CN106525949A - 一种有机磷农药的电化学检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有机磷农药的电化学检测方法。所述的检测方法为：首先制备石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物修饰的电化学传感器，然后以K₃[Fe(CN)₆]为探针，基于乙酰胆碱酯酶能与有机磷农药发生强烈结合作用的原理，进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，记录响应电流，通过相关数据的分析与推导，即可得到待测样品中相应有机磷农药的浓度。本发明提供的检测方法对有机磷农药的检测限在0.012～0.23ng/mL之间，线性范围为1～1500ng/mL。本发明具有如下的有益效果：与其他利用酶抑制法进行有机磷农药快速检测的方法相比，本发明提供的检测方法无需进行酶促反应，因此大大节省了检测时间，同时也避免了因为采用不同来源的酶所导致检测结果重复性差的问题。

Description

一种有机磷农药的电化学检测方法

技术领域

本发明属于食品安全检测和分析化学技术领域，涉及一种有机磷农药的电化学检测方法，具体的说是涉及一种基于乙酰胆碱酯酶和有机磷农药具有强烈结合作用的检测方法。

背景技术

我国是个农业大国，每年进出口的农产品产量居世界首位。有机磷农药因具有品种多、药效高、杀虫谱宽等特点，已逐渐成为我国应用最广、使用量最大的一类杀虫剂。有机磷农药在给我国带来巨大经济效益的同时，也给食品安全、生态系统等带来了巨大的危害。近些年来，有机磷农药急性中毒事件频发，如青岛出现的甲拌磷严重超标毒韭菜事件，导致11人中毒；武汉5.23有机磷事件导致多位患者出现急性中毒；安徽省祁门县某中学的18名学生因食用含有有机磷农药的青菜而中毒等。此类有机磷中毒事件后果严重，影响恶劣，因此，近年来国家对有机磷农药使用的监管和要求已日趋严格。

目前有机磷农药的检测方法主要包括气相色谱‐质谱联用法、液相色谱‐质谱联用法、高效液相色谱法以及酶抑制法等。色谱类分析方法需要大型分析仪器，过程操作繁琐，不能实现现场检测；酶抑制法则由于仪器小型化、检测时间短等优势在有机磷快速检测领域占有一席之地。然而，由于所使用的酶来源多样，其催化选择性和催化活性大有差异，给实际检测的重复性和可靠性带来了不利的影响。

发明内容

本发明利用分子模拟方法对传感器进行了设计，首先模拟研究了壳聚糖对对硫磷的修饰作用以及乙酰胆碱酯酶与有机磷农药的识别机制，发现对硫磷与壳聚糖具有很强的分子间作用力，有利于修饰；利用乙酰胆碱酯酶与有机磷农药小分子的结合作用，分析了有机磷小分子的关键作用基团和位点，发现壳聚糖上修饰的小分子取向完全可以被乙酰胆碱酯酶识别，适合于该类传感器的研制。基于此，本发明提供了一种无需酶促反应、检测时间短、可检测多种有机磷农药的电化学检测方法。

本发明的目的在于提供一种有机磷农药的电化学检测方法，所述检测方法快速、高效、灵敏度高、稳定性好。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

1)电化学传感器的制备：将石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物滴涂于干净的玻碳电极表面，制得有机磷农药多残留检测电化学传感器；

2)孵育液的配制：配制含有有机磷农药和乙酰胆碱酯酶(AChE)的磷酸缓冲溶液(PBS)，下称孵育液；

3)工作曲线的建立：将步骤1)所述的电化学传感器浸入步骤2)所述孵育液中孵育，以磷酸缓冲溶液冲洗干净，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，记录响应电流；空白标样的响应电流为I₀，含有有机磷标样的响应电流为I_x，响应电流的增加值ΔI等于I_x与I₀的差值；将所述ΔI与孵育液中有机磷的浓度C绘制成ΔI‐C工作曲线，采用线性回归法得到ΔI‐C线性回归方程；

4)有机磷农药的测定：将待测样品配制为含有与步骤2)相同浓度的乙酰胆碱酯酶的孵育液，按照与步骤3)相同的方法对步骤1)所述的电化学传感器进行孵育和差分脉冲伏安扫描，记录响应电流；根据响应电流的增加值ΔI和ΔI‐C线性回归方程，得到相应有机磷农药的含量。

所述的有机磷农药为对硫磷、辛硫磷、毒死蜱、敌敌畏、甲胺磷、甲基嘧啶磷、乐果、氧化乐果、二嗪磷、倍硫磷和敌百虫。

所述的孵育液中有机磷农药浓度依次为0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL、800ng/mL、1200ng/mL和1500ng/mL，其中均含有浓度为10μg/mL的乙酰胆碱酯酶(AChE)。

石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物的制备方法：将10mg石墨烯加入到4mL质量浓度为1g/L的壳聚糖溶液中，室温下转速5000rpm超声分散30min，然后加入2ml质量浓度为0.2g/L的对硫磷溶液，继续超声30min，置于4℃冰箱中储存。

电化学传感器的制备方法：将直径为3mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨至镜面，并依次用乙醇、蒸馏水超声清洗5min，再用蒸馏水冲洗干净；将6μL石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物滴涂在清洗干净的玻碳电极表面，置于37℃真空干燥箱内晾干；然后将玻碳电极置于质量百分比浓度为0.05％的牛血清蛋白溶液中孵育30min，以封闭石墨烯‐壳聚糖表面剩余的活性位点；最后用PH为7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面，制得所述电化学传感器。

所述电化学传感器包括基底玻碳电极，和修饰于玻碳电极表面的石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物膜。

本发明提供的检测方法对有机磷农药的检测限在0.012～0.23ng/mL之间，线性范围为1～1500ng/mL。

本发明基于乙酰胆碱酯酶(AchE)和有机磷农药发生强烈的结合作用的原理，被结合到所述的电化学传感器上，从而改变电化学传感器的电化学响应信号，实现有机磷农药的检测。

本发明具有如下的有益效果：与其他利用酶抑制法进行有机磷农药快速检测的方法相比，本发明提供的检测方法无需进行酶促反应，因此大大节省了检测时间，同时也避免了因为采用不同来源的酶所导致检测结果重复性差的问题。

附图说明

图1为石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物的紫外可见吸收光谱图。

图2为电化学传感器对对硫磷进行检测的DPV曲线图。

图3为电化学传感器对辛硫磷进行检测的DPV曲线图。

图4为电化学传感器对毒死蜱进行检测的DPV曲线图。

图5为电化学传感器对敌敌畏进行检测的DPV曲线图。

图6为电化学传感器对甲胺磷进行检测的DPV曲线图。

图7为电化学传感器对甲基嘧啶磷进行检测的DPV曲线图。

图8为电化学传感器对乐果进行检测的DPV曲线图。

图9为电化学传感器对氧化乐果进行检测的DPV曲线图。

图10为电化学传感器对二嗪磷进行检测的DPV曲线图。

图11为电化学传感器对倍硫磷进行检测的DPV曲线图。

图12为电化学传感器对敌百虫进行检测的DPV曲线图。

图13为对硫磷检测的ΔI‐C工作曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例结合附图对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例1有机磷农药检测电化学传感器的制备

(1)石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物的制备

将石墨烯(10mg)加入到4mL壳聚糖溶液(质量浓度为1g/L)中，室温下超声分散30min(转速为5000rpm)，然后加入2ml对硫磷溶液(质量浓度为0.2g/L)，继续超声30min，置于4℃冰箱中储存待用。

石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物的紫外可见吸收光谱如图1所示。石墨烯‐壳聚糖分散液的最大吸收峰为262nm，对硫磷的最大吸收峰为272nm，石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物的最大吸收峰为267nm，位于石墨烯‐壳聚糖及对硫磷之间，表明已形成石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物。

(2)电化学传感器的制备：将玻碳电极(直径为3mm)用Al₂O₃抛光粉打磨至镜面，并依次用乙醇、蒸馏水超声清洗5min，再用蒸馏水冲洗干净；将实施例1中制备的石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物(6μL)滴涂在清洗干净的玻碳电极表面，置于37℃真空干燥箱内晾干；然后将玻碳电极置于牛血清蛋白溶液(质量百分比浓度为0.05％)中孵育30min，以封闭石墨烯‐壳聚糖表面剩余的活性位点；最后用磷酸缓冲溶液(PH为7.4)冲洗电极表面，制得所述电化学传感器。

制得的电化学传感器包括基底玻碳电极，和修饰于玻碳电极表面的石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物膜。

实施例2有机磷农药标准样的检测

本实施例分别对有机磷农药标准样品进行检测，有机磷农药样品选自对硫磷、辛硫磷、毒死蜱、敌敌畏、甲胺磷、甲基嘧啶磷、乐果、氧化乐果、二嗪磷、倍硫磷和敌百虫。

将实施例1中制备的电化学传感器分别浸入有机磷农药浓度依次为0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL、800ng/mL、1200ng/mL和1500ng/mL的孵育液(其中均含有浓度为10μg/mL的AchE)中进行孵育，以磷酸缓冲溶液冲洗干净，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，记录响应电流；空白标样的响应电流为I₀，含有有机磷标样的响应电流为I_x，响应电流的增加值ΔI等于I_x与I₀的差值；将所述ΔI与孵育液中有机磷的浓度C绘制成ΔI‐C工作曲线，采用线性回归法得到ΔI‐C线性回归方程。

将待测样品在同样条件下采用相同方法对所述电化学传感器进行孵育和DPV扫描，记录响应电流；将响应电流的增加值ΔI代入ΔI‐C线性回归方程，即可得到待测样品中相应有机磷农药的浓度。

图2‐图12依次为对硫磷、辛硫磷、毒死蜱、敌敌畏、甲胺磷、甲基嘧啶磷、乐果、氧化乐果、二嗪磷、倍硫磷和敌百虫的DPV曲线，其中每幅图中曲线从上到下浓度依次为1500ng/mL、1200ng/mL、800ng/mL、600ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、1ng/mL和0ng/mL。

图13为对硫磷检测的ΔI‐C工作曲线，其线性范围为1‐1500ng/mL，其中线性回归方程ΔI＝12.62071+0.00902C，线性相关系数R＝0.99393。

上述有机磷农药检测的ΔI‐C线性回归方程、线性相关系数(R)、线性范围及最低检测限见表1。

表1有机磷残留量单独检测

实施例3苹果中毒死蜱的加标检测

称取清洗干净的苹果样品(三份平行样品，每份质量为50±0.005g)放入烧杯中，加入毒死蜱标准溶液，然后加入50mL水和100mL丙酮，用绞碎机绞碎提取3min。过滤后取100mL滤液置于分液漏斗中，加入15g氯化钠，剧烈振荡3min后静置，待溶液分层后用50mL二氯甲烷萃取水相，将丙酮和二氯甲烷提取液合并。以无水硫酸钠干燥除去其中水分，旋蒸浓缩至约2mL，用氮气将剩余液体吹干，最后加入10mL乙醇‐水溶液(V：V＝1：1)，震荡至溶解，低温遮光保存待用。

按照上述方法配制不加入毒死蜱的空白样品，和3个加入不同毒死蜱浓度的加标样品(标准加入法)，并以实施例2中所述方法对所述电化学传感器进行孵育和DPV扫描，记录响应电流；根据实施例2中得到的毒死蜱对应的响应电流的增加值ΔI和浓度C之间的ΔI‐C线性回归方程，计算得到毒死蜱的浓度。检测回收率结果见表2。

表2苹果中毒死蜱的加标检测结果

实施例4青菜中敌敌畏的加标检测

称取清洗干净的青菜样品(三份平行样品，每份质量为50±0.005g)放入烧杯中，加入敌敌畏标准溶液，然后加入50mL水和100mL丙酮，用绞碎机绞碎提取3min。过滤后取100mL滤液置于分液漏斗中，加入15g氯化钠，剧烈振荡3min后静置，待溶液分层后用50mL二氯甲烷萃取水相，将丙酮和二氯甲烷提取液合并。以无水硫酸钠干燥除去其中水分，旋蒸浓缩至约2mL，用氮气将剩余液体吹干，最后加入10mL乙醇‐水溶液(V：V＝1：1)，震荡至溶解，低温遮光保存待用。

按照上述方法配制不加入敌敌畏的空白样品，和3个加入不同敌敌畏浓度的加标样品(标准加入法)，并以实施例2中所述方法对所述电化学传感器进行孵育和DPV扫描，记录响应电流；根据实施例2中得到的敌敌畏对应的响应电流的增加值ΔI和浓度C之间的ΔI‐C线性回归方程，计算得到敌敌畏的浓度。检测回收率结果见表3。

表3青菜中敌敌畏的加标检测结果

Claims (6)

1.一种有机磷农药的电化学检测方法，包括以下步骤：

1)电化学传感器的制备：将石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物滴涂于干净的玻碳电极表面，制得电化学传感器；

2)孵育液的配制：配制含有有机磷农药和乙酰胆碱酯酶的磷酸缓冲溶液，下称孵育液；

3)工作曲线的建立：将步骤1)所述的电化学传感器浸入步骤2)所述孵育液中孵育，以磷酸缓冲溶液冲洗干净，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中进行差分脉冲伏安扫描，记录响应电流；空白标样的响应电流为I₀，含有有机磷标样的响应电流为I_x，响应电流的增加值ΔI等于I_x与I₀的差值；将所述ΔI与孵育液中有机磷的浓度C绘制成ΔI‐C工作曲线，采用线性回归法得到ΔI‐C线性回归方程；

4)有机磷农药的测定：将待测样品配制为含有与步骤2)相同浓度的乙酰胆碱酯酶的孵育液，按照与步骤3)相同的方法对步骤1)所述的电化学传感器进行孵育和差分脉冲伏安扫描，记录响应电流；根据响应电流的增加值ΔI和ΔI‐C线性回归方程，得到相应有机磷农药的含量。

2.根据权利要求1所述的一种有机磷农药的电化学检测方法，其特征在于：所述的有机磷农药分别为对硫磷、辛硫磷、毒死蜱、敌敌畏、甲胺磷、甲基嘧啶磷、乐果、氧化乐果、二嗪磷、倍硫磷和敌百虫。

3.根据权利要求1所述的一种有机磷农药的电化学检测方法，其特征在于：所述的孵育液中有机磷农药浓度依次为0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL、800ng/mL、1200ng/mL和1500ng/mL，其中均含有浓度为10μg/mL的乙酰胆碱酯酶。

4.根据权利要求1所述的一种有机磷农药的电化学检测方法，其特征在于：所述的石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物的制备方法是将10mg石墨烯加入到4mL质量浓度为1g/L的壳聚糖溶液中，室温下转速5000rpm超声分散30min，然后加入2ml质量浓度为0.2g/L的对硫磷溶液，继续超声30min，置于4℃冰箱中储存。

5.根据权利要求1所述的一种有机磷农药的电化学检测方法，其特征在于：所述的电化学传感器的制备方法是将直径为3mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨至镜面，并依次用乙醇、蒸馏水超声清洗5min，再用蒸馏水冲洗干净；将6μL石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物滴涂在清洗干净的玻碳电极表面，置于37℃真空干燥箱内晾干；然后将玻碳电极置于质量百分比浓度为0.05％的牛血清蛋白溶液中孵育30min，以封闭石墨烯‐壳聚糖表面剩余的活性位点；最后用PH为7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面，制得所述电化学传感器。

6.根据权利要求1所述的一种有机磷农药的电化学检测方法，其特征在于：所述电化学传感器包括基底玻碳电极，和修饰于玻碳电极表面的石墨烯‐壳聚糖‐对硫磷复合物膜。