CN106573049A - 用于治疗纤维化疾病的trail受体激动剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了促凋亡剂例如激动性TRAIL受体的配体和激动剂可诱导或加快细胞凋亡，这导致纤维化和潜在的疾病，例如特征为纤维化、肝硬化或它们的并发症的肝脏、胰腺、肺和皮肤疾病。组合物和方法可用于选择性地去除肝纤维化和肝硬化的起源即肝星状细胞(HSC)和胰腺纤维化和胰腺炎的起源即活化的胰星状细胞(PSC)和，并且可以通过同时减少由这些活化的星状细胞分泌或诱导的多种纤维化相关分子来有效地降低或预防进一步的慢性纤维化。组合物通常可有效地靶向激动性TRAIL受体，例如在生理条件下在活化的HSC和PSC中选择性表达的TRAIL‑R1/DR4和TRAIL‑R2/DR5。配体和激动剂可用于靶向激动性TRAIL受体，其包括但不限于TRAIL‑R1/DR4和/或TRAIL‑R2/DR5激动剂。

Description

用于治疗纤维化疾病的TRAIL受体激动剂

交叉引用

本申请要求2014年4月21日提交的美国临时专利第61/982,207号申请、2014年5月8日提交的美国临时专利第61/990,530号申请的优先权和权益，并且本申请是2015年3月11日提交的美国实用新型第14/645,276号申请的部分继续申请，其公开内容均通过引用明确并入本文。

序列表的参考

本申请包含以ASCII格式通过EFS-Web提交的序列表，其通过引用以其整体并入本文。ASCII副本，创建于2015年4月9日，命名为“THER_100_ST25.txt”，大小为4,814字节。

技术领域

本发明一般涉及用于治疗纤维化疾病的组合物和方法，具体涉及用于治疗肝纤维化和肝硬化及其并发症和其他器官如胰腺的纤维化的TRAIL促凋亡剂和方法，例如，通过消除纤维化起因即活化的星状细胞同时下调多个纤维化分子的活性。

背景技术

纤维化疾病，特别是在肺、肝、胰腺、皮肤、肾中，导致全世界多达45％的死亡(Friedman,SL,et al,Science Translational Medicine,5(167):167sr1(2013))。对于肝病，没有可用于人类肝纤维化和肝硬化的抗纤维化剂。由于从病毒、肥胖相关和酒精相关的纤维化和肝硬化的患病率增加，以及用于移植的肝脏捐赠的短缺，存在肝脏纤维化治疗的临床紧迫性。

在1985年，肝星状细胞(HSC)被确定为通过超表达细胞外基质组分的肝纤维化发展的主要元凶(Friedman SL,et al.,PNAS,82(24):8681-5(1985))。胰星状细胞(PSC)是肌成纤维细胞样细胞，其在胰腺纤维化、胰腺炎和胰腺癌的发展中起关键作用(Omary,M.B.,et al.,J.Clin.Invest.117(1):50-59(2007))。响应于胰腺损伤或炎症，静态的PSC被激活为肌成纤维细胞样细胞并且表达平滑肌肌动蛋白，非常类似于HSC。

现有的肝纤维化治疗方法有几个缺点。一些治疗方案会影响HSC。许多保肝药减弱或中和上游炎症反应，因而活化HSC，这已经在体外和体内进行了研究。对维生素E在非酒精性脂肪肝炎(NASH)的临床试验中进行了评估，证明减轻了组织学的肝损伤，但没有抗纤维化效果(Sanyal,AJ.,et al.,New Eng,J.Mede,362(18):1675-85(2010))。

据报道肝细胞生长因子(HGF)调节HSC增殖、胶原蛋白合成以及TFG-β的表达。通过基因治疗或注射重组蛋白递送HGF防止实验性肝纤维化的进展。然而，存在使用HGF或HGF模拟物的顾虑，其刺激肝细胞生长和增加肿瘤发生的潜在风险(Fallowfield,JA.,AmericanJournal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology,300(5):G709-G15(2011))。

对防止HSC活化或增殖的药剂也进行了研究。HSC活化与PPAR-r的低水平表达相关。PPAR-r的上调或PPAR-r配体的添加逆转HSC的活化。已对一些PPAR-r配体格列酮类在动物模型中进行了测试，但其仅在疾病病程早期轻微地减缓纤维化进展(Leclercq,IA,etal.,Gut,55(7):1020-9(2006))。

还已知他汀类药物HMG-CoA还原酶抑制剂可在体外抑制HSC增殖并且对肝纤维化模型中的门静脉高压症和血管紧张素II-诱导的炎症提供有益效果。例如，早期的阿托伐他汀治疗减弱HSC的活化和大鼠胆管结扎后的胶原沉积；然而，一旦纤维化被建立而启动治疗时(Trebicka,J.,et al.,Journal of Hepatology,53(4):702-12(2010))，阿托伐他汀是无效的，这表明其仅作为预防药剂是有益的，而不是治疗药剂。

肾素-血管紧张素系统在肝纤维化和门静脉高压症中起到重要作用。研究表明，血管紧张素转化酶抑制剂和AT1R拮抗剂沙坦类药物可以降低纤维化(Yang,L.,et al.,Journal of Hepatology,43(2):317-23(2005))。用AT1R拮抗剂洛沙坦治疗带有慢性丙型肝炎病毒(HCV)的患者减慢了纤维化进展和促纤维化基因(Colmenero,J.,et al.,American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology,297(4):G726-34(2009))。

TGF-β是肝纤维化的发病机理中的关键效应子。降低或抑制TGF-β合成和信号转导被认为是重要的治疗靶标。抑制TGF-β作用的多种策略包括使用TFG-β中和抗体、诱骗受体、siRNA和寡核苷酸。一些TGF-β相关分子在动物模型中显示抗纤维化作用，然而，由于TGF-β受体在所有细胞类型上广泛表达，因此会难以靶向HSC，这种抑制剂可触发自身免疫疾病或细胞去分化。

慢性胰腺炎(CP)是以胰腺结构和功能的进行性和不可逆性破坏为特征的疾病(Braganza,J.M.,et al.,Lancet,377(9772):1184-97(2011))。CP伴有胰腺纤维化和持续的腹痛。CP和CP相关的疼痛的管理是有挑战性的，因为CP目前是不可治愈的病症。尚没有出现用于人的药物，这导致CP患者群明显缺医少药。CP通过显著的纤维化识别。胰腺纤维化主要由PSC安排。在胰腺损伤或发病期间，静态的PSC经历活化并转化为增殖性、纤维化和收缩的肌成纤维细胞，其促进胶原沉积并导致纤维化组织。因此，活化的PSC是针对胰腺的抗纤维化和抗疼痛治疗的主要靶标(Omary,M.B.,et al.,J.Clin.Invest.117(1):50-59(2007))。然而，如同HSC，缺少在体内特异性靶向并影响活化PSC的方法阻碍这一策略。

在纤维化过程中和HSC或PSC活化后，许多纤维化相关分子高度上调，并有助于纤维化及其并发症的发展。这些分子包括但不限于PDGF、TGFβ、CTGF、MMP、TIMP和胶原(Friedman,S.L.,Nat Rev Gastroenterol Hepatol.7(8):425-36(2010))。常见的抗纤维化策略是抑制体内的许多纤维化相关分子之一的调节。抑制一种纤维化相关分子将提供一些抗纤维化功效；然而，因为纤维形成是与涉及许多纤维形成分子的多种途径相关的复杂过程，所以这种方法不会高效地停止或逆转纤维化。多个纤维化相关分子的同时抑制或下调将表现出强的抗纤维化功效，然而，难以在生理条件下同时靶向多个分子，特别是通过利用单个药物分子。

因此，本发明的目的是提供用于治疗纤维化疾病包括肝纤维化和胰腺纤维化的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供用于在生理条件下同时抑制或下调多种纤维化相关分子的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供用于降低、抑制或逆转肝纤维化和其它疾病如肝硬化及其并发症的组合物和方法。

本发明的又一个目的是提供用于降低或抑制肝脏炎症的方法和组合物。

本发明的另一个目的是治疗其它器官的纤维化及其相关并发症，例如胰腺纤维化、慢性胰腺炎及其并发症如疼痛的方法。

发明内容

已经发现促凋亡剂如激动性TRAIL受体的配体和激动剂可以诱导或增加引起纤维化和潜在疾病的细胞凋亡，潜在疾病例如特征为纤维化、肝硬化或其并发症的肝疾病、胰腺疾病、肺疾病和皮肤疾病。本文公开的组合物和方法可用于选择性地去除肝纤维化和肝硬化的起源即活化的肝星状细胞(HSC)和胰腺纤维化和胰腺炎的起源即活化的胰星状细胞(PSC)，并且可以同时有效地降低由活化星状细胞诱导的多种纤维化相关分子的调节。这将整体减少或逆转纤维化或预防进一步的纤维化相关的并发症。所述组合物通常在生理条件下有效靶向在活化的HSC和PSC中选择性表达的激动性TRAIL受体，如TRAIL-R1/DR4和TRAIL-R2/DR5。可用于靶向激动性TRAIL受体的配体和激动剂包括但不限于TRAIL-R1和/或TRAIL-R2激动剂，如重组人(rh)TRAIL、工程化TRAIL类似物、例如用聚合物如聚(乙二醇)、共聚物和支链类似物改性的长效TRAIL蛋白，以及生物聚合物如透明质酸。基于TRAIL的长效制剂包括聚合物体系；TRAIL融合蛋白；激动性抗TRAIL-R1抗体；激动性抗TRAIL-R2抗体；和结合TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的激动性小分子或肽分子。这些激动剂单独或与其它治疗剂组合可降低或阻断多个器官中现有纤维化的发展或者可以逆转现有纤维化。用于治疗纤维化疾病的示例性方法包括向有需要的个体施用有效量的促凋亡剂以诱导肝星状细胞、胰星状细胞、肌成纤维细胞(fibromyoblast cell)、髓成纤维细胞(fibromyoblastic cell)、活化的内皮细胞或活化的上皮细胞中的细胞凋亡，其产生或诱导过量的细胞外基质，导致肝脏、胰腺或其他器官的不希望的结疤。促凋亡剂可以是TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)激动剂，例如聚乙二醇化的TRAIL或激动性TRAIL抗体。这种抗体在癌症患者中进行临床试验，但没有显示出很大的成功。TRAIL可以是例如天然或基因工程化(重组)形式的蛋白质。在优选的实施方案中，TRAIL是人TRAIL或其功能片段或变体。例如，功能片段可以是281个氨基酸的人TRAIL的片段。在优选的实施方案中，所述片段具有全长281个氨基酸人形式(1-281)的氨基酸序列114至281或95至281。

在一些实施方案中，聚乙二醇化的TRAIL包括三聚体TRAIL，其包括拉链氨基酸基序，更优选异亮氨酸拉链基序，其有利于在其N末端形成三聚体以及PEG或其衍生物，其中PEG结合三聚体TRAIL的至少一个单体的N末端。PEG或其衍生物可以是直链、支链或三聚体形式的PEG。PEG的示例性衍生物包括甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯、甲氧基聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇醛、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺和多支化聚乙二醇。在一些实施方案中，PEG或其衍生物具有1000至100000Da，优选5000至50000Da的分子量。

该技术的关键方面是通过在生理条件下特异性消除纤维化的起源细胞(例如活化的肝星状细胞和胰星状细胞)以同时靶向多种纤维化相关分子。这为治疗诱导导致不希望的结疤的过量细胞外基质的病理症状提供了手段。代表性的病症包括肝纤维化和肝硬化以及慢性胰腺炎和其它器官例如肺、皮肤、心脏和肾脏的纤维化。这也减少了作为肝硬化的主要并发症的腹水的量和作为慢性胰腺炎的主要并发症的疼痛。

附图说明

图1是显示TRAIL激动剂、PEG-TRIAL和激动性TRAIL抗体诱导纤维形成激活的人原代肝星状细胞(HSC)的起源细胞的细胞凋亡的柱状图。高度活化的HSC(在第7天和14天)对TRAIL诱导的细胞凋亡更敏感。凋亡表示为诱导的细胞死亡(％)，计算为相对于未处理细胞的百分比，并通过细胞死亡测定法测量。*P<0.05相对于第1天，**P<0.01相对于第1天。

图2是显示分别在治疗的几周中CCl₄，CCl₄和TRAIL，CCl₄和PEG-TRAIL的注射方案的实验设计的图示。使用组1方案检查PEG-TRAIL是否阻止纤维形成，使用组2方案检查PEG-TRAIL是否逆转肝纤维化，并且使用组3方案研究PEG-TRAIL是否改善肝硬化。

图3是显示来自用媒介、单独的CCl₄和具有PEG-TRAIL的CCl₄处理的分离的肝组织的蛋白质印迹中星状细胞活化的标记物的α-SMA(α-SMA)的相对蛋白表达水平的柱状图。当用CCl₄处理大鼠时，α-SMA水平显着增加，然而，PEG-TRAIL降低α-SMA的表达。***P<0.001相对于媒介物，*P<0.05相对于CCl₄。

图4A和4B是每个肝脏样品的20个区域中的定量胶原沉积(Sirius红染色，图4A)和α-SMA阳性区域(图4B)的点图。

图5是来自用媒介物，CCl₄+媒介和CCl₄+PEG-TRAIL处理的组3(图2)的小鼠中腹水体积(ml)的点图。

图6是显示来自健康大鼠(白色柱)和用乙醇/蛙皮素/Lieber Decarli(LD)餐食(黑色柱)和含PEG-TRAIL的乙醇/蛙皮素/LD(灰色条)处理的酒精诱导的慢性胰腺炎(CP)大鼠的分离的胰腺组织的蛋白质印迹中的α-SMA、星状细胞活化的标记物、PDGFRβ、纤维化标记物的相对蛋白质表达水平。当用乙醇/蛙皮素/LD处理大鼠时，α-SMA和PDGFRβ的水平显着增加，然而，PEG-TRAIL减少α-SMA和PDGFRβ的表达。#P<0.05相对于载体，***P<0.001相对于CP+载体，*P<0.05相对于CP+载体。

发明详述

I.定义

如本文所用，术语“治疗”包括抑制、缓解、预防或消除与所治疗的疾病、病症或紊乱相关的一种或多种症状或副作用。

术语“降低”、“抑制”、“减轻”或“减少”是相对于对照而使用。本领域技术人员将容易地鉴别用于每个实验的合适的对照。例如，将用化合物处理的个体或细胞中的降低的响应与未用化合物处理的个体或细胞中的响应进行比较。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻所治疗的疾病状态的一种或多种症状或另外提供期望的药理学和/或生理学作用的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，例如个体依赖性变量(例如年龄、免疫系统健康等)，疾病或紊乱，和所施用的治疗。有效量的效果可以是相对于对照而言。这种对照是本领域已知的且在本文进行讨论，并且可以是例如个体在药物或药物组合施用之前或不施用时的状况，或在药物组合的情况下，该组合的效果可以与仅施用一种药物的效果相比较。

如本文所用，术语“组合疗法”是指治疗疾病或其症状，或实现期望的生理变化的方法，包括施用有效量的两种或更多种化学试剂或组分以治疗疾病或其症状，或产生生理变化，其中所述化学试剂或组分一起施用，例如同一组合物的一部分，或在同一时间或不同时间单独和独立地施用(即，将每种试剂或组分的施用通过彼此相隔有限的时间段分开)。

如本文所用，术语“剂量方案”是指关于制剂、给药途径，药物剂量、给药间隔和治疗持续时间的药物施用。

如本文所用，术语“多肽”包括蛋白质及其片段。多肽在本文中作为氨基酸残基序列公开。那些序列从氨基到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列由如下所示的三个字母或单字母代码命名：丙氨酸(Ala,A)，精氨酸(Arg,R)，天冬酰胺(Asn,N)，天冬氨酸(Asp,D)，半胱氨酸(Cys,C)，谷氨酰胺(Gln,Q)，谷氨酸(Glu,E)，甘氨酸(Gly,G)，组氨酸(His,H)，异亮氨酸(Ile,I)，亮氨酸(Leu,L)，赖氨酸(Lys,K)，甲硫氨酸(Met,M)，苯丙氨酸(Phe,F)，脯氨酸(Pro,P)，丝氨酸(Ser,S)，苏氨酸(Thr,T)，色氨酸(Trp,W)，酪氨酸(Tyr,Y)和缬氨酸(Val,V)。

如本文所用，术语“变体”是指与参考多肽或多核苷酸不同但保留基本性质的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体在氨基酸序列上与另一个参考多肽不同。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列在整体上非常类似，并且在许多区域中是相同的。变体和参考多肽可以通过一个或多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)在氨基酸序列上不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的残基。多肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或者其可以是未知的天然存在的变体。

可以对本公开的多肽的结构进行修饰和改变，并且仍然获得具有与多肽相似特征(例如，保守氨基酸取代)的分子。例如，某些氨基酸可以取代序列中的其它氨基酸而没有明显的活性损失。因为定义该多肽的生物功能活性的是多肽的相互作用能力和性质，所以可以在多肽序列中进行某些氨基酸序列取代，但获得具有相似性质的多肽。

在进行这种改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。氨基酸亲水指数在赋予多肽相互作用生物功能中的重要性在本领域中通常已得到理解。已知某些氨基酸可以取代具有相似亲水指数或分数的其它氨基酸，并且仍然导致具有相似生物活性的多肽。基于其疏水性和电荷特性，每个氨基酸已被指定亲水指数。这些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

据认为，氨基酸的相对亲水特性决定所得多肽的二级结构，其进而限定多肽与其它分子如酶、底物、受体、抗体和抗原的相互作用。本领域已知氨基酸可以被具有相似亲水指数的另一氨基酸取代，并且仍然获得功能等同的多肽。在这种变化中，亲水指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，±1以内的氨基酸的取代是特别优选的，并且±0.5以内的氨基酸的取代甚至是更特别优选的。

类似氨基酸的取代也可以基于亲水性进行。以下亲水性值已指定为氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解，氨基酸可以取代具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学等价物，特别是免疫学上等同的多肽。在这样的变化中，优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，特别优选±1以内的氨基酸的取代，更特别优选±0.5以内的氨基酸的取代。

如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种上述特征的示例性取代是本领域技术人员公知的，并且包括(原始残基：示例性取代)：(Ala:Gly,Ser)、(Arg:Lys)、(Asn:Gln,His)、(Asp:Glu,Cys,Ser)、(Gln:Asn)、(Glu:Asp)、(Gly:Ala)、(His:Asn,Gln)、(Ile:Leu,Val)、(Leu:Ile,Val)、(Lys:Arg)、(Met:Leu,Tyr)、(Ser:Thr)、(Thr:Ser)、(Tip:Tyr)、(Tyr:Trp,Phe)和(Val:Ile,Leu)。特别地，多肽的实施方案可以包括与目的多肽具有约50％、60％、70％、80％、90％和95％序列同一性的变体。

如本领域已知的“同一性”是通过比较序列确定的两个或多个多肽序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还指通过这种序列的串(string)之间的匹配确定的多肽之间的序列相关性的程度。“同一性”还可以指多肽与参考多肽的全长相比的序列相关性的程度。“同一性”和“相似性”可以通过已知方法容易地计算，包括但不限于在下列文献中所描述的：Computational Molecular Biology(计算分子生物学),Lesk,A.M.,Ed.,OxfordUniversity Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(生物计算：信息学和基因组工程),Smith,D.W.,Ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(序列数据的计算机分析，第I部分),Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,Eds.,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology(分子生物学中的序列分析),von Heinje,G.,AcademicPress,1987；和Sequence Analysis Primer(序列分析引物),Gribskov,M.and Devereux,J.,Eds.,M Stockton Press,New York,1991；and Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM JApplied Math.,48:1073(1988).

确定同一性的优选方法被设计为给出测试的序列之间的最大匹配。将确定同一性和相似性的方法编码在公众可获得的计算机程序中。两个序列之间的同一性百分比可以通过使用包含Needelman和Wunsch(J.Mol.Biol.,48:443-453,1970)算法(例如，NBLAST和XBLAST)的分析软件(即遗传学计算机组的序列分析软件包(Sequence Analysis SoftwarePackage of the Genetics Computer Group),Madison Wis.)。默认参数用于确定本公开的多肽的同一性。

作为实例，多肽序列可以与参考序列相同，即是100％相同，或者与参考序列相比可以包括高达特定整数个氨基酸改变，使得同一性％少于100％。此类改变选自：至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)或插入，并且其中所述改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何位置，其单独散布在参考序列中的氨基酸之间或在参考序列内的一个或多个连续的组中。

对于给定的同一性％的氨基酸改变的数目，通过将参考多肽中的氨基酸总数乘以相应百分比同一性的数字百分比(除以100)，然后从参考多肽中的所述氨基酸总数中减去该乘积来确定。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指并置(juxtaposition)，其中组件被配置成执行其通常的功能。例如，与编码序列可操作地连接的控制序列或启动子能够实现编码序列的表达，并且与蛋白质可操作地连接的细胞器定位序列将有助于连接的蛋白质定位在特定细胞器。

如本文所用，术语“细胞类型”是本领域中对细胞进行分组或分类的方式。术语细胞类型是指基于部分地通过多肽、核苷酸或代谢物的常见生物学功能、位置、形态、结构、表达确定的其生物特性的细胞分组。

如本文所用，术语“细胞状态”是指细胞类型的状况。细胞在其整个生命中是动态的，并且可以实现分化、功能、形态和结构的各种状态。如本文所用，细胞状态是指其生命期内的特定细胞类型。

如本文所用，术语“细胞表面标记物”是指存在于细胞表面或附近足以以类型或状态唯一地识别细胞的任何分子，例如部分、肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、抗体、抗原和/或代谢物。

II.用于治疗肝和胰腺疾病的组合物

激动性TRAIL受体的配体和激动剂

已发现，激动性TRIAL受体的配体和激动剂可以配制成使得配体有效治疗纤维化和/或纤维化相关并发症。

在优选的实施方案中，配体或激动剂不需要递送将有效的载体如颗粒或基质。例如，尽管提供了包含颗粒和其它递送载体的制剂，但是在一些实施方案中，配体在循环中稳定并且保持有效至少一天，优选至少两天，而不借助于时间释放基质、颗粒或其他随时间释放或可降解的载体。

配体和激动剂通常是TRAIL缀合物，其包括与缀合物分子连接的TRAIL肽、模拟物或模拟物，优选TRAIL或其片段、变体或融合物，其与在不存在缀合物分子的情况下的TRAIL片段、变体或融合物相比，延长TRAIL缀合物的体内半衰期。

TRAIL-缀合物制剂和剂量方案可以靶向和消除有助于纤维形成的纤维化诱导活化肝星状细胞(HSC)和胰星状细胞(PSC)的起源，而不是静止星形细胞。通过消除这种起源细胞，由星状细胞活化分泌或诱导的多种纤维化相关分子可以同时被抑制或下调。例如，系统性PEG-TRAIL的施用去除活化的HSC或PSC群，并在蛋白质和mRNA的水平上减少和/或归一化高度上调的纤维发生分子，包括α-SMA、1型胶原、3型胶原3、PDGFR、TGFβ、MMP-2、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3、BMP-7的。如下文更详细地讨论的，所公开的组合物通常以有效靶向和消除纤维化的起源细胞并且同时减少一种或多种纤维化相关分子的量施用于有需要的个体。

A.TRAIL肽及类似物

TRAIL-缀合物包括连接有缀合物分子的TRAIL结构域，TRAIL结构域通常是TRAIL肽、类似物或模拟物，优选TRAIL或其片段、变体或融合物。

TRAIL

TRAIL/Apo2L(TNFSF10)最初在与已知TNF超家族配体具有同源性的基因的EST数据库的搜索中被鉴定(Benedict et al.,J.Exp.Med.,209(11):1903-1906(2012))。在人类中，TRAIL结合两种促细胞凋亡死亡受体(DR)，TRAIL-R1和TRAIL-R2(TNFRSF10A和10B)，以及不诱导死亡的两种其他膜受体，并且可以充当死亡信号转导的诱骗物。TRAIL与其同源DR的结合诱导死亡诱导信号转导复合物的形成，最终导致半胱天冬酶活化和细胞凋亡的启动(Benedict et al.,J.Exp.Med.,209(11):1903-1906(2012))。

在一些实施方案中，TRAIL缀合物包括TRAIL肽或激动性TRAIL受体结合片段或其变体。

人TRAIL的核酸和氨基酸序列是本领域已知的。例如，人TRAIL的氨基酸序列是

MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG(SEQ ID NO:1,(UniProtKB数据库登录号P50591(TNF10_HUMAN))。在一些实施方案中，TRAIL缀合物包括包含或具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的TRAIL肽。

优选地，TRAIL是可溶性TRAIL。内源性全长TRAIL包括胞质结构域、跨膜结构域和细胞外结构域。通常，可溶性TRAIL是没有胞质结构域和跨膜结构域的全长TRAIL的片段。因此，可溶性TRAIL可以是TRAIL的胞外结构域(例如，SEQ ID NO:1的胞外结构域)或其功能片段。SEQ ID NO:1的TRAIL的共有胞外结构域是SEQ ID NO:1的氨基酸39-281。因此，在一些实施方案中，TRAIL缀合物包括包含或具有SEQ ID NO:1的氨基酸39-281、41-281、91-281、92-281、95-281和114-281的TRAIL肽，或其功能片段或变体。

在一些实施方案中，TRAIL缀合物包括可以通过TRAIL-R1和/或TRAIL-R2激动信号传导的SEQ ID NO:1的功能片段或变体。SEQ ID NO:1的片段或变体可以与SEQ ID NO:1具有50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或超过99％的序列同一性。

优选地，其功能片段或变体包括SEQ ID NO:1的细胞外结构域或其功能片段。据认为，TRAIL的C-末端150个氨基酸包括受体结合结构域。因此，在一些实施方案中，功能片段包括SEQ ID NO:1的氨基酸132-281。在其它具体实施方案中，所述片段是SEQ ID NO:1的氨基酸95-281或氨基酸114-281。

变体可以具有相对于SEQ ID NO:1的一个或多个取代、缺失或添加，或其任何组合。在一些实施方案中，变体是天然存在的备选序列、剪接变体或取代、添加或缺失变体或其细胞外结构域或功能片段或替代序列、剪接变体或取代、添加或缺失变体。天然存在的替代序列和变体公开于UniProtKB数据库登录号P50591(TNF10_HUMAN)，版本140(最后修改于2014年1月22日)。

TRAIL类似物

TRAIL可以作为三聚体与其受体相互作用。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法中使用的配体或激动剂是多聚体或可以形成多聚体，优选三聚体。三聚体可以是同源三聚体或异源三聚体。

本文所述的所有TRAIL蛋白可以使用用于分离天然或重组蛋白质的标准技术来制备，并且如本文所述进行化学修饰。

TRAIL缀合物可以包括TRAIL类似物，或激动性TRAIL受体结合片段或其变体。TRAIL类似物是本领域已知的。在优选的实施方案中，与野生型或内源性TRAIL相比，类似物对一种或多种激动性TRAIL受体(例如TRAIL-R1(DR4)和/或TRAIL-R2(DR5))具有增加的亲和力或特异性，对一种或多种拮抗性或诱骗性TRAIL受体(例如受体DcR1和DcR2)或其组合具有降低的亲和力或特异性。

在一些实施方案中，类似物是野生型TRAIL的DR4选择性突变体。DR-4选择性突变体是本领域已知的，并且公开于例如Tur,J.Biological Chemistry,283(29):20560-8(2008)中。在特定实施方案中，类似物是具有D218H或D218Y取代的SEQ ID NO:1的变体，或其功能片段(例如，细胞外结构域)。

在一些实施方案中，类似物是野生型TRAIL的DR5选择性突变体。具体的DR-5-选择性突变体包括具有D269H、D269H/E195R或D269H/T214R的SEQ ID NO:1的变体及其功能片段(例如细胞外结构域)。这些变体描述于van der Sloot,Proc.Nat.Acad.Sci.U SA 103(23):8634-9(2006)。

TRAIL融合蛋白

TRAIL缀合物可以是TRAIL融合蛋白。TRAIL融合多肽具有第一融合配偶体，包括所有或部分TRAIL蛋白胞外结构域，其(i)直接与第二多肽融合，或(ii)任选地与融合至第二多肽的接头肽序列融合。融合蛋白任选地含有用于使两个或多个融合蛋白二聚化或多聚化的结构域。肽/多肽接头结构域可以是单独的结构域，或者可以包含在融合蛋白的其它结构域(TRAIL多肽或第二多肽)之一内。类似地，用于使融合蛋白二聚化或多聚化的结构域可以是单独的结构域，或者可以包含在融合蛋白的其它结构域(TRAIL多肽、第二多肽或肽/多肽接头结构域)之一内。在一个实施方案中，二聚化/多聚化结构域和肽/多肽接头结构域是相同的。

本文公开的融合蛋白可以是式I：

N-R1-R2-R3-C

其中“N”表示融合蛋白的N末端，“C”表示融合蛋白的C末端，“R1”是TRAIL多肽，“R2”是任选的肽/多肽接头结构域，“R3”是第二多肽。或者，R3可以是TRAIL多肽，R1可以是第二多肽。

融合蛋白可以是二聚化或多聚化的。二聚化或多聚化可以通过二聚化或多聚化结构域在两种或更多种融合蛋白之间发生。或者，融合蛋白的二聚化或多聚化可通过化学交联发生。形成的二聚体或多聚体可以是同源二聚体/同源多聚体或异源二聚体/异源多聚体。

第二多肽的存在可以改变TRAIL融合多肽的溶解度、稳定性、亲和力和/或化合价。如本文所用，“化合价”是指每分子可用的结合位点的数目。在一些实施方案中，第二多肽含有免疫球蛋白重链恒定区的一个或多个结构域，优选具有对应于人免疫球蛋白Cγ1链的铰链区CH2和CH3区或鼠免疫球蛋白Cγ2a链的铰链区CH2和CH3区的氨基酸序列。在特定的二聚体融合蛋白中，二聚体由两条Ig重链的铰链区中的Cys残基共价结合生成，所述Ig重链具有在二聚化的正常Ig重链中二硫键连接的相同的Cys残基。

在一个具体的实施方案中，TRAIL融合蛋白是TRAIL-模拟物，其包括在一条多肽链中组合的称为单链TRAIL受体结合结构域(scTRAIL-RBD)的三个TRAIL-原体亚序列，如Gieffers,Molecular Cancer Therapeutics,12(12):273547(2013)中所描述的。两个所谓的scTRAIL-RBD(其中每个具有三个受体结合位点)可以紧密接近，产生具有六价结合模式的多聚体融合蛋白。在一些实施方案中，通过将人免疫球蛋白G1(IgG1)-突变蛋白C-末端的Fc部分与scTRAIL-RBD多肽融合，从而每个药物分子产生六个受体结合位点来实现多聚化。

基于对主要由二聚体(DbscTRAIL)组成的靶向的scTRAIL的scFv接头修饰，scFv-scTRAIL的强制二聚化超过一些靶细胞类型的非靶向scTRAIL的活性约100倍(Siegemund，同上)。还证实在靶阴性细胞上DbscTRAIL的活性增加，表明除了靶向之外，等同于标准TRAIL本身的至少二聚体装配的寡聚化增强凋亡信号传导。因此，在优选的实施方案中，TRAIL融合蛋白具有可以导致例如二聚体、三聚体或六聚体分子的多聚化结构域，例如二聚化或三聚化结构域或其组合。

促进三聚体形成的另一融合蛋白包括氨基末端融合至三聚亮氨酸或异亮氨酸拉链结构域的TRAIL的受体结合片段。

TRAIL融合蛋白和在功能测定中使用融合蛋白的结果也描述于Wahl,Hepatology,57(2):625-36(2013)中。

生产多肽的方法

所公开的TRAIL多肽、其片段、变体和融合物可以使用本领域已知的常规技术制备。分离的多肽可以通过例如化学合成或通过在宿主细胞中重组生产获得。为了重组产生多肽，含有编码融合蛋白的核苷酸序列的核酸可用于转化、转导或转染细菌或真核宿主细胞(例如昆虫、酵母或哺乳动物细胞)。通常，核酸构建体包括与编码多肽的核苷酸序列可操作地连接的调控序列。调控序列(本文中也称为表达控制序列)通常不编码基因产物，而是影响它们可操作地连接的核酸序列的表达。

用于表达和产生多肽的有用的原核和真核系统是本领域熟知的，包括例如大肠杆菌菌株如BL-21，和培养的哺乳动物细胞如CHO细胞。

在真核宿主细胞中，许多基于病毒的表达系统可用于表达多肽。基于病毒的表达系统是本领域公知的，包括但不限于杆状病毒、SV40、逆转录病毒或基于痘苗的病毒载体。

稳定表达多肽的哺乳动物细胞系可使用具有合适的控制元件和选择性标记物的表达载体产生。例如，真核表达载体pCR3.1(Invitrogen Life Technologies)和p91023(B)(see Wong et al.(1985)Science 228:810 815)适合于在例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS-1细胞、人胚胎肾293细胞、NIH3T3细胞、BHK21细胞、MDCK细胞和人血管内皮细胞(HUVEC)中表达变体多肽。其它合适的表达系统包括可通过Lonza Group Ltd.获得的GS基因表达系统^TM。

在通过电穿孔、脂质转染、磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖或其它合适的转染方法引入表达载体后，可以选择稳定的细胞系(例如通过代谢选择或对G418、卡那霉素或潮霉素的抗生素抗性)。可以培养转染的细胞以使目的多肽表达，并且可以从例如细胞培养上清液或从裂解细胞中回收多肽。或者，可以通过(a)将扩增的序列连接到哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen Life Technologies)中，和(b)使用小麦胚芽提取物或兔网织红细胞裂解物体外转录和翻译来产生融合蛋白。

可以使用例如色谱方法如亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石色谱来分离多肽。在一些实施方案中，可以将多肽工程化以包含含有允许多肽被捕获到亲和基质上的氨基酸序列的另外的结构域。例如，可以使用蛋白A柱分离细胞培养上清液或细胞质提取物中的Fc融合多肽。此外，诸如c-myc、血凝素、多组氨酸或Flag^TM(Kodak)的标签可用于帮助多肽纯化。这样的标签可以插入多肽内的任何地方，包括在羧基或氨基末端。可用的其他融合物包括有助于检测多肽的酶，例如碱性磷酸酶。免疫亲和层析也可用于纯化多肽。多肽可以另外被工程化以包含使多肽由其产生的细胞分泌的分泌信号(如果没有已经存在的分泌信号)。然后可以方便地从细胞培养基中分离分泌的多肽。

B.抗体组合物和制备方法

纯化的TRAIL受体多肽、片段、融合物或其抗原或表位可用于制备特异性结合TRAIL受体的抗体。抗体可以使用本领域已知的任何合适的方法制备。随后，可以使用本领域已知的方法筛选抗体的功能活性(例如，激动或拮抗活性)。

抗体可以在细胞培养物、噬菌体或各种动物中产生。在一个实施方案中，抗体是哺乳动物抗体。噬菌体技术可用于分离初始抗体或产生具有改变的特异性或亲合力特征的变体。这样的技术是常规的并且是本领域公知的。在一个实施方案中，抗体通过本领域已知的重组方法产生。例如，可以通过用包含编码抗体的DNA序列的载体转染宿主细胞来产生重组抗体。一种或多种载体可用于转染在宿主细胞中表达至少一个VL和一个VH区的DNA序列。抗体生成和生产的重组方法的示例性描述包括Delves,Antibody Production:Essential Techniques(抗体生产：主要技术)(Wiley,1997)；Shephard等人,Monoclonal Antibodies (单克隆抗体)(Oxford University Press,2000)；Goding,Monoclonal Antibodies: Principles And Practice(单克隆抗体：原理和实践)(Academic Press,1993)；Current Protocols In Immunology(免疫学实验室指南)(John Wiley&Sons,最新版本)。

所公开的抗体可以通过重组方法修饰以增加抗体在介导所需功能中的更大功效。可以使用重组方法通过取代修饰抗体。通常，取代将是保守取代。例如，抗体恒定区中的至少一个氨基酸可以用不同的残基替换。参见例如美国专利号5,624,821，美国专利号6,194,551，WO 9958572；和Angal等人，Mol.Immunol.30:105-08(1993)。氨基酸的修饰包括氨基酸的缺失、添加和取代。在一些情况下，进行这样的改变以减少不期望的活性，例如补体依赖性细胞毒性。通常，通过共价或非共价地连接提供可检测信号的物质来标记抗体。多种标记和缀合技术是已知的，并且在科学和专利文献中广泛报道。可以筛选与TRAIL受体结合的这些抗体。参见例如，Antibody Engineering:A Practical Approach(抗体工程化：实践方 法)(牛津大学出版社，1996)。

具有所需生物活性的合适抗体可以通过体外测定来鉴定，所述体外测定包括但不限于：增殖、迁移、粘附、软琼脂生长、血管发生、细胞-细胞通讯、凋亡、转运、信号转导和以下体内测定如抑制肿瘤生长。

可用于所公开的组合物和方法的抗体包括任何类别的完整免疫球蛋白(即，完整抗体)、其片段，和至少含有抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白。可变结构域在抗体之间的序列不同，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性通常不是通过抗体的可变结构域平均分布。其通常集中在轻链可变结构域和重链可变结构域中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，其主要采用β-折叠构型、通过三个CDR连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近在一起，并且与来自其它链的CDR一起促进抗体的抗原结合位点的形成。

还公开了具有生物活性的抗体片段。片段，无论是否连接到其它序列，都包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他选择的修饰，条件是片段的活性与未修饰的抗体或抗体片段相比没有显著改变或受损。

技术也可适用于产生对本公开的抗原性蛋白质具有特异性的单链抗体。用于产生单链抗体的方法是本领域技术人员熟知的。可以通过使用短肽接头将重链和轻链的可变结构域融合在一起，从而在单个分子上重建抗原结合位点来产生单链抗体。已经开发了单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C末端经由15至25个氨基酸的肽或接头连接于另一个可变结构域的N末端，而没有显著破坏抗原结合或结合的特异性。选择接头以允许重链和轻链以其正确的构象取向结合在一起。

可以通过连接两个scFv来工程化二价单链可变片段(di-scFv)。这可以通过产生具有两个VH和两个VL区的单个肽链，产生串联scFv来完成。ScFv也可以设计有对于两个可变区太短以至于不能一起折叠(约5个氨基酸)的接头肽，迫使scFv二聚化。这种类型被称为双抗体。已经显示双抗体具有比对应的scFv低至多40倍的解离常数，意味着它们对它们的靶具有高得多的亲和力。更短的接头(一个或两个氨基酸)导致形成三聚体(三链抗体或三链体)。还产生了四抗体。与双抗体相比，它们对其靶标显示出更高的亲和力。

单克隆抗体获自基本上同质的抗体群体，即除了可能存在于抗体分子的小子集中的可能的天然存在的突变之外，群体内的单个抗体是相同的。单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及此类抗体的片段相同或同源，只要它们显示所需的拮抗活性即可。

单克隆抗体可以使用产生单克隆抗体的任何方法制备。在杂交瘤方法中，小鼠或其他合适的宿主动物通常用免疫剂免疫以引发产生或能够产生将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外免疫。

抗体也可以通过重组DNA方法制备。可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离编码所公开的抗体的DNA并测序。也可以产生抗体或活性抗体片段的文库，并使用噬菌体展示技术进行筛选。

人和人源化抗体

许多非人抗体(例如，衍生自小鼠、大鼠或兔的那些)在人中是天然抗原性的，因此当施用于人时可产生不期望的免疫应答。因此，在所述方法中使用人或人源化抗体用于减少施用于人的抗体将引起不期望的免疫应答的机会。

可以使用能够在免疫后在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下产生人抗体的完整组成成分的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J(H))基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后产生人抗体。任选地，抗体在其他物种中产生并且“人源化”用于人的施用。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括来自受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替换的人免疫球蛋白(受体抗体)，其具有期望的特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替换。人源化抗体还可以含有既不在受体抗体中也不在输入(imported)的CDR或框架序列中发现的残基。通常，人源化抗体将基本上含有至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最优选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。

人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一个或多个多肽链的DNA序列。人源化可以基本上通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行。因此，非人抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或片段，其中基本上小于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列替代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。

为了降低抗原性，用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择是非常重要的。根据“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受最接近啮齿动物的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)。另一种方法使用衍生自轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体。

更重要的是，抗体是人源化的，其保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质。为了实现这个目标，优选通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域技术人员熟悉的。可用的计算机程序说明和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从共有序列和输入序列中选择和组合FR残基，从而实现所需的抗体特征，例如对靶抗原的增加的亲和力。一般来说，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。

单链抗体

用于产生单链抗体的方法是本领域技术人员熟知的。通过使用短肽接头将重链和轻链的可变结构域融合在一起，从而在单个分子上重建抗原结合位点来产生单链抗体。已经开发了单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C末端经由15至25个氨基酸的肽或接头连接于另一个可变结构域的N末端，而没有显著破坏抗原结合或结合的特异性。选择接头以允许重链和轻链以其正确的构象取向结合在一起。这些Fv缺乏存在于天然抗体的重链和轻链中的恒定区(Fc)。

单价抗体

体外方法也适合于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术完成抗体的消化以产生其片段，特别是Fab片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶进行消化。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，每个Fab片段具有单个抗原结合位点和残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生称为F(ab')₂片段的片段，其具有两个抗原结合位点，并且仍然能够交联抗原。

在抗体消化中产生的Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域。Fab'片段与Fab片段的不同在于，在重链结构域的羧基末端添加几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab')₂片段是包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab'片段的二价片段。Fab'-SH是本文对Fab'的命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。抗体片段最初以其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对的形式产生。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

杂交抗体

抗体可以是杂交抗体。在杂交抗体中，一个重链和轻链的对与在针对一个表位产生的抗体中发现的重链和轻链的对同源，而另一个重链和轻链的对与在针对另一个表位产生的抗体中发现的对同源。这导致多功能化合价的性质，即二价抗体具有同时结合至少两个不同表位的能力。这种杂交体可以通过产生相应组分抗体的杂交瘤的融合或通过重组技术形成。当然，这种杂合体也可以使用嵌合链形成。

使用蛋白质化学制备抗体的方法

产生包含抗体的蛋白质的一种方法是通过蛋白质化学技术将两个或更多个肽或多肽连接在一起。例如，可以使用目前可获得的实验室设备，使用Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)或Boc(叔丁氧基羰基)化学，化学合成肽或多肽。(Applied Biosystems，Inc.，FosterCity，CA)。本领域技术人员可以容易地理解，例如，可以通过标准化学反应合成对应于抗体的肽或多肽。例如，肽或多肽可以合成并且不从其合成树脂上切割，而抗体的其他片段可以合成并随后从树脂上切割，从而暴露在其它片段上被功能性阻断的末端基团。通过肽缩合反应，这两个片段可以分别通过肽键在其羧基和氨基末端共价连接，以形成抗体或其片段。或者，如上所述在体内独立地合成肽或多肽。一旦分离，这些独立的肽或多肽可以通过相似的肽缩合反应连接形成抗体或其抗原结合片段。

例如，克隆的或合成的肽区段的酶连接允许相对短的肽片段连接以产生更大的肽片段、多肽或完整蛋白质结构域。或者，合成肽的天然化学连接可用于从较短的肽片段合成地构建大肽或多肽。该方法由两步化学反应组成。第一步是未保护的合成肽-α-硫酯与含有氨基末端Cys残基的另一未保护的肽区段的化学选择性反应，得到硫酯连接的中间体作为初始共价产物。在反应条件没有变化的情况下，该中间体经历自发的快速的分子内反应，以在连接位点形成天然肽键。

C.缀合物和复合物

所公开的TRAIL缀合物还包括与TRAIL结构域或不结合TRAIL受体的抗体部分连接的第二缀合物分子。

聚环氧烷如PEG

亲水性聚合物如聚环氧烷或其共聚物如BASF销售的可以与分子共价结合以改善TRAIL的药代动力学和药效动力学性质(Kim,et al.,BioconjugateChem.,22(8),pp 1631–1637(2011))。研究显示用PEG衍生的TRAIL类似物维持抗癌活性，同时在血浆中表现出更高的代谢稳定性，延长的药代动力学特性和更大的循环半衰期(Chae,et al.,Molecular cancer therapeutics 9(6):1719-29(2010)；Kim,et al.,Bioconjugate chemistry,22(8):1631-7(2011)；Kim,et al.,Journal ofpharmaceutical sciences100(2):482-91(2011)；Kim,et al.,Journal of controlledrelease:official journal of the Controlled Release Society 150(1):639(2011))。

因此，在一些实施方案中，TRAIL结构域用一个或多个乙二醇(EG)单元，更优选2个或更多个EG单元(即聚乙二醇(PEG))或其衍生物衍生化。PEG的衍生物包括但不限于甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇醛、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺和多支化聚乙二醇。

EG或衍生物单元的精确数目取决于所需的活性、血浆稳定性和药代动力学曲线。例如，Kim等人(同上)报道，2、5、10、20和30K-PEG-TRAIL分别在小鼠中导致相对于TRAIL的循环半衰期为1.1小时的更大的3.9、5.3、6.2、12.3和17.7小时的循环半衰期。在一些实施方案中，PEG的分子量在约1和100kDa之间，优选在约1和50kDa之间。例如，PEG可具有“N”kDa的分子量，其中N为1至100之间的任何整数。PEG可具有“N”Da的分子量，其中N为1,000至1,000,000之间的任何整数。在具体实施方案中，PEG的分子量是“N”Da，其中“N”在1,000和50,000之间，或更优选在5,000和50,000之间。

促凋亡剂可以与直链或支链PEG缀合。一些研究已经表明，与直链PEG-蛋白相比，用支链PEG衍生化的蛋白具有延长的体内循环半衰期，据认为部分是由于支链PEG-蛋白的更大的流体动力学体积。Fee,et al.,Biotechnol Bioeng.,98(4):725-3(2007)。

肽配体可以使用本领域已知的方法在C-末端或优选在N-末端衍生化。

TRAIL-PEG缀合物可以由下式表示：

X-L-(PEG)_n，

其中

X表示TRAIL蛋白，

L表示接头，

PEG表示支链聚(乙二醇)链，以及

n是选自2、3、4、5、6、7或8的整数。

在某些实施方案中，n是2。

聚环氧烷通过接头与蛋白质偶联。接头可以是聚环氧烷，并且优选将两个聚环氧烷聚合物连接到蛋白质。

在一个具体的实施方案中，TRAIL-缀合物是包括TRAIL结构域和PEG的PEG-缀合物，TRAIL结构域包括截短形式的人TRAIL，例如，人TRAIL的全长形式(1-281)的精氨酸-114到甘氨酸-281，PEG的分子量为1,000至100,000道尔顿，优选5,000至50,000道尔顿。

N-末端修饰的PEG-TRAIL缀合物可以通过在还原剂的存在下使TRAIL结构域的N-末端胺与PEG的醛基反应来获得。PEG和TRAIL可以以2至10或优选5至7.5的摩尔比(PEG/TRAIL)反应。

在优选的实施方案中，TRAIL缀合物包括拉链氨基酸基序，例如异亮氨酸拉链基序，其允许在三种TRAIL缀合单体之间形成三聚体。

PEG链优选但不必具有相等的分子量。每个PEG链的示例性分子量范围为约10kDa至60kDa，优选约20kDa至40kDa。PEG40是合成的支链PEG部分，其具有40kDa的分子量：20+20kDa(每个PEG链)。

三聚PEG部分可以由连接到连接臂的分支PEG链组成。下面紧接着提供三聚体PEG部分的可视化描述。

合成以下三聚PEG：YPEG42、YPEG43.5、YPEG45、YPEG50和YPEG60。

·YPEG42是三聚PEG部分，其具有42kDa的分子量：(20+20kDa)(支链PEG)+2kDa(连接臂)。

·YPEG43.5是三聚PEG部分，其具有43.5kDa的分子量：(20+20kDa)(支链PEG)+3.5kDa(连接臂)。

·YPEG45是三聚PEG部分，其具有45kDa的分子量：(20+20kDa)(支链PEG)+5kDa(连接臂)。

·YPEG50是三聚PEG部分，其具有50kDa的分子量：(20+20kDa)(支链PEG)+10kDa(连接臂)。

·YPEG60是具有60kDa的分子量的三聚体PEG部分：(20+20kDa)(支链PEG)+20kDa(连接臂)。

接头部分

蛋白质或肽通过接头与支链PEG部分共价连接。接头是聚合物，并且通常具有至少800埃的原子长度。通常，接头具有约800至约2,000埃，约800至约1,500埃，约800至约1,000埃或约900至约1,000埃的原子长度。应当理解，上面列出的原子距离是指完全延伸的聚合物，并且当为固态或溶液时，接头可以折叠或卷曲，使得支链PEG和蛋白质或肽之间的实际距离小于上面列出的原子长度。

在某些实施方案中，接头是分子量为约1kDa至30kDa，优选约2kDa至20kDa的聚(乙二醇)衍生物。接头也可以是长度为至少80个单位的天然或非天然氨基酸。

接头的PEG替代物包括合成或天然的水溶性生物相容性聚合物如聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺，蛋白质如透明质酸和硫酸软骨素，纤维素如羟甲基纤维素，聚乙烯醇和聚羟基烷基(甲基)丙烯酸酯。

蛋白质和肽可以使用常规化学方法与接头共价结合。伯胺基团，如在N-末端或在赖氨酸残基中发现的，将在还原条件下与醛及其等价物反应，得到胺。(Molineux，Currentpharmaceutical design，10(11)：1235-1244(2004))。例如在半胱氨酸残基中发现的氢硫基(-SH)基团可以与各种迈克尔受体(包括丙烯酸和甲基丙烯酸衍生物以及马来酰亚胺)进行共轭加成(Gong et al.,British Journal of Pharmacology,163(2):399-412(2011))。在肽和蛋白质中发现的其它合适的亲核基团包括二硫键(Brocchini,et al.,Natureprotocols,1:2241-2252(2006))和组氨酸残基(Cong,et al.,Bioconjugate Chemistry,23(2):248-263(2012))。

接头可以使用常规化学方法与蛋白质或肽共价连接。例如，接头聚合物可以在一端用亲电子基团例如醛、环氧化物、卤素(氯、溴、碘)、磺酸酯(甲苯磺酸酯、甲磺酸酯)、迈克尔受体或活化羧酸酯衍生化，然后与蛋白质或肽中的亲核胺或硫醇基团反应。合适的迈克尔受体包括丙烯酸和甲基丙烯酸衍生物，如丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，以及马来酰亚胺。合适的活化羧酸酯包括碳酸硝基苯酯和NHS(N-羟基琥珀酸)酯。在其它实施方案中，含有精氨酸残基的肽和蛋白质可以与含有反应性1,3-二酮官能团的接头共价连接。

缀合物可通过首先将接头与肽或蛋白质连接，然后将接头与支链聚(乙二醇)连接，或通过首先将接头与支链聚(乙二醇)连接，然后将接头与肽或蛋白质连接来制备。键形成的最佳顺序由所涉及的具体化学转化确定。

大分子

在其它实施方案中，TRAIL可以通过报道的方法使用生物聚合物或多肽衍生为具有延长的半衰期的长效TRAIL；例如但不限于使用化学缀合的透明质酸(Yang et al.,Biomaterials 32(33)；8722-8729(2011)，库存的多肽(Amiram et al.,Proc Natl AcadSci U S A,110(8)；27922792(2013),U.S.公开申请号US 2013-0178416 A1)和与延伸的重组多肽连接的TRAIL(美国公开申请号US 2010-0239554 A1)。

复合物

TRAIL结构域可以与带负电荷的部分复合。在一些实施方案中，带负电荷的部分可以促进配体或激动剂加载到纳米颗粒中用于延长释放、持续释放或随时间释放的递送。在一些实施方案中，带负电荷的部分本身介导配体或激动剂的延长释放、持续释放或随时间释放的递送。优选地，带负电荷的部分基本上不降低配体或激动剂诱导或增强免疫细胞或滑膜细胞中凋亡的能力。

开发了在带正电荷的TRAIL和带负电荷的硫酸软骨素(CS)(CS/TRAIL)之间复合物的形成，并且显示促进TRAIL在聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)微球(MS)中的加载，而不损害TRAIL的活性(Kim,et al.,Journal of Pharmacy and Pharmacology,65(1):11–21(2013)。在pH 5.0下以2TRAIL与CS(TC2)的重量比形成约200nm的纳米复合物，该复合物在通过多乳液方法制备的PLGA MS中比天然TRAIL的复合物具有>95％更高的加载效率。因此，在一些实施方案中，配体或激动剂，特别是TRAIL肽和变体，功能片段及其融合蛋白或其缀合物如PEG-缀合物与硫酸软骨素复合，并任选装载入微米或纳米颗粒，例如基于PLGA的颗粒中。

在其它实施方案中，配体或激动剂，特别是TRAIL肽，及其变体，功能片段和融合蛋白，或其缀合物如PEG-缀合物与透明质酸(HA)复合。通过混合带正电荷的PEG-TRAIL和带负电荷的HA制备的PEG-TRAIL和HA的纳米复合物显示出在体内具有持续的递送，与PEG-TRAIL相比，具有可忽略的生物活性损失(Kim,et al.,Biomaterials,31(34):9057-64(2010))。通过在含有1％HA的溶液中施用纳米颗粒来进一步增强递送。

D.靶向部分

TRAIL缀合物、包含TRAIL缀合物试剂的组合物和用于TRAIL缀合物试剂的递送载体可以包括靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分增加促凋亡剂到目标器官或靶细胞的靶向或累积。

在优选的实施方案中，靶向部分增加肝脏和胰腺中促凋亡剂的靶向或积聚，更优选地增加肝星状细胞和胰星状细胞。用于肝靶向的组合物和方法是本领域已知的，参见例如描述用于靶向肝细胞的组合物和方法的美国公开第2013/0078216号申请和Poelstra,etal.,J.Control Release,161(2):188-97(2012)，其识别每种肝脏疾病的靶细胞并且检查药物递送到这些细胞的策略。蛋白质、病毒、聚合物和脂质体的使用都可用于增强对肝脏或更优选肝星状细胞的靶向。在一些实施方案中，肝靶向分子与促凋亡剂本身融合或缀合，或与包含促凋亡剂的组合物或携带促凋亡剂的递送载体(例如，载体如微粒或纳米颗粒、脂质体等)缀合。

该分子可以靶向在肝脏或胰腺中表达的蛋白质，或优选地在肝星状细胞或胰星状细胞周围的微环境的表面上或其中表达的蛋白质。靶部分可以靶向本领域中使用的蛋白质以识别肝星状细胞或胰星状细胞。优选地，促凋亡剂、其组合物和用于递送它们以治疗肝脏疾病和肝纤维化的媒介是(1)特异性靶向活化的HSC，并且优选地不结合存在于其它组织或静止HSC中的肌成纤维细胞；(2)可以到达具有活性纤维形成的区域；(3)被免疫系统良好耐受并且不被网状内皮系统非特异性摄取。

示例性靶向策略包括与结合至甘露糖-6-磷酸/胰岛素样生长因子II受体的人血清白蛋白(M6P-HAS)偶联的甘露糖-6-磷酸，和偶联至识别胶原VI型受体的HAS的环肽(pCVI-HAS)(Beljaars,Hepatology,29:1486-1493(1999)和Beljaars,et al.,J BiolChem.,275:12743-12751(2000))。这些蛋白质的结构允许另外的化学实体的偶联，这使得抗纤维化剂选择性递送到HSC是可行的。在另一个具体的实施方案中，靶标是络丝蛋白，其为由肝星状细胞表达的大的分泌的细胞外基质糖蛋白，并在组织学上使用以将其与其它肌成纤维细胞区分开。

靶向部分可以是例如与在肝脏中或更优选地在肝细胞表面上或在肝星状细胞周围的微环境中表达的抗原结合的抗体或抗体片段，例如免疫球蛋白(抗体)单可变结构域(dAb)。抗体或其抗原结合片段可用于将缀合物引导至细胞类型或细胞状态。在一个实施方案中，包含配体或激动剂或递送载体的配体或激动剂组合物具有抗体结合结构域，例如来自已知结合抗体的蛋白质，例如来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A和蛋白G。已知结合抗体的其他结构域是本领域已知的，并且可以被取代。抗体结合结构域可以促进靶标抗体与配体或激动剂或包括配体或激动剂或递送载体的组合物的连接。在某些实施方案中，抗体是多克隆的、单克隆的、直链的、人源化的、嵌合的或其片段。代表性抗体片段是结合非病毒载体的抗体结合部分的那些片段，包括本领域已知的Fab、Fab'、F(ab')、Fv双抗体、直链抗体、单链抗体和双特异性抗体。在优选的实施方案中，靶标抗体或其片段对肝星状细胞表面标志物是特异性的，并且如本领域已知的那样被产生以降低对人宿主的潜在免疫原性。例如，可以利用含有完整人免疫球蛋白基因簇的转基因小鼠，其能够产生“人”抗体。在一个实施方案中，使用这种人抗体的片段作为靶向信号。在优选的实施方案中，在原核细胞培养物中制备在人抗体上建模的单链抗体。

E.小分子和肽分子

在一些实施方案中，促凋亡剂是识别TRAIL-R1和/或R2的小分子或肽分子。示例性小分子是本领域已知的，并在Wang,et al.,Nature Chemical Biology,9:84–89(2013)中讨论。该活性最初通过高通量化学筛选用于与Smac的小分子模拟物(凋亡蛋白抑制剂的拮抗剂)组合促进细胞死亡的化合物而发现。结构-活性关系研究产生被称为bioymifi的更有效的类似物，其可以作为单一试剂来诱导DR5聚类和聚集，从而导致凋亡。

一价、二价和三价TRAIL-模拟肽描述于Pavet,et al.,Cancer Research,70:1101-1110,(2010)中。因此，在一些实施方案中，激动性TRAIL受体的配体或激动剂是一种或多种模拟物。

预期其剂量与上述化合物在相同的范围内。

F.配体缀合物

在一个替代实施方案中，生物聚合物或多糖可以与配体或激动剂缀合。例如，如Yang,et al.,Biomaterials,32(33):8722-9(2011)中所述，HA与配体或激动剂缀合。Yang描述了醛改性的HA和IFNα的N-末端基团之间的偶联反应，其可以用于将HA与本文公开的促凋亡剂偶联。IFNα含量可以控制为每个单独的HA链2-9个分子的范围，生物缀合效率高于95％。缀合物在体内表现出改善的活性和半衰期，并通过靶向肝中过表达的CD44即HA受体而增加IFNα向肝脏的递送。HA可以在偶联至促凋亡剂后用作靶向肝脏疾病和活化的HSC的配体(Kim,et al.,ACS Nano,4(6):3005-14(2010))。

在一些实施方案中，促凋亡剂被改性以改善纯化、去除标签、促进小分子连接(attachment)或其组合。串联应用的弹性蛋白样多肽和分选酶A(SrtA)转肽酶提供了用于重组蛋白的无色谱纯化方法和任选的将蛋白质位点特异性缀合到小分子上的方法(Bellucci,et al.,Angewandte Chemie International Edition,52(13):3703–3708(2013))。该系统提供了以高产率和纯度产生生物活性蛋白的有效机制。

其他标签和标记是本领域已知的，并且包括例如SUMO标签，His标签，其通常包括六个或更多个通常是连续的组氨酸残基；FLAG标签，其通常包括序列DYKDDDDK(SEQ ID NO:2)；血凝素(HA)，例如YPYDVP(SEQ ID NO:3)；MYC标签例如ILKKATAYIL(SEQ ID NO:4)或EQKLISEEDL(SEQ ID NO:5)。使用纯化标签以促进蛋白质纯化的方法是本领域已知的，并且包括例如色谱步骤，其中标签可逆地结合层析树脂。

纯化标签可以在融合蛋白的N末端或C末端。可以在体内(例如，在表达期间)或在分离蛋白质后离体从目标多肽分离纯化标签。因此，纯化标签也可用于从表达后的细胞裂解物中除去融合蛋白。

融合蛋白还可以包括表达或溶解性增强的氨基酸序列。示例性表达或溶解性增强的氨基酸序列包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(TRX)、NUSA、泛素(Ub)和小泛素相关改性剂(SUMO)。

在一些实施方案中，融合蛋白包括一个或多个接头或间隔子。在一些实施方案中，接头或间隔子是一个或多个多肽。在一些实施方案中，接头包括甘氨酸-谷氨酸二氨基酸序列。接头可以用于联接或连接融合蛋白的两个结构域、区或序列。

G.制剂

在大多数情况下，TRAIL激动剂全身性递送，最优选通过注射递送，或通过植入物、控释基质或包衣递送。

提供了具有或不具有递送载体的包含活性剂的药物组合物。药物组合物可以通过肠胃外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)，肠内或经粘膜(鼻、阴道、直肠或舌下)给药途径或使用生物可蚀性插入物给药，并且可以以适合于每种给药途径的剂型配制。

在某些实施方案中，组合物局部施用，例如通过直接注射到待治疗的部位(例如，注射至肝脏)。在一些实施方案中，将组合物注射或以其它方式直接施用到预期治疗部位(例如，邻近肝脏)处或附近的血管组织上的脉管系统中。通常，局部施用导致组合物的局部浓度增加，该浓度大于通过全身给药可以获得的浓度。

活性剂及其药物组合物可以通过胃肠外注射以水溶液施用。制剂也可以是悬浮液或乳液的形式。通常，提供包括有效量的活性剂的药物组合物，并且该组合物任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这样的组合物包括稀无菌水、多种缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的缓冲盐水；和任选的添加剂，如去污剂和增溶剂(例如20、80，也称为聚山梨酯20或80)，抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)和防腐剂(例如硫柳汞钠(Thimersol)、苄醇)和填充物质(例如，乳糖、甘露醇)。非水溶剂或载体的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射的有机酯如油酸乙酯。制剂可以在使用前即刻冻干重溶/重悬。制剂可以通过例如通过细菌截留过滤器过滤、通过将灭菌剂并入组合物中、通过照射组合物或通过加热组合物来灭菌。

活性剂可以配制用于肺或粘膜给药，例如用于治疗肺缺血。在一个实施方案中，将化合物配制用于肺部递送，例如鼻内施用或口腔吸入。呼吸道是参与大气和血流之间的气体交换的结构。肺是分支结构，最终以发生气体交换的肺泡结束。肺泡表面积是呼吸系统中最大的，并且是吸收药物的地方。肺泡由没有纤毛或粘液毯的薄的上皮覆盖并分泌表面活性剂磷脂。呼吸道包括上呼吸道，其包括口咽和喉，之后是下呼吸道，其包括气管，随后分叉成支气管和细支气管。上下气道称为导气路。然后终末细支气管分成呼吸细支气管，其之后通向最终的呼吸区、肺泡或深肺。深肺或肺泡是用于全身药物递送的吸入治疗气溶胶的主要目标。

已经观察到包含低分子量药物的治疗组合物的肺部给药，例如治疗哮喘的β-雄激素拮抗剂。在肺中有活性的其它治疗剂已经全身施用并通过肺吸收靶向。鼻递送被认为是用于治疗剂的有前景的给药技术，原因如下：由于许多微绒毛覆盖上皮表面，鼻子具有可用于药物吸收的大表面积，上皮下层高度血管化，来自鼻子的静脉血直接进入全身循环，因此避免了肝脏中首过代谢引起的药物损失，其提供了更低的剂量，更快速地获得了治疗性血液水平，更快的地药理活性，更少的副作用，每cm³高的总血流量，多孔内皮基底膜，并且容易获得。

本文所用的术语气溶胶是指细雾微粒的任何制剂，其可以是溶液或悬浮液，无论是否使用推进剂生产。气溶胶可以使用标准技术生产，例如超声波处理或高压处理。

用于肺部制剂的载体可以分为用于干粉制剂的载体和作为溶液施用的载体。用于将治疗剂递送至呼吸道的气雾剂是本领域已知的。对于经由上呼吸道的施用，可将制剂配制成溶液，例如水或缓冲或未缓冲的等渗盐水、或作为悬浮液，用于作为滴剂或作为喷雾鼻内施用。优选地，这样的溶液或悬浮液相对于鼻分泌物是等渗的，并且具有大约相同的pH，例如从约pH 4.0至约pH 7.4或从pH 6.0至pH 7.0。缓冲剂应当是生理上相容的，并且包括，仅举例来说，磷酸盐缓冲液。例如，代表性的鼻减充血剂被描述为缓冲至约pH6.2。本领域技术人员可以容易地确定用于鼻和/或上呼吸道给药的无害水溶液的合适的盐水含量和pH。

优选地，水溶液是水、含有盐的生理学上可接受的水溶液和/或缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或任何其它可接受的施用于动物或人的水溶液。这样的溶液是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于蒸馏水、去离子水、纯水或超纯水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)。其它合适的水性载体包括但不限于林格氏溶液和等渗氯化钠。水性悬浮液可包括悬浮剂，如纤维素衍生物、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和黄蓍胶，以及润湿剂如卵磷脂。用于水性悬浮液的合适的防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。

在另一个实施方案中，低毒有机(即非水性)3类残留溶剂如乙醇、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚和丙醇的溶剂可用于制剂。基于其容易雾化制剂的能力选择溶剂。溶剂不应与化合物有害地反应。应当使用溶解化合物或形成化合物的悬浮液的合适的溶剂。溶剂应当是足够挥发性的，以能够形成溶液或悬浮液的气溶胶。可以根据需要加入另外的溶剂或雾化剂，例如氟利昂，以增加溶液或悬浮液的挥发性。

在一个实施方案中，组合物可以含有少量的聚合物、表面活性剂或本领域技术人员熟知的其它赋形剂。在该背景中，“少量”是指不存在可能影响或介导化合物在肺中摄取的赋形剂，并且存在的赋形剂以不会不利地影响肺中化合物摄取的量存在。干脂质粉末由于它们的疏水特性可以直接分散在乙醇中。对于存储在有机溶剂如氯仿中的脂质，将所需量的溶液置于小瓶中，并在氮气流下蒸发氯仿，以在玻璃小瓶的表面上形成干燥薄膜。当用乙醇重构时，膜容易膨胀。将悬浮液超声处理以将脂质分子完全分散在有机溶剂中。也可以使用可重复使用的PARI LC Jet+雾化器(PARI Respiratory Equipment，Monterey，CA)在无水乙醇中制备脂质的非水悬浮液。

具有大颗粒尺寸的干粉制剂(“DPF”)具有改善的流动性特征，例如较少的聚集、更容易雾化和潜在较少的吞噬作用。通常产生的用于吸入治疗的干粉气溶胶的平均直径主要在小于5微米的范围内，尽管优选的范围在空气动力学直径上为1和10微米之间。大的“载体”颗粒(不含药物)已与治疗性气溶胶共同递送，以帮助实现有效的雾化以及其它可能的益处。

III.治疗方法

通常通过注射施用组合物，但在一些实施方案中，它们可以局部(如在手术期间)施用或施用至粘膜表面(直肠、阴道、口服或肺部)。这些可以以溶液、植入物或凝胶形式施用，或以干燥形式的干粉或重新溶解或重悬地施用。

下面的实施例说明了活化的细胞，例如肝星状细胞和胰星状细胞，可以被导致TRAIL诱导的细胞凋亡的TRAIL-R1(DR4)和/或TRAIL-R2(DR5)激动剂特异性地靶向和杀灭。重要的是，通过消除这样的活化星状细胞，高度上调的纤维化相关分子在体内模型的纤维化中同时下调。这表明化合物可用于治疗病理状况，其中活化的成纤维细胞、肌成纤维细胞、髓成纤维细胞以及活化的内皮和上皮细胞产生或诱导过量的细胞外基质，导致不希望的纤维化或结疤。结疤形成或纤维化可以在肝脏、胰腺、肺、心脏、肾脏、肠、皮肤或动脉中。

还提供了特异性靶向并减少、抑制和/或从器官去除活化的成纤维细胞、肌成纤维细胞、髓成纤维细胞和产生过量细胞外基质的内皮和上皮细胞的方法。

如下文更详细讨论的，所述方法通常包括向患有纤维化或可能发展为纤维化的个体施用有效量的促凋亡剂以减少纤维化，通常通过诱导或增加有可能遭受纤维化、肝硬化或其并发症例如腹水或疼痛的细胞的细胞凋亡。如本文所使用的，“减少”可以是减小尺寸、刚度(如在结疤组织中)或本领域技术人员所理解的因素的组合。

A.肝病

在一个优选实施方案中，所述组合物和方法用于治疗肝脏疾病。肝纤维化的特征在于过量的细胞外基质产生，主要是I型胶原，其作为对慢性肝损伤的炎症反应。工业化国家中肝纤维化的主要原因包括慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染、酒精滥用和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)(Bataller,et al.,.Clin.Inves.,115(2):209-18(2005))。进行性肝纤维化最终导致肝硬化和脉管系统畸形，进一步导致肝衰竭、门静脉高压(PHT)、肝细胞癌(HCC)和过早死亡。PHT还可以引发进一步的并发症，如胃肠出血、腹水、脑病以及降低的血小板水平或减少的白细胞计数。肝纤维化和肝硬化的治疗可以提供更高的护理标准并减少与纤维化级联直接相关的并发症。在去除肝中的致伤因子后，纤维化级联进展可以减慢或可以消退。直到1985年，鉴定肝星状细胞(HSC)是ECM在肝脏中过表达的主要原因，可以研究其潜在的治疗。

在慢性肝损伤或疾病期间，静止的HSC经历活化并从星形维生素A富集细胞转变为具有纤维发生性质的高度增殖、成肌细胞样维生素A缺陷细胞(Bataller,et al.,.Clin.Inves.,115(2):209-18(2005)；Friedman,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.U S A；82(24):8681-5(1985)；Senoo,Medical electron microscopy:official journal of theClinical Electron Microscopy Society of Japan 37(1):3-15(2004))。活化的HSC表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)并分泌I型胶原(Friedman,et al.,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America；82(24):8681-5(1985)；Rockey,et al.,Journal of submicroscopic cytology and pathology,24(2):193-203(1992)；Ramadori,et al.,Virchows Archiv B,Cell pathology includingmolecular pathology59(6):349-57(1990))。鉴定作为肝损伤中的主要纤维形成细胞类型的先前已知为脂肪细胞、Ito细胞或前窦形细胞的活化的HSC以及涉及该过程的关键细胞因子的识别已经为抗纤维化剂提供了许多策略(Bataller,et al.,.Clin.Invest.,115(2):209-18(2005))。

已经尝试了多种疗法以减少活化的HSC的积累以防止过量的ECM，其已经被证明在实验模型中是有效的(Wynn,et al.,Nature medicine,18(7):1028-40(2012)；Cohen,etal.,Ther.adv.gastroent.,4(6):391-417(2011)；Kisseleva,et al.,Best practice&research Clinical gastroenterology,25(2):305-17(2011))。例如，肾素血管紧张素系统阻滞剂和抗氧化剂可以减少结疤组织的积累，但是仅在实验模型中显示功效。目前有许多建议的治疗肝纤维化和肝硬化的策略(表1来自Friedman，In：Bruce A Runyon ACT，ed.UpToDatecom，(2011))。靶向活化的HSC或其活化、增殖和功能是重要的抗纤维化策略(Friedman,In:Bruce A Runyon ACT,ed.UpToDatecom,(2011)；Breitkopf,et al.,Clinical and Experimental Research,29:121S-31S(2005)；Kisseleva,et al.,Journalof Gastroenterology and Hepatology,21:S84-S87(2006))。HSC逆转已经显示在许多形式的肝细胞损伤的动物模型中促进纤维化消退(Kisseleva,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,109(24):9448-53(2012)；Troeger,et al.,Gastroenterology,143(4):1073-83(2012))。然而，即使HSC激活和纤维形成终止，逆转的HSC对复发性纤维形成刺激具有更高的反应性，表明这些HSC不完全逆转到静止状态(Troeger,et al.,Gastroenterology,143(4):1073-83(2012))。另一种提出的方式是消除激活的HSC，其促进凋亡而不是逆转(Bataller，et al。，Semin Liver Dis，21(03)：437-52(2001)；Friedman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，109(24)：9230-1(2012))。

这在大鼠肝纤维化的自发恢复模型中进一步验证，其中活化的HSC的凋亡对于纤维化的消退是至关重要的(Iredale,et al.,J Clin Invest,102(3):538-49(1998))。该模型中的活化HSC显示负责产生纤维化基质以及通过产生金属蛋白酶(TIMP)的组织抑制剂来保护基质免于降解。然而，重要的是，文献报道了不存在促进肝星形细胞中特异性凋亡的治疗方法，例如本文公开的方法。

B.治疗肝病的方法

治疗方法通常包括向有需要的个体施用有效量的促凋亡剂，例如激动性TRAIL受体的一种或多种配体或激动剂，以诱导或增加一种或多种靶细胞类型的凋亡，所述靶细胞类型诸如肝星状细胞、肌成纤维细胞、髓成纤维细胞、活化的内皮细胞或活化的上皮细胞，其产生或诱导过量的细胞外基质，导致个体中肝的不希望的结疤形成。在优选的实施方案中，靶细胞是肝星状细胞。

通常，促凋亡剂以有效量施用于个体以增加一种或多种靶细胞类型的凋亡。优选地，凋亡水平有效降低或抑制肝脏疾病或其一种或多种症状的发作或进展。例如，在一些实施方案中，促凋亡剂以有效量施用以减少纤维化或增加纤维化消退，减少结疤组织的积累，减少纤维化级联进展，减少细胞外基质的积累，减少肝硬化或其组合。

可以使用多种技术在个体中评估肝星状细胞凋亡和肝纤维化的消退。也可以看到个体患有的肝脏疾病的总体改善。可以评估个体的状况和个体的肝功能，以监测与肝脏疾病，特别是与肝纤维化相关的一种或多种症状的严重性或完全消失的任何减轻。例如，可以评估黄疸、液体潴留、瘀伤的容易性、鼻出血的频率、皮肤或指甲的状况是否有任何变化。个体的一般健康可以改善，并且可以将其评估为恢复的指标。个体可以显示出食欲增加，恶心、重量增加和/或强度和能量的一般感觉的发生率或严重性的降低。个体还可以降低住院或需要其他医疗关注的发生率。

可以改善或增加个体的肝功能。肝功能可以稳定。这可以以多种方式评估。可以取肝活检或血液样品，并且可以测定肝功能的标志物。可以研究的肝功能标志物包括透明质酸、前胶原IIIN肽、前胶原IC肽、Undulin-胶原16、7S IV型胶原、MMP-2和TIMP-1水平。

个体的肝脏可以显示出减少的结节、坏死、炎症或其组合。特别地，个体的肝脏可以显示其肝脏中纤维化的量的减少或稳定。可以减少肝脏中纤维化材料的存在，并且这可以通过使用染色剂例如天狼星红对来自肝活检的切片染色来确定。可以确定特定纤维化细胞外基质组分例如胶原，特别是胶原I和III的存在和量。还可以进行生物化学分析以确定个体中TIMP和/或MMP的水平和TIMP表达的减少。

肝脏中肝星状细胞的凋亡也可以从肝脏活检确定。可以测量肝星状细胞凋亡频率的任何变化，特别是任何增加。凋亡细胞可以使用多种公知的方法鉴定。可以使用技术如TUNEL染色(末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口标记)来鉴定凋亡细胞。TUNEL染色是特别有用的，因为其可以用于原位鉴定凋亡细胞。通过共染色，可以检查经历凋亡的细胞是肝星状细胞，例如通过染色α-平滑肌肌动蛋白表达细胞进行。

可以使用用于鉴定和/或定量凋亡的其他公知技术，例如，膜联蛋白V染色、针对单链DNA的抗体、半胱天冬酶底物测定、连接介导的PCR和细胞膜通透性染色。可以通过凝胶电泳分析DNA片段化。染色也可以用于确定与细胞凋亡相关的形态特征，例如膜起泡和细胞核的分解。吖啶橙染色可用于鉴定凋亡细胞。可以用碘化丙啶对细胞染色以分析DNA含量。可以使用诸如台盼蓝染色的测试来检查膜细胞是完整的，并且它们是凋亡的而不是坏死的。

可以将促凋亡剂的施用效果与对照进行比较。合适的对照是本领域已知的，包括例如匹配的未治疗个体或施用不诱导或增加靶细胞凋亡的治疗剂的匹配个体。

组合物可以局部或全身施用，如上所述。在具体的实施方案中，通过经皮注射到肝中将组合物施用于个体。注射可以进入和/或邻近肝中的纤维化或结疤形成部位、过度细胞外基质蓄积的部位、活化或增殖的HSC的部位，或患病的肝的另一生物化学、组织学或形态学标志物的部位。如下文更详细讨论的，组合物可以单独给药或与其它活性剂组合给药。

IV.组合疗法

本文公开的一种或多种促凋亡剂及其组合物可以单独或与一种或多种另外的活性剂组合施用于有需要的个体。在一些实施方案中，第二活性剂是本领域已知的用于治疗纤维化疾病，特别是肝纤维化疾病的药剂。在一些实施方案中，第二活性剂是调节肝星状细胞的活性剂，例如减少肝星状细胞增殖、减少肝星状细胞活化或活性、增加星状细胞凋亡、减少细胞外基质或其组分特别是胶原的沉积，增加细胞外基质或其组分特别是胶原的降解的试剂或其任何组合。在一些实施方案中，第二活性剂增加细胞对配体或激动剂的功效、增强其效果或以其它方式改善细胞的对配体或激动剂的性能或敏感性。

在一些实施方案中，第二活性剂与肝星状细胞的调节无关。例如，在一些实施方案中，第二药剂减少肝脏炎症。在一些实施方案中，第二活性剂可以是治疗或减少肝纤维化的一种或多种症状而不影响肝星状细胞的增殖、活性、活化或凋亡的药剂。

示例性的另外的治疗剂包括但不限于甘草甜素、卤夫酮、肝细胞生长因子(HGF)、HOE 077、干扰素-α、干扰素-γ、白细胞介素-10、马洛替酯、己酮可可碱、磷脂酰胆碱、S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAMe)、饱和脂肪酸、小柴胡汤(Sho-saiko-to)、Sylimarin、转化生长因子β(TGF-β)抑制剂、TNP470、生育酚、曲古抑菌素A和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)(Bataller,et al.,Semin Liver Dis.,21(3)(2001)。

A.第二活性剂

1.抗氧化剂

第二活性剂或后续活性剂可以是抗氧化剂。示例性抗氧化剂包括但不限于维生素E(α-生育酚)、水飞蓟素(从水飞蓟(Silybum marianum)中提取的类黄酮抗氧化剂)，磷脂酰胆碱(PPC)、S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAMe)、类视黄醇(棕榈酸视黄酯)和天然酚类化合物(白藜芦醇和槲皮素)。

2.抑制HSC迁移或与周围细胞外基质的相互作用的药剂

在一些实施方案中，第二活性剂或后续活性剂是减少或抑制肝星状细胞的迁移或细胞与其微环境(例如周围或下面的细胞外基质)之间的相互作用的试剂。用血小板衍生生长因子(PDGF)-BB、转化生长因子(TGF)-β1和/或上皮生长因子(EGF)刺激HSC增加迁移能力和上调基质金属蛋白酶(MMP)-2活性(Yang,et al.,Gastroenterology,124(1):147-59(2003))。由PDGF-BB诱导的迁移被认为与增加的增殖相关，而TGF-β1/EGF诱导的迁移似乎是增殖无关的。Yang等人(同上)还报道了COL-3(MMP-2和MMP-9的抑制剂)抑制由PDGF-BB或TGF-β1的直接活化诱导的HSC的迁移，但对通过没有直接接触的趋化刺激的迁移诱导没有影响，显示出PDGF-BB或TGF-β1诱导的迁移的两种不同的MMP依赖性和MMP非依赖性机制。

因此，在一些实施方案中，第二活性剂是减少或抑制PDGF-BB-诱导的迁、TGF-β1诱导的迁移或其组合的药剂。示例性的抑制剂是COL-3，其是临床试验的主题。1期试验包括将从36mg/m²/d逐步增加的剂量的COL-3施用于个体，发现最大耐受剂量为98mg/m²/d，并且在70mg/m²/d时耐受性良好。

PDGF-BB、TGF-β1和胶原I诱导的迁移也可以被α(1)和/或α(2)-整联蛋白阻断抗体和竞争性RGD拮抗剂抑制，并且研究表明，姜黄素通过减少MMP-2的表达和活性来抑制活化的HSC的迁移和侵袭(Huang,et al.,Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,17(11):835-8(2009)。其他证据表明干扰素α和干扰素γ也可以抑制HSC，或增加其凋亡(Weng,et al.,JHepatol.,59(4):738-45(2013)和(Glassner,et al.,Lab Invest.,92(7):967-77(2012))。

3.抑制肝脏炎症的药剂

在一些实施方案中，第二活性剂或后续活性剂是减少或抑制肝脏炎症的药剂。示例性抗炎剂包括但不限于皮质类固醇、秋水仙碱和马洛替酯。

在一些实施方案中，第二活性剂或后续活性剂是降低或抑制促炎因子或细胞因子的活性的试剂。例如，所述试剂可以是白细胞介素-1受体拮抗剂，或可溶性肿瘤坏死因子-α(TNF-α)受体，其可以减少肝组织中的坏死和炎症。另外，已显示IL-10下调促炎Th1应答。用重组白细胞介素-10治疗的慢性HCV感染的患者不仅显示出肝脏炎症的改善，而且显示出纤维性结疤的初始沉积的消退(Louis,et al.,Hepatology,28:1607-1615(1998))。

4.抑制TGF-β活性的药剂

在一些实施方案中，第二活性剂抑制TGF-β活性。用于防止TGF-β与其受体结合的方法包括使用显性阴性II型TGF-β受体，与人IgG的Fc部分融合的II型受体的胞外结构域的表达，截短的II型受体的表达，以及可溶性II型受体的构建。HGF作为重组蛋白或通过基因治疗在不同实验模型中也有效预防肝纤维化的进展，并且可用于调节HSC增殖、胶原形成和TGF-b表达，而没有潜在的缺点和延长的全身或总体抑制TGF-β的危险。

在一些实施方案中，第二活性剂是微RNA或其模拟物。miR-17-92簇(19a,19b,92a)的成员在活化的HSC中显著下调(Lakner,et al.,Hepatology,56(1):300-10(2012))。特别地，miR19b模拟TGF-β信号转导组分的负调节已经通过减少的TGF-β受体II(TGF-βRII)和SMAD3表达、miR19b与TGF-βRII的3'非翻译区的结合、TGF-β信号转导的抑制，降低的I型胶原的表达并阻断TGF-β诱导的α1(I)和α2(I)前胶原mRNA的表达来证明。miR19b还通过形态学评估钝化了活化的HSC表型，并降低了平滑肌α-肌动蛋白表达。因此，在优选的实施方案中，微RNA是miR19b或其模拟物。

5.化疗剂

已经研究了激动性TRAIL受体的配体，其单独和与常规癌症治疗例如化疗剂组合用于治疗癌症。一些报道表明化疗药物可以使细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感，一些结果表明，两种试剂的组合比在单独使用试剂时的作用总和更有效(Cuello,et al.,GynecolOncol.,81(3):380-90(2001)Wu,et al.,Vitam Horm.,67:365-83(2004))。因此，在一些实施方案中，本文公开的个体和疾病用激动性TRAIL受体的配体或激动剂和化疗剂的组合治疗。在一些实施方案中，个体不患有癌症。

示例性化疗药物包括但不限于多柔比星、5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、紫杉醇及其衍生物、伊立替康、托泊替康、安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐、替尼泊苷、表鬼臼毒素、曲妥珠单抗西妥昔单抗和利妥昔单抗(或)或贝伐单抗及其组合。

B.组合治疗的剂量和治疗方案

本文公开的治疗方法通常包括治疗疾病或其症状，或用于实现期望的生理变化的方法，包括向动物例如哺乳动物，特别是人施用有效量的促细胞凋亡药剂以治疗肝脏疾病或其症状，或产生生理变化。在一些实施方案中，促凋亡剂与另外的活性剂组合。促凋亡剂和另外的活性剂可以一起施用，例如作为同一组合物的一部分，或者在同一时间或在不同时间单独和独立施用(即施用配体或激动剂和第二活性剂彼此间隔有限的时间段)。因此，术语“组合”或“组合的”用于指伴随、同时或贯序施用配体或激动剂和第二活性剂。所述组合可以同时(例如作为混合物)，单独但同时(例如，通过分开的静脉内线路进入同一个体；一种试剂口服，而另一种试剂通过输注或注射等给予)或贯序地(例如，先给予一种试剂，然后给予第二试剂)。

在优选的实施方案中，与第二活性剂组合施用促凋亡剂可实现比当单独或分离施用促凋亡剂和第二活性剂时更佳的结果(即，通过组合实现的结果是多于仅单独的组分所获得的结果的加和)。在一些实施方案中，组合使用的一种或两种药剂的有效量低于单独给药时每种药剂的有效量。在一些实施方案中，当用于组合治疗中时，一种或两种药剂的量在单独使用时是亚治疗的。

组合治疗的治疗方案可以包括配体或激动剂的一次或多次施用。组合治疗的治疗方案可以包括一次或多次施用第二活性剂。

在一些实施方案中，在第一次施用第二活性剂之前施用促凋亡剂。在其它实施方案中，在第一次施用第二活性剂之后施用配体或激动剂。

配体或激动剂可以在施用第二活性剂之前或之后至少1、2、3、5、10、15、20、24或30小时或天施用。

药剂的剂量方案或周期可以是完全或部分重叠，或可以是顺序的。例如，在一些实施方案中，促凋亡剂的所有这样的施用发生在施用第二活性剂之前或之后。或者，施用一个或多个剂量的促凋亡剂可以与施用第二治疗剂在时间上交错，以形成均一或非均一的治疗过程，由此施用一个或多个剂量的促凋亡剂，随后施用一个或多个剂量的第二活性剂，然后施用一个或多个剂量的细胞凋亡剂；或一个或多个剂量的第二活性剂，然后是一个或多个剂量的促凋亡剂，随后是一个或多个剂量的第二活性剂等，所有这些都根据施用治疗的研究者或临床医生选择或期望的任何时间表。

每种试剂的有效量可以作为单一单位剂量(例如，作为剂量单位)或在有限时间间隔内施用的亚治疗剂量施用。这样的单位剂量可以以每天基础施用有限的时间段，例如长达3天，或长达5天，或长达7天，或长达10天，或长达15天或长达20天或最多25天。

V.试剂盒

还公开了医疗试剂盒。医疗试剂盒可以包括例如单独的或与第二治疗剂组合的促凋亡剂，优选激动性TRAIL受体的配体或激动剂的剂量供应。当与第二治疗剂组合时，活性剂可以单独(例如，冻干)或在药物组合物(例如混合物)中提供。活性剂可以是单位剂量，或在应在给药前稀释的储备液中。在一些实施方案中，试剂盒包括药学上可接受的载体的供应。试剂盒还可以包括用于施用活性剂或组合物的装置，例如注射器。试剂盒可包括用于以如上所述的用途中施用化合物的印刷说明书。

通过参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明。

实施例1：通过活化的人原代肝脏星状细胞(HSC)和胰腺星状细胞(PSC)表达TRAIL-R1/DR4和TRAIL-R2/DR5

材料和方法

人原代肝脏星状细胞

人原代HSC、PSC和星状细胞培养基(SteCM)获自ScienCell ResearchLaboratories(Carlsbad,CA)。在聚赖氨酸包被的平板中，在补充有2％的FBS、1％的星状细胞生长添加物(stellate cell growth supplement)和1％的青霉素/链霉素溶液的SteCM培养基中培养细胞。然后，为了活化原代星状细胞，将细胞在6孔塑料培养平板中培养1、4、7和14天，收集细胞。通过蛋白质印迹分析和实时PCR测定所培养的星形细胞中DR-4、DR-5和α-SMA的表达。

比较定量实时RT-PCR

用TRIzol试剂(Life Technologies,Grand Island,NY)提取培养细胞的总RNA，使用反转录系统(Reverse Transcription System)(Life Technologies,Grand Island,NY)反转录成cDNA。根据制造商的说明书，使用SYBR Green Master Mix(Life Technologies,Grand Island,NY)用StepOnePlus Real-Time PCR System(Life Technologies,GrandIsland,NY)对每个样品一式两份地进行比较定量实时PCR。将靶基因的表达水平归一化为GAPDH的表达，并基于比较循环阈值Ct法(2^-ΔΔCt)计算靶基因的表达水平。1型胶原和α-SMA、TGF-β、Timp-1、TRAILR1/DR-4以及TRAILR2/DR-5引物用于PCR。

蛋白质印迹分析

将培养的细胞用冰冷的PBS洗涤三次并在含有蛋白酶抑制剂的冷裂解缓冲液(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)中收集。然后，将细胞超声并离心，测量上清液的蛋白浓度。α-SMA抗体(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)、TGF-β抗体(Cell signaling,Beverly,MA)、DR-4抗体(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)和DR-5抗体(Abcam,Cambridge,MA)用于活化的星形细胞和肝纤维化的标志物。切割的PARP-1(Cellsignaling)的抗体用作细胞凋亡的标志物。抗-β-肌动蛋白的抗体(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)用于蛋白加载对照。

结果

从铺板(plating)开始，人原代HSC和PSC逐渐活化并逐步表达DR4和DR5。为了确认TRAIL-R1/DR4和TRAIL-R2/DR5的基因表达，在培养的细胞中进行实时PCR。随着HSC和PSC的活化，DR4和DR5的基因表达逐渐增加。使用实时PCR评估mRNA表达。基于实时PCR分析，α-SMA(星形细胞活化的标志物)；1型胶原；TGF-β和MMP-2、MMP-9、MMP-13；以及Timp-1在早期活化(第4天)的星形细胞和完全活化(第7天和第14天)的星形细胞中上调，却在细胞休眠期(quiescence stage)期间检测不到。在高度活化的星形细胞中还诱导了通过蛋白质印迹分析确认的TRAIL-R1/DR4和R2/DR5的蛋白质水平，在休眠细胞中却没有。类似地，在第0天，αSMA(α-SMA)在培养的细胞中检测不到，但在第4天和第7天，在培养的细胞中明显增多。在第0天、第4天和第7天，β-肌动蛋白同等程度地存在。确认了HSC活化期间，DR5和α-SMA的表达(未示出数据)。该结果表明HSC和PSC在活化期间起始表达死亡受体或者过表达已有的死亡受体。

实施例2：活化的人原代HSC和PSC显示出对TRAIL激动剂诱导的细胞调亡的增强的敏感性。

材料和方法

细胞凋亡的免疫荧光染色

将细胞铺板在35mm培养皿(MatTek公司,Ashland,MA)中的玻璃盖玻片上，生长1、4、7和14天。然后，在这些天用或不用含有1微克/ml(μg/ml)TRAIL的TRAIL激动剂、PEGTRAIL或50ng/ml的DR5抗体(R&D systems,Minneapolis,MN)处理3小时。将细胞用冷PBS洗涤两次，在4％多聚甲醛的PBS中固定10分钟。为了检测细胞凋亡，根据制造商的说明书使用TdTIn Situ Apoptosis Detection Kit(TUNEL)-Fluorescein(R&D systems,Gaithersburg,MD)。简言之，将细胞用蛋白酶K在室温下孵育15分钟，然后用DW洗涤两次，用TdT标记缓冲液浸没，然后用TdT标记反应混合物在37℃下孵育1小时。接着，将细胞用TdT终止缓冲液处理以终止标记反应，用DW洗涤两次。最后，加入Step-Fluor溶液，将细胞在室温下孵育20分钟，用PBS洗涤两次。将含有DAPI的荧光计数培养基(Fluorescence Mounting Medium)(VectorLaboratories,Burlingame,CA)用于样品。在荧光显微镜下使用495nm滤光器观察样品的细胞凋亡，使用358nm滤光器观察样品的DAPI。

蛋白质印迹分析

将培养的细胞用冰冷的PBS洗涤三次，在含有蛋白酶抑制剂的冷裂解缓冲液(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)中收集。然后，将细胞超声并离心，测量上清液的蛋白浓度。将抗切割的PARP-1的抗体(Cell signaling)用作细胞凋亡的标志物。抗-β-肌动蛋白的抗体(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)用于蛋白加载对照。

细胞活力(MTT测定)

将HSC和PSC铺板于48孔平底平板中，培养1、4、7和14天。在第1天、第4天、第7天和第14天，在37℃下用TRAIL、PEG-TRAIL和TRAIL激动性抗体、抗DR5的抗体孵育细胞3小时。在指定的时间，向每个孔加入终浓度为5μg/ml的MTT溶液，孵育1小时。在除去培养基后，向每个孔加入200ml的DMSO以溶解甲臜晶体。使用酶标仪(Bio-Tek Instruments,Inc,Winooski,VT)测定590nm处的吸光度。对于每个条件，测定三个重复孔。

结果

活化的人原代HSC和PSC显示出对TRAIL诱导的细胞凋亡的增强的敏感性。HSC和PSC分别在培养基中培养1、4、7和14天后，用TRAIL、PEG-TRAIL和TRAIL激动性抗体、抗DR5的抗体孵育3小时。在7天和14天后在用TRAIL处理的细胞中通过用明视野显微镜(Nikonmetrology,Brighton,MI)直接对细胞培养物平板照相观察到的TUNEL荧光与对照细胞以及凋亡细胞相比有所增加，表明高度活化的HSC和PSC(在第7天和第14天)比活化程度差的HSC和PSC(在第1天和第4天)更易感。此外，通过蛋白质印迹分析确认切割的PARP-1(细胞凋亡标志物)的蛋白质水平。当在第7天和第14天在活化的HSC和PSC中用TRAIL激动剂处理时，观察切割的PARP-1(细胞凋亡标志物)的水平作为活化星形细胞中TRAIL诱导的细胞凋亡的证据。

为了定量分析活化的HSC和PSC对TRAIL激动剂的TRAIL敏感性，将TRAIL敏感性以诱导的细胞死亡(％)表示，作为相对于未经处理的细胞的百分比计算，在3小时孵育后通过MTT测定测量。TRAIL、PEG-TRAIL和TRAIL激动性抗体在第7天和第14天(在实施例1中示出在这些时间点高度活化)的活化HSC和PSC中诱导强的TRAIL介导的细胞凋亡。在HSC中，当在活化的第7天和第14天用TRAIL激动剂处理时，与第1天处理的细胞的细胞死亡相比，TRAIL、PEG-TRAIL和抗DR5的抗体诱导的细胞死亡增加4.5倍、4.1倍和4.4倍以及7.5倍、6.2倍和5.2倍(图1)。类似地，在PSC中，从第1天至第14天，TRAIL、PEG-TRAIL和抗DR5的抗体诱导增加5.5倍、4.7倍、5倍的细胞死亡。这些结果清楚地表明，可特异性地靶向活化的HSC和PSC(纤维化肝脏和胰腺疾病的起因)并通过用TRAIL激动剂处理它们来将它们除去。

实施例3：TRAIL处理预防肝脏纤维化。

材料和方法

在大鼠中通过CC1₄诱导的肝脏纤维化(组1)

将6-8周龄的SD大鼠(Hanlim Experimental Animal Laboratory,Seoul,Korea)分成3组(每组8-10只大鼠)；i)载体(橄榄油)，ii)在橄榄油中的20％CCl₄和iii)在橄榄油中的CCl₄以及TRAIL(组1，图2)。每周三次通过腹膜内注射向大鼠施用CCl₄(在橄榄油中的20％CCl₄，2ml/kg)或施用橄榄油作为对照，持续4周，同时用每3天以4mg/kg静脉内施用的TRAIL处理或对于对照组(组1，图2)用相同量的盐水处理。

肝脏纤维化的肝脏组织学和免疫组织化学

处理后，将动物处死，收集的肝脏组织固定于10％缓冲甲醛中，石蜡包埋，切成4μm厚的切片。然后，将切片用苏木精和伊红(H&E)染色。为了检测活化的HSC，用α-SMA(DakoCytomation,Carpinteria,CA)进行免疫组织化学。免疫组织化学的所有步骤使用Histostain-Plus Kit(Life Technology)。简言之，将肝脏切片脱蜡，水化、在3％过氧化氢溶液中淬灭，在玻片上洗涤。向玻片施用封闭液，随后施用第一α-SMA抗体和生物素化的第二抗体接着是酶缀合试剂。通过色原/底物试剂盒(Vector Laboratories,Burlingame,CA)用3,3’二氨基联苯胺(DAB)使肝脏切片玻片显色。为了检测胶原沉积，将肝脏切片用天狼星红染色溶液(Sigma,St.Louis,MO)染色，在5％醋酸水中洗涤。在光学显微镜下(OlympusAmerica)使染色的肝脏组织可见。

纤维化肝脏中HSC细胞调亡的免疫荧光分析

将肝脏切片用第一抗体(α-SMA抗体(Dakocytomation)和半胱天冬酶-3(caspase-3)(Cell signaling))抗体和第二抗体(抗-小鼠Alexa Fluor 488和抗-兔Alexa Fluor546)免疫染色，用含DAPI的荧光计数培养基(Vector Laboratories,Burlingame,CA)计数。在荧光显微镜下观察切片并记录图像。

结果

来自对照、CCl₄、CCl₄以及TRAIL的肝脏组织的H&E、α-SMA免疫组织化学分析和天狼星红染色(胶原沉积标志物)表明，TRAIL处理明显预防并抑制肝脏纤维化。来自在无TRAIL的情况下用CC1₄处理的大鼠的肝脏组织显示出强的α-SMA信号和天狼星红，这指示了肝脏中纤维化的信号。相比之下，用CC1₄和TRAIL同时处理的大鼠表现出明显减少的纤维化，其通过肝脏中减少的α-SMA和胶原来证实(未示出数据)。该结果表明，TRAIL激动剂如TRAIL在体内有效地预防肝脏纤维化的诱导。

为了确认这样预防效应是否是由活化的HSC中TRAIL诱导的细胞凋亡所诱导的，对来自CCl₄和盐水处理组、CCl₄和TRAIL处理组和对照组处理的大鼠的肝脏组织中的α-SMA、半胱天冬酶-3(细胞调亡标志物)和DAPI(细胞核)进行免疫荧光分析。在CC1₄和盐水处理组以及CC1₄和TRAIL处理组中均检测到α-SMA(Alexa Fluor 488，绿色)，而在TRAIL处理的正常肝脏组织和CCl₄处理的纤维化肝脏组织中没有检测到半胱天冬酶-3(Alexa Fluor 546，红色)。相比之下，当在纤维化肝脏组织中用TRAIL处理时，观察到来自半胱天冬酶-3的强细胞凋亡信号。尤其地，表达的与α-SMA(活化HSC标志物)共定位的半胱天冬酶-3证实了TRAIL特异性诱导活化HSC中的细胞凋亡。

实施例4：聚乙二醇化TRAIL逆转肝纤维化的处理

材料和方法

大鼠中由CCI₄诱导的肝纤维化(组2)

将6-8周龄SD大鼠(Hanlim实验用动物实验室)分成3组(每组8-10只大鼠)；i)媒介物(橄榄油)，ii)20％CCl₄的橄榄油和iii)CCl₄的橄榄油和PEG-TRAIL。通过腹腔内注射每周三次向大鼠施用CCl₄(2ml/kg)或施用橄榄油作为对照组，持续4周。在诱导肝纤维化总共4周后，将大鼠用4mg/kg的静脉内施用的PEG-TRAIL每隔一天进行处理，持续2周，同时继续CCl₄或橄榄油注射(组2，图2)。

蛋白质印迹分析

将快速冷冻的肝组织仍然在液氮温度下的同时置于瓷研钵中并杵磨和研磨成细粉。然后将细粉末在冰冷的PBS缓冲液(1mM的PMSF，以及抑肽酶、亮抑蛋白酶肽和胃酶抑素A各1μg/ml)中短暂地用超声处理溶解。通过在4℃下以14,000rpm离心来澄清细胞裂解物。通过Bradford溶液(Bio-Rad,Hercules,CA)测量蛋白质的浓度。通过SDS-PAGE分辨相同量的蛋白质，并使用半干印迹仪(Bio-Rad)将凝胶上的蛋白质转移到硝化纤维素(Bio-Rad,Hercules,CA)。在TBST(10mM的Tris-Cl，pH8.0，150mM的NaCl，0.5％Tween-20)中用3％BSA封闭膜，并在4℃下用一抗孵育过夜。将抗DR4(Abcam,Cambridge,MA)、抗DR5(Abcam)、抗半胱天冬酶-8(Cell Signaling Technology,Danvers,MA)、抗切割的PARP-1(CellSignaling Technology)、抗切割的半胱天冬酶-3(Cell Signaling Technology)、抗切割半胱天冬酶-9(Cell Signaling Technology)、抗αSMA(Sigma)、抗MMP-2(Santa CruzBiotechnology)、抗胶原蛋白1(Cell Signaling Technology)、抗TGF-β(Abcam)、抗TIMP-1(Millipore,Billerica,Ma)、抗PDGFR-β(Santa Cruz Biotechnology)、抗GAPDH(SantaCruz Biotechnology)和抗β-肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology)用于蛋白印迹分析。通过增强的化学发光法显现免疫印迹。

实时PCR定量(qPCR)

来自培养细胞和大鼠肝组织的总RNA按照公司提供的说明用TRIzol试剂(LifeTechnologies,Grand Island,NY)提取。使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)通过分光光度法测量RNA浓度。使用High-Capacity cDNA ReverseTranscription System(Life Technologies)将1-2μg的总RNA逆转录为cDNA。使用快速SYBR Green Master Mix(Life Technologies)和StepOnePlus Real-Time PCR System(Life Technologies)对每个样品进行两次或三次重复的qPCR。靶基因的表达水平标准化为GAPDH的表达并基于比较循环阈值的Ct方法(2^-ΔΔCt)来计算。使用RT2qPCR引物组(Qiagen,Valencia,CA)进行大鼠肝样品的qPCR；Col1a2(PPR56530A)，Acta2(PPR59337B)，Mmp3(PPR48487B)，Col3a1(PPR43017A)，Mmp9(PPR44728C)，Mmp13(PPR45162A)，Timp1(PPR48051C)，Timp3(PPR06533A)，Gapdh(PPR06557B)，Tgfb1(PPR06430B)，Tgfb3(PPR06467C)，Tgfbr2(PPR06488E)和Bmp7(PPR46571A)(RT2qPCR Primer Assay,SABiosciences,Quiagen)。

其他生物标志物分析

羟脯氨酸，肝脏中胶原沉积的制造者，使用肝组织的测定通过羟脯氨酸测定试剂盒(Sigma，MAK008-1KT)根据制造商的说明书测量。通过心脏穿刺收集大鼠血液，置于室温下2小时，并以3000rpm离心20分钟。在血清中分析的常规肝功能测试包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白、白蛋白、碱性磷酸酶(ALP)总胆红素和直接胆红素。

肝脏组织学和肝纤维化的免疫组织化学

将肝组织固定在10％福尔马林缓冲液中，嵌入在石蜡中，切成4μm厚的切片。然后将切片用苏木精和曙红(H&E)和免疫组织化学染色。进行的免疫组织化学染色包括用于检测HSCs激活的α-SMA(DakoCytomation,Carpinteria,CA)和用于检测胶原沉积的Sirius红染色。染色的肝组织在光学显微镜(Olympus America)下成像，并且使用ImageJ软件(NIH)在每个样品的20个区域中定量α-SMA或Sirius红色阳性区域。为了检测细胞凋亡，对如上所述的肝切片根据制造商的说明使用TUNEL-Fluorescein(R&D systems,Gaithersburg,MD)。

结果

蛋白质印迹分析显示，在CCl₄处理和CCl₄联合PEG-TRAIL处理组中TRAIL-R(大鼠中的TRAIL受体)上调，然而，与CCl₄和对照组相比，纤维化标记物、PAI-1和α-SMA(α-SMA)的表达在PEG-TRAIL组中显著降低(图3)。α-SMA和Sirius红的免疫组织化学分析证明，与不含PEG-TRAIL的CCl₄处理的大鼠相比，用PEG-TRAIL处理的大鼠显示出纤维化的显著减少(p<0.05)。分析的图像被量化为每个区域的阳性面积(％)(图4A和4B)。为了验证减少的α-SMA(α-SMA)和胶原是否归因于活化的HSC中的TRAIL诱导的细胞凋亡，通过TUNEL测定法分析肝组织。仅在CCl₄和PEG-TRAIL组合组中强烈检测到TUNEL阳性细胞，但在其他对照组、橄榄油组、盐水组和CCl₄处理组中未检测到。从用PEG-TRAIL处理的肝组织获得的mRNA的qPCR中揭示了与活化的HSCs包括TRAIL-R、α-SMA、胶原1、胶原3、TGF-β1、MMP-2、MMP-3、PDGFR、TIMP-1、TIMP-3和BMP-7相关的多个高度上调的纤维化相关基因的明显减少(相对于非PEG-TRAIL-处理的CCl₄组，p<0.05)。蛋白印迹分析证实这些基因在PEG-TRAIL处理组中的蛋白水平的表达水平降低。

此外，PEG-TRAIL处理组的羟脯氨酸水平低于未处理组，这些结果与肝重量-体重(LW/BW)比、碱性磷酸酶和总胆红素的较低水平一致(相对于非PEG-TRAIL处理的CCl₄组，p<0.05)。总的来说，这些体内结果清楚地表明，肝纤维发生可以通过消除激活的HSCs以及同时通过用TRAIL及其激动剂处理纤维化肝来减少多种纤维化相关分子来逆转和/或抑制。

实施例5：聚乙二醇化TRAIL的处理改善肝硬化并减少腹水发病率和体积。

材料和方法

大鼠中由CCl₄诱导的肝硬化(组3)

将6-8周龄SD大鼠(Hanlim实验用动物实验室)分为3组(每组8-10只大鼠)；i)媒介物(橄榄油)，ii)20％CCl₄的橄榄油和iii)CCl₄的橄榄油和PEG-TRAIL。首先通过腹腔内注射每周三次向大鼠施用CCl₄(2ml/kg)或施用橄榄油作为对照组，持续8周。在8周时间点，用4mg/kg的静脉内施用的PEG-TRAIL每隔一天处理大鼠，持续2周，或用相同量的盐水处理连同CCl₄或橄榄油处理作为对照组(组3，图2)。

蛋白质印迹分析和qPCR

如上所述，通过蛋白质印迹和qPCR分析在蛋白质和mRNA水平上分离的肝组织中以上所列的TRAIL-R、α-SMA和纤维化相关分子的调节模式。

肝脏组织学和肝纤维化的免疫组织化学

将肝组织固定在10％福尔马林缓冲液中，嵌入在石蜡中，切成4μm厚的切片。然后将切片用苏木精和曙红(H&E)和免疫组织化学染色。进行的免疫组织化学染色包括用于检测HSC激活的α-SMA(DakoCytomation,Carpinteria,CA)和用于检测胶原沉积的Sirius红染色。染色的肝组织在光学显微镜(Olympus America)下成像，并且使用ImageJ软件(NIH)在每个样品的20个区域中定量α-SMA或Sirius红色阳性区域。

腹水液的收集和测量

当在处理期间发生腹水时，将大鼠安乐死，并通过灭菌的注射器从大鼠腹膜收集腹水。测量腹水液的体积、细胞计数、总蛋白和白蛋白浓度，以确定血清-腹水白蛋白梯度(SAAG)，其已经在前瞻性研究中证实以分类腹水。

结果

在单独的CCl₄处理10周后，所有大鼠显示出具有离散的炎症体征的小结节性肝硬化。在6只大鼠中发现腹水，体积范围为4-65ml。分离的肝脏显示明显的形态损伤。与仅用CCl₄处理6周的大鼠相比，通过Sirus红染色从肝组织发现了胶原沉积的强烈的迹象。相比之下，用CCl₄和PEG-TRAIL处理的大鼠与单独用CCl₄处理的大鼠相比，显示形态正常的肝脏。此外，PEG-TRAIL处理的肝组织清楚地显示了通过免疫组织化学显示的较低纤维化标记物，即α-SMA和胶原。此外，与用PEG-TRAIL进行了CCl₄处理的大鼠相比，PEG-TRAIL处理增加了总蛋白和白蛋白的血清水平，同时显著降低了肝组织中的胆红素和羟脯氨酸水平(相对于非PEG-TRAIL处理的CCl₄组，p<0.05)。如在肝纤维化模型中所证明的，PEG-TRAIL处理在蛋白质和mRNA水平上大幅地下调与纤维形成相关的分子。多重表达的PEG-TRAIL处理组的相对倍数变化，包括TRAIL-R、α-SMA、胶原1、胶原3、TGF-β1、MMP-2、MMP-3、PDGFR、TIMP-1和TIMP-3显著低于非PEG-TRAIL处理的CCl₄组(相对于非PEG-TRAIL-处理的CCl₄组，p<0.05)。腹水是肝硬化的主要并发症之一。用CCl₄处理8-10周的60％(6/10)的大鼠出现腹水。相比之下，用PEG-TRAIL和CCl₄处理的大鼠表现出仅为30％(3/10)的降低的腹水发生率。尤其是，与不含PEG-TRAIL的CCl₄组相比，PEG-TRAIL处理组中腹水液的体积显著地降低了(图5)。总之，PEG-TRAIL的处理逆转并抑制肝硬化的进展，同时减少具有肝硬化肝脏疾病的大鼠的腹水发病率。

实施例6：在醇诱导的慢性胰腺炎大鼠模型中，PEG化的TRAIL的处理逆转胰腺纤维化。

材料和方法

大鼠中乙醇/蛙皮素/LD流质食物诱导的慢性胰腺炎(CP)

将6-8周龄的SD大鼠(Hanlim实验动物实验室)分成3组(每组8-10只大鼠)；i)媒介物(PBS)，ii)用媒介物处理的CP大鼠和iii)用TRAIL处理的CP大鼠。如在其他地方报道的(Deng,X.,et at.,Am.J.Pathol.166(1):93-106(2005))在大鼠中诱导实验性醇诱导的CP的模型。3组大鼠喂食乙醇浓度从0-36％逐渐增加的LD流质食物，持续7天，然后喂食36％乙醇3周。用20微克/kg(μg/kg)的蛙皮素(Σ)对大鼠进行腹膜内注射，每周一次4个小时的注射，直到第28天。从第23至第28天用PEG-TRAIL(4mg/kg)或PBS每日静脉内处理大鼠六天。对照组用PBS处理。处理后，通过免疫组织化学和免疫印迹分析胰腺标本。胰腺组织用H&E和Massons的三色染色剂(胶原)染色，并分析包括α-SMA、PDGFRβ、切割的半胱天冬酶-8和COX-2的生物标志物的调节。

结果

在CP模型中，通过H&E染色和高度表达的胶原明显观察到胰腺纤维形成。此外，α-SMA(激活的PSC标记)和纤维形成标记如PDGFRβ高度上调(相对于媒介物，分别为6倍和4倍，p<0.05)(图6)。PEG-TRAIL处理显著地减少胶原沉积，下调α-SMA和PDGFβ(相对于媒介物，分别为1倍和2倍)以及包括COX-2的其它炎症标记，如通过蛋白质印迹分析所证明的(相对于非PEG-TRAIL处理的CP组，p<0.05)。裂解的胱天蛋白酶-8仅在PEG-TRAIL处理的CP中显著地上调了(相对于媒介物13倍，p<0.05)，表明根除激活的PSC是由于TRAIL介导的细胞凋亡。

Claims (24)

1.用于治疗个体的纤维化或肝脏疾病的方法，包括向个体施用有效量的促凋亡剂以诱导肝星状细胞、胰星状细胞、肌成纤维细胞、髓成纤维细胞、活化的内皮细胞或活化的上皮细胞中的细胞凋亡，从而产生或诱导过量的细胞外基质，其导致器官或组织不希望的结疤、肝硬化或其后果例如腹水或疼痛。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述不希望的结疤为肝脏的纤维化或肝硬化。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述不希望的结疤为胰腺的纤维化。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述不希望的结疤为肺的纤维化。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述不希望的结疤为皮肤的纤维化。

6.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述促凋亡剂包括TRAIL激动剂，其被并入或包在纳米颗粒、微粒、胶束、脂质体、合成脂蛋白颗粒、或碳纳米管、凝胶或悬浮液、具有与其结合或其中并入有TRAIL激动剂的包衣、或装置中，其中TRAIL激动剂共价结合或连接装置表面、在所述表面上的聚合包衣下混合或应用、或在植入的同时物理应用至所述装置。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述促凋亡剂被配制用于延迟释放、持续释放或改进释放。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述促凋亡剂包括激动性TRAIL抗体、其类似物、其衍生物或其片段。

9.根据权利要求8所述的方法，其中聚乙二醇化TRAIL包括三聚体TRAIL，其包含有利于在N-末端形成三聚体的拉链氨基酸基序；和PEG或其衍生物，其中所述PEG结合到三聚体TRAIL的一个单体的N末端。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述PEG或其衍生物具有直链或支链的三聚体形式。

11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述PEG或其衍生物选自下组：甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯，甲氧基聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺，甲氧基聚乙二醇醛，甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺和多支链聚乙二醇。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述PEG或其衍生物为甲氧基聚乙二醇醛。

13.根据权利要求8-12中任一项所述的方法，其中所述PEG或其衍生物的分子量为1,000至100,000或分子量为5,000至50,000。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效量在外科手术前或在外科手术时或外科手术后立即施用。

15.根据权利要求1所述的方法，其中将所述有效量施用到肝脏中纤维化或结疤的部位和/或附近、过量细胞外基质积聚的部位、活化或增殖HSC的部位、或另一患病肝脏的生化、组织学、或者形态标记的部位。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述TRAIL激动剂是局部施用。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述TRAIL激动剂是全身施用。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中有效量的所述TRAIL激动剂以一个或多个剂量施用。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中有效量的所述TRAIL激动剂在一天或多天的期间存在或释放。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述TRAIL激动剂与额外的活性剂联合施用。

21.包含用于权利要求1-20任一项方法中所述的TRAIL激动剂的剂量单位。

22.根据权利要求21所述的剂量单位，其以用于治疗肝脏或胰腺疾病的有效量配制。

23.根据权利要求21所述的剂量单位，其以用于治疗肺纤维化的有效量和制剂配制。

24.根据权利要求21所述的剂量单位，其以用于治疗皮肤纤维化的有效量和制剂配制。