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CN106461682B - HbA1c的酶促测定 - Google Patents

HbA1c的酶促测定 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种确定糖化血红蛋白(HbA1c)的量的方法，其中，如果需要，样品中的红细胞溶血，并且如果需要，之后释放的血红蛋白与蛋白水解剂接触并且对通过这种方式或其他方式产生的糖化血红蛋白降解产物进行定量。为了提供具有足够的反应必要的化学化合物稳定性性质的可用于此的过程和试剂，提出了提供无活性蛋白酶形式的必需蛋白水解剂，其然后仅在原位再活化。在本发明的具体实施方式中，为了使在1‑3范围的非常低的pH下解折叠的血红蛋白稳定化，溶血溶液中应该存在至少一种合适的稳定剂，并且，在其中无色染料与确定HbA1c的量结合使用的本发明的实施方式中，根据本发明，提出了后者可用特定膦化合物和/或含硫化合物稳定化。

Description

HbA1c的酶促测定
技术领域
本发明涉及一种确定样品中糖化血红蛋白(HbA1c)的量的方法，以及可用于确定样品中糖化血红蛋白(HbA1c)的量的方法的试剂盒。
背景技术
根据IFCC(国际临床化学和实验医学联合会)的定义，糖化血红蛋白(HbA1c)是葡萄糖与血红蛋白的β链的N-端缬氨酸偶联的稳定产物，并且HbA1c的量相对于总血红蛋白的量(mmol HbA1c/mol总血红蛋白)表示在采集血液样品前最后8周的平均血糖水平并且因此称为“长期血糖”。因此，通常应该在20至42mmol/mol范围内的HbA1c值是糖尿病诊断和治疗的重要指标。
已知的确定HbA1c的方法是例如免疫试验，例如比浊免疫试验(TIA)和高功率液相色谱(HPLC)。酶促方法也已存在一段时间，其中对糖化血红蛋白与果糖基氨基酸氧化还原酶(FAOD)的反应进行定量。
在酶促研究中，如所有其他HbA1c方法的情况那样，第一步是血液样品中红细胞的溶血破裂以释放其中含有的HbA1c。然后，释放的糖化血红蛋白与蛋白水解试剂接触以产生糖化血红蛋白降解产物。这些蛋白水解产生的降解产物包括果糖基缬氨酸(Fru-Val)和果糖基缬氨酸组氨酸(Fru-Val-His)或者更长链的果糖基肽，其从糖化血红蛋白的β链的氨基末端切下。通过果糖基氨基酸氧化酶(FAOX)或果糖基肽氧化酶(FPOX)的酶活性来氧化果糖基氨基酸或果糖基肽，其中该氧化步骤的结果是产生过氧化氢(H2O2)。
在上述氧化步骤中，产生的过氧化氢的量与果糖基化的氨基酸或肽的量相关。因此，在该步骤中产生的过氧化氢的量是关于样品中HbA1c的量的测量值。因此，对HbA1c的量的确定最终受到对过氧化氢的量定量的影响，例如，基于颜色反应，其通过光测量评价并且其在化学计量上与过氧化氢的量相关。然而，原则上，也可能相应使用用于对样品中过氧化氢的量进行定量的任何其他分析方法。
在给定的过氧化氢定量方法中，还原的无色染料被过氧化氢氧化。然而，该方法带来了困难，无色染料的自氧化导致非特异性空白值信号以及光谱背景增加，其导致对分析信号的精确分光光度测量中的困难。在另一个方面中，无色染料相比其他染料的优势在于它们通常有更高的分子吸收系数。除了主要部分以外，无色染料的最大吸收很高，以至于一般可忽略与血液组分例如胆红素和血红蛋白的相互作用的光学影响。
发明目的
化学和诊断试剂的长期稳定性是一个难以解决的问题，尤其是试剂在运输、储存和/或加工期间暴露于特别高或特别低的温度和/或明显的温度变化时。应理解，这也以相同程度施加于上述无色染料，例如，HbA1c的酶和其他试剂。
然而，同时，待研究的起始材料以及待确认以实现可靠可重复结果的反应的中间体和最终产物的稳定性也是重要的。
因此，本申请的发明人将目的设为提供一种确定样品中糖化血红蛋白(HbA1c)的方法以及可用于该方面的试剂，其中反应必要的化学化合物以足够稳定的形式存在。优选地，本发明的方法和本发明的试剂的目标在于在确定HbA1c的量的同时确定总血红蛋白。
发明内容
根据本发明，通过下文详述的多个方面达到上述目标，并且其通常有共同特性，即其包括一种确定样品中HbA1c的量的方法，其中进行了以下方法步骤：
a)使样品中的红细胞溶血以释放血红蛋白，包括其中含有的HbA1c，
b)使方法步骤a)中释放的包括HbA1c的血红蛋白接触蛋白水解作用试剂，用于产生糖化血红蛋白降解产物；并且
c)通过对方法步骤b)中产生的糖化血红蛋白降解产物进行定量来确定HbA1c的量。
用于本发明的术语样品表示出于分析操作的目的制备的任何材料，并且其含有待分析的比例的血红蛋白和/或HbA1c。在大多数情况中，样品将是新鲜全血样品。然而，本发明还包括以下样品，例如，血液保存物、纯化的血液、全血冻干物、红细胞浓缩物、预溶血的血液样品、血红蛋白标准溶液、HbA1c标准溶液和含有合成血红蛋白降解产物的标准溶液，例如，合成HbA1c降解产物。
方法步骤a)并不要求HbA1c已经在待分析的样品中游离存在。在标准溶液含有合成血红蛋白或HbA1c降解产物的情况中，也不额外需要方法步骤b)。其中在待分析的样品中固有含有的血红蛋白或HbA1c或其降解产物尚未存在于溶液中时，在步骤a)之前或期间将它们放入通常水性的溶液中。
红细胞的溶血基本受到所有机械、化学或渗透溶血手段或方法的影响，其中本领域普通技术人员知晓它们导致红细胞的完全溶血。本发明的手段或方法在其导致通过破坏细胞膜溶解红细胞并且将红细胞中含有的血红蛋白转移至周围介质中时被认为是溶血作用的。
本领域技术人员已知的溶血作用手段或方法的示例是超声处理或添加溶血去污剂(detergent)或强低渗盐溶液。
在使用溶血作用去污剂的本发明的实施方式中，它们可选自，例如，离子型、阴离子型和两性去污剂，其中本文所用术语去污剂表示其包括降低两相之间的界面张力或液体表面张力的物质。
在某些实施方式中，使用的溶血作用去污剂例如选自以下：溶血聚乙二醇(PEG)、溶血糖苷和酯、溶血聚氧乙烯烷基醚、溶血聚氧乙烯烷基苯基醚、溶血聚氧基乙二醇、溶血聚氧丙烯聚氧乙烯三嵌段共聚物(泊洛沙姆，普流罗尼克)、正-十二烷基-β-D-麦芽苷、正-庚基-β-D-硫苷、正-辛基-β-D-硫苷、蔗糖月桂酸酯、蔗糖癸酸酯、蔗糖亚油酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖胆酸酯和上述化合物的衍生物及其混合物。
原则上，考虑本领域技术人员已知的所有蛋白水解作用手段，例如，蛋白酶，其中本发明的手段在其通过肽键的水解导致蛋白质切割时具有蛋白水解效果。
在蛋白水解剂是蛋白酶的实施方式中，其原则上可选自通过真核细胞或原核细胞重组获得或从生物体或者丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、金属或未知类型的生物体组分内源性获得的所有蛋白酶，例如，顶体蛋白、氨基肽酶B、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶I、羧基肽酶A、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、糜蛋白酶、胶原酶、双肽酰肽酶4、中性蛋白酶、弹性蛋白酶、因子IIa、因子Xa、无花果蛋白酶、gpr-内肽酶、HIV-蛋白酶、激肽释放酶、MBTPS1、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤溶酶、前菌毛素IV型肽酶、脯氨酰-寡肽酶、蛋白酶K、蛋白酶体、肾素、分泌酶(α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶)、嗜热菌蛋白酶(EC 3，4，24，27)、凝血酶、胰蛋白酶、尿激酶、来自杆菌(Bacillussp.)的蛋白酶N、来自曲霉(Aspergillus sp.)的蛋白酶、来自链霉菌(Streptomyces sp.)的蛋白酶XIV、和来自嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)的蛋白酶S。
在本发明的某些实施方式中，使用特异性切割HbA1c的蛋白酶可能具有相关优势。然而，通常本发明并不要求蛋白酶在区分糖化和非糖化血红蛋白方面有任何特异性。因此，在该方面，也可使用不特异性区分HbA1c和非糖化血红蛋白的蛋白酶。在许多实施方式中，甚至可能明确需要使用的蛋白酶并不以相应方式特异性作用。
在本发明的许多方面中，不需要使用蛋白酶来产生给定的降解产物。然而，在本发明的许多实施方式中，特定地使用蛋白酶，其蛋白水解活性导致果糖基缬氨酸组氨酸或果糖基缬氨酸从糖化血红蛋白的β链的氨基末端释放。
确定HbA1c的量可能基本受到本领域技术人员已知的用于方法步骤b)中产生的糖化血红蛋白降解产物的所有定量过程的影响，例如，通过HPLC分析或酶促测定，如本文之前所述。
除了上述方法以外，本发明还提出了用于确定样品中HbA1c的量的方法的试剂盒，其特征在于它们包含在分开容器中的至少2种不同溶液，其中至少2种不同溶液分别是实施下文中详细描述的本发明的多个方面的组合物。
方面1-蛋白酶稳定化
根据第一方面，因为提出了用于确定样品中HbA1c的量的方法而达到了本发明的上述目的，其中要求进行方法步骤a)至c)。
根据本发明的这一方面，因为至少2种不同溶液与HbA1c接触，激活了方法步骤b)中使用的蛋白水解作用剂，其中一种溶液具有1-8范围内的pH值，并且含有
i)至少一种蛋白酶，
ii)每1000kU/l的蛋白酶，0.1至2mmol/l的针对二价金属离子的螯合剂，和
iii)0.5至10mmol/l Ca2+或0.5至10mmol/l Mg2+，
其中螯合剂：Ca2+或螯合剂：Mg2+的摩尔比的范围是1∶2-1∶20，并且另一种溶液含有100至5000μmol/l的选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子。
另外，提出了用于确定样品中HbA1c的方法的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含分开的容器中的至少2种不同溶液，其中一种溶液具有1-8范围的pH-值，并且含有上述组分i)至iii)，其中螯合剂：Ca2+或螯合剂：Mg2+的摩尔比的范围是1∶2-1∶20，并且另一种溶液含有100至5000μmol/l的选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子。
在本发明的某些实施方式中，含有蛋白酶的溶液的pH值为至少4和/或至多6。在本发明的其他实施方式中，含有蛋白酶的溶液的pH值大于4和/或小于6。在本发明的具体实施方式中，溶液的pH值范围是4.5-5.5并且在非常具体的实施方式中，其范围是4.9-5.1。
金属蛋白酶的活性取决于二价金属离子如Fe2+、Mn2+、Co2+或Zn2+的存在。目前，54个金属蛋白酶家族被分成15个亚族(clan)，其中最显著的是具有39个家族的亚族MA。这39个家族中就有19个可与所谓的中性锌金属蛋白酶相关。其他金属蛋白酶是锰或钴依赖性的。
以下金属蛋白酶属于宗派MA：膜丙氨酰氨基蛋白酶、肽酰-二肽酶A、甲拌磷-寡肽酶、寡肽酶F(乳球菌(Lactococcus))、溶真菌素(mycolysin)、免疫抑制剂A(芽孢杆菌(Bacillus))、非中性链霉菌-蛋白酶、利什曼溶蛋白、微生物胶原酶、胶原酶colA、基质-金属肽酶1、锯齿溶素(serralysin)、脆溶素、自溶素(衣藻属(Chlamydomonas))、虾红素、复制溶素(reprolysin)、脑啡肽酶、IgA-特异性金属内肽酶、链格孢溶素(tentoxilysin)、嗜热菌蛋白酶、中性葡萄球菌蛋白酶、羧基肽酶taq、炭疽热致死因子、次溶素(deuterolysin)、真菌溶素(fungalysin)、细胞切割蛋白ftsH、胞吞溶素(cytophagalysin)、妊娠相关血浆蛋白1、Ste24-内肽酶(酿酒酵母(Saccharomyces))、HtpX-内肽酶(大肠杆菌E.coli))、古细菌溶素(archaelysin)、肽酶blaR1、肽酶prtB、增强蛋白、甘氨酰-氨基肽酶(荚膜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas capsulata))、肽酶IgA(多枝梭菌(Clostridium ramosum))、肽酶stcE(大肠杆菌(E.coli))、肽酰-asp-金属内肽酶(绿脓假单胞菌(P.aeruginosa))和ImmA-肽酶。
如果蛋白酶在延长的时间段上是其活性形式，则存在大部分的酶通过自消化而被破坏的风险。在这一方面，如果需要避免酶的自消化，则通常需要蛋白酶的酶促活性的暂时无活性。
蛋白酶的自消化问题已经为本领域所知。为了解决这一问题，本领域提出，例如，通过螯合剂从蛋白酶嗜热菌蛋白酶中移去锌的蛋白酶嗜热菌蛋白酶，具体是含SH基团的试剂，或通过简单过量的EDTA。
然而，本申请的发明人意识到过量的螯合剂可能对蛋白酶的稳定性有负面影响，因为螯合剂不仅从蛋白酶中移去对催化活性而言必要的辅因子，如需要的那样，并且还移去大比例的Ca2+和/或Mg2+，但是许多蛋白酶的稳定性和结构完整性需要Mg2+或Ca2+的存在。另外，发明人发现在特定pH-值下在试剂隔室中制备无活性形式的蛋白酶并且在第二试剂隔室中制备的通过选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子的手段再活化蛋白酶代表了没有显著活性损失的蛋白酶长期储存的最佳形式。
由于钙离子和镁离子对蛋白酶的蛋白质稳定性而言是明显必要的，使用过量的螯合剂最终导致蛋白酶蛋白的失稳。然而，发明人发现可能通过提供相当过量的Ca2+和/或Mg2 +来抵抗这种失稳，其使得使用使蛋白酶失活所需的量的螯合剂不会带来蛋白酶的蛋白质结构失稳。
这种连接的关键之处在于使用的钙或镁离子与使用的螯合剂的具体摩尔比，这确保了存在充足的钙或镁离子来使蛋白酶的蛋白质结构稳定而不从与螯合剂的螯合物中置换选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子。
适用于本发明的针对二价金属离子的螯合剂的示例是乙酰丙酮、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺、乙二胺四乙酸盐(EDTA)、N-(2-羟乙基)-乙二胺-N.N.N′-三乙酸三钠盐(HEDTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-双(氨基乙基醚)-N，N，N′，N′四乙酸(EGTA)、2-(2-氨基乙基氨基)乙醇、二亚乙基三胺、亚氨基二乙酸盐、三亚乙基四胺、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、三氨基三乙基胺、次氮基三乙酸盐、双(亚水杨基)乙二胺、乙二胺三乙酸盐、乙二胺四乙酸盐、二亚乙基三胺盐(DTPA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸盐、草酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、二甲基乙二肟、8-羟基喹啉、2，2′-二吡啶、1，10-菲咯啉、二巯基丁二酸、1，2-双(二苯基膦基)乙烷。
用于选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子的螯合剂以比对于钙离子或镁离子更高的亲和性结合选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子。优选地，使用的螯合剂以比钙离子或镁离子至少高103倍的结合强度结合选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子。
可根据蛋白酶的量在上述范围内自由选择螯合剂浓度。在一个实施方式中，溶液含有每1000kU/l的蛋白酶中0.5至1.5mmol/l的螯合剂。在另一个实施方式中，溶液含有每1000kU/l的蛋白酶中0.9至1.1mmol/l的螯合剂。
可在上述浓度范围内自由选择钙离子或镁离子的量。在一个实施方式中，钙离子或镁离子浓度范围是3至8mmol/l。在另一个实施方式中，钙或镁浓度范围是4至7mmol/l。
金属离子可用于以任意合适盐形式使用的试剂溶液中，只要选择的盐形式在批料中产生所需量的溶解金属离子，例如，盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、甲酸盐和乙酸盐。在批料中有金属离子Ca2+或Mg2+的实施方式中，在某些实施方式中，出于该目的而在使用试剂溶液中存在的钙盐或镁盐因此是氯化钙、硝酸钙、甲酸钙、乙酸钙或相应的Mg2+盐。在其中二价金属离子选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的实施方式中，出于该目的而在使用的试剂溶液中提供的金属盐可以是例如氯化亚铁、硝酸镁、甲酸钴或乙酸锌。
根据相应实施方式，螯合剂：Ca2+或螯合剂：Mg2+的摩尔比可在1∶2-1∶20的范围内自由选择。在本发明的某些实施方式中，螯合剂：Ca2+和螯合剂：Mg2+的摩尔比范围是1∶4至1∶10。在许多实施方式中，螯合剂：Ca2+和螯合剂：Mg2+的比率范围是1∶4至1∶8。在其他实施方式中，该比率的范围是1∶5至1∶7。
根据本发明，通过加入含100至5000μmol/L的相应使用的蛋白酶必需的金属离子(Fe2+、Mn2+、Co2+或Zn2+)的溶液来再活化通过上述方式失活的蛋白酶。本申请的发明人发现，这种特定量的相应二价金属离子足够重新占据蛋白酶的蛋白质结构中的位置，这是蛋白酶的活化所需要的，尽管同时存在大量的螯合剂以及钙或镁离子。根据涉及的相应实施方式，活化溶液中的金属离子含量可在具体范围内自由选择。在某些实施方式中，金属离子含量的范围是500至2000μmol/L。在其他实施方式中，金属离子含量的范围是200至400μmol/l。
在本发明的实施方式中，含有选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子之一的溶液是溶血溶液，其向方法步骤a)中的样品中添加，该溶血溶液含有溶血去污剂。更具体地，本发明的目的之一是将尽可能多的用于HbA1c确定操作中的试剂一起合并到尽可能少的合并的试剂溶液中。就此而言，已经发现选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+并且后续蛋白酶活化需要的二价金属离子当然也可存在于含有蛋白酶的另一个试剂溶液中。例如，在本发明的许多实施方式中，选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子也存在于提供FPOX或FAOX的溶液中(参见下文R1)或也存在于刚好在HbA1c分析过程开始时使用的溶血溶液中。
在本发明的实施方式中，通过以下在分开容器中提供的溶液形式将用于HbA1c确定的各种试剂混合在一起：
-含有溶血去污剂以及100至5000μmol/L的选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子的溶血溶液(H)，
-含有FPOX或FAOX和过氧化物酶的第一试剂溶液(R1)，和
-另外含有蛋白酶和每1000kU/l蛋白酶中0.1至2mmol/l的针对二价金属离子的螯合剂和1至10mmol/l的Ca2+或Mg2+以及无色染料的第二试剂溶液(R2)，其中螯合剂：Ca2+和螯合剂：Mg2+的摩尔比的范围分别是1∶2至1∶20。
上述试剂盒可以下方式用于确定HbA1c的方法中。首先，由于需要，用于样品制备，其中全血与溶血溶液混合。然后向其产生的溶血产物中添加第一试剂溶液(R1)，其结果是第一试剂溶液中含有的FPOX破坏可能存在的内源性果糖基肽，而不是与HbA1c确定相关的末端果糖基化肽，因为其尚未被释放。
在反应基本结束之后，实现对预孵育的溶血物的总血红蛋白含量的分光光度测定。然后实施实际孵育，其中向预孵育的溶血物中加入第二试剂溶液(R2)。通过溶血溶液的方式由组合物中已经含有的额外二价金属离子(例如，锌离子)来活化其中含有的蛋白酶apo酶(例如，嗜热菌蛋白酶apo酶)，并且从血红蛋白的β链切下N-末端糖化肽。切下的糖化肽与EPOX反应，其中在将糖化的肽切成肽和葡糖醛酮之后产生过氧化氢。
在所得过氧化氢存在下，已经通过第一试剂溶液(R1)的方式导入组合物中的过氧化物酶导致无色染料氧化成其有色氧化形式。然后在加入第二实际溶液(R2)之后可通过分光光度测量非常迅速地(例如，10-30秒，根据测量设备的性质)实现实际HbA1c确定操作，即刚好在FPOX-诱导的反应发生之前发生，并且此后在加入R2之后再次发生(例如，2-15分钟，根据测量设备的相应性质)，即在无色染料的过氧化氢诱导的氧化结束之后。最终，考虑两个测量之间的差并通过形成HbA1c的含量和之前确定的总血红蛋白的商来实现HbA1c含量的确定。然而，测量间隔极大程度上取决于相应的使用分析仪、光度计等。因此，在2-15分钟后仅一次直接测量也将是可能的。
方面2-解折叠血红蛋白的稳定化
除了蛋白酶稳定化以外，本发明的发明人也将解折叠样品中含有的血红蛋白作为目标，包括HbA1c，尽可能大，并且使其在解折叠形式下稳定，以例如允许蛋白酶对血红蛋白消化的效率最大，并且使血红蛋白变成可测量的分光光度稳定形式。
本领域已知通过降低溶血物中pH值来将血红蛋白解折叠至一定程度。在确定HbA1c的量的常规方法中，在约5的pH值下实现解折叠。然而，HbA1c值的较大幅降低的劣势在于通过这种方式处理的血红蛋白严重变性并凝集并以该形式沉淀，使得其不再是蛋白酶消化的合适形式。
然而，本发明的发明人发现了可实现用非常低的pH值极快并高效解折叠并随后使解折叠的血红蛋白稳定的方式。出于该目的，根据本发明的这一方面，提出了确定样品中HbA1c的量的方法，其中，由于需要，进行方法步骤a)至c)，其中该方法的特征在于，通过加入溶血溶液(H)来实现方法步骤a)中的溶血，其中该溶血溶液的pH值范围是1-3，并且含有溶血去污剂和至少一种稳定剂，其中至少一种稳定剂选自磷脂酰胆碱、2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2‘-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物或共聚物或其混合物。
本文所用术语磷脂酰胆碱是指通式(I)的化合物：
其中R1和R2选自完全饱和或者单或多不饱和直链或支链脂肪酸残基。在多不饱和脂肪酸残基的实施方式中，它们优选是双、三或四不饱和的，并且在与饱和度不相关的某些实施方式中，脂肪酸残基选自具有C8至C22范围的链长度的那些或具有C16至C22范围的链长度的那些(例如，1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)。
本文所用术语2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2‘-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物或共聚物是指具有通式(II)的重复单元的聚合物或共聚物：
在以共聚物形式存在的实施方式中，除了上述具体通式(II)的单元以外，它们包括其他甲基丙烯酸酯单元，其与脂族或芳族残基酯化。
在加入溶血溶液之后，溶血物的pH值对应于溶血溶液的pH值。这通过溶血溶液的合适缓冲来实现。根据本发明的这一方面，溶血溶液的pH值范围是1-3，因此溶血样品(＝溶血物)的pH值也设为1-3范围内的pH值。与稳定化去污剂联用的溶血物的持续低pH值导致可快速并高效地破坏未折叠的血红蛋白。
另外，提出了用于确定样品中HbA1c的量的方法的试剂盒，其中该试剂盒包含至少一种具有溶血作用去污剂的溶血溶液和另外2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2‘-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物，磷脂酰胆碱或其混合物，并且具有1-3范围内的pH值。
将pH值降低至1-3的范围导致血红蛋白非常快速和强烈的解折叠。然而，如上述已经提到的那样，存在血红蛋白变性、聚集并沉淀的风险，如也可通过例如添加三氯乙酸实现。然而，本申请的发明人发现，可能避免血红蛋白的变性、沉淀和聚集，如果溶血溶液还含有2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2‘-(三甲基铵乙基)、磷脂酰胆碱或其混合物。
关于本发明的这一方面，使用术语“解折叠”来表示二级和三级结构的部分溶解，然而，其并不导致血红蛋白沉淀。与变性的血红蛋白相反，根据本发明解折叠的血红蛋白因此留在溶液中。本发明使用的术语变性的血红蛋白表示其蛋白质结构溶解一定程度，以至蛋白质沉淀和聚集，如例如通过三氯乙酸处理导致的那样。
在解折叠产物稳定化的同时血红蛋白的上述更大解折叠在仅5-15秒内令人惊讶地迅速发生，并且可通过在2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2‘-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物、磷脂酰胆碱或其混合物存在下在整个所述的1-3的pH值范围内发生。在本发明的某些实施方式中，pH值的范围是2-3。在一个实施方式中，溶血溶液的pH值的范围是2.4-2.6。
方面3-无色染料稳定化
本申请的发明人所设的另一个目的是使在确定样品中HbA1c的量的方法中的无色染料稳定化，其中使用这种无色染料。
本文使用的术语无色染料是指一种物质，其通过与至少一种氧化物质和/或具有过氧化物酶活性的物质反应，从无色的起始形式转化成可分光光度测量的有色形式。适用于本发明的无色染料的示例是N，N，N′，N′，N″，N″-六(3-磺丙基)-4，4′，4″-三氨基三苯基甲烷六钠盐(TPM-PS)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲基氨基)-二苯基胺钠盐(DA64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲基氨基)-吩噻嗪钠盐(DA67)、2，2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)和三苯基胺、吩噻嗪、吩噁嗪、联苯胺、三烯丙基咪唑、邻苯二胺衍生物、三苯基甲烷和具有上述无色染料性质的邻-联甲苯胺衍生物，以及4-氨基安替比林与苯酚化合物或N，N-双取代的苯胺化合物的组合和3-甲基苯并噻唑酮腙(MBTH)与苯胺化合物的组合。适于本发明的无色染料的其他实施例是EP0038205、EP0124287和EP0045220中所述的二苯基胺衍生物。
在本发明的一个方面中，在确定样品中HbA1c的量的方法中实现无色染料的稳定化，因而在方法中进行方法步骤a)至c)，并且通过FPOX或FAOX的手段使其氧化产生过氧化氢并通过确定所得的过氧化氢的量来在方法步骤c)中实现对糖化血红蛋白降解产物的定量，其中基于在过氧化物酶存在下无色染料的颜色反应来对过氧化氢的量进行定量，并且其中无色染料在溶液中产生，其为了使染料稳定而含有通式(I)的化合物：
其中P表示磷原子，并且其中X1、X2和X3互相独立地选自取代或未取代的直链或支链C1C8-烷基残基、取代或未取代的环己基残基以及取代或未取代的苯基残基。
如在本说明书的开头部分所述，无色染料的原理是基于通过由于待检测物质的存在使无色染料从其无色起始形式转化成有色形式来实现物质的检测。为了确保该转化在实施实际检测反应之前尚未发生，优选如果无色染料稳定化在其无色还原形式而实际检测反应不受其不利影响。
本申请的发明人发现可通过加入通式(I)的化合物而实际检测反应(在本发明的情况中，在过氧化物酶存在下检测过氧化氢)不受其不利影响或破坏来实现对无色染料的有效稳定化。
通式(I)的化合物的示例是三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双(对-磺化苯基)苯基膦二水合二钾盐、1，3，5-三氮杂-7-膦金刚烷、三(3-磺化苯基)膦一水合钠盐、三(4，6-二甲基-3-磺化苯基)膦三钠盐一水合物、三(羟甲基)膦、二叔丁基(3-磺化丙基)膦、二苯基(间-磺化苯基)膦二水合钠盐、和[2-二环己基膦)乙基]-三甲基氯化铵，而并不表示本发明仅用实施例中所列的那些化合物进行。
或者，为了使无色染料稳定，也可添加含硫化合物，更具体地单一或多种硫醇、硫醚、硫酮或其混合物。这类含硫化合物的示例是硫二甘醇、硫代苹果酸、硫代烟酰胺、硫代-NAD及其混合物，而并不因此将本发明限于这些具体实施例。
上述含硫化合物可单独使用或与之前通式(I)的化合物联用。因此，在本发明的某些实施方式中，无色染料在溶液中产生，为了使染料稳定，其含有至少一种通式(I)的化合物，例如TCEP和至少一种含硫化合物，例如硫二甘醇。
因此，本发明还涉及用于确定样品中HbA1c的量的方法的试剂盒，其特征在于其包含至少一种试剂溶液，其含有无色染料，并且为了使无色染料稳定，含有至少一种通式(I)的化合物和/或至少一种含硫化合物。
在一个实施方式中，试剂溶液中含有的通式(I)的稳定剂化合物的浓度范围是10-20mol/mol无色染料。在具体实施方式中，通式(I)的稳定剂化合物的量的范围是10-15mol/mol无色染料。
在确定样品中HbA1c的量的上述方法中，通常使用含有SH基团例如上述含硫化合物的试剂。然而，这种含SH基团的化合物可能干扰实际HbA1c检测反应，并且更具体地在FPOX或FAOX与果糖基氨基酸或肽反应形成过氧化氢并且对从中产生的过氧化氢进行定量处。在该方面，本申请的发明人已经显示必须尽可能多地封闭导致上述检测反应中的干扰的SH基团。
根据本发明，因此提出为了优化实际HbA1c检测反应，通过加入SH基团捕获剂如N-乙基马来酰亚胺(NEM)来封闭干扰反应的SH基团。因此，添加SH基团捕获剂应该最晚在刚好进行HbA1c检测反应之前发生。
在给定的实施方式中，在溶血溶液中含有SH基团捕获剂，例如NEM。在一个替代的实施方式中，实际溶液中含有SH基团捕获剂，例如NEM，其保持与试剂溶液分离并且添加，其中存在用硫醇稳定化的无色染料。
因为需要，也可进行本发明的方法，使得在方法步骤a)至c)过程中或之间测定总血红蛋白浓度。因此，该方法优选包括测定总血红蛋白浓度的步骤，以能够直接以相对量，例如mmol/mol具体表示HbA1c浓度。
试剂盒的具体实施方式
在本申请所述的本发明的实施方式中，提供了试剂盒，其至少包含在分开容器中的以下三种溶液：
-含有溶血作用去污剂的溶血溶液(H)，
-含有FPOX或FAOX的第一试剂溶液(R1)，和
-含有蛋白酶的第二试剂溶液(R2)，其中：
a)溶血溶液(H)的pH值范围是1-3并且含有2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物、磷脂酰胆碱或其混合物，和/或
b)溶血溶液(H)含有100至5000μmol/L的选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子，并且第二试剂溶液(R2)含有蛋白酶，其蛋白水解活性导致从糖化血红蛋白的β链的氨基末端释放果糖基-缬氨酸-组氨酸或果糖基-缬氨酸，并且每1000kU/l的蛋白酶分别含有0.1至2mmol/l的针对二价金属离子的螯合剂以及0.5至10mmol/l的Ca2+或0.5至10mmol/l的Mg2 +，其中螯合剂：Ca2+和螯合剂：Mg2+的摩尔比范围分别是1∶2-1∶20，和/或
c)第二试剂溶液(R2)含有无色染料和一定比例的用于使所述无色染料稳定的通式(I)的化合物和/或一定比例的用于使无色染料稳定的至少一种含硫化合物。
在基于在检测反应中形成的过氧化氢最终实现对HbA1c的定量测定的实施方式中，上述试剂溶液中的至少一个含有过氧化物酶并且试剂溶液中的至少另一个含有无色染料。在这些实施方式中，试剂溶液中的一种选择性地也含有SH基团捕获剂如NEM，其中在不含无色染料的试剂溶液之一含有SH基团捕获剂。
在本发明的一个具体实施方式中，试剂盒包含具有以下组分的三种试剂溶液：
-溶血溶液，其含有溶血作用去污剂、2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物、磷脂酰胆碱或其混合物，前述要求的量的用于制备选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的金属离子的金属盐，和SH基团捕获剂如NEM，
-含有FPOX或FAOX和过氧化物酶(POD)的第一试剂溶液(R1)，和
-第二试剂溶液(R2)，其含有蛋白酶，其蛋白水解活性导致从糖化血红蛋白的β链的氨基末端释放果糖基-缬氨酸-组氨酸或果糖基-缬氨酸，Ca2+盐或Mg2+盐以及二价金属离子的螯合剂，各自具有上述要求的量，无色染料和用于使无色染料稳定的通式(I)的化合物和/或用于使无色染料稳定的含硫化合物。
出于原始公开的目的，指出本领域技术人员可从本说明书中看到的所有特征，附图和权利要求，即使它们以仅与某些其他特征关联的具体术语说明，可单独结合并且也可以与本文公开的其他特征或特征组任意组合，除非表示排除或者这种组合在技术方面不可能或无意义。为了说明书的简洁性和可读性，特征的所有可能想到的组合的全部明确表示分散在本文中。
还指出对于本领域技术人员而言，以下实施例的实施方式仅以示例的方式列出了本发明的可能实施方式是不言自明的，这些实施方式如本发明的实施例所示。因此，本领域技术人员将理解具有权利要求中所示的本发明的特征或特征组合的所有其他实施方式也落入本发明的保护范围内。为了说明书的简洁性和可读性，所有可能想到的组合的全部明确表示分散在本文中。
实施例
1.蛋白酶稳定化
a)蛋白酶稳定化，通过SDS凝胶电泳分析：
在2至8℃或更高温度下以液体形式或试剂中储存一段时间之后，蛋白酶嗜热菌蛋白酶有被自身蛋白水解破坏的强趋势。这是对在延长的时间期间有均匀质量要求的液态稳定试剂中使用蛋白酶的技术障碍。蛋白酶嗜热菌蛋白酶是Zn2+依赖性的并且发明人能够显示在Ca2+-依赖性结构稳定化的通式通过螯合剂的方式使一种蛋白酶失活允许更好地使用嗜热菌蛋白酶和相关金属蛋白酶用于临床-化学诊断。
为了证明蛋白酶的可能稳定化，将不同的相应量或比率的螯合剂和Ca2+导入其中含有蛋白酶嗜热菌蛋白酶的试剂基础基质中。在这种情况中试剂2中使用的EDTA和钙的浓度具体如下表1所示。
表1：
将所得的批料(参见上表)分装并且分别在4℃和37℃下储存7天。从这些批次中分别获取相同的样品量，与SDS-PAGE应用缓冲液混合，并且通过SDS-PAGE的方式使蛋白质组合物变性分离，并通过考马斯染色使其可视化(参见图1)。
在与其他凝胶条带的比较中，在条带4和5中明显观察到更大量的蛋白酶嗜热菌蛋白酶。因此，与其他组合物中相比，蛋白酶嗜热菌蛋白酶在该组合物中以温度依赖性的关系明显受到更好的保护免于自消化。编号E411/13B的批次的比较显示EDTA的存在是保护免受自消化而言必要的。比较编号E411/13A和E411/13C与E411/13B的批次显示，需要特定的小量EDTA并且钙离子也必须以给定的最小量存在。
另外，以下数据证明对于分别在4℃和37℃下的延长期间内储存而言，特定组合物的嗜热菌蛋白酶稳定化作用。
b)HbA1c测试系统中蛋白酶稳定化的分析
通过示例的方式在HbA1c试剂基质中实施图1中以蛋白质分析水平显示的蛋白酶稳定化。出于该目的，向试剂基础基质2中添加钙离子和EDTA的各种浓度组合，以及相应等量的示例蛋白酶嗜热菌蛋白酶。这些批次分别分割，直接测量(新鲜)或者试剂2在2-8℃下储存11天(11d/2-8℃)并且试剂2在37℃下储存7天，然后在2-8℃下另外储存4天(7d/37℃+4d/2-8℃)。
然后在BM 6010c临床-化学分析仪系统中分别用相同的溶血融合和相同试剂1来测量相应的试剂基础基质2。
DiaSys Calibrators TruCal HbA1c net(制品1 3350)用于校准。随时间测量并评价不同试剂基质2的HbA1c测定，并且储存在不同温度下，如表2所示。这一方面的ΔmE对应于校准物水平2相对于校准物水平1在mE上的差。
在该方面中形成测量基础的基础组合物如下，其中在单独测试中，单个组分(乙酸钙/ETDA)以下表中具体显示的方式变化：
溶血溶液：
甘氨酸，60mol/l
N-乙基马来酰亚胺，7.5mmol/L
2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2′-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物，50g/L
氯化锌1200μmol/L
pH-值2.5
试剂溶液1：
BIS-TRIS，100mmol/L
NaCl，100mmol/L
FPOX，大于0.8kU/L
POD，大于50kU/L
pH-值7.2
试剂溶液2：
乙酸钠，20mmol/L
NaCl，100mmol/L
乙酸钙，浓度参见表2
TCEP，0.1mmol/L
DA-67，0.08mmol/L
Titriplex/EDTA，浓度参见表2
蛋白酶(嗜热菌蛋白酶)1000U/ml
pH-值5.0
在该方面中测量所基于的应用如下：
试剂1：90μL
试剂2：30μL
溶血样品：15μL
溶血步骤：5μL样品+100μL溶血溶液
波长(HbA1c-测定)：658nm(主)/805nm(次)
测量循环：22/23-41/42
表2：
从表2A)中推导出在没有锌离子的情况下，没有HbA1c测定可能独立于钙离子浓度和EDTA。不同储存条件的水平1和水平2的不同信号归因于2个校对物的不同血红蛋白水平。
表2B)相反显示了在锌离子和不同钙离子和EDTA比率存在下的嗜热菌蛋白酶的功能。表2C)显示了在不同储存条件下单个校准物的ΔmE损失。与具有0.5mmol/L的钙离子的批料相比，具有6mmol/L的钙离子的两个批料显示明显较小的信号损失。
具体地，关于7天/37℃+4天/2-8℃的储存条件，2种钾浓度与相同浓度的EDTA之间的差异是显著的。本文所述的结果深刻地证明了无活性但在结构上稳定化的嗜热菌蛋白酶在液体试剂基质中在各种温度和时间下的储存能力及其反应性。
2.解折叠血红蛋白稳定化
血红蛋白的在先高效解折叠以及解折叠形式的稳定化对于Hb和HbA1c的准确测量而言是必要的。出于通过溶血去污剂使溶血中的解折叠的血红蛋白稳定化，例如，在以下测试中通过示例的方式将2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2‘-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物加入溶血溶液基础基质中，并且在这种情况中，pH-值的范围设为1-3。
在临床化学分析仪Hitachi 912上用相同试剂1和试剂2分别测量含有和不含添加剂的各种溶血溶液变化(如1b具体使用试剂组合物)，相应的修饰如表中所述。为了评价溶血物的稳定性，人工制备溶血物(50μL全血样品+1000μL每溶血溶液(含或不含添加剂2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2‘-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物)并直接测量。然后溶血物在15-25℃下在装置中开放储存并且在直至产生溶血物之后最大240分钟的各种时刻测量。在这种情况中，在分析仪上在240分钟的时间段上测量HbA1c测定信号并且分别对应于刚确定的HbA1c值。在该方面，以下应用形成在Hitachi912上的测量基础：
试剂1：240μL
试剂3：80μL
溶血样品：40μL
波长(HbA1c-测定)：660nm(主)/800nm(次)
测量周期：18-31
图2a-d中所示的结果显示，与不含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2‘-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物的样品相比，含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2‘-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物的各种样品的稳定性显著增加，图2a-d。以下批料的详细结果示于图2：
图a)TruCal HbA1c水平1，没有添加
图b)TruCal HbA1c水平1，有添加
图c)低HbA1c，中等血红蛋白，没有添加
图d)低HbA1c，中等血红蛋白，有添加
依靠所示的结果，明显已经显示在所述条件下向溶血溶液中添加2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2‘-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物显著改善了血红蛋白分子的稳定化，由相对于相应的刚测量的HbA1c测定10％限制(虚线+/-10％)。
3.用膦使无色染料稳定化
为了改善试剂基质中无色染料的稳定性，检查各种水溶性稳定物质的无色染料稳定化作用。在该方面，不含稳定剂添加剂的试剂组合物用作阴性对照并且1，3，5-三氮杂-7-磷杂金刚烷用作对照物质，只要该物质并不对应于结构先决条件即可。
通过示例方式产生以下试剂制备物：
20mM bis-tris缓冲剂(双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷)
20mM乙酸钠
100mM NaCl
6mM乙酸钙
15g/L曲通X 405
0.08mM DA67(无色染料)
1000U/ml嗜热菌蛋白酶
1mM EDTA
现在，向不含稳定剂的具体试剂基础基质中加入相应相同浓度的相应不同稳定剂。在这种情况中，不含稳定剂物质的等份用作参照。
使用光度计在各种情况中在开始(新鲜)之后直接并在各种情况中在37℃下储存4天后在660nm处分别测量相应试剂组合物的固有吸收。在这种情况中，660nm消光相对于时间增加是相对于染料的无色形式转化成其有色变体的测量，并且因此是相对于无色形式的氧化失稳的测量。
在上述条件下，实现了表3所示的结果。
表3：mE中660nm处的固有着色R2
4.用含硫化合物使无色染料稳定化
检查多种含硫化合物的染料稳定化作用。出于该目的，研究了在2-8℃和37℃下储存后含有无色染料DA 67的试剂溶液(基质：NaCl，乙酸钙，曲通X 405+嗜热菌蛋白酶，参见相应组合物3)的固有着色。在这种情况下，通过在2-8℃下储存来实现表4中显示的结果。
表4：mE中660nm处的固有着色R2
第0天 第2天 第8天 第10天
不含添加剂 50.1 136 344 463
0.1mM TCEP 20.4 23.4 48.1 106
0.2mM TCEP 14.2 18.7 41.6 97.4
2mM硫代烟酰胺 50.6 73.9 133.5 205
2mM硫代烟酰胺+0.2mM TCEP 9.6 17 41.5 91.8
4mM硫代烟酰胺 55.7 79.9 122 209
2mM硫代-NAD 74.3 138 215 292
4mM硫代-NAD 97.9 139 203 274
4mM硫代烟酰胺+0.1mM TCEP 26.7 36.3 55.5 106
2mM硫代-NAD+0.2mM TCEP 11.1 34.6 56.6 105
4mM硫代-NAD+0.1mM TCEP 21.3 46.3 68.3 128
通过在37℃下储存来实现表5中所示的结果。
表5：mE中660nm处的固有着色R2
第0天 第2天 第8天 第10天
不含添加剂 50.1 610 2220 2513
0.1mM TCEP 20.4 23.4 66.2 646
0.2mM TCEP 14.2 18.7 31.9 295
2mM硫代烟酰胺 50.6 73.9 233 671
2mM硫代烟酰胺+0.2mM TCEP 9.6 17 41.5 29.7
4mM硫代烟酰胺 55.7 79.9 215 704
2mM硫代-NAD 74.3 138 366 1174
4mM硫代-NAD 97.9 139 305 893
4mM硫代烟酰胺+0.1mM TCEP 26.7 36.3 55.5 48.8
2mM硫代-NAD+0.2mM TCEP 11.1 34.6 56.6 51.5
4mM硫代-NAD+0.1mM TCEP 21.3 46.3 68.3 109
5.用TCEP与含硫化合物使无色染料稳定化
检查多种含硫化合物在与TCEP联用后的染料稳定化作用。出于该目的，研究了在2-8℃和37℃下储存后含有无色染料DA 67的试剂溶液(基质：缓冲剂NaCl，乙酸钙，曲通X405+嗜热菌蛋白酶，参见相应组合物3)的固有着色。在这种情况下，通过在2-8℃下储存来实现表6a和6b中显示的结果。
表6a：mE中660nm处的固有着色R2
表6b：mE中660nm处的固有着色R2
第0天 第2天 第8天 第10天
不含添加剂 115 323 848 1154
2mM乙酰基-NAD 169 1097 1869 2037
2mM硫代苹果酸 91 114 158 197
通过在37℃下储存来实现表7a和7b中显示的结果。
表7a：mE中660nm处的固有着色R2
第0天 第2天 第8天 第10天
不含添加剂 128 957 2583 2821
2mM S-NAD 228 437 662 1591
2mM硫代烟酰胺 73 189 292 862
2mM NAD 62 1220 2717 2940
2mM硫脲 85 514 594 2152
1％2.2硫二甘醇 96 211 494 1730
0.1mM TCEP 89 111 219 1350
2.2硫二甘醇+TCEP 0.1mM 83 92 104 272
表7b：mE中660nm处的固有着色R2(分开批料)
6.硫二甘醇单独或与TCEP组合的信号稳定化作用
在硫二甘醇单独或与TCEP组合存在下研究HbA1c校准信号。
试剂2基础基质(使用如1b中具体所示的试剂组合物，相应修饰描述于表中)与10g/L β-硫二甘醇混合并且该基础基质的部分分别与不同浓度的TCEP混合。
在BM 6010c上测量这些试剂2变体分别与不同的溶血溶液和试剂1。出于该目的，使用DiaSys Calibrators TruCal HbA1c net(制品13350)。在这种情况中，测量并评价了相应HbA1c测定。
在该方面中测量针对BM 6010c所基于的应用如下：
试剂1：90μL
试剂3：30μL
溶血样品：15μL
溶血步骤：5μL样品+100μL溶血溶液
波长(HbA1c-测定)：6t58nm(主)/805nm(次)
测量周期：22/23-41/42
在这种情况中，实现了表8中显示的结果。
表8
仅在使用硫二甘醇时，7d/2-8℃和7d/37℃下的HbA1c测定中有明显信号下降。所示的结果相反清楚证明了TCEP和硫二甘醇在不同TCEP浓度下的组合使用。

Claims (14)

1.一种确定样品中糖化血红蛋白(HbA1c)的量的方法，其中进行以下方法步骤：
a)使所述样品中的红细胞溶血以释放其中含有的HbA1c，
b)使方法步骤a)中释放的HbA1c接触蛋白水解剂，用于产生糖化血红蛋白降解产物；并且
c)通过对方法步骤b)中产生的糖化血红蛋白降解产物进行定量来确定HbA1c的量
其特征在于，方法步骤b)中使用的蛋白水解剂如下产生，其中，使至少两种不同溶液与方法步骤a)中释放的HbA1c接触，其中一种溶液的pH值范围是1-8，并且含有
i)金属蛋白酶，
ii)每1000kU/l的金属蛋白酶中0.1至2mmol/l的针对二价金属离子的螯合剂，和
iii)0.5至10mmol/l Ca2+或0.5至10mmol/l Mg2+，
其中螯合剂:Ca2+或螯合剂:Mg2+的摩尔比的范围是1:2-1:20，并且另一种溶液含有100至5000μmol/l的选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有100至5000μmol/l的选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子的溶液是在方法步骤a)中向所述样品添加的溶血溶液，该溶血溶液含有溶血作用去污剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过加入溶血溶液(H)来实现所述方法步骤a)中的溶血，其中所述溶血溶液具有溶血作用去污剂和2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物、磷脂酰胆碱或其混合物并且pH值范围是1-3。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过由果糖基肽氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶对方法步骤c)中的糖化血红蛋白降解产物进行氧化产生过氧化氢并且通过确定所得过氧化氢量来实现对方法步骤c)中的糖化血红蛋白降解产物的定量，其中通过过氧化物酶存在下的无色染料的颜色反应来对过氧化氢的量进行定量，并且其中所述无色染料在溶液中制备，为了使所述染料稳定化，所述溶液含有通式(I)的化合物：
其中P表示磷原子，并且其中X1、X2和X3互相独立地选自取代或未取代的直链或支链C1C8-烷基残基、取代或未取代的环己基残基以及取代或未取代的苯基残基。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，为了使所述无色染料稳定化，含有该染料的所述溶液含有至少一种含硫化合物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述至少一种含硫化合物选自硫二甘醇、硫代苹果酸、硫代烟酰胺、硫代-NAD及其混合物。
7.如权利要求5和6之一所述的方法，其特征在于，在进行方法步骤c)中的确定HbA1c的量的操作之前，向反应混合物中加入SH基团捕获剂。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在方法步骤a)至c)之间或过程中进行确定总血红蛋白浓度的操作。
9.一种用于确定样品中糖化血红蛋白(HbA1c)的量的方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含分开容器中的至少2种不同溶液，其中一种溶液的pH值范围是1-8并且含有金属蛋白酶和每1000kU/I的金属蛋白酶0.1至2mmol/l的针对二价金属的螯合剂和0.5至10mmol/l Ca2+或0.5至10mmol/l Mg2+，其中螯合剂:Ca2+或螯合剂:Mg2+的摩尔比的范围是1:2-1:20，并且另一种溶液含有100至5000μmol/l的选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，其至少包含分开容器中的以下溶液：
-含有溶血作用去污剂以及100至5000μmol/L的选自Fe2+、Mn2+、Co2+和Zn2+的二价金属离子的溶血溶液(H)，
-含有果糖基肽氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶和过氧化物酶的第一试剂溶液(R1)，和
-另含有金属蛋白酶和每1000kU/l的金属蛋白酶中0.1至2mmol/l针对二价金属离子的螯合剂和0.5至10mmol/l的Ca2+或0.5至10mmol/l的Mg2+以及无色染料的第二试剂溶液(R2)，其中螯合剂:Ca2+和螯合剂:Mg2+的摩尔比的范围分别是1:2至1:20。
11.如权利要求9和10之一所述的试剂盒，其特征在于，所述溶液(H)是溶血溶液，其含有溶血作用去污剂并且还含有2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵乙基)磷酸聚合物、磷脂酰胆碱或其混合物并且pH值范围是1-3。
12.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，用于染料稳定化的所述溶液(R2)含有至少一种通式(I)的化合物：
其中P表示磷原子，并且其中X1、X2和X3互相独立地选自取代或未取代的直链或支链C1C8-烷基残基、取代或未取代的环己基残基以及取代或未取代的苯基残基。
13.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，用于无色染料稳定的所述溶液(R2)含有至少一种含硫化合物，其中至少一种含硫化合物选自硫二甘醇、硫代苹果酸、硫代烟酰胺、硫代-NAD及其混合物。
14.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述溶液(R1)含有SH基团捕获剂，其中所述SH基团捕获剂优选是N-乙基马来酰亚胺。
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