CN106497976A

CN106497976A - 一种用于矫正重症β‑地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒

Info

Publication number: CN106497976A
Application number: CN201610930594.5A
Authority: CN
Inventors: 邢晓; 王雯倩; 宋珂慧; 郭栋; 麦玉蝉; 陈莉; 郭伟
Original assignee: Guangdong Yike Gene Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Yike Gene Technology Co ltd
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2017-03-15

Abstract

本发明公开了一种用于矫正重症β‑地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒，是由一套用于制备特异性HBB‑101 HIV慢病毒的试剂和一套HIV慢病毒侵染造血干细胞的试剂组成。本发明还公开了所述试剂盒在使重症β‑地中海贫血患者自体造血干细胞转变为能具有正常合成β‑珠蛋白功能的造血干细胞中的应用。实验证实本发明的试剂盒操作简单，病毒滴度较高，病毒感染效率高达56.99％，对矫正后的造血干细胞进行PCR鉴定和DNA测序鉴定阳性后即可进行静脉回输从而实现治愈重症β‑地中海贫血患者的目的，在临床研究及治疗应用上发展前景广阔。

Description

一种用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB 基因试剂盒

技术领域

本发明涉及一种基因治疗试剂盒，尤其是涉及一种用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒。

背景技术

β-地中海贫血是一种遗传性血红蛋白病，属常染色体显性遗传，是由β-珠蛋白基因(HBB)突变导致的β-珠蛋白合成障碍，是全球最常见的单基因遗传病。

HBB基因位于11号染色体短臂1区2带，本病除少数几种为几个核苷酸缺失外，绝大部分都是点突变(单个核苷酸置换，增加或缺失)所致，突变致β链合成部分受抑制者称“β+地中海贫血”；致β链完全受抑制者称“βo地中海贫血”。βo/βo纯合子表现为重型，β+/βo杂合子多表现为中间型，β+/β表现为轻型，由于β珠蛋白基因突变缺失类型繁多，存在多重杂合状态，以及γ、δ肽链代偿因素，临床表现从完全无症状的携带者到严重贫血的重型之间没有明显分界。全世界已发现100种基因突变类型，我国有20种，主要分布在长江以南省份，尤其以广东、广西、海南、四川、云南、台湾等省份为多发。各地区地贫患者占的比例：云南：4.8％、四川：2.37％、贵州：2.21％，福建：1.83％、广西：1.52％、广东：1.08％。目前β-地中海贫血主要依赖定期输血进行维持治疗，给病人家庭及社会带来了沉重的负担。异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前根治重型β地中海贫血症的惟一临床手段。但众所周知，造血干细胞的来源及移植后的排斥反应极大限制了其临床应用。

随着分子生物学和分子遗传学理论和技术的迅速发展，人们对基因治疗进行了广泛和深入的基础研究，并在实施方法、转移效率、基因表达、动物试验、安全性评价等方面取得了很大的进展，基因治疗作为一种临床治疗方法已逐渐开始为人们所接受。β-地中海贫血是由于HBB基因的点突变所致的遗传性疾病，基因治疗β-地中海贫血作为新的治疗方式将患者有缺陷的基因进行替代或补偿缺陷功能成为新的研究热点。但检索发现：目前并没有利用携带功能正常的HBB基因免疫缺陷型自我失活型慢病毒(HIV)侵染β-地中海贫血患者自体造血干细胞，然后将矫正好的造血干细胞回输至患者体内实现治疗β-地中海贫血的相关产品。

发明内容

针对现有技术中还没有适宜治疗β-地中海贫血的基因试剂问题，本发明的目的是提供一种用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒。

本发明所述用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒，由一套用于制备特异性HBB-101HIV慢病毒的试剂和一套HIV慢病毒侵染造血干细胞的试剂组成；

其特征在于：

所述用于制备特异性HBB-101HIV慢病毒的试剂是：浓度为500～1000ng/μl特异性pSINHBB-101HIV慢病毒表达质粒500μl，用于阴性对照的浓度为500～1000ng/μl绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的pSIN GFP HIV慢病毒表达质粒200μl，浓度为500～1000ng/μlpsPAX2包装质粒200μl，浓度为500～1000ng/μl pMD2G包装质粒200μl，浓度为0.1～5M的CaCl₂ 10ml，2×HBS水溶液100ml；其中，所述2×HBS水溶液中含有280mM NaCl、1.5mMNa₂HPO₄和50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)；

所述HIV慢病毒侵染造血干细胞的试剂是：浓度为0.5mg/ml聚凝胺(polybrene)5μl，灭菌双蒸水5ml。

上述用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒中：所述用于制备特异性HBB-101HIV慢病毒的试剂优选是：浓度为800ng/μl特异性pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒500μl，用于阴性对照的浓度为800ng/μl绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的pSIN GFP HIV慢病毒表达质粒200μl，浓度为800ng/μl psPAX2包装质粒200μl，浓度为800ng/μl pMD2G包装质粒200μl，浓度为2M的CaCl₂ 10ml，2×HBS水溶液100ml；其中，所述2×HBS水溶液中含有280mM NaCl、1.5mM Na₂HPO₄和50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。

上述特异性pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒的构建方法：设计HBB基因(GeneBank NO.NC_000011)特异性引物，退火形成两端含酶切位点粘端的双链DNA，与经Not1和Spe1双酶切回收的pSIN载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养，对克隆产物进行PCR鉴定、DNA测序，鉴定出的阳性克隆即为构建成功的特异性pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒。

上述pSIN GFP HIV慢病毒表达质粒的构建方法：设计GFP基因(Gene Bank NO.NC_011521.1)特异性引物，退火形成两端含酶切位点粘端的双链DNA，与经Not1和Spe1双酶切回收的pSIN载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养，对克隆产物进行PCR鉴定、DNA测序，鉴定出的阳性克隆即为构建成功的特异性pSIN GFP HIV慢病毒表达质粒。

上述浓度为2M的CaCl₂溶液是由40ml超纯水中加入无水CaCl₂固体4.4g，定容至50ml，过滤(0.22μm滤膜)后分装至10ml试剂瓶中制得。

上述2×HBS水溶液是由900ml超纯水中加入NaCl 16.38g，Na₂HPO₄ 0.309g，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)12g，调pH至7.05，定容至1L，过滤(0.22μm滤膜)后分装至100ml试剂瓶中制得。

上述浓度为0.5mg/ml聚凝胺(polybrene)是由0.9％生理盐水1ml中加入0.5mg的聚凝胺粉末进行充分溶解后分装至5μl试管中制得。

本发明所述用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒的试剂含量为一人份量，专人专用。

本发明所述用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒在使重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞转变为能具有正常合成β-珠蛋白功能的造血干细胞中的应用。

具体的，上述应用的方法是：

(1)将特异性pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒与psPAX2包装质粒和pMD2G包装质粒按照体积比2～8:3:1的比例混合，共转染293T细胞，然后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后，制得高滴度的慢病毒浓缩液；

(2)将制得的慢病毒浓缩液加入已添加了聚凝胺(polybrene)的重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞中，使慢病毒感染造血干细胞，培养得到能具有正常合成β-珠蛋白功能的造血干细胞。

上述应用中：所述特异性pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒与psPAX2包装质粒和pMD2G包装质粒优选按照体积比4:3:1的比例混合，共转染293T细胞，制得的慢病毒滴度最高。

本发明公开了一种用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒，检索表明本发明的试剂盒填补了治疗重症β-地中海贫血基因产品的空白。解决了传统治疗重症β-地中海贫血中出现的各种问题。开辟出了基因治疗β-地中海贫血新的治疗方法。

本发明提供的用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒具有完整的操作流程，应用操作简单，病毒滴度较高，病毒感染效率高达56.99％。预示本试剂盒在使重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞转变为能具有正常合成β-珠蛋白功能的造血干细胞中具有广泛应用。对矫正后的造血干细胞进行PCR鉴定和DNA测序鉴定阳性后即可进行静脉回输从而实现治愈重症β-地中海贫血患者的目的。在临床研究及治疗应用上发展前景广阔。

附图说明

图1为β-珠蛋白基因(HBB)全长PCR产物。

图2为pSIN HBB-101质粒测序结果图。

图3为慢病毒表达质粒和包装质粒图谱。

其中：

A.pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒图谱；

B.pSIN GFP HIV慢病毒表达质粒图谱；

C.psPAX2包装质粒图谱；

D.pMD2G包装质粒图谱。

图4为磁珠分选前后CD34+细胞的百分比变化图。

其中：左图为分选前外周血中造血干细胞的含量占比，右图为分选后外周血中造血干细胞的含量占比。

图5为不同比例包装后病毒感染造血干细胞感的染效率结果示意图。

图6为重组造血干细胞集落形成数据图。

图7为RT-PCR检测重组造血干细胞中HBB基因表达情况。

图8为比例2慢病毒颗粒感染造血干细胞后提取HBB基因DNA测序与正常HBB基因对比情况。

其中：A为HBB基因编码区SNP测序峰值对比图，B为HBB基因编码区测序序列比对图。

具体实施方式

一般性说明：如下实施例所涉及的酶均购自Thermo公司，血液DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒、RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，操作完全按照相应说明书进行。质粒构建中基因测序和引物合成由华大基因公司完成。GFP绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N3来源于ATCC(美国典型菌种保藏中心)；大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。实施例中的其他实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。

所述LB液体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L。

实施例1：特异性HBB基因序列的获取

根据NCBI检索的human HBB基因序列，检索序列号为NC_000011，设计特异性引物获取HBB基因全长。

1.采集正常人外周血，使用Chelex-100法提取总DNA(参见血液DNA提取试剂盒说明书)。

2.使用Primer Premier 5软件设计特异性引物如下(SEQ ID No.1&SEQ IDNo.2)：HBB基因全长克隆上游引物5’-GGATCTTCCA GAGATTGTAC GGCTGTCATC ACTTAG-3’HBB基因全长克隆下游引物5’-CTGCCGTTCG ACGATTAAGG AACACTTCAGGGGAAAG-3’

3.按照表1的反应体系进行PCR扩增。

表1

4.Bio-Rad C1000PCR仪(Bio-Rad，美国)进行PCR反应，反应体系为98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸2min，4℃结束反应。

5.使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并回收(参见琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒说明书)，结果见图1，并命名为人血红蛋白β-珠蛋白基因HBB-101。

6.对HBB-101进行测序检测其准确性,

HBB-101的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

实施例2：pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒的构建

1.使用SpeI和NotI对HBB-101基因片段进行酶切，37℃酶切2h，酶切反应体系如下：

2.经SpeI和NotI双酶切回收pSIN HIV慢病毒表达质粒并使其线性，按照下表进行37℃酶切反应2h，酶切反应体系如下：

3.克隆制备

(1)连接

反应体系为：

(2)转化

①用冷却的无菌枪头取200μl转移至无菌离心管中，加2μl连接液，混匀，冰上放置30min。

②42℃恒温水浴加热90s，然后迅速置于冰上冷激2min。

③将连接转化的混合物加入到500μl无抗生素LB液体培养基中，180rpm，37℃孵育50min，使细菌恢复活力。

④取200μL菌液均匀地涂抹在含Amp的LB固体培养基平板上，37℃条件下培养过夜。

4.阳性克隆的鉴定及DNA测序

(1)阳性克隆筛选用枪头挑取平板上的白色单克隆菌落，分别接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃200rpm培养5-10小时。

(2)菌液PCR鉴定以菌液为模板，HBB基因全长克隆引物进行10μl体系进行普通PCR鉴定，10μl反应体系：菌液1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)1μl，dNTP Mixture(各2.5mM)0.5μl，TaKaRa LA Taq 0.1μl，ddH₂O 6.4μl。

(3)PCR反应反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共33个循环；最后72℃延伸10min。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，选出阳性克隆。

(4)挑选阳性克隆菌落，使用质粒抽提试剂盒提取质粒(参见质粒提取试剂盒说明书)，进行DNA测序。(如图2)

获得pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒。

实施例3：pSIN GFP HIV慢病毒表达质粒的构建

1.获取根据NCBI检索的GFP基因序列，检索序列号为NC_011521.1，设计特异性引物获取GFP基因全长。

2.使用Primer Premier 5软件设计GFP基因特异性引物如下(SEQ ID No.4&SEQID No.5)：

GFP基因上游引物：5’-GGACTAGTTGAGTAAAGG-3’

GFP基因下游引物：5’-TTGCGGCCGCTTATTTGTA-3’

3.以质粒pEGFP-N3为模板，克隆GFP基因全长，通过琼脂糖凝胶电泳回收GFP基因片段。

4.使用SpeI和NotI对GFP基因片段进行酶切，37℃酶切2h，酶切反应体系如下：

5.经SpeI和NotI双酶切回收pSIN HIV慢病毒表达质粒并使其线性，按照下表进行37℃酶切反应2h，酶切反应体系如下：

6.克隆制备

(1)连接

反应体系为：

(2)转化

②42℃恒温水浴加热90s，然后迅速置于冰上冷激2min。

7.阳性克隆的鉴定及DNA测序

(2)菌液PCR鉴定以菌液为模板，GFP基因全长克隆引物进行10μl体系进行普通PCR鉴定，10μl反应体系：菌液1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)1μl，dNTP Mixture(各2.5mM)0.5μl，TaKaRa LA Taq 0.1μl，ddH₂O 6.4μl。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，选出阳性克隆。

(4)挑选阳性克隆菌落，使用质粒抽提试剂盒提取质粒(参见质粒提取试剂盒说明书)。

获得pSIN GFP HIV慢病毒表达质粒。

实施例3：HIV慢病毒的包装。

HIV慢病毒是由三种质粒组成(如图3)包括psPAX2包装质粒、pMD2G包装质粒和pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒或者pSIN GFP HIV慢病毒表达质粒包装，四种质粒经过无内毒素高纯度抽提获得。

1.病毒包装细胞的准备：取浓度为1×10⁶个/ml 293T细胞(购自美国ATCC公司)8ml接种到10cm细胞培养盘中，加入10ml新鲜的1640培养基(购自美国Hyclone公司)，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24小时后，吸出所有培养基，再加入5ml 1640培养基，待用。

2.按照以下试剂的顺序和体积分别添加到50ml离心管中。

其中pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒和pSIN GFP HIV慢病毒表达质粒分别与psPAX2包装质粒、pMD2G包装质粒以体积比分别按照2:3:1、4:3:1和8:3:1的比例进行反应。各反应依次分别命名为比例1、比例2、比例3。

3.分别加入CaCl₂溶液156.25μl，快速摇匀，约10s；

4.分别加入2xHBS 1250μl，快速摇匀30s，静置2min 30s；

5.吸取2.5ml新鲜培养基加入上述混合物中，充分吹打混匀，获得复合物；

6.将复合物逐滴均匀地分别加入3份已换好新鲜培养基的293T细胞中，混匀，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养；

7.培养12-14h后细胞全换液，混匀，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养；

8.继续培养细胞36h后，荧光显微镜下观察细胞形态与转染情况，沿培养皿侧壁将病毒上清液吸出至50ml离心管中；

9.将收集的病毒上清使用0.45μm的过滤注射器过滤病毒液至病毒收集管中；

10.向病毒收集管中加满入293T新鲜培养液至病毒管口；

11.50000rpm/min，4℃，离心2.5h；

12.去上清，使用100μl冰PBS(体积)重悬病毒，分装，-80℃保存。

实施例4：慢病毒滴度的测定

将实施例3获得的三组不同比例包装的慢病毒颗粒分别同时进行如下1～8步操作。

1.取出7个干净EP管，依次标号为1～7。每个EP管中加入990μlDMEM+10％FBS培养基。取出10μl浓缩病毒加入1号EP管中，混匀，病毒此时浓度为1/10。再从1号EP管中取出10μl加入到2号离心管中，混匀。3～7号管重复2号管操作。此时病毒被稀释成1/10～1/10⁷倍。每个离心管中补入10μl 1640培养基，此时每个离心管中为1ml病毒悬液。

2.准备7个六孔板，加入10μl的病毒悬液，待用。

3.取对数生长期的NIH3T3细胞(购自美国ATCC公司)，0.25％胰酶-EDTA消化2min，放入显微镜下观察细胞状态。当细胞皱缩变圆，即可加入完全培养基终止消化，将细胞吹打下来。

4.收集细胞到离心管中，配平，300×g离心3min。

5.弃掉上清液，加入1ml 1640培养基重悬细胞，取10μl细胞计数。

6.将细胞悬液稀释成2×10⁶/ml，向六孔板每孔加入1ml细胞悬液，同时每孔加入2μl浓度为0.5mg/ml聚凝胺(polybrene)。

7.48h后，吸上清，收集细胞，流式检测GFP％。

8.以流式检测GFP％最接近1的稀释倍数进行计算，用下列公式计算病毒感染滴度：

病毒感染滴度(PFU/ml)＝[(2×10⁶细胞/孔)×GFP％]/(病毒液体积×稀释倍数)。

9.三组不同比例包装的慢病毒滴度见表2。

表2

实施例5：造血干细胞的分选和培养(美天旎免疫磁珠分选试剂盒)

1.包被细胞培养板：使用密度为5μg/cm²的Fibronectin(纤连蛋白)包被12孔细胞培养板，37℃静置6h。

2.复苏冻存的重症β-地中海贫血患者外周血单个核细胞，37℃水浴融化，将细胞从冻存管中转移到15ml离心管中，用巴氏管滴加F12培养基并定容至8ml，过程中边滴加边晃动。离心300g，3min。

3.倒掉上清液，使用1mlFACS冲洗液(含2％FBS的1×PBS)，重悬细胞，吹打混匀后用70μm细胞筛网过滤到新15ml离心管中。

4.细胞计数。再次离心，500g，10min。吸上清，按照计数的细胞数，每1×10⁸个细胞用300μl重悬细胞。

5.孵育抗体：避光操作，按照每1×10⁸个细胞加入50μl FCR封闭液与50μl CD34微珠，4℃，30min。

6.加入2ml FACS冲洗液，离心300g，3min。去上清，加入1ml FACS冲洗液重悬细胞，用70um细胞筛网过滤细胞。

7.准备吸附用磁铁及吸附用柱子。先用3ml FACS冲洗液润洗吸附柱，润洗完成后将细胞悬液加入吸附柱中，待其自然滴落完成后，加入3ml FACS冲洗液并重复5次，共计加入15ml FACS冲洗液。

8.取下吸附柱置于新15ml离心管中，加入3ml FACS冲洗液，使用活塞将液体压出洗脱CD34细胞。

9.吸100μl细胞，避光加入1μl CD34抗体，4℃，30min。流式检测CD34+细胞的百分比(如图4)。

10.取样计数。计数完成后离心500g，5min。

11.去上清，加入X-VIVO 20培养基(购自瑞士Lonza公司)重悬细胞，按比例加入以下浓度的预刺激因子，充分混匀后分装到12孔培养板中每孔2ml，培养待用。

实施例6：慢病毒颗粒有效性的验证

1.3组病毒感染外周血造血干细胞及流式细胞仪检测慢病毒侵染效率

(1)观察细胞形态和生长状况，计数，控制CD34活细胞数在1×10⁵个。

(2)吸弃1.5ml旧培养基，并添加1.5ml新鲜的X-VIVO 20培养基。

(3)向培养基内添加polybrene(聚凝胺)，体积为32μl，混匀后静置1～3min。

(4)将按照三组不同比例包装的慢病毒滴度计算后的病毒分别加入上述细胞中，病毒加入量如表3，混合均匀。

表3

(5)37℃培养24h后观察细胞形态并更换新鲜的X-VIVO 20培养基。

(6)37℃培养48小时后将细胞收集到离心管中，离心，并用新鲜的X-VIVO 20培养基重悬收获。

(7)使用流式细胞仪检测细胞表达绿色荧光蛋白的百分比(如图5)。

2.造血干细胞集落形成试验及外源HBB基因的表达测序

(1)收集病毒感染后的造血干细胞，计数。

(2)使用200μl IMDM+2％FBS重悬3000个造血干细胞。

(3)在细胞悬液中加入1ml甲基纤维素，混匀，加入2.5mm培养盘。

(4)把培养盘放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养12～14天，培养过程中禁止移动。

(5)12～14天过后观察集落形态，计数红系集落数量(如图6)。

(6)使用尖头长玻璃管吸取红系集落放于存有500μl PBS的EP管中。

(7)集落挑取完之后再加入500μl PBS，混匀，离心，500g，5min。

(8)去上清，加入200μl TRIZOL裂解细胞。

(9)提取RNA并反转录为cDNA(参见RNA提取试剂盒和反转录试剂盒说明书)。

(10)RT-PCR检测红系集落cDNA中HBB基因的表达量，其中涉及的特异性引物见SEQID No.6-9。

①反应体系见下表

②使用Bio-Rad CFX96系统的PCR仪，反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸20s(加Plate Read)，共40个循环；最后Melt Curve(熔解曲线)65℃到95℃，每30s升高0.5℃。

③根据起峰循环数采用2^-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量，进行数据分析(如图7)。

实施例7：比例2慢病毒颗粒有效性的验证

1.观察细胞形态和生长状况，计数，控制CD34活细胞数在1×10⁵个。

2.吸弃1.5ml旧培养基，并添加1.5ml新鲜的X-VIVO 20培养基。

3.向培养基内添加polybrene(聚凝胺)，体积为32μl，混匀后静置1～3min。

4.取470μl比例2慢病毒加入细胞，混合均匀。

5.37℃培养24h后观察细胞形态并更换新鲜的X-VIVO 20培养基。

6.37℃培养48h后将细胞收集到离心管中，离心，收获。

7.使用200μl IMDM+2％FBS重悬3000个造血干细胞。

8.在细胞悬液中加入1ml甲基纤维素，混匀，加入2.5mm培养盘。

9.把培养盘放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养12～14天，培养过程中禁止移动。

10.12～14天过后观察集落形态，计数红系集落数量。

11.使用尖头长玻璃管吸取红系集落放于存有500μl PBS的EP管中。

12.集落挑取完之后再加入500μl PBS，混匀，离心，500g，5min。

13.去上清，加入200μl TRIZOL裂解细胞。

14.提取RNA并反转录为cDNA。

15.PCR的产物送测序，可检测到特异性SNP双峰(如图8)。

序列表

<110>广东铱科基因生物科技有限公司

<120>一种用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒

<141> 2016-10-16

<160>9

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213>人工序列

<221> HBB基因全长克隆上游引物

<222>（1）…（36）

<400> 1

ggatcttcca gagattgtac ggctgtcatc acttag 36

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213>人工序列

<221> HBB基因全长克隆下游引物

<222>（1）…（37）

<400> 2

ctgccgttcg acgattaagg aacacttcag gggaaag 37

<210> 3

<211> 2088

<212> DNA

<213>人工序列

<221>人血红蛋白β-珠蛋白基因HBB-101

<222>（1）…（2088）

<400>3

tttttagtag caatttgtac tgatggtatg gggccaagag atatatctta gagggagggc 60

tgagggtttg aagtccaact cctaagccag tgccagaaga gccaaggaca ggtacggctg 120

tcatcactta gacctcaccc tgtggagcca caccctaggg ttggccaatc tactcccagg 180

agcagggagg gcaggagcca gggctgggca taaaagtcag ggcagagcca tctattgctt 240

acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc 300

tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag 360

ttggtggtga ggccctgggc aggttggtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 420

atagaaactg ggcatgtgga gacagagaag actcttgggt ttctgatagg cactgactct 480

ctctgcctat tggtctattt tcccaccctt aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag 540

aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag 600

gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac 660

aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat 720

cctgagaact tcagggtgag tctatgggac gcttgatgtt ttctttcccc ttcttttcta 780

tggttaagtt catgtcatag gaaggggata agtaacaggg tacagtttag aatgggaaac 840

agacgaatga ttgcatcagt gtggaagtct caggatcgtt ttagtttctt ttatttgctg 900

ttcataacaa ttgttttctt ttgtttaatt cttgctttct ttttttttct tctccgcaat 960

ttttactatt atacttaatg ccttaacatt gtgtataaca aaaggaaata tctctgagat 1020

acattaagta acttaaaaaa aaactttaca cagtctgcct agtacattac tatttggaat 1080

atatgtgtgc ttatttgcat attcataatc tccctacttt attttctttt atttttaatt 1140

gatacataat cattatacat atttatgggt taaagtgtaa tgttttaata tgtgtacaca 1200

tattgaccaa atcagggtaa ttttgcattt gtaattttaa aaaatgcttt cttcttttaa 1260

tatacttttt tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt tcagggcaat 1320

aatgatacaa tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg ataatttctg 1380

ggttaaggca atagcaatat ctctgcatat aaatatttct gcatataaat tgtaactgat 1440

gtaagaggtt tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg cttttatttt 1500

atggttggga taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc taatcatgtt 1560

catacctctt atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca 1620

tcactttggc aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg 1680

tgtggctaat gccctggccc acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct 1740

attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc 1800

ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgcaatg atgtatttaa 1860

attatttctg aatattttac taaaaaggga atgtgggagg tcagtgcatt taaaacataa 1920

agaaatgaag agctagttca aaccttggga aaatacacta tatcttaaac tccatgaaag 1980

aaggtgaggc tgcaaacagc taatgcacat tggcaacagc ccctgatgca tatgccttat 2040

tcatccctca gaaaaggatt caagtagagg cttgatttgg aggttaaa 2088

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<221> GFP基因上游引物

<222>（1）…（18）

<400> 4

ggactagttg agtaaagg 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<221> GFP基因下游引物

<222>（1）…（19）

<400> 5

ttgcggccgc ttatttgta 19

<210> 6

<211> DNA

<212>

<213>人工序列

<221> 内参基因GAPDH上游引物

<222>（1）…（21）

<400> 6

tgacttcaac agcgacaccc a 21

<210> 7

<211> DNA

<212>

<213>人工序列

<221> 内参基因GAPDH下游引物

<222>（1）…（21）

<400> 7

caccctgttg ctgtagccaa a 21

<210> 8

<211> DNA

<212> 18

<213>人工序列

<221> HBB基因特异性上游引物

<222>（1）…（18）

<400> 8

atgaagttgg tggtgagg 18

<210>9

<211> DNA

<212> 18

<213>人工序列

<221> HBB基因特异性下游引物

<222>（1）…（18）

<400> 9

tgaggttgtc caggtgag 18

Claims

1.一种用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒，由一套用于制备特异性HBB-101HIV慢病毒的试剂和一套HIV慢病毒侵染造血干细胞的试剂组成；

其特征在于：

所述用于制备特异性HBB-101HIV慢病毒的试剂是：浓度为500～1000ng/μl特异性pSINHBB-101HIV慢病毒表达质粒500μl，用于阴性对照的浓度为500～1000ng/μl绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的pSIN GFP HIV慢病毒表达质粒200μl，浓度为500～1000ng/μl psPAX2包装质粒200μl，浓度为500～1000ng/μl pMD2G包装质粒200μl，浓度为0.1～5M的CaCl₂10ml，2×HBS水溶液100ml；其中，所述2×HBS水溶液中含有280mM NaCl、1.5mM Na₂HPO₄和50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)；

2.根据权利要求1所述用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒，其特征在于：所述用于制备特异性HBB-101HIV慢病毒的试剂是：浓度为800ng/μl特异性pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒500μl，用于阴性对照的浓度为800ng/μl绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的PSIN GFP HIV慢病毒表达质粒200μl，浓度为800ng/μl psPAX2包装质粒200μl，浓度为800ng/μl pMD2G包装质粒200μl，浓度为2M的CaCl₂ 10ml，2×HBS水溶液100ml；其中，所述2×HBS水溶液中含有280mM NaCl、1.5mM Na₂HPO₄和50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。

3.权利要求1或2所述用于矫正重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒在使重症β-地中海贫血患者自体造血干细胞转变为能具有正常合成β-珠蛋白功能的造血干细胞中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用方法是：

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述特异性pSIN HBB-101HIV慢病毒表达质粒与psPAX2包装质粒和pMD2G包装质粒按照体积比4:3:1的比例混合，共转染293T细胞，制得的慢病毒滴度最高。