些细胞表面上的CD84表达。如在图10B中所示，除其在CLL细胞上的表达之外，亦检测NLC以及M210B4基质细胞表面上的CD84。这表明CD84可能涉及CLL细胞及其微环境之间的细胞-细胞相互作用。
实施例11
CD84在调节微环境诱导的免受CLL自发性凋亡和药物诱导凋亡的保护中作用的分析
为了确定CD84是否在CLL细胞与其微环境的相互作用中起作用，所述相互作用导致细胞存活，在存在或不存在抗CD84阻断抗体的情况下将CLL细胞与基质细胞共培养(如上所述)。M210B4 (图11A-G)诱导对CLL细胞的抗凋亡作用，如通过膜联蛋白-PI/7AAD染色所测量(详述于上文实施例1)。通过杂交瘤B4 (图11A-C)阻断CD84部分克服基质诱导的抗凋亡作用，这导致诱导CLL细胞死亡。
本发明人接着想要确定通过阻断CD84诱导的凋亡是否为针对CLL细胞的直接作用，或者所述抗体是否可以阻止CLL细胞与基质的相互作用，从而诱导其死亡。因此，通过siRNA在M210B4中减量调节CD84表达。然后将CLL细胞添加到培养物中并监测其生存。如在图11D-G中所证明，缺失CD84特异性减少基质介导的CLL细胞生存。因此，基质上表达的CD84经由细胞-细胞接触介导CLL细胞生存。为了进一步证明微环境中表达的CD84对CLL细胞生存的作用，通过B1和B4抗体阻断M210B4上表达的CD84。1小时之后，洗涤抗体并随后将CLL细胞添加到共培养物中。48小时之后，通过膜联蛋白-7AAD染色测量细胞生存。阻断基质CD84显著诱导CLL细胞凋亡(图12A-D)，表明基质诱导的生存通过CD84基质-CLL相互作用来介导。
尽管本发明已结合其具体实施方案进行描述，但显然许多备选方案、修改和变动对本领域技术人员而言会是明显的。因此，意图其包括落入随附权利要求的精神和广义范围内的所有这类备选方案、修改和变动。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在本文中均通过引用以其整体结合到本说明书中，其引用程度如同具体且单独地指出各单独的出版物、专利或专利申请通过引用结合到本文中。此外，本申请中任何参考文献的引用或鉴定不应理解为承认所述参考文献可用作为本发明的先有技术。就节标题所使用的程度而言，不应将其理解为必要限制。

Claims (27)

1. 一种包含抗原识别结构域的分离的抗体，其特异性结合CD84的和
(i)减量调节基质细胞对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞的抗凋亡活性；和/或
(ii)诱导CLL细胞移动出骨髓。
2. 一种包含抗原识别结构域的分离抗体，所述抗原识别结构域包含如在SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6中所述的互补决定区(B4)，其中所述抗体特异性结合CD84。
3. 一种包含抗原识别结构域的分离抗体，所述抗原识别结构域包含如在SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12中所述的互补决定区(B1)，其中所述抗体特异性结合CD84。
4.权利要求2或3的分离抗体，其减量调节基质细胞对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞的抗凋亡活性。
5.权利要求2或3的分离抗体，其抑制CCL3从CLL细胞中分泌。
6.权利要求2或3的分离抗体，其抑制BCL-2在CLL中表达。
7.权利要求2或3的分离抗体，其抑制基质Bcl-2表达。
8.权利要求2或3的分离抗体，其减少基质细胞中的IL-6和IL-8的表达。
9.权利要求2或3的分离抗体，其诱导CLL细胞移动出骨髓。
10.权利要求1-9中任一项的分离抗体，其为IgG。
11.权利要求1-9中任一项的分离抗体，其中所述抗体为人源化抗体或嵌合抗体。
12.权利要求1-11中任一项的分离抗体，其中所述抗体为双特异性抗体。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项的分离抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。
14.一种在患有B细胞恶性肿瘤的受试者的B细胞中诱导凋亡的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗上有效量的权利要求1-12中任一项的抗体，从而在所述受试者的B细胞中诱导凋亡。
15.一种在有需要的受试者中治疗B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗上有效量的权利要求1-12中任一项的抗体，从而治疗所述B细胞恶性肿瘤。
16.权利要求1-12中任一项的抗体在制备经鉴定用于治疗B细胞恶性肿瘤的药剂中的用途。
17.权利要求14或15的方法，或者权利要求16的用途，其中所述B细胞恶性肿瘤选自淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。
18.权利要求14或15的方法，或者权利要求16的用途，其中所述B细胞恶性肿瘤选自Hodgkin淋巴瘤、非Hodgkin淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)/慢性淋巴系白血病(CLL)、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)、结外边缘区B细胞淋巴瘤-粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、毛细胞白血病、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性成淋巴细胞性前B细胞白血病、浆细胞白血病、前B细胞白血病、早期前B细胞白血病和前B急性成淋巴细胞样白血病。
19. 一种在有需要的受试者中诊断B-CLL的方法，所述方法包括：
(a)使所述受试者的生物样品与权利要求1-12中任一项的抗体在这样的条件下接触，所述条件允许在CD84同种型C (SEQ ID NO: 14)和所述抗体之间形成免疫复合物；和
(b)确定所述生物样品中所述免疫复合物的水平，其中所述免疫复合物水平的增加关于来自健康个体的生物样品中的所述免疫复合物的水平超过预定阈值表示B-CLL。
20.权利要求19的方法，其中所述测定在蛋白质水平上实现。
21.权利要求19的方法，其进一步包括使用诊断测定法证实所述诊断，所述诊断测定法选自所述CD84同种型c特有的表面标志物表达、核型分析和种系突变。
22.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-10和12中任一项的抗体的核酸序列。
23. 权利要求22的分离的多核苷酸，其如在SEQ ID NO: 26或27中所述。
24. 一种鉴定对抗B细胞恶性肿瘤的假定药物的方法，所述方法包括：
(a)使用试验物质处理具有B细胞恶性肿瘤的模型动物；和
(b)检测如在(a)中处理的所述模型动物的周缘组织中B细胞恶性肿瘤细胞相对于骨髓中的B细胞恶性肿瘤细胞，其中与所述处理之前的所述比率相比在所述比率上的增加表示所述试验物质为对抗B细胞恶性肿瘤的假定药物。
25.权利要求24的方法，其中所述试验物质为抗CD84抗体。
26.权利要求24的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤为B-CLL。
27.权利要求24的方法，其中所述模型动物选自通过在小鼠中移植人CLL而诱导的异种移植模型和Eu-TCL1鼠模型。
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