CN106512008A

CN106512008A - 干扰素调节因子5（irf5）及其抑制剂在治疗心肌肥厚中的应用

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Publication number: CN106512008A
Application number: CN201610963766.9A
Authority: CN
Inventors: 李红良; 邓克穷; 黄赞
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: CN106512008B

Abstract

本发明公开了干扰素调节因子5（IRF5）及其抑制剂在治疗心肌肥厚中的应用，属于基因的功能与应用领域。本发明确定了IRF5基因的表达与心肌肥厚疾病间的相互关系：抑制IRF5的表达显著抑制心肌肥厚、纤维化，改善心功能；促进IRF5表达显著促进心肌肥厚及其纤维化，恶化心功能。因此，IRF5可作为药物靶标用于筛选保护心脏功能、预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及抗心肌纤维化的药物，IRF5的抑制剂可用于制备保护心脏功能和预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及抗心肌纤维化的药物。

Description

干扰素调节因子5(IRF5)及其抑制剂在治疗心肌肥厚中的应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，涉及干扰素调节因子5(InterferonRegulatory Factor-5，IRF5)作为药物靶标在筛选治疗心肌肥厚的药物中的应用，以及IRF5的抑制剂在制备治疗心肌肥厚的药物中的应用。

背景技术

心肌肥厚是心脏对各种刺激产生的代偿性增生，以心肌细胞体积增大、心脏质量增加为特征，是独立的心血管危险因素之一，最终导致心力衰竭，甚至猝死。多种刺激均可导致心肌肥厚，主要包括机械牵张、压力负荷以及多种神经体液因素(如缺血、缺氧、NO缺乏、炎症因子等)[1]。其主要病理变化包括心肌细胞肥大、心肌间质增殖以及细胞外基质重建等，即心肌重构。心肌肥厚时，心肌细胞蛋白合成增加、体积增大、直径增宽或长度增加；心肌肌节数量增多、纤维组织增生、胚胎基因再表达[2]。关于心肌肥厚的分子机制尚未完全阐明，其主要与细胞信号通路激活密切相关。目前研究表明，参与心肌肥厚的信号通路主要有Jak-STAT、低分子量GTPases、G蛋白家族、PKC、MAPK、CaN、Wnt、AMPK及miRNA信号通路等，且各信号通路及信号通路效应子之间相互作用。目前对心肌肥厚的主流治疗策略是通过干预心肌重构相关的分子靶点，改善心功能，预防和逆转心脏重构[3]。当今临床上，血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素II受体I阻断剂(ARBs)、钙拮抗剂(CAs)被作为主要的抗心肌肥厚药物。此外动物实验还提示了他汀类药物在治疗心肌肥厚中的潜力[4]。

IRF家族是一大类对IFN起调控作用的转录因子。IRF家族包含10个成员，其中，IRF1-9普遍表达于哺乳动物中，IRF10则特异性地在鸟类和鱼类中表达。在结构上，IRF家族成员的N末端含有相对保守的DNA结合结构域(DNA binding domain，DBD)，C末端包含有IRF相关结构域(IRF associated domain，IAD)、自我抑制结构域、磷酸化位点等[5]。IRF5基因定位于染色体7p32，其全长序列与IRF家族其他成员高度同源。在无应激状态下，IRF5主要位于细胞浆，当受到外界刺激后，能够被磷酸化形成二聚体，并入核诱导IFN的表达。IRF5是巨噬细胞M1极化的标志物，它在M1巨噬细胞中高表达，并且它能够通过直接激活IL-12p40、IL-12p35和IL-23p19的表达以及抑制IL-10的表达来调节巨噬细胞M1的极性分化[6]。IRF5能通过促进Blimp1的表达来促进B细胞的成熟，对于成熟B细胞上的抗体产生和分泌是必须的[7]。在T细胞中，IRF5缺失导致Th1细胞反应障碍，IL-12p35和iNOS的表达显著下调，IRF5缺失的小鼠无法抵抗杜氏利什曼原虫的感染[8]。在单核细胞向单核源性的树突细胞分化的过程中，IRF5表达上调并促进了树突细胞TNF-α的持续性分泌[9]。在所有的IRF家族成员中，IRF5与自身免疫性疾病发生发展的关系最为密切，包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病、系统性硬化等[10]。

参考文献：

1.Manning J，Vehaskari VM.Postnatal modulation of prenatallyprogrammed hypertension by dietary Na and ACE inhibition.Am J Physiol RegulIntegr Comp Physiol.2005，288(1)：R80-84.

2.Devereux RB.Therapeutic options in minimizing left ventricularhypertrophy.Am Heart J.2000，139(1Pt 2)：S9-14.

3.Avanza AC Jr，El Aouar LM，Mill JG.Reduction in left ventricularhypertrophy in hypertensive patients treated with enalapril，losartan or thecombination of enalapril and losartan.Arq Bras Cardiol.2000，74(2)：103-117.

4.Gava AL，Balarini CM，Peotta VA，et al.Baroreflex control of renalsympathetic nerve activity in mice with cardiac hypertrophy.AutonNeurosci.2012，170(1/2)：62-65.

5.Ikushima H，Negishi H，Taniguchi T.The IRF family transcriptionfactors at the interface of innate and adaptive immune responses.Cold SpringHarbor symposia on quantitative biology.2013；78：105-16.

6.Barnes BJ，Moore PA，Pitha PM.Virus-specific activation of a novelinterferon regulatory factor，IRF-5，results in the induction of distinctinterferon alpha genes.The Journal of biological chemistry.2001 Jun 29；276(26)：23382-90.

7.Lien C，Fang CM，Huso D，Livak F，Lu R，Pitha PM.Critical role of IRF-5in regulation of B-cell differentiation.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America.2010Mar 9；107(10)∶4664-8.

8.Krausgruber T，Blazek K，Smallie T，Alzabin S，Lockstone H，Sahgal N，Hussell T，Feldmann M，Udalova IA.IRF5promotes inflammatory macrophagepolarization and TH1-TH17responses.Nature immunology.2011Mar；12(3)：231-8.

9.Paun A，Bankoti R，Joshi T，Pitha PM，Stager S.Critical role of IRF-5inthe development of T helper 1responses to Leishmania donovani infection.PLoSpathogens.2011；7(1)：e1001246.

10.Eames HL，Corbin AL，Udalova IA.Interferon regulatory factor 5inhuman autoimmunity and murine models of autoimmune disease.Translationalresearch：the journal of laboratory and clinical medicine.2016Jan；167(1)：167-82.

发明内容

为改进临床防治心肌肥厚疾病现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定IRF5基因的表达与心肌肥厚疾病间的相互关系，提供IRF5作为药物靶标在筛选、防治心肌肥厚疾病药物中的应用，进而提供IRF5的抑制剂在制备防治心肌肥厚疾病的药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

1、IRF5基因敲除显著抑制了心肌肥厚、纤维化，改善心功能

本发明选用心脏特异性α-MHC-MCM小鼠、IRF5心脏特异性基因敲除小鼠(IRF5-CKO)、用于构建IRF5-CKO的条件性敲除小鼠(IRF5-flox，IRF5正常表达)进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究IRF5基因敲除对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除基因所致的IRF5缺陷显著地抑制心肌肥厚、纤维化及改善心功能。

2、IRF5基因过表达显著促进了心肌肥厚及其纤维化，恶化心功能

本发明选用心脏特异性IRF5转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究IRF5基因过表达对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明过表达IRF5基因显著地促进心肌肥厚、纤维化，并恶化心功能。

3、IRF5干扰(AdshIRF5)及过表达(AdIRF5)腺病毒对经Ang II诱导的心肌细胞肥大模型的影响

本发明通过构建重组腺病毒AdshIRF5及AdIRF5感染SD乳鼠原代心肌细胞，予以Ang II刺激构建心肌细胞肥大模型，对照组则予以PBS，经免疫荧光监测及心肌细胞表面积统计表明，在Ang II刺激下IRF5干扰病毒明显抑制心肌细胞肥大，心肌细胞表面积减小；IRF5过表达病毒显著促进心肌细胞肥大，心肌细胞表面积增大。

由上述结果可知IRF5基因缺陷抑制促进了心肌肥厚、纤维化，改善心功能，促进IRF5表达则促进心肌肥厚、纤维化，恶化心功能。本发明的研究证明了：在主动脉缩窄术造成心肌肥厚模型中，IRF5具有促进心肌肥厚及其纤维化，恶化心功能的作用。

因此，针对上述功能，IRF5基因可作为药物靶点，构建IRF5基因过表达的体外细胞模型或动物模型，从而用于筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物；IRF5基因也可作为基因治疗中的靶基因，在其基础上设计并制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的目的。例如，以IRF5为靶基因设计干扰IRF5表达的双链siRNA，通过化学方法合成后注射入人体，通过RNA干扰的方法使IRF5基因沉默以治疗心肌肥厚疾病；此外还可以设计并构建IRF5的突变体，注射后进入细胞，竞争IRF5原型的作用底物，从而抑制IRF5的功能，达到治疗目的；另还可以IRF5为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用IRF5基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选发现其中能够特异性抑制IRF5的分子，从而为心肌肥厚疾病提供新的治疗性分子。

本发明针对IRF5的上述功能，提供IRF5作为药物靶标在筛选保护心脏功能、预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及抗心肌纤维化的药物中的应用。所述的应用是非诊断和非治疗的目的；所述的筛选是指筛选IRF5的抑制剂。

本发明针对IRF5的上述功能，提供IRF5的抑制剂在制备保护心脏功能、预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及抗心肌纤维化的药物中的应用。

一种保护心脏功能的药物，包含IRF5的抑制剂。

一种预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，包含IRF5的抑制剂。

一种抗心肌纤维化的药物，包含IRF5的抑制剂。

所述的IRF5的抑制剂具有本领域公知的含义，其可以是能够特异抑制IRF5对靶基因的调控作用的任何物质，可以是在细胞中特异抑制IRF5表达的物质，也可以是与IRF5具有特异性相互作用并能减弱IRF5作用的物质。优选为IRF5基因的siRNA、IRF5基因的RNA干扰载体，IRF5的抗体及其他能够抑制IRF5表达的抑制剂中的一种。

一种筛选用于保护心脏功能和预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物的方法，为筛选IRF5的抑制剂的方法，包括：根据IRF5的序列设计其反义RNA，或者将IRF5与候选物质接触，检测IRF5的表达或作用，并选择特异抑制IRF5表达或减弱IRF5作用的候选物质。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现IRF5的新功能，即IRF5具有促进心肌肥厚及其纤维化，恶化心功能的作用。

(2)基于IRF5的功能，其为研制保护心脏功能、预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物提供靶标。

(3)IRF5的抑制剂可用于制备保护心脏功能、预防、缓解和/或治疗心肌肥厚疾病的药物。

附图说明

图1是心脏特异性IRF5基因敲除小鼠的打靶策略图。

图2是心脏特异性IRF5转基因小鼠的构建策略及IRF5蛋白表达量统计图。其中，A为构建策略；B为蛋白表达量统计，图中TG1-TG4是不同个体的IRF5转基因小鼠。

图3是正常人和扩张性心肌病患者心脏中IRF5蛋白的表达图，GAPDH作为内参，结果显示扩张性心肌病患者心脏中IRF5的表达上调(*：p＜0.05vs正常人组)。

图4是α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB术4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图，结果显示IRF5敲除显著降低HW/BW、LW/BW及HW/TL(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham组，§：p＜0.05vs IRF5-flox sham，#：p＜0.05vs α-MHC-MCM AB组)。

图5是α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB术4周后心脏表型、心脏组织HE染色及心肌细胞横截面积统计柱状图，结果显示IRF5敲除显著减轻心肌细胞肥大(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham组，§：p＜0.05vs IRF5-flox sham，#：p＜0.05vs α-MHC-MCM AB组)。

图6是α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB术4周后心脏组织天狼星红染色图，结果显示IRF5敲除显著减轻心脏的纤维化(*：p＜0.05vs α-MHC-MCM Sham组，§：p＜0.05vs IRF5-flox sham，#：p＜0.05vs α-MHC-MCM AB组)。

图7是NTG和IRF5-TG小鼠AB术4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图，结果显示IRF5过表达组HW/BW、LW/BW及HW/TL明显升高(*：p＜0.05vsNTG Sham组，#：p＜0.05vs NTGAB组)。

图8是NTG和IRF5-TG小鼠AB术4周后心脏表型、心脏组织HE染色及心肌细胞横截面积统计柱状图，结果显示IRF5过表达会促进心肌细胞肥大(*：p＜0.05vsNTG Sham组，#：p＜0.05vs NTG AB组)。

图9是NTG和IRF5-TG小鼠AB术4周后心脏组织天狼星红染色图，结果显示IRF5过表达会加重心脏纤维化(*：p＜0.05vs NTG Sham组，#：p＜0.05vs NTG AB组)。

图10是α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB术4周后超声检测心功能结果统计柱状图，结果显示敲除IRF5显著改善心功能；其中，LVEDD为左室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率(*：p＜0.05vs α-MHC-MCM Sham组，§：p＜0.05vsIRF5-flox sham，#：p＜0.05vs α-MHC-MCM AB组)。

图11是NTG和IRF5-TG小鼠AB术4周后超声检测心功能结果统计柱状图，结果显示过表达IRF5心功能显著恶化；其中，LVEDD为左室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率(*：p＜0.05vs NTG Sham组，#：p＜0.05vs NTG AB组)。

图12是SD乳鼠原代心肌细胞用腺病毒AdshRNA、AdshIRF5、AdGFP、AdIRF5感染，经Ang II刺激后的免疫荧光及细胞表面积统计柱状图，IRF5的过表达病毒促进心肌细胞肥大，IRF5的干扰病毒抑制心肌细胞肥大(*：p＜0.05vsAdshRNA/AdGFP PBS组，#：p＜0.05vsAdshRNA/AdGFP Ang II组)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进行一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养

实验动物：选用8-10周龄、体重23.5-27.5g、雄性的心脏特异性Cre小鼠(α-MHC-Cre(α-MHC-MCM)，背景为C57BL/6，购自Jackson Laboratory，货号005650)、IRF5-flox条件性敲除小鼠(IRF5-flox)、心脏特异性IRF5基因敲除小鼠(IRF5-CKO)、心脏特异性IRF5转基因小鼠(IRF5-TG)及非转基因小鼠(NTG，同龄同窝对照非转基因小鼠)为实验对象。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级实验动物中心。SRF级小鼠饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

实施例1心脏特异性IRF5基因敲除小鼠以及IRF5转基因小鼠的构建

1.心脏特异性IRF5基因敲除小鼠的构建(构建策略见图1)

利用CRISPR-Cas9技术构建心脏特异性IRF5基因敲除小鼠。首先，通过在线CRISPR设计工具(http：//crispr.mit.edu)分别在小鼠IRF5基因内含子2和3中各设计一个CRISPR的打靶位点，靶序列分别为：

IRF5-sgRNA 1：GGCAAGCAGGTACAATCTCAA AGG，

IRF5-sgRNA 2：GGCAGTGGTAATGAAGAAGCACC TGG。

此外还设计了一个用于同源修复的供体载体(Donor Vector)，它包括两侧同源臂、中间的外显子3以及两个同向的loxp序列。

(1)打靶载体的构建：分别将sgRNA1和sgRNA2对应的两条引物融合成双链DNA，然后用T4DNA连接酶连入经过限制性内切酶BsaI处理过的pUC57-sgRNA载体中。该载体上游有一个T7启动子，可以用于后续的体外转录实验。

(2)条件性敲除骨架载体pBluescript SK(+)-2loxp的构建：

分别合成4条寡聚单链核苷酸序列：

loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，

loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；

loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，

loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；

上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2两条双链。将pBluescript II SK(+)载体用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)双酶切后连接入loxp1退火双链，再将测序正确的载体用BamHI(NEB，R0136L)和SDeI(NEB，R0133L)双酶切，连接入loxp2退火双链，得到条件性敲除骨架载体，命名为pBluescript SK(+)-2loxp。

(3)供体载体的构建：根据引物设计原则，设计如下引物(表1)用于扩增供体载体的左右同源臂(LA和RA)以及中间的外显子部分(M)。扩增得到的产物经表l中所示限制性内切酶酶切后得到3个片段，将其分别连入条件性敲除骨架载体pBluescript SK(+)-2loxp中，得到供体载体。

表l构建供体载体所需引物序列及对应酶切位点

引物名称	引物序列	酶切位点
			IRF5 LA-F	CCGCTCGAGAGTGCCTTTCTGTGGAGAGC	XhoI
IRF5 LA-R	ATGGACGTCTTGAGGCCAAGCAGACCAAA	AatII
			IRF5 M-F	TCTACCGGTATTGTACCTGCTTGCCCTCC	AgeI
IRF5 M-R	GGCGATATCCCTCACCCCACTCCCAGATA	EcoRV
			IRF5 RA-F	GGACTAGTCCTTTGCCTGCTGCTTCTTG	SpeI
IRF5 RA-R	ATAAGAATGCGGCCGCCTCCCCAGTTCAGCCTTGAC	NotI

(4)打靶载体的转录：对CRIPR/Cas9系统包含的两个部分(负责切割作用的Cas9蛋白和引导Cas9蛋白定位到靶位点的gRNA)分别进行转录。对于Cas9蛋白，将其表达载体pST1374-Cas9(Addgene 44758)用PmeI进行酶切，以纯化后回收线性化质粒为转录模板，用T7mMESSAGE mMACHINE试剂盒(AM1345，Ambion)进行体外转录，获得加帽的mRNA产物。并用Poly(A)Tailing试剂盒(Ambion)对上述产物加尾，获得成熟的mRNA产物；对于sgRNA，使用MEGAshortscript^TM Kit(AM1354，Ambion公司)进行体外转录。将转录得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)进行纯化。

(5)IRF5-flox条件性敲除小鼠的制作

将上述成熟的mRNA产物与供体载体一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠体内进行培育。得到的小鼠进行鉴定。取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取基因组，并通过PCR方法筛选阳性首建鼠。从确定发生同源重组的小鼠中随机挑选一只作为F0代进行后续的繁殖，最终获得IRF5-flox纯合小鼠，该小鼠体内IRF5蛋白正常表达。

(6)心脏特异性IRF5基因敲除小鼠的制作

将上述IRF5-flox小鼠与心脏特异性α-MHC-Cre(购自Jackson Laboratory，货号005650)转基因小鼠交配，筛选得到IRF5^flox/flox/α-MHC-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen(他莫昔芬)，诱导Cre酶的表达，Cre酶特异性的识别两个同向的loxp，并切除两者之间的序列及其中的一个loxp，最后得到心脏细胞特异性IRF5基因敲除小鼠。

2.心脏特异性IRF5转基因小鼠的构建(构建策略见图2A)

以C57BL/6小鼠IRF5基因的cDNA为模板，用如下引物PCR扩增小鼠IRF5基因(NCBI，Gene ID：27056，NM_012057.4)：

上游引物：5’-GCTCTAGAGCCACCATGAACCACTCAGCCCCA-3’，

下游引物：5’-GCTCTAGATTATTGCATGCCAACTGGGT-3’。

把扩增得到的产物和pCAG-CAT-LacZ载体(北京协和医学院基础学院杨青林老师实验室提供，制备过程参见参考文献：Kim T，Zhelyabovska O，Liu J，et al.Generationof an Inducible，Cardiomyocyte-Specific Transgenic Mouse Model with PPAR b/dOverexpression[J].Peroxisome Proliferator-Activated Receptors(PPARs)，57.)用限制性内切酶XbaI(NEB，#R0145L)酶切后连接，得到转基因载体pCAG-CAT-IRF5-polyA，IRF5的表达由CAG启动子驱动得到。

将构建的pCAG-CAT-IRF5-polyA载体通过显微注射构造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到IRF5-floxed转基因小鼠。心脏特异性IRF5转基因小鼠由IRF5-fioxed转基因小鼠和α-MHC-Cre(购自Jackson Laboratory，货号005650)小鼠杂交繁殖得到，方法同上述基因敲除小鼠的构建。

取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取对应组织总蛋白，使用Western Blot方法筛选IRF5表达量最高的小鼠。将其同窝阳性鼠继续繁殖，从而获得稳定遗传心脏特异性IRF5转基因小鼠品系。为了反映病理生理状态下IRF5的改变，本发明选择了IRF5-TG2小鼠，Western Blot及定量分析显示，其心脏组织中IRF5表达量约为正常组织4.38倍(图2B)。

实施例2IRF5在正常人和心肌病患者心脏中的表达

选用正常人心脏(非心脏原因的死亡捐献的个体)、扩张型心肌病患者心脏移植手术病人置换的受体)，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹实验(Western Blot)，结合特异性识别IRF5的抗体进行检测，测定其IRF5的表达，GAPDH作为内参。检测结果如图3所示，扩张型心肌病患者心脏中IRF5的表达明显上调。

实施例3心肌肥厚模型的获得

1.实验动物分组：通过主动脉缩窄术(AB)建立心肌肥厚模型。随机分为10组，分组如下：对照组小鼠假手术组(α-MHC-MCM Sham、IRF5-flox Sham)及AB术组(α-MHC-MCMAB、IRF5-floxAB)、IRF5基因敲除小鼠假手术组(IRF5-CKO Sham)及AB术组(IRF5-CKOAB)、非转基因小鼠假手术组(NTG Sham)及AB术组(NTG AB)、心脏特异性IRF5转基因小鼠假手术组(TG Sham)及AB术组(TGAB)。

2.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄(AB)手术，模型操作流程：

2.1术前准备

(1)麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药(3％戊巴比妥钠)量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准(一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间)。

(2)术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。

(3)气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上(加热垫需提前预热)，然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。

2.2主动脉弓降支结扎术

取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75％的酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G(25.0-27.5g小鼠)或者27G(23.5-25.0g)注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出1cc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。假手术组(Sham)在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同心肌肥厚模型组。

2.3术后护理

主动脉弓降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。IRF5基因敲除小鼠及对照组小鼠术后4周、非转基因小鼠及心脏特异性IRF5转基因小鼠术后4周分别进行各项指标的检测。

实施例4心肌肥厚模型小鼠病理学检测

1.取材

(1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10％甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10％KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。

(2)取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10％KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。

(3)相关测量及计算：取出小鼠心脏、肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值(HW/BW)，肺重与体重的比值(LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值(HW/TL)。

2.病理学检测

2.1制备石蜡标本切片

主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

2.2苏木精-伊红(HE)染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70％酒精充分混合均匀)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水)1min→水洗1min→伊红溶液(珠海贝索，BA-4024)3-5min→蒸馏水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用Image-ProPlus 6.0软件统计细胞横截面积。

2.3天狼星红(PSR)染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2％磷钼酸2min→0.1％天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB术后的表型结果见图4、图5、图6。Sham(假手术)组中α-MHC-MCM、IRF5-flox小鼠和IRF5-CKO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；α-MHC-MCM、IRF5-flox小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；AB术后4周，IRF5-CKO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较对照组小鼠降低(图4)。心脏表型，Sham组心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，IRF5-CKO小鼠的心脏明显小于α-MHC-MCM、IRF5-flox对照组小鼠；HE染色切片可观察到：Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，IRF5-CKO组则较对照组细胞肥大减轻，差异有统计学意义(图5)。PSR染色后，发现AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络状；AB术后IRF5-CKO小鼠胶原含量及血管周围胶原含量低于对照组小鼠(图6)。以上结果说明经AB术后，小鼠发生明显的心肌肥厚，而IRF5-CKO小鼠的心肌肥厚程度轻于对照组小鼠。

图7、图8、图9是NTG和IRF5-TG小鼠AB术后的表型结果。同样NTG小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明显大于NTG小鼠(图7)。心脏表型，AB组较Sham组的心脏均增大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远大于NTG小鼠。HE染色切片可观察到：TG小鼠AB术后心肌细胞横截面积大于Sham组，AB组TG小鼠显著大于NTG小鼠(图8)。PSR染色可见：TG小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量均高于NTG小鼠AB组(图9)。以上结果说明经AB术后，小鼠发生明显的心肌肥厚，IRF5-TG小鼠的心肌肥厚程度较NTG小鼠更重。

实施例5心肌肥厚模型小鼠超声检测心功能

1.前期准备

(1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

(2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0％异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

2.心功能检测

小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司)。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)及短轴缩短率(FS)。

本实施例运用M型超声心动图检测评价心肌肥厚和心功能。图10是α-MHC-MCM、IRF5-flox和IRF5-CKO小鼠AB术后心功能检测结果。与对照Sham组相比，α-MHC-MCM、IRF5-flox小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥厚的指标LVEDD、LVESD均不同程度的增加，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周，IRF5-CKO小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度轻于α-MHC-MCM、IRF5-flox小鼠。这些结果与IRF5-CKO小鼠心肌肥厚减轻的结果一致。

图11是NTG和IRF5-TG小鼠AB术后的超声检测结果。与NTG Sham组相比，NTG小鼠AB术后4周表现出心功能降低及心肌肥厚。主要表现为心肌肥厚的指标LVEDD、LVESD升高，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚指标升高的程度及反映心功能的指标下降的程度均明显高于NTG组。这些结果与TG小鼠心肌肥厚显著加重的结果一致。

实施例6IRF5干扰(AdshIRF5)及过表达(AdIRF5)腺病毒对Ang II刺激的原代心肌细胞肥大的影响

1.原代新生SD大鼠心肌细胞培养

(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，颈部以下75％酒精消毒，用眼科剪和显微镊取下心脏，放入盛有10mL DMEM/F12培养基的玻璃平皿中。再取另一只，重复以上过程。

(2)用DMEM/F12培养基清洗心脏，并将心脏剪成1-2mm³的碎片。转入到放有转子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。转速为120r/min，消化15min，静止数秒钟，弃去上清液。

(3)加入胰酶消化液，转速为120r/min，消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用含20％小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4℃冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。

(4)将收集好的心肌细胞悬液以1500rpm转速离心8min，弃去上清液。在离心管中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离心管中，细胞悬液用细胞40μm过滤网过滤。

(5)将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过滤。根据细胞悬液的总量加入Brdu(终浓度0.1mM)，混匀之后，加入到用0.1％明胶包被的器皿中。

(6)轻摇分散细胞，勿漩涡摇晃。37℃、5％CO₂孵育48小时用PBS清洗1次，更换培养基。

2.IRF5干扰(AdshIRF5)及过表达(AdIRF5)腺病毒对经Ang II诱导的心肌细胞肥大模型的影响

AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作对照)、AdshIRF5(含shRNA-IRF5(沉默RNA-IRF5融合蛋白)的腺病毒，沉默IRF5表达)、AdGFP(含GFP(绿色荧光蛋白)的腺病毒，用作对照)及AdIRF5(含GFP-IRF5(绿色荧光蛋白-IRF5融合蛋白)的腺病毒，IRF5过表达)。

(1)重组腺病毒构建

从美国InvivoGen公司购得IRF5的表达载体，应用腺病毒表达系统AdenoVec构建重组AdGFP、AdIRF5；从美国SuperArray公司购得shRNA、shIRF5载体，然后应用腺病毒表达系统AdenoVec构建重组AdshRNA、AdshIRF5。

(2)重组腺病毒的鉴定

取病毒粗提液加入裂解液，经混匀、离心后取上清液作为模板进行PCR扩增，产物通过凝胶电泳鉴定。

(3)重组腺病毒的扩增

转染前接种HEK293细胞，待细胞达到50-70％汇合时换液，加入含有重组腺病毒载体的新鲜培养液，培养90分钟后再添加新鲜培养液，培养至大约有50％的细胞从培养板上脱落时，收集细胞悬液。反复冻融以制备病毒粗提液，通过CsCl密度梯度超速离心法纯化病毒液。

(4)重组腺病毒滴度测定

在96孔板中接种HEK293细胞，24小时后加入倍比稀释的病毒液，1-10列加入稀释的病毒液，每个浓度8个重复孔，11-12列加入无病毒完全培养液，培养10天后在显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，计算每个浓度的阳性率。病毒滴度采用Spearman-Karber Method计算：滴度(pfu/mL)＝10^(x+0.8)，x＝各浓度阳性率总和。前提条件：阴性对照无CPE和生长抑制现象；最小稀释浓度组均有CPE；最大稀释浓度组均无CPE。

(5)重组腺病毒作用的鉴定：

用2×10⁸pfu/virus浓度的AdIRF5和AdGFP及AdshIRF5和AdshRNA感染6孔培养板中培养的心肌细胞(约80％汇合度)，24小时后收集细胞，加入蛋白裂解液裂解50分钟后收集上清，取50μg样品经10％SDS-PAGE电泳分离后，用IRF5特异性抗体做Western Blot分析。根据IRF5蛋白的表达，确定腺病毒AdIRF5和AdGFP及AdshIRF5和AdshRNA是否能发挥预期作用。由AdGFP和AdshRNA感染的细胞IRF5蛋白表达含量不变。由Adsh IRF5感染的细胞IRF5蛋白表达含量显著减少；相反的，由AdIRF5感染的细胞IRF5蛋白表达含量显著增加。

腺病毒10MOIs分别感染培养3天的原代心肌细胞，12小时后用1μM血管紧张素II(Ang II)(购自Sigma，A9525)或对照PBS刺激48小时，然后进行免疫荧光试验。结果表明，经AdshIRF5腺病毒感染后的心肌细胞表面积较AdshRNA对照组显著减小，而经AdIRF5腺病毒感染的心肌细胞表面积则与对照组相比AdGFP明显增大(图12)。即IRF5的干扰腺病毒抑制心肌细胞肥大，IRF5过表达的腺病毒则促进心肌细胞肥大。

由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，IRF5基因缺陷显著抑制了心肌肥厚、纤维化，改善心功能，IRF5基因过表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能。因此IRF5基因具有促进心肌肥厚及纤维化并使心功能恶化的作用，IRF5基因可促进主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病的发生发展。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 干扰素调节因子5（IRF5）及其抑制剂在治疗心肌肥厚中的应用

<130> 1

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

ggcaagcagg tacaatctca aagg 24

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

ggcagtggta atgaagaagc acctgg 26

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp1-F

<400> 3

agcttgacgt cataacttcg tatagcatac attatagcaa tttataccgg tgat 54

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp1-R

<400> 4

atcaccggta taaattgcta taatgtatgc tatacgaagt tatgacgtca 50

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp2-F

<400> 5

gatcccttaa gataacttcg tatagcatac attatagcaa tttatacgcg ta 52

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp2-R

<400> 6

ctagtacgcg tataaattgc tataatgtat gctatacgaa gttatcttaa gg 52

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF5 LA-F

<400> 7

ccgctcgaga gtgcctttct gtggagagc 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF5 LA-R

<400> 8

atggacgtct tgaggccaag cagaccaaa 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF5 M-F

<400> 9

tctaccggta ttgtacctgc ttgccctcc 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF5 M-R

<400> 10

ggcgatatcc ctcaccccac tcccagata 29

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF5 RA-F

<400> 11

ggactagtcc tttgcctgct gcttcttg 28

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IRF5 RA-R

<400> 12

ataagaatgc ggccgcctcc ccagttcagc cttgac 36

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物

<400> 13

gctctagagc caccatgaac cactcagccc ca 32

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物

<400> 14

gctctagatt attgcatgcc aactgggt 28

Claims

1.IRF5作为药物靶标在筛选保护心脏功能的药物中的应用，其特征在于：所述的应用是非诊断和非治疗的目的。

2.IRF5作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用，其特征在于：所述的应用是非诊断和非治疗的目的。

3.IRF5作为药物靶标在筛选抗心肌纤维化的药物中的应用，其特征在于：所述的应用是非诊断和非治疗的目的。

4.IRF5的抑制剂在制备保护心脏功能的药物中的应用。

5.IRF5的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用。

6.IRF5的抑制剂在制备抗心肌纤维化的药物中的应用。

7.一种保护心脏功能的药物，其特征在于：包含IRF5的抑制剂。

8.一种预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，其特征在于：包含IRF5的抑制剂。

9.一种抗心肌纤维化的药物，其特征在于：包含IRF5的抑制剂。

10.根据权利要求4-6任一项所述的应用或7-9任一项所述的药物，其特征在于：所述的IRF5的抑制剂是能够特异抑制IRF5对靶基因的调控作用的任何物质。