CN106488927A

CN106488927A - 用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法

Info

Publication number: CN106488927A
Application number: CN201580038031.9A
Authority: CN
Inventors: S·帕蒂尼尔
Original assignee: Roquette Freres SA
Current assignee: Kerr Bean Biotech Corp
Priority date: 2014-07-18
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2017-03-08
Also published as: KR20170028353A; US20170152294A1; BR112017001039A2; MX2017000772A; WO2016009145A1; EP3169695B1; JP2017521451A; EP3169695A1

Abstract

本发明涉及一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤：供给一种由发酵产生的微藻生物质；任选地，洗涤该生物质，以便消除可溶性间质化合物，在50℃和150℃之间，优选在100℃和150℃之间的温度下将该生物质热透化，持续时间在10秒和5分钟之间，优选持续时间在10秒和1分钟之间；将以此方式透化的生物质借助选自下组的固液分离技术进行消除，该组由以下各项组成：正向过滤或切向过滤、絮凝和离心，更确切地，多级离心，以获得一种可溶性部分；任选地，将由此获得的可溶性部分通过微孔过滤进行回收和澄清，以便从中除去残余不溶性元素；在具有小于5kDa，优选在1kDa和5kDa之间的截止阈值的膜上对该可溶性部分进行超滤，以产生一种可溶性分离蛋白；然后将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。

Description

用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法

本发明涉及一种用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法。

本发明还涉及以此方式获得的微藻分离蛋白。

背景技术

所属领域技术人员熟知，小球藻是一种潜在的食物来源，因为它们富含蛋白质和其他必需营养素。

它们被描述为包含45％的蛋白质、20％的脂肪、20％的碳水化合物、5％的纤维素和10％的矿物质和维生素。

鉴于其丰度和氨基酸谱，微藻蛋白因此被认为是大豆蛋白或豌豆蛋白的替代性食物来源。

蛋白部分也可以被开发为化妆品行业、或甚至医药行业中的功能剂。

然而，由于在所述部分中存在不希望的化合物(例如叶绿素)而导致包含它们的食物组合物的颜色、味道和结构方面发生不希望的变化，所以在微藻蛋白的食品应用方面的发展尚不显著。

为了增加其在食品应用中的潜力，并且也为了增加其商业价值，因此必须在不影响它们的分子结构的前提下从微藻中提取这些蛋白。

“软”提取技术将因此需要分离具有高溶解度和良好技术和功能特性的蛋白质，但是微藻细胞壁的刚性，尤其绿色微藻的刚性，根本上与这一点矛盾，这是因为它破坏了细胞内蛋白质的提取和完整性。

因此，与其相反，常规地“硬”的物理或化学条件被用来破坏微藻细胞壁。

因此，许多研究提出了碱溶类型、通过有机溶剂型或高压匀浆类型提取的技术。

然而，在这些技术选择中，蛋白质的变性未认为是麻烦的，这是因为大多数的这些方法开发，是出于分析的目的，或意在提供用于酶消化的底物，从而产生水解蛋白。

然而，保存细胞组分完整性的有效崩解方法具有不仅最大化产率，而且最大化提取的产物的质量的责任。

换言之，用于优化崩解壁的方法必须例如避免：

-目标产物的化学污染，

-使用过高的破裂能；后者可能导致感兴趣的细胞内分子的不可逆变性或降解。

此外，对于大规模生产而言，对于选择的方法，重要的是可转换值这一规模。

最后，这一细胞崩解步骤的引入必须是容易的，并且必须对随后的方法/处理步骤不具有负面影响。

所有这些限制影响崩解方法的效率并且由于同样原因影响其能量消耗。

这就是为什么珠磨机技术是优选的，因为它被认为对于按其天然形式释放细胞内蛋白质是有效的。

在珠磨机中，将细胞与小球形颗粒一起以悬浮液状态搅动。细胞的破碎是由珠间剪切力、碾磨以及与珠的碰撞引起的。

例如，专利US 5 330 913中给出了一种适合的珠磨机的描述。这些珠使细胞破裂以从中释放细胞内容物。然后以“水包油”乳液形式获得粒径小于起源细胞的悬浮液。

通常雾化此乳液并且消除水，然而留下包含由细胞碎片、间质可溶性化合物和油组成的异质混合物的干燥粉末。

在使用这些细胞崩解技术时难以解决的是单独地分离细胞内内容物(以便排除膜碎片、糖、纤维和脂肪)，并且尤其是保存蛋白负载的质量。

在四爿藻属的微藻的情况下，安雅施文茨法伊尔(Anja Schwenzfeier)等人(生物资源技术(Bioresource Technology)，2011，102，9121-9127)提出了保证分离蛋白质的溶解度和氨基酸谱质量的方法，其中污染物(例如染色物质)被除去，该方法包括以下步骤：

-用珠磨机进行细胞崩解，

-将磨碎的微藻悬浮液离心，

-上清液的透析，

-穿过离子交换树脂，

-洗脱物的透析，

-脱色，然后

-洗涤和再悬浮。

然而，这种实验室方法(用于处理24g的生物质)不能放大到工业规模，其中而将珠磨机方法用于回收完整生物质。

已经提出了替代解决方案，完全地改变了用于释放微藻细胞内容物的技术，例如脉冲场电处理。

这是因为生物细胞暴露于高强度脉冲电场会改变细胞膜的结构。

外源场引起细胞膜的充电。在充足的跨膜电压(0.5V-1V)下，磷脂的分子排列改变，这导致细胞膜失去其屏障作用，使得它可渗透。取决于使用的条件，这一细胞膜透化会是可逆的或不可逆的。

然而，为了有效提取细胞内化合物，本领域普通技术人员建议造成细胞膜的不可逆的透化，由此导致其崩解。

然后，细胞膜的这一破裂促进释放细胞内容物的释放，并且在使用补充性溶剂提取技术的情况下，也促进溶剂渗透进入细胞。

尽管是有前景的，但是不幸地，这一技术并不能外推至工业规模以处理在1m³至200m³的反应器中产生的生物质。

其结果是，对于提供用于弱化微藻细胞壁的技术仍存在未满足的需求，该技术能够释放细胞内内容物，而不崩解细胞或削弱其组分的质量。

本申请人公司已经发现，这种需要可以通过将用于微藻细胞的热透化的方法与离心和膜分离(微孔过滤，超滤)的步骤加以组合得到满足。

因此，本申请人公司反对一个技术偏见，该技术偏见认为，用于细胞破碎的热方法，就像由机械崩解引起的剪切力，是用于降解或变性源自微藻的产物的替代的技术(里奇蒙(Richmond)，1986，微藻大量培养手册(Handbook of Microalgal Mass Culture)，CRC出版有限公司(CRC Press,Inc)-莫利纳格里马(Molina Grima)等人，2003，微藻生物质和代谢物的回收：方法选项和经济学(Recovery of microalgal biomass and metabolites:process options and economics)，生物技术进步(Biotechnol.Adv.)20:491-515)。

此外，一旦释放自细胞内区室，可以容易地通过离心和膜分离进行分子的回收，只要由本申请人公司开发的热处理并不导致细胞壁的崩解。

本发明涉及一种用于热透化小球藻属微藻生物质的方法，该方法以从微藻生物质中回收尤其富含肽和多肽并且富含寡糖的可溶性部分的方式进行。

更确切地，根据本发明所述的方法是一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

-提供一种由发酵产生的微藻生物质，

-任选地，洗涤该生物质，以便消除间质可溶性化合物，

-在50℃和150℃之间，优选在100℃和150℃之间的温度下将该生物质热透化，持续时间在10秒和5分钟之间，优选持续时间在10秒和1分钟之间，

-将以此方式透化的生物质通过选自下组的固液分离技术进行消除，该组由以下各项组成：正向过滤或切向过滤、絮凝和离心，更具体地，多级离心，以获得可溶性部分，

-任选地，将以此方式获得的可溶性部分通过微孔过滤进行回收和澄清，以便从中除去残余不溶性物质，

-在具有小于5kDa，优选在1kDa和5kDa之间的截止阈值的膜上对该可溶性部分(澄清的或未澄清的，取决于是否分别进行了前述回收和澄清的步骤)进行超滤，以便获得可溶性分离蛋白，然后

-将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。

微藻的选择

优选地，小球藻属微藻选自由普通小球藻、根腐小球藻和原壳小球藻组成的组，并且更具体地是原壳小球藻。

在一个具体实施例中，该菌株为原壳小球藻(菌株UTEX 250-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(The Culture Collection of Algae at the Universityof Texas at Austin-USA))。

在另一个具体实施例中，该菌株为耐热性小球藻(菌株UTEX 1663-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(The Culture Collection of Algae at theUniversity of Texas at Austin-USA))。

在异养条件下并且在不存在光的情况下进行培养通常导致产生具有按干细胞的重量计，45％至70％的蛋白含量(通过测量氮含量N×6.25进行评估)的小球藻生物质。

如将在下文示例，分两个步骤进行这一培养：

-在包含葡萄糖和酵母提取物的培养基中进行预培养，在28℃下，伴随搅动，持续72h，然后

-自身在葡萄糖和酵母提取物中持续多于36h，在28℃下，伴随搅动并且在用氨水调节的pH 6.5下，进行用于产生生物质的培养，

这生成具有按干细胞的重量计，52％的级别的蛋白含量(用N x 6.25进行评估)的大约80g/l的生物质。

然后通过固液分离，通过正面过滤或切向过滤、或通过另外为本领域普通技术人员已知的任一方式收集生物质。

任选地，本申请人公司然后推荐以这样一种方式洗涤生物质，该方式是关于通过生物质的一系列的浓缩(通过离心)/稀释来消除间质可溶性化合物。

出于本发明的目的，术语“间质可溶性化合物”旨在意指发酵培养基中的所有可溶性有机污染物，例如水溶性化合物，例如盐、残余葡萄糖、具有2或3的聚合度(或DP)的寡糖、或肽。

然后将其间质可溶性化合物的以此方式纯化的生物质优先调节至按重量计15％和30％之间的干物质，优选调节至20％和30％之间的干物质。

生物质的热透化

然后在50℃和150℃之间，优选在100℃和150℃之间的温度下进行热处理，持续时间在10秒和5分钟之间，优选持续时间在10秒和1分钟之间。

这一处理使能允许细胞内组分扩散进反应介质。

最后，在这些步骤结束时，允许温度冷却至0℃和10℃之间的最终温度，优选冷却至4℃的级别的温度。

不希望受具体理论束缚，本申请人公司认为，在这些操作条件下进行的热处理可以因此充当细胞膜弱化方法，该方法允许自发释放细胞内区室的可溶性组分，或甚至释放细胞外基质。

除了离子物质，有机物质，例如糖(主要是DP1和DP2)，肽和多肽也从细胞排出。

相反地，脂质和疏水有机化合物保留在细胞中，由此清晰地证明，细胞被透化并且并未被溶化或破坏。

因此，根据本发明所述的方法并未导致乳液形成，而是的确形成水性悬浮液。

所有这些可溶性物质通过透化膜的释放类似于渗析型的自由扩散的过程。

因此，滞后时间是必需的，以允许在透化膜的热处理后充分的扩散。

在文献中，用于酵母细胞膜的脉冲场透化的方法(目的是从其提取蛋白)需要从4h至6h(日内瓦(Ganeva)等人，2003，(Analytical Biochemistry)，315，77-84)。

根据本发明，使用在10秒和5分钟之间的远远更短的反应时间。

然后通过固液分离技术，通过正面或切向过滤、通过絮凝、通过离心或通过另外为本领域普通技术人员已知的任一方式消除残余生物质，由此使能容易地回收已经从其中去除微藻细胞的可溶性部分。

在用于消除生物质的此步骤之前，可能对透化的细胞进行稀释，以便提高此固液分离步骤的产率和质量。

所得可溶性部分最后基本上由蛋白(50％-80％w/w)和糖(5％-15％w/w)组成。

膜分离

用于回收可溶性蛋白的常规方法一般基于用三氯乙酸(10％重量/体积)或用硫酸铵沉淀所述蛋白的步骤。

然而，通过沉淀发生的这些分离是非常破坏性的细胞破裂方法(通常是通过超声处理或匀浆)的结果，尽管这些可能事实上增加提取率，尤其是生成变性的低溶解度蛋白。

然后能仅借助通过化学手段(用氢氧化钠裂解)、物理手段(高温处理)或酶手段(蛋白水解酶)的其水解产物(至肽)，设想其重新功能化。

恰恰相反，根据本发明所述的方法使可能释放完整天然肽和多肽，其所有功能性仍可以表达。

本发明的方法接下来导致通过膜分级来分离感兴趣的蛋白。

因此本申请人公司推荐分两个步骤进行该方法：

-在具有小于5kDa，优选在1kDa和5kDa之间的截止阈值的膜上对该可溶性部分(澄清的或未澄清的，取决于是否分别进行了前述回收和澄清的步骤)进行超滤，以便获得可溶性分离蛋白。

利用这些通路使可能纯化其残留的盐和糖的可溶性肽和多肽。

由此获得可溶性蛋白的分离物，其具有按重量计大于90％的蛋白含量。

从以下实例将更清楚地理解本发明，所述实例旨在是说明性的，并且是非限制性的。

具体实施方式

实例1：通过分批补料发酵进行原壳小球藻的生产

使用的藻种是原壳小球藻UTEX 250。

预培养：

-在一个2l锥形瓶中的500ml的培养基；

-该培养基的组成(以g/l计)：

表1

孵育在以下条件下进行：持续时间：72h；温度：28℃；搅动：110rpm(伊孚森莫特顿(Infors Multitron)孵育器)。

然后将预培养物转移到30l赛多利斯(Sartorius)型发酵罐中。

用于生物质生产的培养：

该培养基如下：

表2

在接种后将发酵罐的初始体积(Vi)调节至17L。达到大约20l-25l的最终体积。

用于进行发酵的参数如下：

表3

温度	28℃
		pH	5.0-5.2，使用28％w/w NH₃
pO₂	20％±5％(通过搅动来维持)
		搅动	最小300rpm
气流速率	15l/min

当残余葡萄糖浓度下降至低于10g/l时，则引入处于在大约800g/l的浓缩溶液形式的葡萄糖，以维持发酵罐中的葡萄糖含量在0与20g/l之间。

结果

在40h时获得包含52％的蛋白的80g/l的生物质。

实例2.原壳小球藻生物质的热透化和可溶性部分的回收

根据实例1获得的生物质经历：

-离心并且洗涤，以达到220g/l的干物质含量并且达到多于90％的纯度(用生物质的干物质与总干物质的比率定义纯度)，然后

-通过UHT在135℃下大约十秒进行热处理。

以此方式获得的“部分溶解的”生物质具有50％的肽和蛋白质(表示为总氨基酸)，20％糖和15％脂质的级别，对应于相对于总初始生物质，20％和50％之间的增溶度。

然后通过离心分离，从可溶性部分将其分离。

因此，“原始”水溶性物质包含60％和75％之间的肽和蛋白(表示为总氨基酸，其中90％精氨酸和谷氨酸)，10％和25％之间的糖和小于1％的脂质。

在离心沉淀中，“耗尽的”的生物质仍具有20％和35％之间的肽和蛋白(表示为总氨基酸)，25％至35％糖和最重要的在20％至25％之间的脂质。

然后将具有5％的干物质含量和60％和75％之间的滴度的肽和蛋白(表示为总氨基酸)的微孔过滤渗透物“P1”在具有<5kDa截止阈值的膜上进行超滤。

以此方式获得的超滤渗余物“R2”具有10％(5％至20％)干物质，并且包含90％以上具有大于或等于5kDa的分子量的肽。

具有小于3％的干物质含量的渗透物“P2”，包含具有小于5kDa的分子量的肽和具有小于或等于2的DP的寡糖。

然后尤其可以在反渗透膜(具有93％的NaCl排斥程度)上过滤这一渗透物“P2”，以获得：

O具有10％以上干物质的渗余物“R3”，包含具有小于5kDa的分子量的肽和DP 2的寡糖，例如蔗糖；

O具有0.1％干物质的渗透物“R3”，包含DP 1的寡糖、盐、游离氨基酸和有机酸。

然后将分离蛋白“R2”：

-用氢氧化钾中和至pH 7，

-通过蒸发浓缩至35％干物质(DM)，

-进行巴氏灭菌并

-雾化。

Claims

1.一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤：

-提供一种由发酵产生的微藻生物质，

-任选地，洗涤该生物质，以便消除间质可溶性化合物，

-将以此方式透化的生物质通过选自下组的固液分离技术进行消除，该组由以下各项组成：正向过滤或切向过滤、絮凝和离心，更具体地，多级离心，以获得一种可溶性部分，

-在具有小于5kDa，优选在1kDa和5kDa之间的截止阈值的膜上对该可溶性部分进行超滤，以便获得一种可溶性分离蛋白，然后

-将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于这些小球藻属微藻选自由普通小球藻、根腐小球藻和原壳小球藻组成的组，并且更具体地是原壳小球藻。