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CN106573955B - 位点特异性蛋白质修饰 - Google Patents

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CN106573955B CN201580033765.8A CN201580033765A CN106573955B CN 106573955 B CN106573955 B CN 106573955B CN 201580033765 A CN201580033765 A CN 201580033765A CN 106573955 B CN106573955 B CN 106573955B
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Abstract

本发明涉及用于位点选择性修饰蛋白质和肽的方法和试剂。位点选择性修饰是利用近邻组氨酸氨基酸的存在增加N末端氨基官能团的反应性，选择性衍生在蛋白质或多肽的N末端的氨基官能团。通过本发明方法获得的修饰的蛋白质或肽可以用于成像检查或治疗性用途。

Description

位点特异性蛋白质修饰
发明领域
本发明一般地涉及向蛋白质或多肽引入修饰基团的新方法。具体地说， 本发明涉及利用近邻组氨酸氨基酸的存在增加N末端氨基官能团的反应 性，选择性衍生在蛋白质或多肽的N末端的氨基官能团。
发明背景
熟知可以通过使基团缀合至蛋白质或肽修饰蛋白质或肽的特性和特 征。通常，这类缀合通常需要蛋白质中的一些官能团与缀合基团中的另一 个官能团反应。氨基，如赖氨酸残基中的N末端氨基或ε-氨基，已经为此 目的与合适的酰化试剂组合使用。经常想要或必需控制缀合反应，如在缀 合化合物与连接蛋白质的情况下和控制连接多少缀合基团。这经常称作特 异性或选择性。
蛋白质或肽的位点特异性修饰是药物和生物技术领域的长期挑战。经 典方法经常导致非特异性标记(例如NHS标记)或需要工程化(例如马来酰 亚胺Cys标记或非天然氨基酸)。此外，选择性化学反应的总数然而非常有 限。一个备选是通过重组方法，引入具有独特反应性的特定非天然氨基酸 并且随后在其他衍生化中利用这种反应性。另一个备选是使用识别待修饰 蛋白质的结构特征和功能特征的酶。
尽管采用重组方法，蛋白质/肽的选择性衍生化仍是非常困难的任务。 因此，本领域需要如在蛋白质或肽的N末端选择性衍化氨基酸残基的一般 方法。
发明简述
本发明涉及一种在N末端氨基酸的氨基官能团修饰靶蛋白或靶肽的方 法，所述方法包括步骤：
a.修饰靶蛋白质或靶肽，从而所产生的蛋白质或肽在与N 末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸；并且
b.使在与N末端氨基酸毗邻的位置处含有组氨酸氨基酸 的蛋白质或肽与酰化化合物在低于6的pH接触，以形成修饰 的蛋白质或多肽。
本发明还涉及用于修饰靶蛋白质或靶肽，从而所产生的蛋白质或肽在 与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的多种方法。这类方法将在 本文中更详细地描述。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种在N末端氨基酸的氨基官能团 修饰靶蛋白或靶肽的方法，所述方法包括步骤：
a.修饰靶蛋白质或靶肽，从而所产生的蛋白质或肽在与N 末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸；并且
b.使在与N末端氨基酸毗邻的位置处含有组氨酸氨基酸 的蛋白质或肽与以下式的活化形式的酸在低于6的pH接触：
HO-C(O)-(L1)n-R1，其中：
L1是接头；
R1是包含促进与生物相互作用剂或与分析剂共价接合的反应基团的 部分或R1是生物相互作用剂或分析剂，
n是0或1，
以形成修饰的蛋白质或肽。
在另一个实施方案中本发明涉及使用下式的酰化剂修饰如上文描述的 靶蛋白或靶肽的选择性方法：
Figure BDA0001188296870000021
其中：
L1是接头；
R是H或-S(O)2Na；
R1是包含促进与生物相互作用剂或与分析剂共价接合的反应基团的 部分或R1是生物相互作用剂或分析剂，
n是0或1。
在前述实施方案的又一个方面，本发明涉及如本文所述在N末端氨基 处修饰蛋白质或肽的选择性方法，其中生物相互作用剂或分析剂选自生物 素、荧光团、毒素、螯合剂、延长半寿期的部分(如例如白蛋白结合部分、 Fc变体或天然Fc)、成像试剂和肽。
在另一个实施方案中，本发明涉及如本文所述在N末端氨基处修饰蛋 白质或肽的选择性方法，其中R1是包含促进与生物相互作用剂或分析剂共 价接合的反应基团的部分。反应基团的例子是酰基、酯或混合酐、炔、四 嗪、马来酰亚胺、亚氨酸酯、羧基或更一般地能够与生物相互作用剂或分 析剂中存在的官能团如氨基、叠氮基、烯基、硫醇基或肼、羟胺基形成共 价键的基团。在这个实施方案的一个特定方面，本发明的方法还包括步骤： 使生物相互作用剂或分析剂与酰化剂中存在的反应基团反应，其中生物相 互作用或生物分析剂借助官能团(任选地借助接头L2)反应。接头将在本文 中更详细地定义。
在一个实施方案中，靶蛋白质或靶肽选自生长分化因子15(GDF15) 蛋白、同源物、变体、片段和其其他修饰形式、天然Fc、Fc变体或APJ 激动剂肽。
本发明的这些和其他方面将在本发明的以下详细说明中阐明。
附图简述
发明详述
定义：
出于解释本说明书的目的，除非另外指定，否则以下定义将适用，并 且在适宜的任何时候，以单数使用的术语也将包括复数形式并且反之亦然。
为了并入本文中，对专利、专利出版物和其他文献所做的全部参考均 进行至法律允许的程度。
通过提供一种以选择性方式向靶蛋白或肽引入修饰化合物的方法，本 发明解决了前述需求。
必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文中和所附权利要求 中所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数称谓。因此，例如，对“缀合 物”的称谓包括对一种或多种缀合物的称谓；对“多肽”的称谓包括对一种或 多种多肽的称谓等。
术语烷基指包含1至30个碳原子的完全饱和分枝或不分枝(或直链或 线性)的烃部分。优选地，烷基包含5至20个碳原子并且更优选地10至15 个碳原子。C10-15烷基指包含10至15个碳的烷基链。
术语“烯基”指具有至少一个碳-碳双键的分枝或不分枝的烃。术语 “C2-30-炔基”指具有2至7个碳原子并且包含至少一个碳-碳叁键的烃。
术语“炔基”指具有至少一个碳-碳参键的分枝或不分枝的烃。术语 “C2-30-炔基”指具有2至7个碳原子并且包含至少一个碳-碳叁键的烃。
术语芳基指在环部分中具有6-10个碳原子的单环状或双环状芳烃基。 芳基的代表性例子是苯基或萘基。
术语杂芳基包括含有5-10个选自碳原子和1至5个杂原子的环成员的 单环或双环杂芳基，并且每个杂原子独立地选自O、N或S，其中S和N 可以氧化成多种氧化状态。对于双环杂芳基系统，该系统是完全芳族的(即 全部环均是芳族的)。
术语环烷基指3-12个碳原子、优选地3-8个或3-7个碳原子的饱和或 不饱和、但非芳族单环、双环或三环烃基。对于双环和三环环烷基系统， 全部环是非芳族的。例如，环烷基涵盖环烯基和环炔基。术语“环烯基”指 具有至少一个碳-碳双键的3-12个碳原子的双环或三环烃基。术语“环炔基” 指具有至少一个碳-碳叁键的3-12个碳原子的双环或三环烃基。
术语杂环基指含有至少一个选自O、S和N的杂原子的饱和或不饱和 非芳族(部分不饱和的但是非芳族)单环、双环或三环环系统，其中N和S 还可以任选地氧化成多种氧化状态。在一个实施方案中，杂环基部分代表 含有5-7个环原子和任选地含有选自O、S或N的其他杂原子的饱和单环 状环。杂环可以用烷基、卤素、氧代、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基取 代。在其他实施方案中，杂环基为双环或三环。对于多环系统，一些环可 以是芳族的并且与饱和或部分饱和的环或多个环稠合。总体的稠合系统并 不是完全芳族的。例如，杂环系统可以是与饱和或部分饱和的环烷基环系 统稠合的芳族杂芳基。
术语“缀合物”意指因靶蛋白/肽与生物相互作用剂/分析剂共价接合、任 选地经接头共价接合所形成的实体。术语“缀合”意指靶蛋白/肽与生物相互 作用剂/分析剂共价接合、任选地经接头共价接合的步骤。
如本文所用，术语“多肽”指由肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论 是否为天然或合成地产生。小于约10个氨基酸残基的多肽常称作“肽”。术 语“肽”意在表示由肽键连接的两个或更多个氨基酸的序列，其中所述氨基 酸可以是天然或非天然的。本术语涵盖术语多肽和蛋白质，所述多肽和蛋 白质可以由借助共价相互作用(例如半胱氨酸桥或非共价相互作用)结合在 一起的两个或更多个肽组成。本领域认可的三字母或单字母缩写用来代表构成本发明肽和多肽的氨基酸残基。除前置“D”时，氨基酸是L-氨基酸。 当单字母缩写是大写字母时，它指D-氨基酸。当单字母缩写是小写字母时， 它指L-氨基酸。基团或字串或氨基酸缩写用来代表肽。肽在左侧用N末端 指示并且从N末端至C末端书写序列。
本发明的肽含有非自然氨基酸(即，自然界中不存在的化合物)并且如 本领域已知，可以备选地使用其他氨基酸类似物。
可以通过Deiters等人,J Am Chem Soc 125:11782-11783,2003；Wang 和Schultz,Science 301:964-967,2003；Wang等人,Science 292:498-500, 2001；Zhang等人,Science 303:371-373,2004或在美国专利号7,083,970中 描述的技术引入某些非自然氨基酸。简而言之，这些表达系统中的某些系 统包括位点定向诱变以将无义密码子如琥珀TAG引入编码本发明多肽的 可读框中。随后将此类表达载体引入宿主中，其中所述宿主可以利用对对 所引入的无义密码子特异并且装载所选择非自然氨基酸的tRNA。对缀合 多个部分至本发明多肽的目的有益的具体非自然氨基酸包括具有乙炔侧链 和叠氮基侧链的那些非自然氨基酸。
“蛋白质”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可以包含非肽 组分，如糖基团。糖和其他非肽取代基可以由其中产生蛋白质的细胞添加 至该蛋白质，并且将随细胞的类型变动。蛋白质在本文中根据它们的氨基 酸主链结构定义；取代基如糖基团通常不予指明，但然而可以存在。由非 宿主DNA分子编码的蛋白质或多肽是“异源”蛋白质或多肽。
“分离的多肽或分离的蛋白质”是这样的多肽或蛋白质(例如GDF15)， 所述多肽或蛋白质基本上不含自然界中该多肽结合的细胞组分如糖、脂、 或其他蛋白质杂质。一般，分离的多肽或蛋白质的制备物含有高度纯化形 式(即，至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、大于95％纯、如 96％、97％、或98％或更纯、或大于99％纯)的多肽或蛋白质。一种显示 特定蛋白质制备物含有分离的多肽或蛋白质的方式是通过在蛋白质制备物 的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮兰染色后 出现单一条带。然而，术语“分离的”不排除存在备选物理形式的相同多肽 或蛋白质、如二聚体或备选地糖基化形式或衍生化形式。优选地，分离的 多肽基本上不含在其天然环境中存在的将干扰其治疗用途、诊断用途、预 防用途或研究用途的任何其他污染性多肽或其他污染物。
本领域普通技术人员将理解，可以在本文所述的任何多肽或蛋白质的 序列中在不必然降低其活性的情况下进行多种氨基酸置换，例如保守性氨 基酸置换。如本文所用，“常作为其置换物使用的氨基酸”包括保守性置换 (即，置换为化学特征可比的氨基酸)。出于保守性置换的目的，非极性(疏 水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性(亲水)、中性氨基酸包括丝氨酸、苏 氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基 酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带正电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸 和谷氨酸。氨基酸置换的例子包括用L-氨基酸置换相应的D-氨基酸、用半 胱氨酸置换同型半胱氨酸或具有含硫醇侧链的其他非自然氨基酸、用赖氨 酸置换高赖氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、鸟氨酸或具有含氨基侧链的 的其他非自然氨基酸、或用丙氨酸置换正缬氨酸等。
如本文所用，术语“氨基酸”指天然存在的氨基酸、非天然氨基酸、氨 基酸类似物和氨基酸模拟物，它们按照类似于天然存在氨基酸的方式发挥 作用，如果它们的结构允许这类立体异构形式，则均处于其D立体异构体 和L立体异构体。氨基酸在本文中通过其公知的三字母符号或通过 IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission)推荐的单字母符号提到。
术语“天然存在的”指在自然界中存在并且未经人类操作的物质。类似 地，如本文所用，“非自然存在的”、“非天然”等指在自然界中不存在并且 已经在结构上由人类修饰或由人类合成的物质。与氨基酸联系使用时，术 语“天然存在的”指20种常规氨基酸(即，丙氨酸(A或Ala)、半胱氨酸(C或 Cys)、天冬氨酸(D或Asp)、谷氨酸(E或Glu)、苯丙氨酸(F或Phe)、甘氨 酸(G或Gly)、组氨酸(H或His)、异亮氨酸(I或Ile)、赖氨酸(K或Lys)、 亮氨酸(L或Leu)、甲硫氨酸(M或Met)、天冬酰胺(N或Asn)、脯氨酸(P 或Pro)、谷氨酰胺(Q或Gln)、精氨酸(R或Arg)、丝氨酸(S或Ser)、苏氨 酸(T或Thr)、缬氨酸(V或Val)、色氨酸(W或Trp)和酪氨酸(Y或Tyr))。
如本文所用，术语“非自然氨基酸”和“非天然氨基酸”，可互换地意在 代表不能在任何生物中使用来自任何生物的未修饰基因或修饰的基因(无 论相同或不同)以生物合成方式生成的氨基酸结构。这些术语指不存在于天 然存在的(野生型)蛋白质序列或本发明序列中的氨基酸残基。这些包括但 不限于不属于20种天然存在氨基酸之一的修饰的氨基酸和/或氨基酸类似 物、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸(Pyl)或吡咯啉-羧基-赖氨酸(Pcl，例如，如 PCT专利公开WO 2010/48582中所述)。可以是通过置换天然存在的氨基 酸、和/或通过向天然存在的(野生型)蛋白质序列或本发明序列插入非自然 氨基酸，引入这类非自然氨基酸残基。非自然氨基酸残基还可以如此掺入， 从而向分子赋予所需的官能性，例如，连接官能部分(例如，PEG)的能力。 与氨基酸联系使用时，符号“U”应当意指如本文所用的“非自然氨基酸”和 “非天然氨基酸”。
如本文所用，指示多肽或蛋白质的术语“类似物”意指修饰的肽或蛋白 质，其中肽/蛋白质的一个或多个氨基酸残基已经由其他氨基酸残基置换和 /或其中一个或多个氨基酸残基已经从肽/蛋白质缺失和/或其中已经向蛋白 质添加一个或多个氨基酸残基。这类氨基酸残基的添加或缺失可以在肽的 N末端和/或在肽的C末端进行。
术语“APJ”(也称作“apelin受体”、“血管紧张素样1受体”、“血管紧张 素II样1受体”等)表示380个残基、7个跨膜结构域、Gi偶联受体，其基 因定位在人类中染色体11的长臂上(NCBI参考序列：NP_005152.1，和由 NCBI参考序列：NM_005161编码)。APJ首次在1993年使用简并寡核苷 酸引物从人基因组DNA克隆(O'Dowd等人,Gene,136:355-60,1993)并且与血管紧张素II受体1型共有显著同源性。然而尽管具有这种同源性，血 管紧张素II不结合APJ。尽管作为孤例许多年，内源性配体已经分离并命 名为apelin(Tatemoto等人,Biochem Biophys Res Commun 251,471-6 (1998))。
术语“APJ激动剂”包括apelin多肽：apelin表示77个残基前蛋白 (NCBI参考序列：NP_0059109.3、并由NCBI参考序列：NM_017413.3编 码)、其经加工成为生物活性形式的apelin肽，如apelin-36、apelin-17、 apelin-16、apelin-13、apelin-12。称作“apelin-36”的全长成熟肽包含36个 氨基酸，但是最有力的同工型是焦谷氨酸化形式的13聚apelin(apelin-13)、 称作“Pyr-1-apelin-13或Pyr1-apelin-13”。不同apelin形式例如在美国专利 6,492,324B1中描述。apelin肽激动剂还在通过引用的方式并入本文的专利 申请号WO2013/111110、WO 2014/081702、WO 2015/013168、WO 2015/013165、WO 2015/013169和WO2015/013169中描述。
术语“GDF15多肽”和“GDF15蛋白”可互换使用并且意指在哺乳动物 (如人或小鼠)中表达的天然存在的野生型多肽。为了本公开的目的，术语 “GDF15蛋白”可以互换用来指任何全长GDF15多肽，其由308个氨基酸 残基组成(NCI Ref.Seq.NP_004855.2)，含有20个氨基酸的信号肽、167 个氨基酸的前结构域和由弗林蛋白酶样蛋白酶从前结构域切除的112个氨 基酸的成熟结构域。308个氨基酸的GDF15多肽称作“全长”GDF15多肽； 112个氨基酸的GDF15多肽(例如氨基酸197-308)是“成熟的”GDF15多肽。 成熟的GDF15肽含有形成TGF-超家族成员常见的半胱氨酸结基序(具有 三个链内二硫化物键)和单个链间二硫键所需要的7个保守半胱氨酸残基。 成熟GDF15肽含有形成第四链内二硫键的两个额外半胱氨酸残基。因此， 有生物活性的GDF15是通过一个链间二硫键共价连接的成熟肽的同型二 聚体。GDF15蛋白或多肽因此还包括该蛋白质的多聚体、更具体地二聚体。
术语“GDF15突变体多肽”涵盖其中已经修饰天然存在的GDF15多肽 序列的GDF15多肽。这类修饰包括但不限于一个或多个氨基酸置换，包 括将非天然存在的氨基酸置换为非天然存在的氨基酸类似物和氨基酸模拟 物。
在一个方面，术语“GDF15突变体蛋白”指这样的GDF15蛋白序列(例 如，SEQ IDNO:1-8)，其中正常情况下在天然GDF15多肽的给定位置处 存在的至少一个残基缺失或由天然GDF15序列中该位置处不存在的残基 替换。在一些情况下，将想要将正常情况下在天然GDF15多肽的给定位 置处存在的单个残基用多于一个正常情况下在该位置不存的的残基替换； 在仍然的其他情况下，可能想要维持天然GDF15多肽序列并且在蛋白质 中给定位置处插入一个或多个残基；在仍然的其他情况下，可能想要完全 缺失给定的残基；全部这些构建体均由术语“GDF15突变体蛋白”涵盖。本 发明还涵盖编码这类GDF15突变体多肽序列的核酸分子。
在多种实施方案中，GDF15突变体蛋白包含与天然存在的GDF15蛋 白至少约85％相同的氨基酸序列。在其他实施方案中，GDF15多肽包含 与天然存在的GDF15蛋白至少约90％、或约95％、96％、97％、98％或 99％相同的氨基酸序列。这类GDF15突变体多肽优选地，但是不必要拥 有野生型GDF15突变体多肽的至少一种活性，如降低血糖、胰岛素、三 酰甘油或胆甾醇水平的能力；降低体重的能力；或改善葡萄糖耐量、能量 消耗或胰岛素敏感性的能力。
尽管GDF15多肽和GDF15突变体多肽和包含这类多肽的构建体主要 就人GDF15而言公开，但本发明不受如此限制并且扩展至GDF15多肽和 GDF15突变体多肽和包含这类多肽的构建体，其中GDF15多肽和GDF15 突变体多肽衍生自其他物种(例如，食蟹猴、小鼠和大鼠)。在一些情况下， GDF15多肽或GDF15突变体多肽可以用来以GDF15突变体多肽的成熟形式治疗或改善受试者中代谢疾病，所述GDF15突变体多肽的成熟形式衍 生自与受试者相同的物种。
GDF15突变体多肽优选地有生物学活性。在各种相应的实施方案中， GDF15多肽或GDF15突变体多肽具有与天然存在形式的成熟GDF15蛋白 等同、较之更大或较之更小的生物学活性。生物活性的例子包括降低血糖、 胰岛素、三酰甘油或胆甾醇水平的能力；降低体重的能力；或改善葡萄糖 耐量、脂质耐受性或胰岛素敏感性的能力；减少尿葡萄糖和蛋白质排泄的 能力。
如本文中在多肽或蛋白质结构的情境下所用，术语“N末端”(或“氨基 端”)和“C末端”(或“羧基端)分别指多肽的氨基最末端和羧基最末端。术语 “N末端氨基酸”指在N末端存在的最末氨基酸。术语“N末端氨基酸毗邻 的氨基酸”指在与N末端的最末氨基酸毗邻的位置处存在的氨基酸(即从N 末端计数，在蛋白质或肽中存在的第二个氨基酸)。
术语延长半寿期的部分指例如聚合物、如聚乙二醇(PEG)、脂肪酸、 胆固醇基团、糖或寡糖；或与救援受体(salvage receptor)结合的任何天然 或合成性蛋白质、多肽或肽。延长半寿期的部分可以与血清半寿期长的血 浆蛋白(例如白蛋白和免疫球蛋白)结合。例如，延长半寿期的部分是IgG 恒定结构域或其片段(例如，Fc区)、人血清白蛋白(HSA)、或白蛋白结合 多肽。在其他实施方案中，延长半寿期的部分是白蛋白结合残基或其他血 浆蛋白结合残基。如本文所用的“白蛋白结合残基”意指与人血清白蛋白非 共价结合的残基。在一个实施方案中，白蛋白结合残基是亲脂残基。在另 一个实施方案中，白蛋白结合残基在生理pH带负电荷。结合残基一般包 含可以带负电荷的羧酸。在另一个实施方案中，延长半寿期的部分是脂肪 酸，所述脂肪酸可以定义为C6-70烷基、C6-70烯基或C6-70炔基链，它们各自用至少一个羧酸(例如1、2、3或4个CO2H)取代并且任选地进一步用羟 基取代。脂肪酸的例子由式A1、A2和A3定义。在其他实施方案中，延 长半寿期的部分是与血浆蛋白(例如白蛋白)非共价结合的小分子。这类小 分子例如是华法林、阿司匹林、苯二氮卓(benzodiazepine)衍生物(例如地西 泮)、吲哚、卡烯内酯(例如毛地黄毒苷)和胆汁酸。
延长半寿期的部分包括白蛋白，所述白蛋白指血浆中最丰富的蛋白质， 取决于来源物种，该蛋白质在其单聚体形式下具有大约65和67千道尔顿 之间的分子量。术语“白蛋白”与“血清白蛋白”互换使用并且不意在限定与 本发明的修饰的肽形成缀合物的白蛋白的来源。因此，如本文所用的术语 “白蛋白”可以指从天然来源如血液或浆液纯化的白蛋白，或它可以指化学 合成的或重组产生的白蛋白。
延长半寿期的部分包括“天然Fc”，所述天然Fc指包含因消化完整抗 体产生或通过其他手段产生的非抗原结合片段(无论是否处于单体形式或 多聚体形式)的序列的分子或序列，所并且可以含有铰链区。天然Fc的原 始免疫球蛋白源优选地是人源的并且可以是任何免疫球蛋白的，不过IgG1 和IgG2是优选的。天然Fc分子由可以通过共价(即，二硫键)和非共价缔 合连接至成二聚体单体多肽或多聚体形式的单体多肽构成。天然Fc分子的 单体亚基之间的分子间二硫键数目范围从1至4，这取决于类别(例如，IgG、 IgA和IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)。天然Fc 的一个例子是因木瓜蛋白酶消化IgG产生的二硫键结合型二聚体(参见 Ellison等人,1982,Nucleic Acids Res.10:4071-9)。如本文所用的术语“天然 Fc”是类属于单体形式、二聚体形式和多聚体形式。
延长半寿期的部分包含“Fc变体”，所述Fc变体指从天然Fc修饰，但 仍然包含救援受体(salvage receptor)(FcRn(新生Fc受体))结合位点的分子 或序列。国际公开号WO97/34631和WO 96/32478描述了示例性Fc变体、 以及与救援受体(salvage receptor)相互作用，并且因而通过引用的方式并 入。因此，术语“Fc变体”可以包括从非人类天然Fc中人源化的分子或序 列。另外，天然Fc包含可以移除的区域，因为它们提供本发明生物缀合物不需要的结构性特征或生物学活性。因此，术语“Fc变体”包含缺少一个或 多个天然Fc位点或残基或其中一个或多个Fc位点或残基已经被修饰、影 响或涉及以下情况的分子或序列：(1)二硫键形成、(2)与选择的宿主细胞不 相容性、(3)在选择的宿主细胞中表达时具有N末端异质性、(4)糖基化、(5) 与补体相互作用、(6)与Fc受体而非救援受体结合、或(7)抗体依赖的细胞 毒性(ADCC)。下文更详细地描述Fc变体。
半寿期延长部分指涵盖如上文定义的天然Fc和Fc变体和序列的“Fc 结构域”。与Fc变体和天然Fc分子一样，术语“Fc结构域”包括单体形式 或多聚体形式的分子，无论从完整抗体消化而来或通过其他手段产生。在 本发明的一些实施方案中，Fc结构域可以例如通过Fc结构域和肽序列之 间的共价键与式I’或式I-IX任一者的多肽缀合。这类Fc蛋白可以通过Fc 结构域缔合形成多聚体并且这些Fc蛋白和它们的多聚体是本发明的一个 方面。
延长半寿期的部分包括“修饰的Fc片段”，所述修饰的Fc片段应当意 指包含修饰的序列的抗体的Fc片段。Fc片段是包含CH2、CH3和部分铰 链区的抗体部分。修饰的Fc片段可以衍生自例如IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4。FcLALA是具有LALA突变(L234A、L235A)的修饰的Fc片段，所 述修饰的Fc片段以降低的效率触发ADCC并且微弱结合及活化人补体。 Hessell等人,2007Nature 449:101-104。例如美国专利号7,217,798中描述 了对Fc片段的额外修饰。
接头将靶蛋白/肽和生物相互作用剂/分析剂或包含促进与生物相互作 用剂/分析剂共价接合的反应基团的任何部分分隔。其化学结构并非关键， 因为它主要起到间隔团的作用。
接头是含有两个反应基团/官能团的化学部分，其中之一可以与靶肽/ 蛋白反应并且另一个与生物相互作用剂/生物分析剂反应。接头的两个反应 性/官能团借助连接部分或间隔团连接，所述连接部分或间隔团的结构并非 关键，只要它不干扰接头与靶蛋白/肽和与生物相互作用剂/分析剂的偶联。
接头可以由通过肽键连接在一起的氨基酸残基组成。在本发明的一些 实施方案中，接头由1至20个由肽键连接的氨基酸组成，其中氨基酸选自 20种天然存在的氨基酸。在多种实施方案中，1至20个氨基酸选自氨基酸 甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和 赖氨酸。在一些实施方案中，接头由非空间位阻的大部分氨基酸如甘氨酸 和丙氨酸组成。在一些实施方案中，接头是聚甘氨酸、聚丙氨酸、甘氨酸 和丙氨酸的组合(如聚(Gly-Ala))、或甘氨酸和丝氨酸的组合(如聚 (Gly-Ser))。
在一些实施方案中，接头包含1至20个选自非天然氨基酸的氨基酸。 尽管1-10个基酸残基的接头优选用于与生物相互作用剂或分析剂缀合，但 是本发明构思具有任何长度或组成的接头。非天然氨基酸接头的例子是具 有以下式的8-氨基-3,6-二氧杂辛酸：
Figure BDA0001188296870000131
或其重复单元。
本文所述的接头是示例性的，并且本发明构思了长得多并且包括其他 残基的的接头。本发明还构思了非肽接头。
在其他实施方案中，接头包含一个或多个烷基、烯基、环烷基、芳基、 杂芳基、杂环基、聚乙二醇和/或一个或多个天然或非天然氨基酸或其组合， 其中烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇和/或天然或 非天然氨基酸的每者任选地组合并借助选自–C(O)O-、-OC(O)-、 -NHC(O)-、-C(O)NH-、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)-O-、 ＝NH-O-、＝NH-NH-或＝NH-N(烷基)-的化学基团连接在一起或连接至生物 相互作用/分析剂和/或连接至靶蛋白质/肽。
含有烷基间隔团的接头例如是–NH-(CH2)z-C(O)-或–S-(CH2)z-C(O)-或 –O-(CH2)z-C(O)-、-NH-(CH2)z-NH-、-O-C(O)-(CH2)z-C(O)-O-、 -C(O)-(CH2)z-O-、-NHC(O)-(CH2)z-C(O)-NH-等其中可以使用z是2-20。 这些烷基接头还可以由任何非空间位阻的基团包括但不限于低级烷基(例 如，C1-C6)、低级酰基、卤素(例如，Cl、Br)，CN、NH2、或苯基等取代。
接头也可以是聚合物性质的。接头可以包含生物稳定或生物可降解的 聚合物链或单元。具有重复连接的聚合物可以在生理条件下根据键不稳定 性而具有不同程度的稳定性。聚合物可以含有多种键如聚碳酸酯 (-O-C(O)-O-)、聚酯(-C(O)-O-)、聚氨酯(-NH-C(O)-O-)、聚酰胺(-C(O)-NH-)。 这些键以举例方式提供，并且不意在限制在本发明的聚合物链或接头中所 用的键的类型。合适的聚合物例如包括、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酸、 葡聚糖、葡聚糖衍生物、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、 多糖、纤维素和纤维素衍生物、淀粉和淀粉衍生物、聚二醇及其衍生物、 聚二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚等及其混合物。聚合物接头例 如是聚乙二醇(PEG)。PEG接头可以是线性或分支的。本发明中PEG接头 的分子量不限于任何特定的大小，但是某些实施方案具有100道尔顿至 5000道尔顿例如500道尔顿至1500道尔顿之间的分子量。
接头在两个末端含有适当的官能反应基团，所述官能反应基团在靶肽/ 蛋白的氨基和生物相互作用剂/生物分析剂上的官能/反应基团之间形成桥
接头可以包含性质不同的几种连接部分(或间隔团)(例如氨基酸、杂环 基部分、PEG和/或烷基部分的组合)。在这个实例中，每个连接部分在两 个末端含有适宜的官能-反应基团，旨在将这些部分连接在一起并在每个末 端处与相应配偶体形成桥。
修饰的靶蛋白/肽或其构建体(即与部分接头连接的肽/蛋白质)包含反 应基团，所述反应基团可以与分析性/生物相互作用剂或其构建体上的可用 反应性官能团(即先前连接的部分接头)反应以形成共价键。反应基团是能 够形成共价键的化学基团。反应基团位于一个缀合位点处并且可以通常是 羧基、磷酰基、酰基、酯或混合酐、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、四 嗪、炔烃、亚氨酸酯、吡啶-2-基-二硫烷基，因而能够与官能团如氨基、羟基、烯基、羧基、肼、羟胺基、叠氮基或硫醇基在其他缀合位点形成共价 键。
用于靶肽/靶蛋白与生物相互作用剂/分析剂和/或接头部分缀合和/或 将性质不同的多种连接部分缀合在一起的特定目的反应基团是N-羟基琥 珀酰亚胺、炔烃(更具体地环辛炔)。
官能团(Fg)包括1.与反应基团如马来酰亚胺、甲苯磺酰基砜或吡啶-2- 基二硫烷基反应的硫醇基；2.与反应基团如羧酸或活化羧酸(例如借助N- 羟琥珀酰胺化学形成酰胺键)、磷酰基、酰基或混合酐反应的氨基(例如氨 基酸的氨基官能团)；3.经历与炔烃和更具体地与环辛炔反应基团的 Huisgen环加成(更通称为点击化学)的叠氮基；4.与选自羟胺或肼的反应 基团反应以分别形成肟或肼的羰基；5.在氮杂[4+2]加成中与四嗪反应基团 反应的烯。尽管本文中描述了接头和官能团/反应基团的几个例子，但本发 明构思了任何长度和组成的接头。
术语“毒素”指能够与大分子如酶、细胞受体和细胞相互作用并造成伤 害或疾病的小分子或肽。这类毒素可以用于癌疗法中以摧毁癌细胞。因为 其毒性，这类毒素本身不能作为药物使用。它们一般连接至指导其抵达癌 细胞的蛋白质。毒素的例子是MMAF(单甲基澳瑞司他汀F)、MMAE(单 甲基澳瑞司他汀E)、mertansine(DM-1)、美登素、隐藻素、tubulysin和海 兔毒素10。
术语“螯合剂”或“络合剂”指能够与金属离子(例如镧系元素)形成络合 物的有机分子。螯合剂常用来标记物蛋白质或肽。金属离子缀合物的终产 物用于放射免疫检测、放射免疫疗法、磁共振成像、光动力疗法或其他相 似的模式。螯合剂或络合剂的非限制性例子是DTPA(二亚乙基三胺五乙酸 酐)和其衍生物、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N”-三乙酸)和其衍生物如 NODA-GA、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸)(结合放 射性金属离子)和其衍生物、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N”,N”'- 四乙酸)和其衍生物、DTTA(N-(对-异硫氰酸苄基)-二亚乙基三胺 -N,N',N”,N”'-四乙酸)。这些和其他螯合剂从商业来源轻易可获得。
术语“成像试剂”是设计成允许临床医务人员确定某团块是否为良性 或恶性并定位身体内转移性癌部位的化学物。成像剂靶向特定的肿瘤，此 后可以调节成像仪器以压制靶。成像剂的例子是荧光团、vivotag、荧光纳 米粒子、萤光素和氙气光。
术语“荧光团”指当光激发时可以再发光的化学化合物。荧光团一般含 有几个合并的芳族基团、或具有几个π键的平面状或环状分子。荧光团通 常与大分子共价结合，充当亲和试剂或生物活性试剂(抗体、肽、核酸)的 标志物(或染料、或标签、或报道分子)。荧光团尤其用来在多种分析方法 即荧光成像和光谱法中着染组织、细胞或材料。例子包括荧光素、罗丹明、 Cy染料如Cy5和Cy7、Alexa染料如Alexa750、Alexa647和Alexa 488、 香豆素等。
如本文所用的“生物相互作用剂”指当引入活组织或细胞时激发生物学 反应的有机部分或化合物。生物相互作用剂的例子包括抗原、毒素、治疗 性蛋白或肽等。生物相互作用剂可以是小分子和大分子。
如本文所用的“分析剂”指可以通过定性或定量表征与分析剂结合或否 则缔合的材料的仪器方法检测到的有机部分或化合物。这类分析剂的例子 包括标签例如荧光团或放射标签。
实施方案
本文中描述了本发明的多种实施方案。将认识到，每个实施方案中具 体说明的特征可以与其他具体说明的特征组合以提供其他实施方案。
在实施方案1中，本发明涉及一种在N末端氨基酸的氨基官能团修饰 靶蛋白或靶肽的方法，所述方法包括步骤：
c.修饰靶蛋白质或靶肽，从而所产生的蛋白质或肽在与N 末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸；
d.使在与N末端氨基酸毗邻的位置处含有组氨酸氨基酸 的蛋白质或肽与酰化化合物在低于6的pH接触，以形成修饰 的蛋白质或肽。
在实施方案2中，本发明涉及根据实施方案1的方法，其中在与N末 端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的所述蛋白质或肽是通过用组氨酸 替换与所述靶蛋白或靶肽的N末端氨基酸毗邻的氨基酸制备的。
在实施方案3中，本发明涉及根据实施方案1的方法，其中在与N末 端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽是通过将在所述靶蛋 白或靶肽的N末端的两个氨基酸替换为氨基酸序列XH-其中H是组氨酸和 X是选自M、A、Q、N和G的氨基酸制备的。
在实施方案4中，本发明涉及根据实施方案3的方法，其中氨基酸序 列XH-是MH-和AH-。
在实施方案5中，本发明涉及根据实施方案1的方法，其中在与N末 端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽是通过将在所述靶蛋 白或靶肽的N末端的三个氨基酸替换为氨基酸序列XHX’-其中H是组氨 酸和X和X’独立地选自M、A、Q、N和G的氨基酸制备的。
在实施方案6中，本发明涉及根据实施方案5的方法，其中氨基酸序 列XHX’-选自AHA-和MHA。
在实施方案7中，本发明涉及根据实施方案1的方法，其中通过在所 述靶蛋白或靶肽的N末端附加式XH的两氨基酸序列或式XHX’-的三氨基 酸序列其中H是组氨酸并且X和X’独立选自M、A、Q、N和G，制备在 与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽。
在实施方案8中，本发明涉及根据实施方案1的方法，其中通过在所 述靶蛋白或靶肽的N末端附加组氨酸标签，制备在与N末端氨基酸毗邻的 位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽。在这个实施方案的一个方面，组氨 酸标签包含1至10个组氨酸氨基酸。在这个实施方案的又一个方面，组氨 酸标签还包含一个或多个甲硫氨酸氨基酸，只要它们不位于与N末端氨基 酸毗邻的位置。
在实施方案9中，本发明涉及根据实施方案8的方法，其中通过附加 选自MHHHHHH-或MHHHHHHM-的氨基酸序列至所述靶蛋白或靶肽 的N末端，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质 或肽。
在实施方案10中，本发明涉及实施方案1-9中任一个的方法，其中酰 化剂是以下式的活化形式的酸：
HO-C(O)-(L1)n-R1，其中：
L1是接头；
R1是包含促进与生物相互作用剂或与分析剂共价接合的反应基团的 部分或R1是生物相互作用剂或分析剂，
n是0或1。
活化形式的羧酸是本领域普通技术人员熟知的。在实施方案10A中， 用于本发明中的活化形式羧酸选自酯如氟苯基酯；酐或混合酐；酰氯、酰 基叠氮化物；酰基磷酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺活化的酸。
在实施方案11中，本发明涉及实施方案10或10A的方法，其中酰化 剂具有以下式：
Figure BDA0001188296870000181
R是H或SO3Na。
在实施方案12中，本发明涉及实施方案10、10A或11的方法，其中 n是1并且L1包含一个或多个烷基、烯基、环烷基基团、芳基、杂芳基、 杂环基、聚乙二醇和/或一个或多个天然或非天然氨基酸或其组合，其中烷 基、链烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇和/或天然或非天 然氨基酸的每者任选地组合并借助选自–C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、 -C(O)NH-、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)-O-、＝NH-O-、 ＝NH-NH-或＝NH-N(烷基)-的化学基团连接在一起或连接至生物相互作用/ 分析剂和/或连接至靶蛋白质/肽。
在实施方案13中，本发明涉及根据实施方案12的方法，其中接头是 具有100和5000kD之间分子量的线性或分枝的烷基或聚乙二醇。在实施 方案13A中，最感兴趣的接头是下式的不分枝低聚乙二醇部分：
Figure BDA0001188296870000191
其中y是0至34。
在实施方案14中，本发明涉及根据实施方案10、10A、11、12或13 的方法，其中R1是生物相互作用剂/分析剂。
在实施方案15中，本发明涉及根据实施方案14的方法，其中R1是生 物素。这种用于生物素酰化的酰化剂的非限制性例子是：
下式的SO3NHS-生物素：
Figure BDA0001188296870000192
下式的SO3NHS-LC-生物素：
Figure BDA0001188296870000193
下式的NHS-PEG24-生物素：
Figure BDA0001188296870000201
和例如从商业来源轻易地可获得的其他已知生物素构建体。
实施方案16，本发明涉及根据实施方案14的方法，其中R1是脂肪酸 (FA)部分。脂肪酸的例子是用至少一个羧酸(例如1、2、3或4个CO2H) 取代并且任选地进一步用羟基取代的C6-70烷基、C6-70烯基、C6-70炔基链。 脂肪酸(FA)优选地经接头L1与靶蛋白或靶肽缀合。在实施方案16A中， 本发明涉及根据实施方案16的方法，其中R1选自以下酸：
Figure BDA0001188296870000202
R2是CO2H、H；
R3、R4和R5彼此独立地是H、OH、CO2H、-CH＝CH2或–C＝CH；
Ak1是分枝的C6-C30亚烷基；
q、r和p彼此独立地6和30之间的整数；并且其中接合点是CO2H 官能团；或酰胺、酯或其可药用盐中的任一者。
在实施方案16C中，R1选自以下脂肪酸：
Figure BDA0001188296870000211
其中Ak2、Ak3、Ak4、Ak5和Ak6独立地是(C8-20)亚烷基，R6和R7独 立地是(C8-20)烷基。
在在实施方案16D中，R1选自以下脂肪酸：
Figure BDA0001188296870000212
这些脂肪酸部分已经在共同提交的美国申请号62/015,862(代理人案 号PAT056274-US-PSP)、62/082,327(代理人案号PAT056274-US-PSP02) 和62/107,016(代理人案号PAT056274-US-PSP03)中描述。
在实施方案17中，本发明涉及根据实施方案1-14和16中任一据实施 方案的方法，其中酰化剂是：
Figure RE-GDA0002424851610000011
R8是线性或分枝的C6-70烷基、线性或分枝的C6-70烯基或线性或分枝 的C6-70炔基，每种基团任选地用1至3个选自羧基和羟基的取代基取代；
s是1至34。在这个实施方案的一个特定方面，R8是
Figure RE-GDA0002424851610000012
其中上文限定Ak1、R2、R3、R4、R5、q、r和p。这类脂肪酸-PEG-NHS 部分的例子已经在共同提交的申请号62/015,862(代理人案号 PAT056274-US-PSP)和美国申请号62/082,327(代理人案号 PAT056274-US-PSP02)和62/107,016(代理人案号PAT056274-US-PSP03)中描述。
在实施方案18中，本发明涉及根据实施方案10、10A、11、12或13 的方法，其中R1是包含促进与生物相互作用剂或与分析剂共价接合的反应 基团的部分。
在实施方案19中，本发明涉及根据实施方案18的方法，其中反应基 团选自酰基、酯或混合酐、炔、四嗪、马来酰亚胺、亚氨酸酯、羧基。在 这个实施方案的一个特定方面，反应基团选自环炔、四嗪和马来酰亚胺。 在这个实施方案的又一个方面，反应基团是环炔部分。
在实施方案20中，本发明涉及根据实施方案18或19的方法，其中 R1是环辛炔部分。在这个实施方案的一个方面，酰化剂是活化形式的以下 羧酸：
Figure BDA0001188296870000231
；或下式的酰化剂：
Figure BDA0001188296870000232
Figure BDA0001188296870000241
在实施方案19的另一个方面，反应基团是四嗪。包含四嗪反应基团的 酰化部分的非限制性例子是活化形式的以下酸：
Figure BDA0001188296870000242
或下式的酰化剂：
Figure BDA0001188296870000251
在实施方案19的又一个方面，反应基团是马来酰亚胺。包含马来酰亚 胺反应基团的酰化部分的非限制性例子是活化形式的以下酸：
Figure BDA0001188296870000252
其中Ak7是C2-10亚烷基；
在实施方案21中，本发明涉及根据实施方案实施方案1至13和18 至20中实施方案的方法，其中酰化剂是：
Figure BDA0001188296870000253
在实施方案22中，本发明涉及实施方案18至21中任一个实施方案的 方法，所述方法还包括步骤：使生物相互作用剂或分析剂与酰化剂中存在 的反应基团反应，其中生物相互作用或生物分析剂借助官能团、任选地借 助接头L2反应。
在实施方案23中，本发明涉及实施方案22方法，其中官能团选自氨 基、叠氮基、烯基、硫醇基和肼、羟胺基。在实施方案23的一个优选方面 即实施方案23A中，官能团是叠氮。
在实施方案24中，本发明涉及根据实施方案22、23或23A的方法， 其中包含叠氮官能团的生物相互作用剂或分析剂是：
Figure BDA0001188296870000261
Figure BDA0001188296870000271
其中y是0至34并且FA是借助其羧酸官能团之一与PEG接头连接 的脂肪酸残基。在另一个实施方案中，FA具有以下式：
Figure BDA0001188296870000272
包含叠氮基官能团的生物相互作用剂的另一个例子是治疗性肽，其中 已经引入(优选地在N末端)，任选地经接头(例如聚甘氨酸)引入叠氮基赖氨 酸。这类生物相互作用剂的例子是
Figure BDA0001188296870000273
在实施方案25中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的方法，其中 生物相互作用剂或分析剂选自生物素、荧光团、毒素、螯合剂、延长半寿 期的部分，如例如白蛋白结合部分或其他血浆蛋白结合部分、天然Fc或 Fc变体、成像试剂和肽。
在实施方案25A中，生物相互作用剂是毒素。毒素的非限制性例子是 MMAF(单甲基澳瑞司他汀)：
Figure BDA0001188296870000281
在实施方案26中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的方法，其中 靶蛋白或靶肽是APJ激动剂肽、天然Fc、或Fc变体或GDF15蛋白或其 突变体。
在实施方案27中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的方法，其中 pH小于5。
在实施方案27中A，本发明涉及根据前述实施方案任一项的方法，其 中pH是约4.5。在实施方案27的另一个方面即实施方案27B中，pH是从 4.5至4.8。在实施方案27B的一个方面，pH是约4.6。在实施方案27B的 另一个方面，pH是约4.75。可以使用乙酸钠、磷酸二氢钠或磷酸钾或其组 合的缓冲溶液调节pH。缓冲剂的非限制性例子是NaOAc、磷酸氢二钠或 二钾(Na2HPO4或K2HPO4)。
在实施方案28中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的方法，其中 pH是4。
在另一个方面，公开了从本文所公开的方法制备的缀合物。在另一个 方面，公开了用本文公开的缀合物或修饰的蛋白质/肽制备的疫苗。在另一 个方面，公开了治疗性蛋白/肽，其具有本文公开的修饰的蛋白质/肽。在另 一个方面，公开了成像剂，其具有本文公开的修饰的蛋白质/肽。在另一个 方面，公开了标记工具，其具有本文公开的修饰的蛋白质/肽。
在另一个实施方案中，这些方法、从这些方法获得缀合物、接头和生 物相互作用剂/分析剂是在以下实施例部分中定义的那些。
方法的步骤a)：合成靶肽/蛋白，从而所产生的蛋白质或肽在与N末端 氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸。
靶蛋白/肽可以是已经在与N末端氨基酸毗邻的位置拥有组氨酸氨基 酸的靶蛋白/肽。如果靶蛋白在与N末端氨基酸毗邻的位置未拥有组氨酸氨 基酸，可以根据本发明的步骤a)修饰蛋白质/肽。可以通过本领域技术人员 已知的标准技术，如翻译后化学修饰或转基因技术，实现在蛋白质中插入 氨基酸残基。
本发明的示例方法涉及步骤a)，所述步骤a)是修饰靶肽或蛋白质，从 而活化在N末端的氨基酸的氨基官能团。
步骤a可以由以下方案1至5代表：
方案1描述了步骤a)，其中通过将与所述靶蛋白或靶肽的N末端氨基 酸毗邻的氨基酸替换为组氨酸氨基酸，修饰靶蛋白或肽：
Figure BDA0001188296870000291
其中P是在N末端具有其最后3个氨基酸(Aa3、Aa2、Aa1)的靶蛋白 /肽。
方案2描述了步骤a)，其中通过以下方式修饰靶蛋白或肽：将所述靶 蛋白或靶肽在N末端的两个氨基酸(即Aa1和Aa2)替换为氨基酸序列XH-， 其中H是组氨酸并且X是选自M、A、Q、N和G的氨基酸的：
Figure BDA0001188296870000292
方案3描述了步骤a)，其中通过以下方式修饰靶蛋白或肽：将所述靶 蛋白或靶肽在N末端的三个氨基酸(即Aa1、Aa2和Aa3)替换为氨基酸序列 XHX’-，其中H是组氨酸并且X和X’独立地是M、A、Q、N和G：
Figure BDA0001188296870000293
Figure BDA0001188296870000301
方案4和5描述了步骤a)，其中通过以下方式修饰靶肽或蛋白：在所 述靶蛋白或靶肽的N末端附加式XH的两氨基酸序列或式XHX’-的三氨基 酸序列，其中H是组氨酸并且X和X’独立选自M、A、Q、N和G：
Figure BDA0001188296870000302
如上文在方案1至5中描述的修饰的肽或多肽/蛋白质可以通过合成化 学方法或通过重组方法或两种方法的组合产生。肽或多肽/蛋白质构建体可 以作为全长制备或可以作为非全长片段合成并连接。本发明的肽和多肽可 以通过本身已知的肽合成方法产生。用于肽合成的方法可以是任何固相合 成法和液相合成法。因此，可以通过能够构成蛋白质的部分肽或氨基酸与 其残余部份缩合，产生目的肽和多肽，当产物具有保护基时，使保护基脱 离，因此可以制造所需的肽。用于缩合和脱保护的已知方法包括以下文献 (1)-(5)中描述的方法。
(1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti,Peptide Synthesis,IntersciencePublishers,New York,1966,
(2)Schroeder和Luebke,The Peptide,Academic Press,New York, 1965,
(3)Nobuo Izumiya等人.Fundamentals and Experiments in PeptideSynthesis,Maruzen,1975,
(4)Haruaki Yajima和Shumpei Sakakibara,Biochemical Experiment Series1,Protein Chemistry IV,205,1977以及
(5)Haruaki Yajima(编著),Development of Drugs-Continued,14, PeptideSynthesis,Hirokawa Shoten.
在反应后，可以通过常规纯化技术如溶剂萃取、柱色谱、液相色谱、 体积排阻色谱(SEC)和重结晶的组合，纯化和分离肽或多肽。在如上分离 的肽是游离化合物的情况下，它可以借助已知的方法转化成合适的盐。相 反，在分离的产物是盐时，它可以借助已知的方法转化成游离肽。
可以通过使用适用于酰胺化的肽合成用树脂，获得多肽的酰胺。树脂 包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨基甲基树脂、4-苄氧基 苄醇树脂、4-甲基二苯甲胺树脂、PAM树脂、4-羟甲基甲基苯基乙酰氨基 甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2',4'-二甲氧苯基-羟甲基)苯氧基树脂、 4-(2',4'-二甲氧苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基树脂、2-氯三苯甲基氯树脂等。 使用这种树脂，通过本身已知的各种缩合技术，已经适当地保护其侧链α- 氨基和官能团的氨基酸在树脂上根据目标肽的序列缩合。在系列反应结束 时，从树脂取下肽或被保护的肽并且移除保护基并且如果需要，形成二硫 键以获得目标多肽。
为了缩合上文提到的保护的氨基酸，可以使用用于合成肽的多种活化 试剂如HATU、HCTU或例如碳二亚胺。碳二亚胺包括DCC、N,N'-二异 丙基碳二亚胺和N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺。为了用这种试剂活 化，可以使用外消旋化抑制剂添加物，例如HOBt或Oxyma Pure。保护 的氨基酸可以随活化试剂和外消旋化抑制剂一起直接添加至树脂或预先活 化为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯随后添加至树脂。用于保护的氨基 酸活化或与树脂缩合的溶剂可以恰当地选自已知可用于肽缩合反应的那些 溶剂。例如，可以是提到N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、氯仿、三 氟乙醇、二甲基亚砜、DMF、吡啶、二噁烷、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、 乙酸乙酯或其合适的混合物。反应温度可以选自迄今已知可用于肽键形成 的范围并且通常选自约-20℃-50℃的范围。活化的氨基酸衍生物通常按 1.5-4倍过量的比例使用。如果通过利用茚三酮反应检验发现缩合不充分， 则缩合反应可以在不移除保护基的情况下重复以实现充分缩合。如果重复 的缩合仍然未提供足够的缩合程度，则未反应的氨基可以用乙酸酐或乙酰 咪唑乙酰化。
原料氨基酸的氨基的保护基包括Z、Boc、叔-戊氧羰基、异冰片氧基 羰基、4-甲氧基苄氧羰基、CI-Z、Br-Z、金刚烷基氧羰基、三氟乙酰基、 邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基氧硫基、二苯基硫代膦基或Fmoc。可 以使用的羧基保护基包括但不限于上文提到的C1-6烷基、C3-8环烷基和C6-10芳基-C1-2烷基以及2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧苄基、4-氯苄基、苯 甲酰甲基、苄氧羰基酰肼、叔丁氧羰基酰肼基和三苯甲基酰肼基。
丝氨酸和苏氨酸的羟基可以通过酯化或醚化保护。适用于所述酯化的 基团包括碳衍生的基团如低级烷酰基，例如乙酰基等、芳酰基，例如苯甲 酰基等、苄氧羰基和乙氧羰基。适用于所述醚化的基团包括苄基、四氢吡 喃基和叔丁基。酪氨酸的酚羟基的保护基包括Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、 Br-Z和叔丁基。
组氨酸的咪唑的保护基包括Tos、4-甲氧基-2,3,6-三乙苯磺酰、DNP、 苄氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。
起始氨基酸的活化的羧基包括相应的酸酐、叠氮基和活泼酯，例如酯 与醇如五氯酚(pentachlorophenol)、2,4,5-三氯酚、2,4-二硝基酚、氰基甲醇、 对硝基苯酚、HONB、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟邻苯二甲酰亚胺、HOBt 等。起始氨基酸的活化的氨基包括相应的磷酰胺。
用于消去保护基的方法包括在催化剂(如钯黑或钯碳)存在下使用氢气 的催化性还原、采用无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或这类 酸的混合物的酸处理、采用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪的碱处理、 在液氨中用钠金属还原。通过上文提到的酸处理进行的消去反应通常在 -20℃-40℃的温度实施并且可以在添加阳离子接纳体如茴香醚、苯酚、茴 香硫醚、间甲酚、p-甲酚、二甲基硫醚、1,4-丁二硫醇、1,2-乙二硫醇的情 况下有利地实施。可以通过苯硫酚处理，消除用于保护组氨酸的咪唑基团 的2,4-二硝基苯基，而可以通过采用稀氢氧化钠溶液或稀氨水的碱处理以 及上文提到的酸处理在1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇存在下，消除用于保护 色氨酸的吲哚基团的甲酰基。
用于保护不应当参与原料反应的官能团的方法、可以使用的保护基、 移除保护基的方法和活化应当参与反应的官能团的方法可以均合理地从已 知的基团和方法中选出。
另一种获得酰胺形式的多肽的方法包括：首先酰胺化C端氨基酸的羧 基，随后向N侧延伸肽链直至所需的链长度，并且随后选择性去保护C末 端肽的α-氨基和将要形成目标多肽的剩余部分的氨基酸或肽的α-羧基并且 在混合溶剂(如本文中提到的那种混合溶剂)中缩合其α-氨基和侧链官能团 已经用上文提到的合适保护基保护的两个片段。这个缩合反应的参数可以 与前文所述相同。通过上述方法从通过缩合获得的受保护肽中，移除全部保护基以因而提供所需的粗制肽。这种粗制肽可以通过已知的纯化方法纯 化并且可以将主要级分冻干以提供目标酰胺化多肽。为了获得多肽的酯， C端氨基酸的α-羧基与所需的醇缩合以产生氨基酸酯并且随后，遵循上文 描述用于产生酰胺的方法。
备选地，重组表达方法特别可用于产生如方案1至5中所述的修饰的 肽或蛋白质。使用宿主细胞(经人工工程化以包含编码肽序列的核酸并且将 转录及翻译并任选地将肽分泌入细胞生长培养基的细胞)的重组蛋白表达 法是本领域中常规使用的。对于重组产生法，编码肽的氨基酸序列的核酸 一般将通过常规方法合成并整合入表达载体。这类方法特别优选用于制造 多肽组合物，所述多肽组合物包含与额外的肽序列或其他蛋白质或蛋白质 片段或结构域融合的肽。宿主细胞可以任选地是选自大肠杆菌、COS-1、 COS-7、HEK293、BHT、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、heLa、 骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞、或其任何衍生物、永生化细胞 或转化细胞中的至少一种。
本发明还涵盖编码上述变体的多核苷酸，所述多核苷酸可以处于RNA 形式或处于DNA形式，所述DNA包括cDNA、基因组DNA和合成性DNA。 DNA可以是双链或单链的。编码本发明组合物的编码性序列可以因遗传密 码的冗余或简并性而变动。
编码本发明组合物的多核苷酸可以包括以下：仅变体的编码序列、变 体的编码序列和额外的编码序列(如功能性多肽)、或前导序列或分泌序列 或原蛋白序列；变体的编码序列和非编码性序列如内含子或变体的编码序 列5’和/或3’的非编码性序列。因此，术语“编码变体的多核苷酸”涵盖一种 多核苷酸，所述多核苷酸不仅可以包括变体的编码序列，还包括了包含额 外编码性序列和/或非编码性序列的多核苷酸。
本发明还涉及所述多核苷酸的变体，所述变体编码含有所示置换的多 肽片段、类似物和衍生物。多核苷酸的变体可以是如上文所述的人GDF15 序列的天然存在等位变体、非自然存在的变体或截短变体。因此，本发明 还包括编码上述变体的多核苷酸、以及这类多核苷酸的变体，所述变体编 码所公开变体的片段、衍生物或类似物。这类核苷酸变体包括缺失变体、 置换变体、截短的变体及添加变体或插入变体，只要存在第一或第二实施 方案的至少一种所示的氨基酸置换即可。
本明的多核苷酸可以在序列已经与表达控制序列有效连接(即，经安置 以确保表达控制序列发挥作用)后在宿主中表达。这些表达载体一般在宿主 生物中作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分可复制。常见地， 表达载体将含有选择标记，例如，四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶，以 允许检测用所需DNA序列转化的那些细胞。GDF15变体可以在哺乳动物 细胞、昆虫细胞、酵母细胞、细菌细胞或其他细胞中在适宜的启动子控制 下表达。使用源自本发明DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可以用 来产生此类蛋白质。
大肠杆菌((E.coli)是特别用于克隆和表达本发明多核苷酸的原核宿 主。适用的其他微生物宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、鼠伤寒沙 门氏菌(Salmonellatyphimurium)和沙雷菌属(Serratia)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的 多个物种，不过出于选择，也可以使用其他微生物宿主。在这些原核宿主 中，还可以产生一般含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点) 的表达载体。此外，可以存在多种熟知启动子的任一者，如乳糖启动子系 统、色氨酸(Trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ或 T7的启动子系统。启动子通常将控制表达，任选地与操纵子序列一起控制 表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动并完成转录和翻译。
蛋白质表达领域的技术人员会认识到，可以在成熟序列的N末端引入 甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列以便在大肠杆菌中表达并且在本发明的 上下文范围内构思这种序列。因此，除非另外指出，否则在大肠杆菌中表 达的本发明组合物具有在N末端引入的甲硫氨酸序列。
其他微生物(如酵母或真菌)也可以用于表达。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、和安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)是优选的 酵母宿主的例子，所述酵母宿主携带具有表达控制序列如启动子(包括3- 磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶)和复制起点、终止序列等(根据需要)的合 适载体。黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)；和裂褶 菌(Schizophyllum commune)是真菌宿主的例子，不过出于选择，也可以使 用其他真菌宿主。
哺乳动物组织细胞培养物也可以用来表达并产生本发明的多肽。本领 域已经开发了能够分泌完整变体的许多合适的宿主细胞系，并且它们包括 CHO细胞系、多种COS细胞系、NS细胞、叙利亚仓鼠卵巢细胞系、Hela 细胞、或人胚肾细胞系(即HEK293、HEK293EBNA)。
用于哺乳动物细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、 启动子、增强子和必需的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、 多聚腺苷化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自SV40、 腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒、Raus肉瘤病毒等的启动子。优选的 多聚腺苷化位点包括衍生自SV40和牛生长激素的序列。
含有目的多核苷酸序列(例如，编码本发明的组合物和表达控制序列) 的载体可以通过熟知的方法转移入宿主细胞，所述方法根据细胞宿主的类 型变动。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理法或电穿孔法 可以用于其他细胞宿主。
可以使用多种蛋白质纯化方法并且这类方法是本领域已知的并且例如 在Deutscher,Methods in Enzymology 182:83-9(1990)和Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,Springer-Verlag,NY(1982)中描述。 选择的纯化步骤将例如取决于用于本发明组合物的产生方法的性质。
多肽可以按照基本上纯的或分离的形式(例如，不含其他多肽)制备。 多肽可以在该多肽相对于可能存在的其他组分(例如，其他多肽或其他宿主 细胞组分)而言富集的组合物中存在。例如，可以如此提供纯化的多肽，从 而多肽在基本上不含其他表达的蛋白质的组合物中存在，例如，少于90％、 少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少 于5％或少于1％的组合物由其他表达的蛋白质组成。
方法的步骤b)：位点特异性缀合至(来自步骤a的)修饰的蛋白质/肽- 选择性乙酰化在修饰的肽/蛋白质N末端的氨基
靶蛋白或肽的N末端氨基的酰化可以由以下方案6代表：
Figure BDA0001188296870000361
其中PM是根据步骤a)的修饰d肽或蛋白质，R1、L1和n如上文限定。
优选地，活化形式的酸6A是NHS-酯。酰化反应在含水介质中在小于 6的pH实施。在另一个实施方案中，酰化反应在小于5的pH实施。在又 一个实施方案中，酰化反应在约4的pH实施。在又一个实施方案中，酰 化反应在约4.5的pH实施。在又一个实施方案中，酰化反应在pH 4.5至 4.8之间实施。在又一个实施方案中，pH是约4.6。在又一个实施方案中， pH是约4.75。可以使用乙酸钠、磷酸钠或磷酸钾或其组合的缓冲溶液调节 pH。缓冲剂的非限制性例子是NaOAc、磷酸氢二钠或二钾(Na2HPO4或 K2HPO4)。
R1可以是生物相互作用剂或分析剂。
备选地，R1是包含促进与生物相互作用剂或与分析剂共价接合的反应 基团的部分。
当R1是包含反应基团的部分时，本发明方法的步骤b)可以由以下方 案7代表：
激活的形式的：
Figure BDA0001188296870000371
其中PM、L1和n如上文限定；M是化学部分并且Rg是反应基团。 Rg的例子是酰基、酯或混合酐、炔、四嗪、马来酰亚胺、亚氨酸酯、羧基。
本发明的方法还可以包括步骤：使生物相互作用剂或分析剂与缀合物 7B的反应基团Rg反应，其中生物相互作用或生物分析剂借助相应的官能 团并且任选地借助接头L2反应。
这个步骤可以由以下方案8代表：
Figure BDA0001188296870000372
其中PM是已经根据步骤a)修饰的靶蛋白或靶肽，从而所产生的蛋白 质或肽在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸；
L1和L2是接头；
Rg是反应基团；
Fg是官能团；
G是因Rg与Fg反应形成的所得化学基团；
R’1是生物相互作用剂或分析剂；
n和t独立地是0或1。
官能团(Fg)的例子是氨基、叠氮基、烯基、硫醇基或肼、羟胺基。
官能团(Fg)包括1.与反应基团如马来酰亚胺、甲苯磺酰基砜或吡啶-2- 基二硫烷基反应的硫醇基；2.与反应基团如羧酸或活化的羧酸(例如借助 N-羟琥珀酰胺化学形成酰胺键)、磷酰基、酰基或混合酐反应的氨基(例如 氨基酸的氨基官能团)；3.经历与炔和更具体地与环辛炔反应基团的 Huisgen环加成(更通称为点击化学)的叠氮基；4.与选自羟胺或肼的反应 基团反应以分别形成肟或肼的羰基；5.在氮杂[4+2]加成中与四嗪反应基团 反应的烯。尽管本文中描述了接头和官能团/反应基团的几个例子，但本发 明构思了任何长度和组成的接头。
在一个实施方案中，本发明涉及根据实施方案18-21中任一个实施方 案的方法，其中R1是这样的部分，所述部分含有促进与含有叠氮基官能团 的生物相互作用剂(即：在化合物8A中，t是0并且Fg是叠氮基)共价接合 的炔反应基团(即Rg是炔或环炔或双环炔)。备选地，生物相互作用剂或分 析剂可以接合至在末端位置含有叠氮基官能团的接头L2(即：在化合物8A 中，t是1并且Fg是叠氮基)。含有炔反应基团的部分从商业来源轻易可获 得。特别感兴趣的是环炔部分。环状炔在蛋白质标记的点击化学中使用的 例子已经在US2009/0068738中描述，所述文献通过引用的方式并入本文。 具体例子已经在上文实施方案20中描述。
这种化学包括叠氮基-炔Huisgen环加成，其更通称为点击化学。在这 个具体实施方案中，因叠氮基-炔环加成而形成的所得化学基团G是如方 案9中所示的三唑：
Figure BDA0001188296870000391
其中上文已经描述全部变量并且C1是任选地用氟取代的单环、二环 或三环碳环系统或杂环系统。在一个实施方案中，L1是C1-C20亚烷基接头， 其中亚烷基链任选地用氧代(＝O)取代，并且其中一个或多个碳由O或NH 替换。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据实施方案18-21中任一个实施 方案的方法，其中R1是这样的部分，所述部分含有促进与含有烯官能团(优 选地应变烯)的生物相互作用剂/分析剂(即：在化合物8A中，s是0并且 Fg是烯或环烯)共价接合的四嗪反应基团。备选地，生物相互作用剂或分析 剂可以接合至在末端位置含有烯官能团的接头L2(即：在化合物8A中，s 是1并且Fg是烯或环烯)。四嗪部分从商业来源轻易可获得并且非限制性 例子已经在实施方案19中描述。这种化学称作氮杂[4+2]环加成。在这个 具体实施方案中，因四嗪-烯环加成而形成的所得化学基团G是下式的多 环基团：
Figure BDA0001188296870000392
其中u是0至2的整数并且v是0至3的整数。
方案10显示使用四嗪-烯环加成时的进一步衍生化
Figure BDA0001188296870000401
其中变量如上文限定并且D是应变烯，即单环或双环烯基环系统。
在一个实施方案中，本发明涉及根据实施方案18-21中任一个实施方 案的方法，其中R1是这样的部分，所述部分含有促进与含有巯基官能团的 生物相互作用剂/分析剂(即：在化合物8A中，s是0并且Fg是-SH)共价接 合的马来酰亚胺反应基团。备选地，生物相互作用剂或分析剂可以接合至 在末端位置含有烯官能团的接头L2(即：在化合物8A中，s是1并且Fg是-SH)。含有马来酰亚胺的部分从商业来源轻易可获得并且非限制性例子 已经在实施方案19中描述。在这个具体实施方案中，因巯基-马来酰亚胺 反应而形成的所得化学基团G具有下式：
Figure BDA0001188296870000402
方案11显示马来酰亚胺-巯基进一步衍生化：
Figure BDA0001188296870000411
上文描述的化学和试剂用来产生构建体Fg-(L2)t-R’1和/或活化形式的 HO-C(O)-(L1)n-R1和/或活化形式的HO-C(O)-(L1)n-Rg。每个连接单元可以 在每个末端拥有适宜的反应基团/官能团。炔(环炔)、马来酰亚胺或四嗪反 应基团与反应配偶体上存在的官能团(分别是叠氮基、巯基和烯)反应。
本发明方法的医学应用和诊断应用
因此，可能想要修饰蛋白质以改变蛋白质/肽的物理-化学特性，例如 增加(或降低)溶解度以调节治疗性蛋白的生物利用率。在另一个实施方案 中，可能想要通过使化合物缀合至蛋白质/肽，调节体内清除率，其中所述 化合物与血浆蛋白例如白蛋白结合或增加蛋白质的大小以防止或延迟经肾 释放。缀合还可以改变并且尤其降低蛋白质/肽对水解(例如体内蛋白酶解) 的敏感性。
在另一个实施方案中，可能想要缀合标签以促进蛋白质/肽的分析。这 类标签的例子包括放射性同位素、荧光标记如已经描述的荧光团和酶底物。
在又一个实施方案中，化合物与蛋白质缀合以促进蛋白质的分离。例 如，对特定柱材料具有特异性亲和力的化合物可以与蛋白质缀合。也可以 需要调节蛋白质的免疫原性，例如通过缀合蛋白质，从而隐藏、掩盖或遮 蔽蛋白质上的一个或多个免疫原性表位。
在一个实施方案中，本发明提供一种改善靶蛋白的药理学特性的方法。 改善相对于相应未修饰的蛋白质。这类药理学特性的例子包括任何特定蛋 白质的体内功能半寿期、免疫原性、肾过滤作用、蛋白酶保护和白蛋白结 合作用或其他血浆蛋白结合作用。
修饰的蛋白质的治疗性用途
就未修饰的蛋白质/肽是治疗性蛋白的方面而言，本发明还涉及修饰的 蛋白质在疗法中的用途、和尤其涉及包含修饰的蛋白质的药物组合物。因 此，如本文所用，术语“治疗”和“治疗”指出于消除疾病病状(如疾病或病症) 的目的，管理并护理患者。该术语意在包括治疗该患者正在遭受的给定病 状的全面治疗，如如施用活性化合物以减轻症状或并发症、延迟疾病、病 症或病状的进展、以减轻或缓解症状和并发症、和/或以治愈或消除疾病、 病症或病状以及以阻止病状，其中阻止将会理解为出于消除疾病、病状或 病症的目的，管理并护理患者并且包括施用活性化合物以阻止症状或并发 症的发作。待治疗的患者优选地是哺乳动物、尤其人类，但它还可以包括 动物，如犬、猫、奶牛、羊和猪。然而，应当是认识到，治疗方案和预防 性(预防性)方案代表本文公开的和由治疗医师或兽医师构思的用途的独立 方面。
如本文所用的“治疗有效量”的修饰蛋白质意指足以治愈、减轻或部分 地停止给定疾病和其并发症的临床表现的量。将足够实现这一点的量定义 为“治疗有效量”。用于每个目的的有效量取决于例如疾病或损伤的严重程 度以及受试者的体重、性别、年龄和总体状态。应当理解，可以使用例行 实验、通过构建值矩阵和检验该矩阵中的不同点，实现确定适宜的剂量， 这均落在受训医师或兽医师的普通技术范围内。
本文公开的方法和组合物提供用于疗法中的修饰的蛋白质。因而，常 见胃肠道外剂量处于每次施用10-9mg/kg至约100mg/kg体重的范围内。 常见的施用剂量是每次施用约0.0000001mg/kg体重至约10mg/kg体重。 精确剂量将取决于例如适应症、药物、频率和施用模式、待治疗的受试者 的性别、年龄和总体状况、治疗疾病或病状的性质和严重程度、所需治疗 效果和本领域技术人员显而易见的其他因素。常见的给药频率是每日二次、 每日一次、每日两次、每周二次、每周一次或伴随甚至更长的给药间隔。 归因于活性化合物与相应的未缀合蛋白质相比半寿期延长，具体实施方案 是长给药间隔如每周二次、每周一次或甚至更长的给药间隔的给药方案。 在治疗中使用同时施用或依次施用的多于一种药物治疗许多疾病。因此， 构思在治疗一种疾病的治疗方法中，修饰的蛋白质可以与正常情况下用于 治疗疾病的一种或多种其他治疗活性化合物组合使用。还构思了修饰的蛋 白质与正常情况下用于治疗疾病中的其他治疗活性化合物组合在制造用于 这种疾病的药物中的用途。
药物组合物
本发明的缀合物可以按照多种方式的任一种施用，包括皮下、肌内、 静脉内、腹腔内、吸入、鼻内、口服等。本发明的特别优选的实施方案利 用本发明缀合物或其酰胺、酯、或盐的连续静脉内施用。本发明的缀合物 可以作为推注或作为经历一段时间的连续输注施用。可以使用植入泵。在 本发明的某些实施方案中，间歇或连续的缀合物施用持续一天至几天(例 如，2-3天或更多天)或更长的时间段，例如，周、月或年。在一些实施方 案中，提供间歇或连续的缀合物施用至少约3天、优选地至少约6天。在 其他实施方案中，提供间歇或连续的缀合物施用至少约1周。在其他实施 方案中，提供间歇或连续的缀合物施用至少约2周。可能想要在施用期间 或在施用多个剂量之间维持缀合物平均血浆浓度高于特定阈值。可以例如， 基于受试者的生理状况、疾病严重程度等确定合乎需要的浓度。可以通过 开展标准临床试验确定这类合乎需要的值。备选地，肽和其缀合物可以借 助FcRn机制口服递送。(Nat Rev Immunol.7(9),715-25,2007；Nat Commun.3；3:610,2012,Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol 304: G262–G270,2013)。
在另一个方面，本发明提供一种包含本发明缀合物或其酰胺、酯或盐 和一种或多种可药用载体的药物组合物。可以将药物组合物针对特定施用 途径如口服施用、皮下施用、肠胃外施用和直肠施用等配制。此外，本发 明的药物组合物可以按固体形式(包括而不限于胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒 剂、冻干剂、散剂或栓剂)或按液态形式(包括而不限于溶液剂、混悬剂或 乳剂)制得。药物组合物可以经历常规的药物操作如无菌生产、灭菌和/或 可以含有常规的惰性稀释剂、滤饼形成剂、张度剂、润滑剂或缓冲剂、以 及辅助剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲剂等。
适于可注射用途的药物组合物一般包括无菌水溶液剂(其为水溶性)或 用于现场制备无菌注射溶液剂或分散剂的分散体和无菌粉末。
对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在全部情况下， 组合物应当是无菌的并且应当保持流动至存在轻易可注射的程度。优选的 药物制剂在制造和储存条件下稳定并且必须针对微生物(如细菌和真菌)的 污染作用加以保护。从总体上看，相关载体可以是溶剂或分散介质，其例 如含有水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和其合 适的混合物。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维 持要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。可以用多种抗 细菌剂和抗真菌剂，例如，尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞 等实现阻止微生物的作用。在许多情况下，将优选在组成上包括等渗剂例 如糖、多元醇如甘露醇、氨基酸、山梨醇、氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶，引起可注射组合物的吸收延 长。在一些实施方案中，可以将多功能赋形剂如重组白蛋白并入配制过程 以促进缀合产物的稳定化而免于降解并且辅助活性组分的施用和释放。 (BioPharm International,2012,第23卷,第3期,第40-44页)。
某些可注射组合物是含水等渗溶液或悬液，并且栓剂有利地从脂质乳 液或悬液制备。所述组合物可以被灭菌和/或含有辅助剂、如防腐剂、稳定 剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外， 它们还可以含有其他有治疗价值的物质。所述组合物分别根据常规的混合、 造粒或包衣方法制备，并且含有约0.1-75％、或含有约1-50％的有效成分。
可以通过将活性化合物以要求的量连同上文所列举的一种成分或成分 组合在合适的溶剂中并入，根据需要，随后过滤除菌，制备无菌可注射溶 液剂。通常，通过将活性化合物并入无菌载体中制备分散剂，所述无菌载 体含有基础分散介质和来自上文列举的那些成分中的所需其他成分。在用 于制备无菌注射溶液的无菌粉末情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷 冻干燥，从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分外加任何额外所需成分的 粉末。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。出于口服治疗性施用 的目的，活性化合物可以随赋形剂一起掺入并且以片剂、药锭剂或胶囊剂 (例如明胶胶囊剂)形式提供。也可以使用流体载体制备口服组合物用作漱 口剂。可以包含药物相容的粘合剂和/或辅助材料作为组合物的部分。片剂、 丸剂、胶囊剂、药锭剂等可以含有以下成分或具有相似性质的化合物的任 一种：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterote；助流剂 如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或矫味剂如胡椒薄荷、水杨酸甲 酯或橙味矫味剂。用于口服递送的制剂可以有利地掺入药剂以改善在胃肠 道中的稳定性和/或以增强吸收。
对于吸入施用，本发明的治疗剂优选地按气溶胶喷雾剂的形式从含有 合适推进剂(例如，气体如二氧化碳)的加压容器或分配器或雾化器递送。 应当指出，肺提供巨大表面积供全身性递送治疗剂。
药剂可以是包封的，例如，包封在聚合性微粒子(如美国公开 20040096403中描述的那些)中，或与本领域已知的多种类型其他药物输送 载体的任一种结合。在本发明的其他实施方案中，药剂与例如美国公开 20040062718中所述的带电荷脂质结合的情况下递送。应当指出，后一个 系统已经用于施用治疗性多肽、胰岛素，从而显示这个系统施用肽剂的实 用性。
全身性施用也可以通过经粘膜或经皮方式进行。
经皮施加的合适组合物包含有效量的本发明缀合物连同合适的载体。 适于经皮递送的载体包括可吸收的药理学可接受溶剂以辅助穿过宿主的皮 肤。例如，经皮装置处于绷带形式，所述绷带包含背衬件、含有化合物任 选地连同载体的储器、任选地在一段延长的时间范围内以受控和预定速率 递送化合物至宿主皮肤的速率控制屏障和将装置固定至皮肤的工具。
用于局部施加(例如施加至皮肤和眼)的合适组合物包括水溶液剂、混 悬剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂或可喷雾制剂，例如，用于通过气溶胶递 送等。这类局部递送系统将尤其适宜于皮肤施加。它们因此特别适合用于 本领域熟知的局部用制剂(包括化妆品制剂)中。这类局部递送系统可以含 有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
在某些实施方案中，药物组合物用于皮下施用。合适的制剂组分和用 于皮下施用多肽治疗药(例如，抗体、融合蛋白等)的方法是本领域已知的。 参见，例如公布的美国专利申请号2011/0044977和美国专利号8,465,739 和美国专利号8,476,239。一般，用于皮下施用的药物组合物含有合适的稳 定剂(例如氨基酸、如甲硫氨酸和或糖如蔗糖)、缓冲剂和张力调节剂。
如本文所用，局部施加还可以涉及吸入或涉及鼻内施加。它们可以按 照来自干粉吸入器的干燥粉末(单独，作为混合物，例如与乳糖的干掺合物、 或混合组分粒子，例如与磷脂类一起)形式或来自加压容器、泵、喷雾器、 雾化器或气雾器的气溶胶喷雾呈递形式，在使用或不使用合适推进剂的情 况下便利地递送。
本发明还提供包含一种或多种物质的药物组合物和剂型，所述物质降 低本发明化合物作为有效成分将分解的速率。在本文中称作“稳定剂”的这 类物质包括但不限于抗氧化剂如抗坏血酸(维生素C)、pH缓冲剂、或盐缓 冲剂、重组白蛋白。
如本文所用，术语“可药用盐”指保留本发明缀合物的生物学作用和特 性并且一般不是生物学不利或否则不良的盐。在许多情况下，本发明的缀 合物能够因存在氨基和/或羧基或与之类似的基团而形成酸盐和/或碱盐。
可药用的酸加成盐可以与无机酸和有机酸形成，例如，乙酸盐、天冬 氨酸、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、重碳酸盐/碳酸盐、硫酸氢 盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、氯茶碱盐、柠檬酸盐、乙二磺酸 盐(ethandisulfonate)、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、 马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂 基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基 硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八烷酸盐(octadecanoate)、 油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、 聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸 盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
可以从中衍生盐的无机酸例如包括氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷 酸等。
可以从中衍生盐的有机酸例如包括乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来 酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲 磺酸、乙磺酸的酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可药用的碱加成盐可以与 无机碱和有机碱形成。
可以从中衍生盐的无机碱例如包括铵盐和来自周期表I族至XII族的 金属。在某些实施方案中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和 铜；特别合适的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。
可以从中衍生盐的有机碱例如包括，伯胺、仲胺和叔胺，取代胺(包括 天然存在的取代胺)、环状胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙 胺、苯乍生(benzathine)、胆酸盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、 哌嗪和氨丁三醇。
本发明的可药用盐可以通过常规化学方法从母体化合物、碱性部分或 酸性部分合成。通常，这类盐可以通过这些化合物的游离酸形式与化学计 量数量的适宜碱(如氢氧化钠、钙、镁或钾、碳酸钠、钙、镁或钾、重碳酸 钠、钙、镁或钾等)反应，或通过这些化合物的游离碱形式与化学计量数量 的适宜酸反应来制备。这类反应一般在水中或在有机溶剂中或在二者的混 合物中实施。通常，在可行的情况下，使用非水介质如醚、乙酸乙酯、乙 醇、异丙醇或乙腈是合乎需要的。额外的合适盐的名单可以例如存在于以 下文献中：“Remington's Pharmaceutical Sciences”,第20版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,(1985)；和Stahl与Wermuth的 “Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use” (Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)。
如本文所用，“可药用载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、 表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌药、抗真菌药)、等渗剂、吸 收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、 润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、多功能赋形剂如重组白蛋白等及其组合， 如本领域普通技术人员本已知(参见，例如，Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,Mack Printing Company,1990,第1289-1329页)。除了 任何常规载体与有效成分不相容的情况下之外，构思了所述载体在治疗组 合物或药物组合物中的用途。
本发明的实施例
实验方法
缩写
ACN 乙腈
Boc 叔丁氧羰基
DIEA 二异丙基乙胺
DIPEA N,N’-二异丙基乙胺
DMF N,N’-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
DTT 二硫苏糖醇
Fmoc 芴甲氧羰基氯化物
HATU 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-]三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧 化物六氟磷酸盐
HCTU 2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基胺六氟磷酸盐
HOBt 羟基苯并三唑
HPLC 高效液相色谱
HPF 六氟酸
LC 液相色谱法
MALDI 基质辅助激光解吸附电离
MS 质谱法
NHS N-羟琥珀酰亚胺
NMP N-甲基吡咯烷酮
NMR 核磁共振
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PEG 聚乙二醇
PS 肽合成
PG 保护基
RP-HPLC 反相HPLC
SM 原料
SCF 超临界流体
SPPS 固相肽合成
TIC 总流量
TIPS 三异丙基硅烷
TFA 三氟乙酸
Trt 三苯甲基
UPLC 超高效液相色谱
LCMS法
Figure BDA0001188296870000491
Figure BDA0001188296870000501
Figure BDA0001188296870000511
Figure BDA0001188296870000521
UPLC HRMS方法F：
柱：Acquity BEH300C4 1.7μm,2.1x50mm
洗脱剂A：水(0.1％TFA)
洗脱剂B：ACN(0.1％TFA)
流速：0.5mL/分钟
温度：40℃
梯度：20％维持0.5分钟，10分钟内斜增至80％ACN
一般肽合成法(本发明方法的步骤：修饰肽，从而所产生的肽在与N末端氨基酸毗 邻的位置含有组氨酸氨基酸)
通过标准固相Fmoc化学合成肽。肽在Liberty微波肽合成仪(CEM Corporation，北卡罗来纳州，美国)上装配。从Fmoc保护的Rink-酰胺-AM- 树脂(Novabiochem，美国)合成在C末端上具有未取代的甲酰胺的肽。
合成循环：用DMF和DCM洗涤树脂。通过20％哌啶/DMF处理(一 般每0.1mmol，7ml，2次)移除Fmoc。将树脂用DMF和洗涤。通过添加 Fmoc-氨基酸(5当量；DMF中的0.2M溶液)、HCTU(5当量；DMF中的 0.5M溶液)和DIPEA(10当量；NMP中的2M溶液)进行偶联，随后在75℃用氮气混合悬液一般5至50分钟，微波功率为0至20瓦特，这取决于具 体要求。用DMF洗涤后，取决于具体要求，偶联步骤可能重复1次。将 树脂用DMF洗涤。
通过制备性反相HPLC纯化肽。使用以下柱：Waters X Bridge30x50 mm 5um柱。流动相由洗脱剂A(H2O中的5mM NH4OH)和洗脱液B(ACN) 组成。基于分离问题的具体要求，设计梯度。从ACN/H2O冻干纯产物。
在下文中，描述代表性实施例的合成。
肽1：AHNGDLKF-NH2
AHNGDLKF-NH2的合成
Figure BDA0001188296870000531
制备A-H(Trt)-N(Trt)-G-D(O-tBu)-L-K(Boc)-F-NH-PS
Fmoc保护的Rink-酰胺-AM-树脂(316mg，0.25mmol)在Liberty微波 肽合成仪上经历固相肽合成(SPPS)。
偶联如下进行：
Figure BDA0001188296870000532
肽1的制备
(从树脂切下，同步移除保护基，随后纯化)
将TFA/H2O/TIPS(95:2.5:2.5)(3mL，含有0.2g DTT)的混合物添加至 中间体(0.25mmol)并且将悬液在室温振摇3小时。滤去切割溶液并且用 95％TFA溶液(1mL)洗涤树脂。将合并的切割溶液和洗涤溶液倾倒于冷二 乙醚(30mL)的混合物上，产生沉淀物。将悬液离心并且倾去上清液。添加 二乙醚(30mL)至残余物，将悬液涡旋混合3分钟并离心，并且倾去上清液， 洗涤过程重复2次。在真空下干燥固体。通过制备性HPLC(梯度：经3.2 分钟5-20％B)纯化粗制物并且从ACN/H2O中冻干以提供实施例1(49mg， 0.054mmol)。LCMS(WatersAcquity UPLC X Bridge C183.5μm 3.0x30 mm，40℃，洗脱剂A：水+5mM NH4OH，洗脱剂B：ACN，经2分钟 梯度5％至95％B/A)：保留时间：0.70分钟；测量值：[M+H]+＝900.8； 计算值：[M+H]+＝901.0)。
类似地合成肽2和3：
肽2.ALNGDLKF-NH2
LCMS保留时间：0.81分钟；测量值：[M+H]+＝876.8；计算值：[M+H]+＝877.0)。
肽3.MHNGDHLF-NH2
LCMS保留时间：0.68分钟；测量值：[M+H]+＝969.8；计算值：[M+H]+ ＝970.1)。
总体NHS反应性分析：(本发明的步骤b)
将磺基-NHS-LC生物素(5当量)添加至pH 430mM NaOAc缓冲液中 的肽(0.2mg/ml)并且反应在室温维持。在1小时后，反应用200当量水合 肼猝灭，并且转化通过LCMS监测并通过MALDI或NMR作图。基于214 nm的UV吸收估计化合物的比率。
SM＝原料
+1＝在N末端上的反应性
+1’＝在赖氨酸处的反应性
+2＝在N末端和赖氨酸处的反应性
Figure BDA0001188296870000551
实施例1：使用AHNGDLKF-NH2和磺基-NHS-LC生物素作为酰化 剂的本发明的步骤b。
LCMS产物保留时间：1.81分钟；测量值：[M+H]+＝1239.63；计算 值：[M+H]+＝1239.6200)。
作图数据(使用MALDI LIFT方法)：生物素+丙氨酸：测量值：[M+H]+＝约411；计算值：[M+H]+＝411.21)。生物素+AH：测量值：[M+H]+＝ 548.27；计算值：[M+H]+＝548.27)。未检出单独的丙氨酸质量。
实施例2：使用ALNGDLKF-NH2和磺基-NHS-LC生物素作为酰化 剂的本发明的步骤b。
LCMS产物保留时间：1.29分钟；测量值：[M+H]+＝876.50；计算值： [M+H]+＝877.0)。加成非常少(大部分是原料)
实施例3：使用MHNGDHLF-NH2和磺基-NHS-LC生物素作为酰化 剂的本发明的步骤b。
LCMS产物保留时间：2.05分钟；测量值：[M+H]+＝1308.5972；计 算值：[M+H]+＝1308.59)。
作图数据(使用MALDI LIFT方法)：作图数据(使用MALDI LIFT方 法)：生物素+甲硫氨酸：测量值：[M-H]＝470.64；计算值：[M-H]＝470.66)。 未检出单独的甲硫氨酸质量。
实施例4：磺基-NHS-LC生物素位点特异性缀合至APJ激动剂肽(中 间体c)：
步骤1：合成A-H-Q-R-P-C-L-S-C-K-G-P-(D-Nle)-苯乙胺中间体a
Figure BDA0001188296870000561
苯乙胺-AMEBA树脂(Sigma Aldrich，0.1mmol，1.0mmol/g)在自动 肽合成仪(CEMLiberty Blue Microwave)上经历固相肽合成，针对Arg残 基采用标准双Arg以及D-Nle偶联两次。将氨基酸制备为DMF中的0.2M 溶液。标准偶联循环定义如下：
·氨基酸偶联：AA(5当量)、HATU(5当量)、DIEA(25当量)
·洗涤：DMF(3X 7mL)
·Fmoc去保护：20％哌啶/0.1M HOBt(2x7mL)
·洗涤：DMF(4x7mL随后1x5mL)
Figure BDA0001188296870000562
Figure BDA0001188296870000571
在装配肽后，将树脂用DMF(2x50mL)和DCM(2x50mL)洗涤，随 后在真空下干燥以产生中间体a(276mg，0.1mmol)。
步骤2：中间体b的制备(从树脂切下肽)
Figure BDA0001188296870000581
中间体a(276mg，0.1mmol)与4mL TFA溶液(37mL TFA，1mL H2O，1mL TIPS，3.06gDTT)组合并且在室温振摇3小时。将溶液从树 脂取出并沉淀入40mL冷Et2O。将溶液涡旋混合并在冰上放置10分钟， 之后在4000转/分钟离心5分钟。移除溶剂并且将白色固体用冷Et2O再洗 涤2次(每次40mL)，离心(每次5分钟)并倾析。在真空下干燥固体过夜， 产生中间体b-批次1(17.4mg，0.012mmol)。LCMS(SQ2产物分析-酸性 肽-极性，Acquity UPLC BEHC18柱，
Figure BDA0001188296870000582
1.7μm，2.1mm x 50mm， 50℃)：Rt＝1.83分钟，MS[M+H]1513.5。
步骤3：中间体c的制备(半胱氨酸残基环化)
Figure BDA0001188296870000591
中间体b-批次1和2(29.6mg，0.020mmol)溶解于水(3mL)和10滴 DMSO中以产生略微混浊的溶液。将碘(HOAc中50mM，0.783mL，0.039 mmol)逐滴缓慢添加并且将反应在室温混合过夜。粗制物反应的LCMS分 析显示原料完全转化。逐滴添加0.5M抗坏血酸(维生素C)直至颜色消散。 通过MS-触发型HPLC纯化材料。汇集级分的冻干产生7mg作为白色粉 末的所需产物(4.63μmol，24％)。LCMS(SQ2产物分析-酸性肽，Acquity UPLC BEH C18柱，
Figure BDA0001188296870000592
1.7μm，2.1mm x 50mm，50℃)：Rt＝0.90 分钟，MS[M+H]1511.8。
步骤4：中间体d的制备(NHS/肽反应性)
Figure BDA0001188296870000601
将磺基-NHS-LC-生物素(Sigma Aldrich，0.737mg，1.324μmol，5当 量)溶解于30mM pH 4NaOAc缓冲液(266μL)中并添加至中间体c(0.4 mg，0.265mmol)。将反应在室温混合16小时。取出33μL反应混合物并 用肼一水合物(0.6μL，200当量)猝灭。通过LCMS观察到原料完全转化成 +1产物。通过用Trypsin Gold(Promega)根据生产商方案消化反应混合物以及LCMS分析，证实在N末端Ala残基的标记。LCMS(SQ2产物分析 -酸性肽，Acquity UPLCBEH C18柱，
Figure BDA0001188296870000602
1.7μm，2.1mm x 50mm， 50℃)：Rt＝2.29分钟，MS[M+2/2]925.8。
步骤5：用Trypsin Gold消化中间体d(N末端标记)
Figure BDA0001188296870000611
在50mM乙酸(1μg/μL)中制备Trypsin Gold(Promega货号TB309) 溶液。中间体d(100μL，0.081μmol)的粗制混合物用50mM Tris-HCl，1 mM CaCl2pH 7.4(200μL)稀释以产生0.5mg/mL溶液。添加Trypsin Gold(3μL)并将反应在37℃混合16小时。LCMS分析显示，切割已经在 中间体d的C端R和K位置出现，在每个片段上添加一个生物素。LCMS (SQ4产物分析-20分钟-酸性-XX极性，Acquity CSH 1.7μm 2.1x100mm, 50℃)：片段1：AHQR+1生物素Rt＝5.92分钟，MS[M+2/2]计算值： 425.715，观测值：426.1；片段2：AHQRPCLSCK+1生物素Rt＝11.40 分钟，MS[M+2/2]计算值：740.345，观测值：740.9，MS[M+3/3]计算值： 493.896，观测值：494.4。
治疗性蛋白的例子(GDF15)：本发明方法的步骤a)：修饰肽，从而所产生的肽在与N 末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸
大肠杆菌细胞中表达人GDF-15蛋白质
将大肠杆菌菌株BL21(DE3)Gold(Stratagene)和Rosetta(DE3) pLysS细胞(Novagen)分别用SEQ ID NO 1至7的构建体和构建体 MAHA-(200-308)-hGDF15转化，克隆入pET26b载体。将转化的细胞在 抗生素选择下首先在3ml并且随后在50ml Luria Broth(Bacto-胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，葡萄糖6g/L)中培育直至达到OD6001.5。预培养物用来接种灌装有Terrific Broth培养基(NH4SO41.2g/L， H2PO40.041g/L，K2HPO40.052g/L，Bacto-胰蛋白胨12g/L，酵母提取物 24g/L)的两个1L发酵器。当pH值增加超过7.1时，通过自动添加1mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导培养物。其他发酵参数是：温 度＝37℃；pH 7.0+/-0.2，通过添加2N NaOH/H2SO4调节；pO2>30％， 级联搅拌器速度，通气量和氧气添加。在诱导后5小时将培养物冷却至10℃ 并且通过离心收获细胞。
GDF15变体的纯化和再折叠
a)包涵体
将表达目的蛋白的重组大肠杆菌沉淀物在4℃重悬(5％w/v)在50mM NaH2PO4/150mM NaCl/5mM苯甲脒.HCl/5mM DTT，pH 8.0中，均化并 且通过2次穿过弗氏压碎器(800巴和80巴)裂解。通过在4℃以12000转/ 分钟离心60分钟分离包涵体(IB)。
b)粗制的解折叠的蛋白质纯化
将IB溶解(5％w/v)在6M胍/100mM NaH2PO4/10mM Tris/20mMβ- 巯基乙醇，pH 8.0中并在室温搅拌2小时。通过在12000转/分钟离心移除 残片。溶解的IB进一步在Ni-NTA-Superflow上纯化(无His标签的构建体 也与这种树脂结合，原因在于高组氨酸含量)。用6M胍/100mM NaH2PO4/10mM Tris/5mMβ-巯基乙醇，pH 8.0基线洗涤后，将结合的材 料用调节至pH 4.5的相同缓冲液洗脱。将洗脱物调节至pH 8.0，添加100 mM DTT并将溶液在4℃搅拌过夜。随后通过添加三氟乙酸(TFA，水中 10％储液)调节pH至2并且将溶液用水中的0.1％TFA进一步1:1稀释。 使用50分钟内0-50％乙腈的梯度通过RP-HPLC(Poros)进一步纯化粗制蛋 白质溶液。汇集和冻干含有GDF-15的级分。
c)蛋白质折叠
方法1：将冻干材料在100mM乙酸中按2mg/ml溶解，在折叠缓冲 液(100mM CHES/1MNaCl/30mM CHAPS/5mM GSH/0.5mM GSSG/20％DMSO，pH 9.5，4℃)中稀释15-20倍，并且将溶液在3天期 间在4℃温和搅拌。在3天后，添加3体积的100mM乙酸并通过超滤(5kD 截断)将溶液浓缩至约100-200ml，用100mM乙酸稀释10倍并再浓缩。 通过制备性RP-HPLC在50℃运行的Vydac C4柱上进一步纯化再折叠的 材料(缓冲剂A：水中的0.1％TFA；缓冲液B：乙腈中0.05％TFA)。在加 载后，将柱用15％缓冲液B洗涤并用50分钟内15％B至65％B的梯度 洗脱。收集的含有目的蛋白的级分用等体积的缓冲液A稀释并冻干。两种 蛋白质的再折叠产率是约25％。
方法2：遵循如方法1中的方案，折叠缓冲液为：100mM CHES，pH 9.4，0.9M精氨酸，0.5M NaCl，1mM EDTA，2.5mM GSH，1mM GSSG(终浓度)。
根据上述方法制备以下GDF15突变体：
M-(His)6-hGDF15
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGACPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(SEQ ID NO:1)。
LCMS：计算的质量：26462观测的质量：26464
MH-(199-308)-hGDF15
MHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQV TMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMV LIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:2)
LCMS：计算的质量：24636观测的质量：24638
M-(His)6-M-hGDF15
MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADW VLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCC VPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:3)。
LCMS：计算的质量：26724观测的质量：26725
M-(His)6-cynoGDF15
MHHHHHHARNGDRCPLGPGRCCRLHTVHASLEDLGWADWV LSPREVQVTMCIGACPSQFREANMHAQIKMNLHRLKPDTVPAPCC VPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCV(SEQ ID NO:4)。
LCMS：计算的质量(二聚体)：26664观测的质量：26665
His-dGDF15： mhhhhhhahardgcplgegrccrlqslraslqdlgwanwvvapreldvrmcvgacpsqfrsanth aqmqarlhglnpdaapapccvpasyepvvlmhqdsdgrvsltpfddlvakdchcv(SEQ ID NO:5)。
LCMS：计算的质量(二聚体)：26368观测的质量：26363
AH-(199-308)-hGDF15
AHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQV TMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMV LIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:6)。
步骤1：构建体M-His6-TEV(ENLYFQ/A)-H-hsGDF15aa199-308的制 备
根据上述方法(步骤a、b和c)制备构建体 M-His6-TEV(ENLYFQ/A)-H-hsGDF15aa199-308。
步骤2：TEV切割来自步骤1的蛋白质
冻干的蛋白质在水中溶解至终浓度1.75mg/ml。通过在6M Guan/50 mM Tris，pH8.0+50mM DTT中1:1稀释，使蛋白质再次解折叠并在室 温搅拌1小时。将材料在VydacC4柱上通过制备性RP-HPLC再纯化并且 冻干。将26mg冻干物溶解于26ml 50mM Tris/3M尿素，pH7.5+3000 单位AcTEV蛋白酶(Invitrogen，12575-023)中并且温育4天。随后通过添 加三氟乙酸(TFA，水中10％储液)调节至pH 2并且将溶液用水中的0.1％ TFA进一步稀释至150ml。通0.22um膜过滤后，将材料在VydacC4柱 上通过制备性RP-HPLC再次纯化以分离成功切割的蛋白质。手工收集级 分；分离并冻干含有靶蛋白的级分。切割的GDF15蛋白随后再折叠并且 再折叠的蛋白质如上文所述那样纯化。
LCMS：计算的质量(二聚体)：24516观测的质量：24518
根据上述方法制备以下GDF15突变体：
MHA-(200-308)-hGDF15
MHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQV TMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMV LIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:7)
LCMS：计算的质量(二聚体)：24752
根据上述方法制备以下GDF15突变体：
AHA-(200-308)-hGDF15
AHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQV TMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMV LIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:8)
LCMS：计算的质量(二聚体)：24430；观测的质量(二聚体)：24432
用脂肪酸酰化剂位点特异性缀合MH-(199-308)GDF15
步骤1：制备脂肪酸-接头酰化剂：
步骤1a：1-苄基3-叔丁基2-十一烷基丙二酸
Figure BDA0001188296870000661
在0℃在N2下向NaH(160mg，4.0mmol)在DMF(8mL)中的悬液添 加DMF(2mL)中的苄基叔丁丙二酸(1.0g，4.0mmol)。将混合物搅拌50 分钟，此后添加DMF(2mL)中的1-溴代十一烷。在额外一小时搅拌后，允 许反应加温到室温。维持反应过夜。添加Et2O(100mL)和水(20mL)以划 分反应。水相用Et2O(100mL)萃取，并将合并的有机物在Na2SO4上干燥。 将溶剂蒸发并且通过快速柱(C1812g，40-100％ACN/水+0.1％TFA)纯 化残余物以产生作为无色油的标题化合物(1.14g，2.82mmol，71％)：LCMS 方法A Rt＝1.58分钟，M+Na 427.4；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.84-0.96(m,3H)1.28(br.s,12H)1.31(m,J＝3.90Hz,6H)1.41(s,9H) 1.88(q,J＝7.38Hz,2H)3.29(t,J＝7.58Hz,1H)5.19(q,J＝12.27Hz,2H) 7.30-7.42(m,5H)。
步骤1b：1,11-二苯基11-叔丁基二十二碳-1,11,11-三羧酸
Figure BDA0001188296870000671
将I-1(650mg，1.61mmol)在DMF(1mL)中的溶液在0℃在N2下缓 慢添加至NaH(70.7mg，1.77mmoL)在DMF(6mL)中的悬液。将混合物搅 拌40分钟，之后添加DMF(1mL)中的苯基11-溴代十一烷酸(571mg，1.61 mmol)。一旦添加，则允许反应加温到室温并搅拌过夜。反应用Et2O(100mL) 稀释并用水(20mL)提取。水相用Et2O(100mL)提取，并将合并的有机物在Na2SO4上干燥。将溶剂蒸发。通过快速柱(硅胶80g，0-10％EtOAc/HEP) 纯化残余物以产生作为无色油的I-2(823mg，1.21mmol，75％)：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 0.84-0.94(m,3H)1.12(m,J＝6.60Hz,4H) 1.19-1.33(m,28H)1.35(s,9H)1.66(quin,J＝7.40Hz,2H)1.85(t,J＝8.44 Hz,4H)2.37(t,J＝7.52Hz,2H)5.14(s,2H)5.16(s,2H)7.30-7.42(m,10 H)。
步骤1c：13-(苄氧基)-2-((苄氧)羰基)-13-氧代-2-十一烷基三十一烷酸
Figure BDA0001188296870000681
向中间体I-2(200mg，0.295mmol)在DCM(3mL)中的溶液添加 TFA(0.6mL)，并且将反应在室温搅拌3小时。将溶剂蒸发并且通过快速 柱(硅胶12g，0-15％EtOAc/HEP)纯化残余物以产生标题化合物(177mg， 0.284mmol，96％)：1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 0.87-0.94(m,3H) 0.94-1.05(m,2H)1.19(br.s.,14H)1.23-1.37(m,16H)1.65(quin, J＝7.40Hz,2H)1.78-1.91(m,2H)1.93-2.05(m,2H)2.37(t,J＝7.52Hz,2 H)5.14(s,2H)5.27(s,2H)7.31-7.44(m,10H)。
步骤1d：1,11-二苄基11-(2,5-二氧代环戊基)二十二烷-1,11,11-三羧酸
Figure BDA0001188296870000682
将DCC(58.6mg，0.284mmol)在DCM(1mL)中的溶液在N2下添加 至I-3(177mg，0.284mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(32.7mg，0.284mmol) 在DCM(2mL)和THF(0.3mL)中的溶液。将反应在室温搅拌4小时。将溶 剂蒸发并且通过快速柱(硅胶12g，0-35％EtOAc/HEP)纯化残余物以产生 作为无色油的标题化合物(153mg，0.213mmol，75％)：1H NMR(400MHz， 氯仿-d)δppm 0.86-0.93(m,3H)1.12-1.21(m,2H)1.21-1.37(m,30H) 1.66(quin,J＝7.40Hz,2H)1.89-2.07(m,4H)2.37(t,J＝7.58Hz,2H)2.84 (br.s.,4H)5.13(s,2H)5.25(s,2H)7.30-7.47(m,10H)。
步骤1e：脂肪酸-接头构建体(中间体5)
Figure BDA0001188296870000691
将中间体I-4(145mg，0.201mmol)在THF(1.5mL)和DCM(1.5mL) 中的溶液添加至充入氨基-PEG24-酸的小瓶。添加DIPEA(88μL，0.504 mmol)并且将反应在摇床平台上搅拌15小时。将溶剂蒸发和通过超临界流 体色谱(Waters HILIC 20x150mm；15-25％MeOH/CO2)纯化残余物以产 生中间体I-5(151mg，0.086mmol，43％)：LCMS方法C Rt＝1.30分钟，[M+2H]+2876.4；1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 0.86-0.93(m,3H) 0.93-1.04(m,2H)1.19(br.s.,15H)1.23-1.37(m,15H)1.61-1.68(m,2 H)1.78(td,J＝12.44,4.34Hz,2H)1.92-2.05(m,2H)2.37(t,J＝7.58Hz,2 H)2.62(t,J＝6.05Hz,2H)3.49(dd,J＝6.72,2.32Hz,2H)3.52-3.59(m,2 H)3.59-3.73(m,92H)3.80(t,J＝6.05Hz,2H)5.13(s,2H)5.18(s,2H) 7.31-7.42(m,10H)8.09(t,J＝5.26Hz,1H)。
步骤1f：中间体6
Figure BDA0001188296870000701
将DCM(0.265mL)中的DCC(22mg，0.103mmol)添加至中间体I-5 (150mg，0.086mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺在DCM(1.5mL)中的溶液。将 反应搅拌1.5小时。添加THF(0.5mL)中的额外N-羟基琥珀酰亚胺(10mg) 和DCM(0.265mL)中的DCC(22mg)并且将反应搅拌过夜。将溶剂蒸发和 通过快速柱(硅胶12，0-5％MeOH/DCM)纯化残余物以产生作为白色固体 的中间体I-6(159mg，定量性)：LCMS方法A Rt＝1.55分钟，[M+H3O+H]+2 933.9。
步骤1g：脂肪酸-接头酰化剂(中间体7)
Figure BDA0001188296870000702
向中间体I-6(159mg，0.086mmol)在THF(5mL)中的溶液添加10％ 碳上Pd(4.6mg，4.3μmol)在THF(1mL)中的悬液。将反应置于氢下并搅 拌40分钟。添加更多碳上Pd(7mg，6.5μmol)并且随后在氢下搅拌另外1 小时。使反应穿过膜滤器并蒸发滤液。通过HPLC(SunfireC18 30x50mm， 45-70％ACN/水+0.1％TFA)纯化残余物以产生标题脂肪酸-接头酰化剂(83mg，0.047mmol，54％)：LCMS方法A Rt＝1.03分钟，[M+2H]+2835.2； 1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 0.84-0.94(m,3H)1.17(br.s.,2H)1.21 -1.39(m,30H)1.57-1.68(m,2H)1.69-1.80(m,2H)1.97-2.10(m,2H) 2.34(t,J＝7.21Hz,2H)2.86(s,4H)2.92(t,J＝6.48Hz,2H)3.51-3.73(m, 96H)3.87(t,J＝6.48Hz,2H)7.45(t,J＝4.46Hz,1H)
实施例5：步骤2：用脂肪酸-接头酰化剂选择性缀合MH-(199-308)-hGDF15
Figure BDA0001188296870000711
将MH-(199-308)-hGDF15(0.393mL，0.028μmol，1.78mg/mL)添加 至1.5ml 30mm乙酸钠缓冲液pH 4。添加NHS脂肪酸(I-7：474ug，0.284 umol，10mg/ml)至溶液。在5小时后，根据MALDI，反应完全。通过使 用amicon超滤10kD洗涤5次，纯化产物，以按73％的产率产生575ug 缀合物。MALDI：sm(18％)，预计的质量：24638观测的质量：24735； +1脂肪酸(38％)预计的质量：26192观测的质量：26268；+2脂肪酸(40％) 预计的质量：27746观测的质量：27798；+3脂肪酸(4％)预计的质量：29300 观测的质量：29333。
实施例6：步骤2：用脂肪酸-接头酰化剂位点特异性缀合M-(His)6-hGDF15-(199- 308)
Figure BDA0001188296870000721
将M-(His)6-hGDF15(0.493ml，0.026μmol，1.42mg/ml)添加至1.5ml 30mm乙酸钠缓冲液pH 4。添加NHS脂肪酸(I-7；0.221mg，0.132umol， 10mg/mL)至该溶液。过夜反应不完全，因而再添加2.5当量的脂肪酸NHS (0.110mg，0.066umol，10mg/mL)并且在5小时后，Maldi显示+2缀合 物作为主要产物。通过使用amicon超滤10kD洗涤5次，纯化产物，以 按76％的产率产生565ug缀合物。MALDI：sm(18％)，预计的质量：26468 观测的质量：26553；+1脂肪酸(38％)预计的质量：28022观测的质量： 28099；+2脂肪酸(40％)预计的质量：29576观测的质量：29649；+3脂 肪酸(4％)预计的质量：31130观测的质量：31201。
Figure BDA0001188296870000731
AH-GDF15+I-7:
标记程度 计算值 观测值 ％
AH-GDF15(二聚体) 24518 24559 3
AH-GDF15+1FA 26072 26091 44
AH-GDF15+2FA 27626 27615 42
AH-GDF15+3FA 29180 29164 11
+1FA和+2FA分别指在单体单元和二聚体单元的N末端添加脂肪酸。 +3FA指非选择性酰化。
序列(单体)：
ahngdhcplgpgrccrlhtvrasledlgwadwvlsprevqvtmcigacpsqfraanmhaqik tslhrlkpdtvpapccvpasynpmvliqktdtgvslqtyddllakdchci
在H2O中制备10mg/mL脂肪酸I-7溶液。将AH-hGDF15(1.12 mg/mL，175μL，0.0080μmol)与202μL 30mM NaOAc缓冲液pH 4.0合 并且添加I-7等分试样(13.33μL)。将反应在室温混合16小时，此时MALDI 分析显示30％原料转化。添加额外的6.67μL I-7等分试样并将反应混合 16小时以及添加13.33μL I-7等分试样。在室温16小时混合后添加I-7 (13.33μL)并且将反应在室温混合3天。添加13.33μL I-7等分试样并且将 反应在室温混合16小时，此时MALDI分析指示>95％转化。使用10kDa MWCO Amicon离心滤器，通过稀释和浓缩反应体系5倍至体积0.2mL， 将溶液交换成30mM NaOAc缓冲液pH 4.0。通过A280(30040M-1cm-1；26072g/mol)测量浓度为0.31mg/mL，30％。
实施例6A：用脂肪酸-接头酰化剂位点特异性缀合 AHA-hGDF15-(200-308)
Figure BDA0001188296870000751
在分子生物学级水中制备10mg/mL脂肪酸(中间体7)溶液。向 AHA-hGDF15(6.67mg/mL于30mM NaOAc pH 4.0中，5.247mL，1.433 μmol)添加30mM NaOAc pH 4.6(可接受范围4.5-5.0)以产生最终蛋白质浓 度0.88mg/mL。添加中间体7(10当量，2.39mL，0.014mmol)并且将反 应在室温混合18小时。沉淀物已在反应小瓶中形成。将反应混合物在4x15 mL 10kDa Amicon离心滤器之间分割并且各自用30mM NaOAc pH 4.0 稀释至15mL。将材料的缓冲液4次交换成30mM NaOAc pH 4.0并且将 样品合并为体积25.6mL，在洗涤期间用移液器尖头搅动滤器中的沉淀物。 沉淀物留在溶液中，从而将混合物在4℃静置过夜。通过A280(30040 M-1cm-1；27538g/mol)测量浓度为1.62mg/mL(100％)。UPLC分析显示 +1产物和+2产物的60％回收率(方法F)。
种类 观测值％
AHA-GDF15 29
AHA-GDF15+1FA 27
AHA-GDF15+2FA 33
AHA-GDF15+3FA 11
纯化：
粗产物是在Waters BEH300
Figure BDA0001188296870000761
3.5μm，4.6mm X 100mm流速 2.5ml/分钟上通过反相色谱(缓冲液A水中0.1％TFA；缓冲液B ACN 中0.1M梯度；99％-80％缓冲液A)纯化。
级分1：未反应的AHA-hGDF15：Rt＝17.33分钟
级分2：AHA-GDF15+1FA：Rt＝20.20分钟(产率大约15％)
级分3：AHA-GDF15+2FA:Rt＝21.60分钟(产率大约15％)
级分4：AHA-GDF15+3FA：Rt＝23.0分钟(产率大约5％)
备选地，反应可以在pH 4.73于10mM Na2HPO4-7H2O和30mM NaOAc中实施：在分子生物学级水中制备10mg/mL中间体7溶液。向 AHA-hGDF15(12.04mg/mL于30mM NaOAc pH 4.0中，4.15μL，0.002 μmol)添加30mM NaOAc 10mM Na2HPO4–7H2O pH 4.73以产生最终蛋 白质浓度0.88mg/mL。添加中间体7(20当量，6.83μL，0.041μmol)并且 将反应在室温混合18小时。反应混合物已经变浑浊，存在沉淀物。UPLC 分析显示+1产物和+2产物的58％回收率(方法F)。
种类 观测值％
AHA-GDF15 0
AHA-GDF15+1FA 11
AHA-GDF15+2FA 47
AHA-GDF15+3FA 34
AHA-GDF15+4FA 7
反应还可以在pH 4.6于30mM NaOAc和10mM K2HPO4中实施：在 分子生物学级水中制备10mg/mL中间体7溶液。向AHA-hGDF15(6.21 mg/mL于30mM NaOAc pH 4.0中，5.261mL，1.337μmol)添加30mM NaOAc10mM K2HPO4pH 4.6(可接受的范围4.5-5.0)以产生最终蛋白质浓 度0.88mg/mL。添加中间体7(10当量，68.3μL，0.409μmol)并且将反应 在室温混合7小时。反应混合物已经变浑浊，存在沉淀物。将反应混合物 在15mL 10kDa Amicon离心滤器中分割成四个9mL部分并且用30mM NaOAc pH 4.0稀释至15mL。将材料的缓冲液4次交换成30mM NaOAc pH 4.0，在每次洗涤期间用移液器尖头搅动沉淀物。将反应混合物浓缩至 体积75mL。沉淀物保留，从而将材料在4℃贮存两天。通过A280(30040 M-1cm-1；27538g/mol)测量浓度为0.4mg/mL(97％)。UPLC分析显示+1 产物和+2产物的61％回收率(方法F)。
种类 观测值％
AHA-GDF15 34
AHA-GDF15+1FA 34
AHA-GDF15+2FA 27
AHA-GDF15+3FA 5
实施例7：M(His)6M-GDF15的生物素酰化，作图证实N末端标记
Figure BDA0001188296870000771
向在30mM NaOAc pH 4乙酸钠缓冲液中的MHHHHHHM-hGDF15 溶液(0.53mg/mL，8mL)每2小时顺序添加以下量：118uL，177uL NHS 酯溶液(pH 4 30mM NaOAc缓冲液中的1.5mg/mL)。使用amicon浓缩器 (3次)以pH 4NaOAc缓冲液浓缩/洗涤混合物，并且反复洗涤管状柱以实 现蛋白质的高回收率。获得5.8mL 0.64mg/mL产物。LCMS：预计值(+1)： 27066，观测值(+1)：27066；预计值(+2)：27406，观测值(+2)：27405。
使用Glu-C消化和作图，证实在N末端90％生物素酰化。
这个方案的目标是还原、烷基化和用Glu-C(金黄色葡萄球菌V8)消化 蛋白质以便后续通过HPLC-MS/MS(高效液相色谱法–串联质谱法)或 MALDI MS(基质辅助激光解吸附电离质谱法)分析。简而言之，将纯蛋白 质重构于离液剂中，用二硫苏糖醇还原，用碘乙酰胺烷基化并且随后用 Glu-C消化。在碳酸氢铵或乙酸铵缓冲液中缓冲时，Glu-C对谷氨酸残基具有特异性。Glu-C将在磷酸盐缓冲液存在下切割天冬氨酸或谷氨酸。
1.实验方法
1.1.重构/变性(25uL中4M GnHCl)
1.1.1.添加25uL 4M盐酸胍(GnHCl)至干蛋白质等分试样。
1.1.2.温和搅拌，振摇或拍打大约2分钟以重构并变性蛋白 质。
1.2.还原(50uL中2M GnHCl，100mM ABC，10mM DTT)
1.2.1.添加20uL新鲜制备的250mM碳酸氢铵缓冲液 (ABC)。
1.2.2.添加在水中的5uL新鲜制备的100mM二硫苏糖醇 (DTT)。
1.2.3.在37℃温育1小时伴以温和振摇。
1.3.烷基化(60uL中1.6M GnHCl，83.3mM ABC，8.3mM DTT，35mM IAA)
1.3.1.添加4.75uL水。
1.3.2.添加在水中的5.25uL新鲜制备的400mM碘乙酰胺 (IAA)。
1.3.3.短暂且温和地搅拌或振摇以混合样品。
1.3.4.在室温在暗处温育40分钟。
1.4.纯化
1.4.1.添加至少1000uL冰冷的乙醇。
1.4.2.温和地搅拌或振摇以混合。
1.4.3.在-20℃温育2小时以沉淀蛋白质。
1.4.4.在4℃以10,000转/分钟离心10分钟。
1.4.5.移除大部分上清液。
1.4.6.在Speedvac中干燥至完全。
1.5.Glu-C消化(100uL中的0.25M GnHCl，25mM Am Ac约 pH 6.5，20:1蛋白质:Glu-C)
1.5.1.在10uL 2.5M GnHCl中重构干燥的蛋白质。
1.5.2.温和搅拌，振摇或拍打大约1分钟以重构蛋白质。
1.5.3.添加10uL新鲜制备的250mM乙酸铵缓冲液。
1.5.4.在100uL MilliQ水中重构10ug Glu-C。
1.5.5.添加适宜量的0.1ug/uL Glu-C以实现比率(1ug Glu-C:20ug蛋白质)。例如，添加10uL用于20ug的蛋白质。
1.5.6.添加水以实现最终反应体积100uL。
1.5.7.在37℃温育4小时伴以温和振摇。
1.5.8.从pH 4.0–9.0，Glu-C具有酶促活性，从而不可能通过 添加酸或碱猝灭其活性。推荐立即分析。
生物素酰化的GDF15样品应当产生339da质量位移的GluC肽。
化学生物素酰化的GDF15的N末端GluC消化产物。序列：LC-生物 素-M(His)6MARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLE。3个半胱氨酸烷基 化的单同位素计算质量＝4311.9755Da；M 3+电荷+1计算质量＝ 1438.3325；观测质量＝1438.3331。
实施例8：M(His)6-hGDF15的位点特异性生物素酰化
Figure BDA0001188296870000801
His-hGDF15+生物素-PEG24-NHS酯：
Figure BDA0001188296870000802
+1生物素和+2生物素分别指单体部分和二聚体部分的N末端的酰化。
在30mM pH 4NaOAc中制备10mg/mL生物素 -PEG24-NHS(Biomatrik,Inc.)溶液。将MHHHHHH-hGDF15(1.007mL， 0.054μmol)与30mM NaOAc pH 4(1.5mL)和生物素-PEG24-NHS(Biomatrik,Inc.，397μL，2.70μmol)合并。将混合物在室温振摇16小时， 此时添加额外10当量(79.4μL)的NHS溶液并且将反应在室温混合16小 时。添加额外10当量(79.4μL)的NHS溶液并且将反应在室温混合16小时。 将反应加热至37℃并搅拌10小时，此时使用10kDaMWCO Amicon离 心滤器，通过稀释和浓缩样品5倍至体积2mL，将混合物交换为30mM NaOAc缓冲液pH 4。LCMS分析显示存在原料、+1产物和+2产物。通过 A280(29090M-1cm-1；27818g/mol)测量浓度为1.20mg/mL(100％)。LCMS 方法D：Rt＝2.48分钟；MS[M+1+1生物素]，[M+1+2生物素]：观测值： 27818.0000，29174.0000，计算值：27823.7，29179.4。
实施例8A：M(His)6-hGDF15的位点特异性生物素酰化
Figure BDA0001188296870000811
His-hGDF15+磺基-NHS-生物素：
Figure BDA0001188296870000812
在30mM pH 4NaOAc中制备10mg/mL磺基-NHS-生物素 (ThermoFisher)溶液。将His-hGDF15B8(100μL，0.0076μmol)与30mM NaOAc pH 4(293.3μL)和磺基-NHS-生物素(ThermoFisher，6.70μL，0.151 μmol)合并。将混合物在室温振摇16小时。使用10kDa MWCOAmicon 离心滤器，通过稀释和浓缩样品5倍至体积150μL，将混合物交换成30mM NaOAc缓冲液pH 4。LCMS分析显示存在原料、+1产物和+2产物。通过 A280(29090M-1cm-1；26917g/mol)测量浓度为1.08mg/mL(80％)。LCMS 方法E：Rt＝5.05分钟；MS[M+1+1生物素]观测值：26690，计算值：26692， [M+1+2生物素]：观测值：26918，计算值：26920，[M+1+3生物素]：观 测值：27143，计算值：27148。
实施例9：BCN酰化剂与M(His)6M-hGDF15的位点特异性缀合
Figure BDA0001188296870000821
His-hGDF15Seq: MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLS PREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPA SYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
将His-hGDF15储液(0.6mL，4.8mg/mL)用30mm NaOAc pH 4.5缓 冲液(5.2mL)稀释至0.5mg/mL。缓慢添加DMSO(251μL)中的10mg/mL (1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯 (NHS-BCN)储液，并且将反应在24℃置于摇床平台上持续21小时。将反 应用30mm NaOAc pH 4.5缓冲液稀释至30mL并使用10kDa MWCO超 滤芯(重复4x)浓缩至2mL以产生2.5mL浓缩物。基于A280(ε＝29090 M-1cm-1，26730g/mol)，该浓缩物是0.93mg/mL(2.33mg，80％)：LCMS QT2_15-60kDa_15分钟_极性
Figure BDA0001188296870000831
BCN：双环壬炔基
+1BCN和+2BCN指单体部分和二聚体部分的N末端氨基的酰化。 +3BCN指非选择性酰化。
实施例10.BCN酰化剂与M(His)6M-hGDF15的位点特异性缀合
Figure BDA0001188296870000832
His-hGDF15Seq：
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGACPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI
将His-hGDF1储液(7.04mL，1.42mg/mL)用30mm NaOAc pH 4.5 缓冲液(12.95mL)稀释至0.5mg/mL。缓慢添加DMSO(0.88mL)中的10 mg/mL(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳 酸酯(NHS-BCN)储液，并且将反应在24℃置于摇床平台上持续24小时。 添加额外部分的NHS-BCN储液(176μL)，并将反应在24℃维持24小时。将反应用30mm NaOAc pH 4.5缓冲液稀释至60mL并使用10kDa MWCO超滤芯(重复4x)浓缩至4mL以产生4.1mL浓缩物。基于A280 (ε＝29090M-1cm-1，26700g/mol)，该浓缩物是2.19mg/mL(8.98mg，89％)： LCMS QT2_15-60kDa_15分钟_极性
Figure BDA0001188296870000841
BCN：双环壬炔基
+1BCN和+2BCN指单体部分和二聚体部分的N末端氨基的酰化。 +3BCN指非选择性酰化。
实施例11:His-hGDF15的荧光团标记
步骤1：荧光团-接头酰化剂(I-8)的制备
Figure BDA0001188296870000851
向Alexafluor647-NHS酯(Life Technologies，5mg，4.00μmol)在PBS(1 mL)中的溶液添加叠氮基-dPEG23-胺(Quanta Biodesign目录号#10525， 4.84mg，4.4μmol)。将反应在室温混合6.5小时，此时添加额外的0.25当 量叠氮基-dPEG23-胺(1mg)连同两滴DIPEA。将反应在室温混合16小时。 通过LCMS分析观察到完全转化。混合物用于下一个步骤中无需进一步纯 化。LCMS方法E：Rt＝1.73分钟；MS[M+H/3]：观测值：646.1，计算值： 655.3。
步骤2：用荧光团剂(I-8)进一步衍生化his-hGDF15-BCN构建体(实施例10)
Figure BDA0001188296870000861
His-hGDF15-AF647：
Figure BDA0001188296870000862
向His-hGDF15-BCN(500μL，2.19mg/mL，0.041μmol)的溶液添加1 的溶液(20.55μL，7.86mg/mL，0.082μol)。将反应在室温混合2天，此时 通过LCMS分析观察到75％转化。使用10kDa MWCO Amicon离心滤器， 通过稀释和浓缩样品8倍至体积2.25mL，将混合物交换成PBS。通过A280 (29090M-1cm-1；28600g/mol)测量浓度为0.32mg/mL(60％)。LCMS方法 B：Rt＝6.19分钟；MS[M+H+1AF647]：观察值：28580.0000，计算值： 28609.336。
实施例12：Cu64同位素螯合剂与GDF15的位点特异性缀合
Figure BDA0001188296870000871
向His-hGDF15溶液(1.12mg/mL，200uL)添加NODA-GA-NHS溶液、 HPF6、TFA盐(CheMatech目录号#C098)(20uL，10mg/mL)，并且将混 合物在室温搅拌2天。通过LC-MS分析观察到部分转化(+1为50％)。添 加200uL pH 4NaOAc缓冲液和20uL NODA-GA-NHS溶液并且将混合物 在室温再搅拌2天。通过LC-MS分析观察到+1和+2的转化是约70％。 添加更多的NODA-GA-NHS溶液(20uL)并且将混合物在室温搅拌过夜。 通过LC-MS分析观察到+1和+2的转化是约80％。将混合物用Amicon 10k 洗涤4次以产生150uL 0.40mg/mL溶液。
标记程度 计算值 观测值 ％
His-hGDF15 26726 26726 20
His-hGDF15+1AF647 27084 27086 50
His-hGDF15+2AF647 27442 27442 30
实施例13：毒素与GDF15的位点特异性缀合
步骤1：毒素构建体的制备
Figure BDA0001188296870000881
向马来酰亚胺MMAF(Concortis)(1.57mg，1.2当量)在DMSO(130uL) 中的溶液添加2-氨基-N-(3-叠氮丙基)-3-巯基丙酰胺(0.2mg，1当量)在72.7 uL DMSO中的溶液和DIPEA(1uL，6当量)，并且将混合物在室温搅拌1 小时。通过LC-MS分析观察到部分转化。添加更多的叠氮基半胱氨酸(100 uL)。将反应搅拌三天。
放大：将(200uL DMSO中的)1.7mg马来酰亚胺MMAF(Concortis) 添加至cys-N3(130uL+100uL)和DIPEA(2uL)并且将反应搅拌超过三天。
将两种混合物合并并通过Sunfire C18纯化，用10-90％ACN/水(0.1％ TFA)(Rt＝1.15分钟)洗脱以按92％产率产生2.9mg纯净产物。
步骤2：BCN位点特异性缀合至His-cynoGDF15(对应于本发明的步骤b)
Figure BDA0001188296870000882
向his-cynoGDF15(B1，150uL，0.87mg/mL)添加pH 4缓冲液(450uL) 和DMSO中的NHS-BCN(Berry and associates目录号LK4320)(10 mg/mL，4.12uL)，并且将混合物在4℃经历周末搅拌。在4℃1天后60％ 转化显而易见，此时添加DMSO中的7当量NHS-BCN在(10mg/ml，4.12 ul)。在4℃另外24小时后，添加13当量NHS-BCN(DMSO中的10mg/mL， 8ul)并且将反应在室温温育4小时。观察到部分转化。将混合物在室温温 育另外4小时。观察到完全转化并且将混合物稀释至15mL并借助Amicon 10K滤芯洗涤/浓缩4次，以按照88％产率产生7mL0.60mg/mL溶液(4.2 mg)。LCMS：+1预计的质量：26844；观测的质量：26842；+2预计的质 量：27024；观测的质量：27020。
步骤3：进一步修饰缀合物构建体
Figure BDA0001188296870000891
向BCN-GDF15(7mL，0.6mg/mL)添加叠氮基-MMAF(200uL， DMSO中7.25mg/mL)并且将混合物在室温搅拌三天，随后在30℃搅拌2 天。获得单修饰产物和双修饰产物的约70％转化。将产物用Amicon 10k 洗涤以按定量产率产生pH 4 30mm乙酸钠中的4.7mL 1mg/mL产物。 Maldi：sm(25％)计算的质量：(+1)26844(+2)27024观测的质量：(+1) 26699；+1毒素(50％)计算的质量：28377观测的质量：(+1)28525；+2 毒素(25％)计算的质量：30088观测的质量：29910。
实施例14：Fc与APJ肽激动剂的位点特异性缀合
总体方案：
Figure BDA0001188296870000901
步骤1：合成NH2-叠氮基Lys-GGGGS-Q-R-P-C-L-S-C-K-G-P-DNle-苯乙胺
中间体14
Figure BDA0001188296870000902
苯乙胺-AMEBA树脂(Sigma Aldrich，0.25mmol，1.0mmol/g)在自动 肽合成仪(CEMLiberty Blue Microwave)上经历固相肽合成，针对Arg残 基采用标准双Arg以及Dnle和叠氮基赖氨酸偶联两次。将氨基酸制备为 DMF中的0.2M溶液。标准偶联循环定义如下：
·氨基酸偶联：AA(5当量)、HATU(5当量)、DIEA(25当量)
·洗涤：DMF(3X7mL)
·Fmoc去保护：20％哌啶/0.1M HOBt(2x7mL)
·洗涤：DMF(4x7mL随后1x5mL)
Figure BDA0001188296870000911
Figure BDA0001188296870000921
在装配肽后，将树脂用DMF(2x50mL)和DCM(2x50mL)洗涤，随 后在真空下干燥以产生中间体14a(770mg，0.250mmol)。
步骤2：中间体14b的制备(从树脂切下肽)
将中间体14a(770mg，0.250mmol)对半分并将每份样品与6mL TFA 溶液(37mLTFA，1mL H2O，1mL TIPS，2.569g(20当量)DTT)组合并 且在室温振摇3小时。将溶液从树脂取出并沉淀入40mL冷Et2O。将溶 液涡旋混合并在冰上放置10分钟，之后在4000转/分钟离心5分钟。移除 溶剂并且将白色固体用冷Et2O再洗涤2次(每次40mL)，离心(每次5分 钟)并倾析。将固体在真空下干燥过夜并通过M-触发型HPLC纯化，产生 作为白色粉末的中间体14b(80mg，0.045mmol，80％)。LCMS(SQ2产物 分析-酸性肽-极性，Acquity UPLC BEH C18柱，
Figure BDA0001188296870000923
1.7μm，2.1mm x50mm，50℃)：Rt＝2.32分钟，MS[M+H+2/2]888.0。
步骤3：中间体14c的制备(半胱氨酸残基的环化)
Figure BDA0001188296870000922
将中间体14b(80mg，0.045mmol)溶解于水(1.25mL)中并且将碘 (HOA中50mM，1.804mL，0.090mMol)逐滴缓慢添加并且将反应在室温 混合3小时。粗制物反应的LCMS分析显示原料完全转化。逐滴添加0.5M 抗坏血酸(维生素C)直至颜色消散。通过MS-触发型HPLC纯化材料。汇 集级分的冻干产生20.1mg作为白色粉末的所需产物(0.045mmol，25％)。LCMS(SQ2产物分析-酸性肽-极性，Acquity UPLC BEH C18柱，
Figure BDA0001188296870000931
1.7μm，2.1mm x50mm，50℃)：Rt＝2.17分钟，MS[M+H+2/2]886.8。
步骤4：Fc-AH构建体的制备
AH-Fc构建体克隆：
使用载体pPL1146作为模板通过标准PCR技术产生下文所示的DNA 片段，所述载体pPL1146含有小鼠Igκ信号序列，后接CMV启动子下游 的人Fc。设计正向引物(5’-GCT TGCTAG CCA CCA TGG AAA CTG-3’)，其含有NheI位点，后接与载体pPL1146中所含的信号序列的 5'末端相对应的序列。反向引物5’-GTT GAT TGA ATT CTT AGA AGC ACA TGG GGC CCTTGT GGC ACA GCC GGG GCC GCT GGC TTC CGC CAC CTC CGC TGC CTC CAC CGC CGC TGCCTC CGC CAC CTG CGC CTG GAC TCA GAG ACA GGG-3’)设计成含有EcoRI位点、 Apelin序列、甘氨酸丝氨酸接头和与pPL1146中所含的人Fc的3’末端互 补的序列。在扩增后，片段用NheI和EcoRI限制性消化，从琼脂糖凝胶 分离和纯化，并且连接入以相同方式消化和纯化的载体pPL1146中。将连 接物转化入大肠杆菌DH5细胞并且通过DNA测序鉴定含有正确质粒的 菌落。所示的序列针对有义链并且以5’-至3’-方向展开。
核苷酸序列
GCTAGCCACCATGGAAACTGACACCCTGCTGCTGTGGGTCC TGCTGCTGTGGGTGCCTGGCAGCACTGGCGCTCATGATAAGACA CACACATGCCCCCCTTGTCCAGCACCAGAGGCAGCTGGAGGACC AAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCTAAAGACACACTGATGA TCTCAAGGACCCCAGAAGTCACATGCGTGGTCGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGT CGAGGTGCATAATGCTAAGACCAAACCCCGAGAGGAACAGTACA ACAGCACCTATCGGGTCGTGTCCGTCCTGACAGTGCTGCACCAG GATTGGCTGAACGGCAAAGAGTATAAGTGCAAAGTGAGTAATAA GGCTCTGCCTGCACCAATCGAGAAAACAATTTCTAAGGCTAAAG GGCAGCCAAGAGAACCCCAGGTGTACACTCTGCCTCCATCTAGG GAGGAAATGACAAAGAACCAGGTCAGTCTGACTTGTCTGGTGAA AGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCAGTGGAGTGGGAATCTAATG GCCAGCCTGAAAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGAC TCCGATGGGTCTTTCTTTCTGTATTCTAAGCTGACCGTGGATAAA AGTCGGTGGCAGCAGGGAAACGTCTTCTCATGCAGCGTGATGCA CGAGGCCCTGCACAATCATTACACACAGAAGTCCCTGTCTCTGA GTCCAGGCAAATGAGAATTC
AH-Fc蛋白表达和纯化：
使用标准聚乙烯亚胺方法，将AH-Fc表达质粒DNA转染入密度1x106细胞/ml的HEK293T细胞。500ml培养物随后在37℃于3L烧瓶中的 FreeStyle 293培养基(LifeTechnologies)内培育4天。
从澄清的条件培养基纯化AH-Fc蛋白。简而言之，使500ml条件培 养基以4ml/分钟流过5ml HiTrap MabSelectSure柱(GE Life Sciences)。 将柱用20个柱体积的含有0.1％Triton X-114的PBS洗涤并且随后将 Fc-AH蛋白用0.1M甘氨酸pH 2.7洗脱，用1M Tris-HClpH 9中和并且 对PBS透析。如通过Charles River ENDOSAFE PTS试验所测量，蛋白质 产率是10至20mg/500ml条件培养基并且内毒素水平是<1EU/mg。
通过还原型、N-去糖基化AH-Fc蛋白的的LC/MS，表征蛋白质。Fc-AH 的分子量如预期。
天然AH-Fc蛋白的LC/MS：峰不均一并且比二聚体所预计的大约3 kD。这是针对具备共有N-连接的糖基化位点的Fc所预计的N-连接的糖基 化的特征。
在Superdex 200上分析性大小排阻：AH-Fc蛋白具有89％和100％之 间的二聚体，0％至10％之间的四聚体，和0％至1％之间的聚集物。
还原型SDS/PAGE：蛋白质主要作为具有预期大小的单体迁移。
步骤5：AH-Fc BCN的制备(在Fc-HA N末端上安装点击手柄)
Figure BDA0001188296870000951
AH-Fc序列：
AHDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
将AH-Fc(来自步骤4：1mL，3mg/mL，0.117μmol)溶解于30mM NaOAc pH 4.0(4.3mL)中并且缓慢添加DMSO(0.70mL)中的10mg/mL储 液(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯 (BCN)，并且将反应在室温置于摇床平台上持续3天。添加BCN(0.25mL) 并且将反应在室温混合3天。添加BCN(0.70mL)并且将反应在室温混合 16小时。使用10kDa MWCO Amicon离心滤器，通过稀释和浓缩反应体 系5倍至体积900μL，将溶液交换成30mM NaOAc pH 4.0。将溶液离心 并移除上清液。通过A280测量浓度为1.73mg/mL(1.56mg，26％)。LCMS (QT2，蛋白质_20-70kDa_3分钟，Proswift Monolith4.6x50mm，50℃， 洗脱剂A：水+0.1％甲酸，洗脱剂B：CAN+0.1％甲酸，2分钟内2-98％) Rt＝1.58分钟。
标记程度 计算值 观测值 ％TIC(MS+)强度
Fc-AH 51141 51141.5 18
Fc-AH+1BCN 51318 51317 31
Fc-AH+2BCN 51495 51496 31
Fc-AH+3BCN 51672 51671 20
步骤6：Fc-HA-BCN+中间体14c(缀合CNM肽至Fc)
Figure BDA0001188296870000961
在H2O中制备中间体14c的50mg/mL储液。添加中间体14c(53.7μL， 1.515μmol)至Fc-HA-BCN在30mM NaOAc pH 4.0中的储液(1.73 mg/mL，1.56mg，0.030μmol)并且将反应在室温混合16小时。使用50kDa MWCO Amicon离心滤器，通过稀释和浓缩反应体系5倍至体积250μL， 将溶液交换成30mM NaOAc pH 4.0。通过A280测量浓度为3.32 mg/mL(830μg，50％)。LCMS(QT2，蛋白质_35-70kDa_3分钟，Proswift Monolith 4.6x50mm，50℃，洗脱剂A：水+0.1％甲酸，洗脱剂B：CAN +0.1％甲酸，2分钟内10-80％B)Rt＝1.43分钟，MS[M(糖基化)+H]54524.5。
Figure IDA0001188296910000011
Figure IDA0001188296910000021
Figure IDA0001188296910000031
Figure IDA0001188296910000041
Figure IDA0001188296910000051
Figure IDA0001188296910000061
Figure IDA0001188296910000071
Figure IDA0001188296910000081

Claims (10)

1.在N端氨基酸的氨基官能团修饰靶蛋白或靶肽的方法，所述方法包括步骤：
a.修饰靶蛋白质或靶肽，从而所产生的蛋白质或肽在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸；
b.使在与N末端氨基酸毗邻的位置处含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽与酰化剂在低于6的pH接触，以形成修饰的蛋白质或肽；
其中酰化剂具有以下式：
Figure FDA0002734830860000011
其中
R是H或SO3Na；
L1是直链或分枝的C1-C30烷基或下式的不分枝低聚乙二醇部分：
Figure FDA0002734830860000012
其中y是0至34；
R1是生物素或脂肪酸部分；且
n是0或1；
或其中所述的酰化剂为下式：
Figure FDA0002734830860000021
Figure FDA0002734830860000031
且其中
通过将在所述靶蛋白或靶肽的N末端的两个氨基酸替换为氨基酸序列XH-，其中H是组氨酸并且X是选自M和A的氨基酸，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽；或
通过将在所述靶蛋白或靶肽的N末端的三个氨基酸替换为氨基酸序列XHX’-，其中H是组氨酸并且X和X’是独立地选自M和A的氨基酸，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽；或
通过在所述靶蛋白或靶肽的N末端附加式XH的两氨基酸序列或式XHX’-的三氨基酸序列，其中H是组氨酸并且X和X’独立选自M和A，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽；或
通过在所述靶蛋白或靶肽的N末端附加组氨酸标签，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽；
其中靶蛋白质是hGDF15、(199-308)-hGDF15、cynoGDF15、dGDF15和(200-308)-hGDF15。
2.根据权利要求1的方法，其中通过附加选自MHHHHHH-或MHHHHHHM-的氨基酸序列至所述靶蛋白或靶肽的N末端，制备在与N末端氨基酸毗邻的位置含有组氨酸氨基酸的蛋白质或肽。
3.根据权利要求1的方法，其中R1选自以下酸：
Figure FDA0002734830860000032
R2是CO2H、H；
R3、R4和R5彼此独立地是H、OH、CO2H、-CH＝CH2或-C≡CH；
Ak1是分枝的C6-C30亚烷基；
q、r和p彼此独立地6和30之间的整数；并且其中接合点是CO2H官能团；或酰胺、酯或其可药用盐中的任一者。
4.根据权利要求3的方法，其中R1选自以下脂肪酸：
Figure FDA0002734830860000041
5.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中酰化剂是：
Figure FDA0002734830860000042
其中
R8是线性或分枝的C6-70烷基、线性或分枝的C6-70烯基或线性或分枝的C6-70炔基，每种基团任选地用1至3个选自羧基和羟基的取代基取代；
s是1至34。
6.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中所述酰化剂为：
Figure FDA0002734830860000051
7.根据权利要求1或2的方法，其中酰化剂是：
Figure FDA0002734830860000052
8.权利要求7的方法，还包括步骤：使下式的生物相互作用剂或分析剂：
Figure FDA0002734830860000061
其中y为0-34且FA为下式：
Figure FDA0002734830860000062
与酰化剂中存在的反应基团反应；
其中Ak1是分枝的C6-C30亚烷基；
R2是CO2H、H；
R3、R4和R5彼此独立地是H、OH、CO2H、-CH＝CH2或-C≡CH；
q、r和p彼此独立地6和30之间的整数。
9.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中pH小于5。
10.根据权利要求9的方法，其中pH是4。
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