CN106566845B

CN106566845B - 一种霍氏肠杆菌生产的生物表面活性剂及其应用

Info

Publication number: CN106566845B
Application number: CN201610990205.8A
Authority: CN
Inventors: 王权; 沈其荣; 刘东阳; 王佳音; 朱瀚
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2016-11-10
Filing date: 2016-11-10
Publication date: 2018-01-16
Anticipated expiration: 2036-11-10
Also published as: CN106566845A

Abstract

本发明公开了一种霍氏肠杆菌生产的生物表面活性剂及其应用。利用霍氏肠杆菌Enterobacter hormaechei生产了生物表活性剂，对配方及生产条件进行了深入探索。对碳源、氮源的加入量进行了改良，并对生产发酵条件进行了改良，使得表面活性剂产量每升达到了2g以上。创新性的将生物表面活性剂与废弃畜禽氨基酸水解液进行伍配，使产物成分不流失，且避免了提纯工作。

Description

一种霍氏肠杆菌生产的生物表面活性剂及其应用

技术领域

本发明属于生物试剂制造领域，涉及一种霍氏肠杆菌生产的生物表面活性剂及其应用。

背景技术

生物表面活性剂是微生物代谢产生的一类结构各异的具有表面活性的物质。结构上其是一个两性分子，通常含有一个亲水基团和一个疏水基团。疏水部分通常是饱和或不饱和的碳链，亲水部分则是多变的，包括单糖、低糖、多糖、短肽、磷酸基等，因此生物表面活性剂结构各异，种类繁多。根据其生化特性和分子量等，通常可以分为糖脂、磷脂和脂肪酸、脂肽或脂蛋白、高分子表面活性剂和颗粒表面活性剂等几大类。表面活性剂都具有改变界面状态的作用，在溶剂中加入很少量时，能够显著降低固、液、气界面间的界面张力，从而产生润湿或者反润湿、乳化或者破乳、分散或者凝集、起泡或者消泡、以及增溶等一系列作用。由于日益严重的环境问题，人们将更多的目光投向了生物表面活性剂。因为生物表面毒性低、易降解，且在强酸、强碱，浓盐，极限温度温度下都具有表面活性。更重要的是其高效性，具有低的临界胶束浓度，却能表现出很高的表面活性。

生物表面活性剂在石油、采矿、食品、化妆品、造纸、纺织、涂料、节能技术、洗涤保洁、精细化工生产以及陶瓷工业中都有广泛的应用。生物表面活性剂可以改善堆肥环境，激发纤维素分解菌活性，用于处理农业固体废弃物。生物表面活性剂也可以作为土壤改良剂、肥料添加剂用于农业生产。一些生物表面活性剂还能作为抗微生物制剂、免疫调节剂以及疫苗佐剂等应用在医药保健行业

另一方面，高度集约化的养殖业中动物正常死亡率提高，而遇到突发性疫病死亡率就更高。如果这些废弃畜禽不进行有效的无害化处理，直接丢弃将造成严重的环境污染，被不法分子获得并进入市场则对人们的身体健康及公共安全造成严重威胁。废弃畜禽也是引发动物疫病的重要传染源，目前国内对病死畜禽的处理方法主要有：直接深埋，建沼气池将其发酵，直接焚烧等方法。这些方法都有其弊端，如造成环境污染或水质污染，而将废弃畜禽酸水解生产农用氨基酸，其不仅无害化解决了上述问题，同时为新型生物有机肥的研制提供丰富的原料。

氨基酸可以作为叶面肥来施用，而且效果显著，氨基酸叶面施肥打破了土壤根部施肥的传统方式，作为对作物土壤施肥的一种直接、高效的辅助措施，已成为现代农业生产中一项重要的施肥技术。但是叶面对养分的吸收受叶片结构、生长环境及喷施液理化性质等多种因素的影响。高等植物表皮具有一层蜡质层，由脂肪酸、酯类、酮、一级醇、二级醇、类萜、醛等具有疏水性的有机物组成，其阻滞了植物对叶面肥的有效吸收。添加表面活性剂可以让对叶面肥与叶片表层充分接触，对吸收有很好的促进作用。

霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)是本实验室从大庆油田被石油污染的土壤中筛选而得，以排油圈大小、表面张力值获为筛选指标经分离纯化获得。对其16rRNA序列的条带切胶回收，进行TA克隆后送测序，通过菌株系统进化树结果分析进行了菌种的鉴定。

发明内容

本发明提供了一种生物表面活性剂及其制法，并将其用于氨基酸叶面肥的施用上，大大促进了作物对叶面肥的吸收。

本发明可通过一下技术手段实现：

一种生物表面活性剂，发酵培养霍氏肠杆菌NJAU B4，离心所得上清液即为所述的生物表面活性剂；所述的霍氏肠杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2016年6月2日，保藏编号为CGMCC No.12590。

其中,霍氏肠杆菌的发酵培养基碳源优选为甘油，加入量为4％(v/v)；氮源优选为硝酸钠NaNO3，加入量优选3g/L。

霍氏肠杆菌的发酵培养基配方优选：NaNO₃ 3.0g/L，CaCl₂·H₂O 0.1g/L，NaHPO₄·2H₂O 3.0g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L,MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，酵母提取物2.0g/L，甘油4％(v/v)，每升发酵培养基2mL微量元素溶液；其中微量元素溶液配方：NaMoO₄·2H₂O 0.05g/L,，FeCl₃·6H₂O 0.08g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.75g/L，CoCl₂·6H₂O 0.08g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5g/L，CuSO₄·5H₂O 0.075g/L，MnSO₄·H₂O 0.75g/L，H₃BO₃ 0.15g/L；pH＝6.0。

离心操作条件优选4℃，10000g，15min。

发酵培养霍氏肠杆菌的条件优选接种量为6％(v/v)，35℃、200rmp条件下培养120±8h。

本发明所述的生物表面活性剂在制备叶面肥中的应用。

所述的应用优选将所述的生物表面活性剂稀释后添加废弃畜禽氨基酸水解液得到叶面肥。

一种叶面肥，将所述的生物表面活性剂稀释4～6倍后再加入废弃畜禽氨基酸水解液，并将pH调在6～8区间内；氨基酸水解液的加入量为稀释后生物表面活性剂溶液总体积的1/400至1/600(v/v)。

本发明所述方法中，废弃畜禽氨基酸水解液优选通过以下方法制备得到：参照已授权专利《病死畜禽动物零污染无害化处理和高附加值资源化利用工艺》专利号：ZL201410429510.0。具体步骤如下:

(1)在密闭容器中先将病死畜禽动物经自动化粉碎、所有固形物和液体自动转入密闭的水解罐后，在初始酸浓度c(1/2H₂SO₄)为3-5mol L-1、80-100℃和1-2个大气压下水解2-5小时；

(2)水解结束待水解罐内溶液冷却至80℃以下时，利用能出入水解罐加料口漂浮直立在油脂上的真空倒吸装置分离上层油脂；

(3)油脂被分离后，在水解罐中按水解液与氢氧化钾质量比为4：1慢慢加入氢氧化钾，边加边搅拌，调整溶液pH值为1-3；或按水解液与龙虾壳或螃蟹壳质量比为10：3在水解液中加入龙虾壳或螃蟹壳，升温至温度80℃、1-2个大气压内下维持1-2小时，然后待温度降至30℃以下，按水解液与氢氧化钾质量比为12.5：1慢慢加入氢氧化钾，调整溶液pH值为1-3；

(4)将调整pH值后的水解液从水解罐中放入塑料容器内，让其自然沉淀1-1.5小时，收集氨基酸溶液；必要时可将溶液再次放入沉淀容器中进行二次沉淀2-3小时，收集氨基酸溶液。

有益效果：

本发明利用筛选的高效产表面活性剂的菌株，通过发酵液的改良提高了表面活性剂的产量，将发酵液直接与氨基酸叶面肥直接伍配，促进植物对氨基酸叶面肥的吸收。

1)一般情况下利用微生物发酵生产得到的比较纯的生物表面活性剂只有0.01-1.00g，而本发明中发酵液上清直接冻干物可以达到12g/L，比较纯的生物表面活性剂有2g/L以上，达到其临界约束浓度时，水溶液的表面张力系数值降至34.14mN/m。

2)避免了复杂的提纯工作。一般生物表面活性剂使用时需要经过复杂的提出工业，特别是萃取过程中需要消耗大量的有机溶剂，如三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等，这些有机溶剂本身和其生产过程对环境都是有害的。而本发明的生物表面活性剂能够直接投入使用。

3)与氨基酸叶面肥伍配，大大促进了植物对叶面肥的吸收，提高了叶面肥的吸收效率。与直接向土壤施用肥料相比，叶面肥可以避免肥料溶于水流失，防止其有效成分在土壤中滞留，不被植物吸收利用。

生物材料保藏信息

NJAU B4,分类命名为霍氏肠杆菌Enterobacter hormaechei，保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2016年6月2号，保藏编号为CGMCC No.12590。

附图说明

图1黄瓜促生盆栽实验表型结果。

图2黄瓜促生盆栽实验的株高、叶绿素含量结果图。

具体实施方式：

实施例1

1.NJAU B4菌株的观察

菌落圆形，表面光滑凸起。边缘光滑，菌落呈如白色稍透明，不产色素；菌体有鞭毛，呈短杆状，革兰氏染色阴性，不产芽孢。

2.种子液的制备

用250mL的三角瓶装20％-30％(v/v)的液体LB培养基，在超净台中用火焰灭菌的接种环挑取少量试管中保存的NJAU B4菌体，在三角瓶中摇荡使菌体进入液体培养基。将接好种的三角瓶放入振荡培养箱，条件是为37℃,转数170rpm，培养时间为24h左右。

LB培养基与发酵培养基均在115℃度高温蒸汽灭菌锅下灭菌30min。

实施例2表面活性剂的生产条件的优化

2.1天数优化实验

为了确定最佳的发酵的天数，对发酵液的各项指标进行测量。原始发酵培养基配方：NaNO₃ 4.0g/L，CaCl₂·H₂O 0.1g/L，NaHPO₄·2H₂O 3.0g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L,MgSO₄·7H₂O0.2g/L，酵母提取物2.0g/L,甘油3％(v/v)，每升发酵培养基2mL微量元素溶液；其中微量元素溶液配方：NaMoO₄·2H₂O 0.05g/L,，FeCl₃·6H₂O 0.08g/L，ZnSO4·7H₂O 0.75g/L，CoCl₂·6H₂O 0.08g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5g/L，CuSO₄·5H₂O 0.075g/L，MnSO₄·H₂O 0.75g/L，H₃BO₃ 0.15g/L。以发酵液的pH、OD600，去菌体后的上清液的表面张力值、和菌体的干物重指标优化发酵天数。实验结果如表1，由于其表面张力值在第四天左右最小，故而选择第四天作为最佳的发酵天数。

表1 NJAU B4产生物表面活性剂的天数优化

2.2正交实验

为了优化发酵条件，进行了五因素水平L16(45)的正交实验，选择温度、初始pH、氮源及碳源加入量和接种量作为5个因素，选择31℃、35℃、39℃、43℃作为温度的四个水平，选择6.0、6.5、7.0、7.5作为pH值的四个水平，选择2g、3g、4g、5g硝酸钠作为氮源的四个水平，选择2％、3％、4％、5％(v/v)的甘油作为碳源的四个水平，选择1％、2％、4％、6％(v/v)的作为接种量的四个水平。实验结果见表2。由此可以得出这些因素对产量的影响。由于实验5得表面张力值最小，故选择初始pH为6.0、3g/L硝酸钠、4％的甘油作为发酵培养基的条件，接种量为6％，35℃下培养。

表2菌株NJAU B4产生物表面活性剂正交实验结果

优化后的发酵培养基配方为：NaNO₃ 3.0g/L，CaCl₂·H₂O 0.1g/L，NaHPO₄·2H₂O3.0g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L,MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，酵母提取物2.0g/L,甘油4％(v/v)，每升发酵培养基2mL微量元素溶液；其中微量元素溶液配方：NaMoO₄·2H₂O 0.05g/L,，FeCl₃·6H₂O0.08g/L，ZnSO4·7H₂O 0.75g/L，CoCl₂·6H₂O 0.08g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5g/L，CuSO₄·5H₂O0.075g/L，MnSO₄·H₂O 0.75g/L，H₃BO₃ 0.15g/L，pH＝6.0。

实施例3表面活性剂产量测定

3.1直接冻干物含量测定

量取上清液1000mL,分装于称好重量的8个组培瓶中，在放置在-80℃冰箱预冻4～5h，在放进冷冻干燥机冻干。冻干后称量其重量，测得到1L中有12.14g冻干物。

3.2水溶液最小表面张力值测定

将10g冻干物溶于10mL水中，用铂金环法表面张力仪在室温20℃下测量溶液的表面张力值为34.14mN/m，再加入1g冻干物，继续测量，数值未变低。

3.3较纯表面活性剂的测定

(1)萃取：将上清液用1mol/L的HCl溶液调节pH至2.0，再用与发酵液等体积的氯仿和甲醇2:1(v/v)混合溶剂萃取，再一次用发酵液1/2体积的混合溶剂萃取。将两次的萃取液混合用旋转蒸发仪在40℃下进行浓缩。浓缩后有机溶剂全部蒸发掉，水相会停留在蒸发装置中，为了更易称重，将浓缩后的溶液再次按3.1中方法进行冻干。

(2)测定：量取1L发酵液做(1)中处理，获得较纯BIA冻干物2.07g.

实施例4氨基酸的叶面肥的制作和改良

4.1废弃畜禽氨基酸水解液的制备方法

(1)在密闭容器中先将病死畜禽动物经自动化粉碎、所有固形物和液体自动转入密闭的水解罐后，在初始酸浓度c(1/2H₂SO₄)为3-5mol L^-1、80-100℃和1-2个大气压下水解2-5小时；

(4)将调整pH值后的水解液从水解罐中放入由聚四氟乙烯塑料制成的容器内，让其自然沉淀1-1.5小时，收集氨基酸溶液；必要时可将溶液再次放入沉淀容器中进行二次沉淀2-3小时，收集氨基酸溶液。

4.2表面活性剂的生产

1)按照2.2中的条件对面活性剂进行批量的生产。选择500mL的三角瓶，装上150mL左右的优化后的发酵培养基，对其进行灭菌处理后接种6％的种子，在振荡培养箱中35℃、200rmp条件下培养120h左右。

2)菌体的去除

将发酵液做离心处理。取适量体积发酵液放在50mL离心管中，在10000g、4℃条件下离心15min，取上清液。

3.3叶面肥的配制

取125mL上一步离心制备的上清液放入500mL的量筒，用去离子水定容至500mL后加入1mL的氨基酸水解液，再用KOH将溶液的pH调为7左右即可。

实施例5盆栽促生实验

5.1试验设计

做黄瓜的水培实验，基础培养液采用稀释4倍的霍格兰营养液配方，长出两片真叶时，选取长势相同的黄瓜苗进行处理。

表3黄瓜促生盆栽实验处理

5.2实验结果

以上实验只做到苗期，看出差异即止，如图1显示。测量了其株高、干重、叶绿素含量进行，结果表明添加了表面活性的叶面肥具有促生效果。相关实验数据如图2显示。数据表明AA和AAB的株高与CK相比，分别增加了10.57％、20.05％，新叶的叶绿素含量分别增加了6.64％、24.23％。这些都表明生物活性剂促进了叶面肥的吸收，特别是叶绿素含量的提高，表明植株对氮素的利用有明显增强。

Claims

1.一种生物表面活性剂，其特征在于发酵培养霍氏肠杆菌NJAU B4，离心所得上清液即为所述的生物表面活性剂；所述的霍氏肠杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2016年6月2日，保藏编号为CGMCC No.12590;霍氏肠杆菌的发酵培养基碳源为甘油，加入量为4%（v/v）；氮源为硝酸钠NaNO3，加入量为3g/L;霍氏肠杆菌的发酵培养基配方为：NaNO₃ 3.0g/L，CaCl₂·H₂O 0.1g/L，NaHPO₄·2H₂O 3.0g/L， KH₂PO₄ 3.0g/L, MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，酵母提取物 2.0g/L，甘油4%（v/v），每升发酵培养基2mL微量元素溶液；其中微量元素溶液配方：NaMoO₄·2H₂O 0.05 g/L,，FeCl₃·6H₂O 0.08 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.75g/L，CoCl₂·6H₂O 0.08g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5g/L，CuSO₄·5H₂O 0.075g/L，MnSO₄·H₂O 0.75g/L，H₃BO₃ 0.15 g/L ；pH=6.0; 发酵培养霍氏肠杆菌的条件为接种量为6%（v/v），35℃、200rmp条件下培养120±8 h;离心操作条件为4℃，10000g，15min。

2.权利要求1所述的生物表面活性剂在制备叶面肥中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于将权利要求1所述的生物表面活性剂稀释后添加废弃畜禽氨基酸水解液得到叶面肥。

4.一种叶面肥，其特征在于将权利要求1所述的生物表面活性剂稀释4~6倍后再加入废弃畜禽氨基酸水解液，并将pH调在6~8区间内；氨基酸水解液的加入量为稀释后生物表面活性剂溶液总体积的1/400至1/600（v/v）。

5.根据权利要求4所述的叶面肥，其特征在于所述的废弃畜禽氨基酸水解液通过以下方法制备得到：

(1) 在密闭容器中先将病死畜禽动物经自动化粉碎、所有固形物和液体自动转入密闭的水解罐后，在初始酸浓度c(1/2H₂SO₄) 为3-5mol L-1、80-100℃和1-2 个大气压下水解2-5小时；

(2) 水解结束待水解罐内溶液冷却至80℃以下时，利用能出入水解罐加料口漂浮直立在油脂上的真空倒吸装置分离上层油脂；

(3) 油脂被分离后，在水解罐中按水解液与氢氧化钾质量比为4：1 慢慢加入氢氧化钾，边加边搅拌，调整溶液pH 值为1-3 ；或按水解液与龙虾壳或螃蟹壳质量比为10：3 在水解液中加入龙虾壳或螃蟹壳，升温至温度80℃、1-2 个大气压内下维持1-2 小时，然后待温度降至30℃以下，按水解液与氢氧化钾质量比为12.5：1 慢慢加入氢氧化钾，调整溶液pH值为1-3 ；

(4) 将调整pH 值后的水解液从水解罐中放入塑料容器内，让其自然沉淀1-1.5 小时，收集氨基酸溶液；必要时可将溶液再次放入沉淀容器中进行二次沉淀2-3 小时，收集氨基酸溶液。