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CN106461595B - 用于检测神经损伤的系统和方法 - Google Patents

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CN106461595B
CN106461595B CN201580028310.7A CN201580028310A CN106461595B CN 106461595 B CN106461595 B CN 106461595B CN 201580028310 A CN201580028310 A CN 201580028310A CN 106461595 B CN106461595 B CN 106461595B
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刘炯权
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Cass Western Reserve University
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Abstract

用于确定身体样本中的丙酮酸脱氢酶(PDH)水平的检测系统包括：至少一种反应溶液，其用于在与所述身体样本中的PDH结合时生成NAD+，所述反应溶液包括丙酮酸盐和NADH；以及生物传感器，其用于确定所生成的NAD+的水平。

Description

用于检测神经损伤的系统和方法
相关申请
本申请要求2014年5月27日提交的申请号为62/003,221的美国临时申请的优先权，该申请的主题全部通过引用方式合并于本文中。
背景技术
创伤性脑损伤(TBI)和相关的头部震荡是由于汽车事故导致的平民、参与诸如橄榄球、足球和曲棍球等接触性体育运动的人的健康问题以及是与美国军事相关的主要健康担忧。仅在美国每年就有170万人遭遇TBI的困扰。处理头部损伤的成本，包括在橄榄球中涉及到的运动员，在经济上和情感上都是昂贵的。TBI是儿童和青少年中死亡和残疾的首要原因。在美国，几乎1-2％的人群忍受着一定程度的TBI相关的残疾。
当前，TBI相关症状的诊断通常是通过神经检查和神经成像测试来实现的，诸如磁共振成像(MRI)和计算机断层成像(CT)扫描。这些测试是昂贵的、耗时的，且要求极其精密的装备和技术娴熟的操作者。此外，结果不能以实时的方式可用，并且测试结果经常是无结果的。此外，非对比的CT扫描对于轻微的损伤不灵敏且会由于额外的头颅损伤或镇静和导气管保护的必要而不清楚。及时管理决策在优化TBI结果上是关键的。结果，由于TBI的临床当场即时检验所给出的实时诊断评估的值期望促进恰当治疗。
发明概述
本文所描述的实施方案涉及用于在身体样本中检测、识别、量化和/或确定诸如创伤性脑损伤的神经损伤的生物标志物的检测系统以及试管内化验，以及涉及用于在患有或疑似患有诸如创伤性脑损伤的神经损伤和/或神经元紊乱的受试者中诊断、识别、补给和/或监测神经损伤如创伤性脑损伤的检测系统和试管内化验。
在一些实施方案中，检测系统包括：至少一种反应溶液，其用于在与身体样本中的丙酮酸脱氢酶(PDH)结合时生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)；以及生物传感器，其用于确定所生成的NAD+的水平。在一些实施方案中，至少一种反应溶液可以包括丙酮酸盐和NADH，丙酮酸盐和NADH的量利于提供用于与PDH的反应以及乳酸盐和NAD+的形成的衬底。
在一些实施方案中，身体样本可以包括身体流体，诸如唾液、血液、血浆、血清、呼吸或尿液，它们可能包含PDH。
在其它实施方案中，生物传感器可以包括衬底、形成在衬底的表面上的工作电极、形成在衬底的表面上的对电极以及介电层，该介电层覆盖工作电极和对电极的一部分且限定了露出工作电极和对电极的其它部分的孔口。
在另外的其它实施方案中，工作电极和对电极可以包括金属膜。例如，工作电极和对电极可以独立地包括金，铂，钯，银，碳，其合金，及其复合物。通过将膜溅射或涂敷到表面上且随后将膜激光烧蚀，能够将金属膜设置在衬底的表面上，从而形成工作电极和对电极。
在其它实施方案中，传感器可以包括在衬底的表面上的基准电极。电介质可以覆盖基准电极的部分。传感器还可以包括测量装置，该测量装置对工作电极和对电极施加电压电位以及测量工作电极与对电极之间的电流流动以确定样本如身体样本中的NAD+的水平。
在另外的其它实施方案中，检测系统可以包括用于检测来自受试者的身体样本中的、指示诸如创伤性脑损伤的神经损伤的除了PDH之外的其它生物标志物的其它生物传感器。这些其它的生物标志物可以包括例如S100B，神经元特异性烯醇化酶(NSE)和分泌肌动蛋白(例如SCGN，SEGN，CALBL或setgin)。生物传感器可以包括衬底、形成在衬底表面上的工作电极、形成在衬底表面上的对电极以及覆盖工作电极和对电极的部分且限定露出工作电极和对电极的其它部分的孔口的介电层。工作电极经官能化或化学官能化而包含用于感兴趣的生物标志物中的至少一个的受体。该受体可以与身体样本中的一个或多个感兴趣生物标志物选择性地键合。
该检测系统还可以包括测量装置，该测量装置用于对工作电极、对电极和/或基准电极施加电压电位且测量工作电极与对电极之间的电流流动。可以使用电化学分析技术(例如循环伏安法(CV)，差分脉冲伏安法(DPV))检测生物标志物和受体(例如键合的生物标志物)的相互作用，以确定身体样本中生物标志物的存在，以及受试者是否具有神经损伤或受试者的神经损伤的程度。
附图说明
图1是依照本申请的方案的生物传感器的示意性图示。
图2是由丝网印刷工艺制造的成行的生物传感器阵列的俯视平面图。
图3示出了显示在0-7.5μM的浓度下丙酮酸脱氢酶的循环伏安法测量的图。丙酮酸和NADH都是375μM。
图4示出了在0-7.5的浓度下PDH的校准曲线。+0.65V用作循环伏安图的电流的电位。
发明详述
除非在本文具体地说明，否则所使用的全部术语都具有与本申请的主题的领域的技术人员所理解的相同的含义。下面的定义将提供关于在说明书和权利要求书中所使用的术语的清楚性。
如本文所使用的，术语“监测”是指使用从数据集中生成结果来提供关于个体或个体的健康或疾病状况的有用的信息。“监测”可以包括例如预后的确定，风险分层，药物治疗的选择，正在进行的药物治疗的评估，治疗有效性的确定，结果的预测，对治疗的反应的确定，疾病或疾病并发症的诊断，跟随疾病的进展或提供与随时间推移患者的健康状况有关的任何信息，选择最可能受益于具有已知分子作用机制的实验性治疗的患者，选择最可能从具有已知分子机制(其中该机制对于药物可能不具有标签的疾病的小子集可能是重要的)的批准药物中获益的患者，筛选患者群体以帮助决定更有侵入性的/昂贵的测试，例如，从非侵入性的血液测试到更具侵入性的选项的测试级联，例如活检，或测试以评估用于治疗另一种适应症的药物的副作用。
如本文所用，术语“定量数据”或“定量水平”或“定量量”是指与可以分配数值的任何数据集组分(例如，标志物，临床标志)相关联的数据，水平或量。
如本文所用，术语“受试者”是指会患有神经损伤(例如创伤性脑损伤)但可能具有或可能不具有这种损伤的人或另一种哺乳动物。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地用于指人类个体。
如本文所用，术语“损伤或神经损伤”旨在包括直接或间接影响中枢神经系统(CNS)的正常功能的损害。例如，损伤可以是对视网膜神经节细胞的损伤；创伤性脑损伤(TBI)；中风相关损伤；脑动脉瘤相关损伤；脊髓损伤，包括单瘫，双瘫，截瘫，偏瘫和四肢麻痹；神经增生性病症或神经性疼痛综合征。CNS损伤或疾病的实例包括TBI，中风，脑震荡(包括脑震荡后综合征)，脑缺血，脑的神经变性疾病，如帕金森氏病，拳击员痴呆，亨廷顿舞蹈病和阿尔茨海默病，Creutzfeldt-Jakob疾病，由于辐射、暴露于电离或铁等离子体而诱发的癫痫发作所继发的脑损伤，神经剂，氰化物，毒性氧浓度，由CNS疟疾引起的神经毒性或用抗疟疾剂，锥虫，疟疾病原体和其它CNS创伤治疗诱导的发作。
如本文所用，术语“中风”是本领域公认的，并且意在包括由脑动脉的破裂或阻塞(例如，通过血块)引起的意识，感觉和自发运动的突然减少或丧失。
如本文所使用的，术语“创伤性脑损伤”是本领域公认的，并且旨在包括这样的状况：其中头部的创伤性打击引起对脑的损害，通常不穿透颅骨。通常，初始创伤可导致扩张性血肿，蛛网膜下腔出血，脑水肿，颅内压升高(ICP)和脑缺氧，这可能由于低脑血流量(CBF)而导致严重的继发性事件。
如本文所用，术语“疑似患有神经损伤的受试者”是指存在指示神经损伤(例如TBI)或正在筛选神经损伤(例如TBI)的一种或多种症状的受试者。怀疑患有神经损伤例如TBI的受试者也可能具有一种或多种风险因素。该术语包括未进行神经损伤(例如TBI)测试的个体，以及已经接受初始诊断但是神经损伤的程度未知的个体。
如本文所用，术语“提供预后”是指提供关于神经损伤例如TBI的存在或程度的影响的信息(例如，通过本文所述的方法确定)。
如本文所使用的，术语“身体样本”是指可以从受试者(例如人)或受试者的组分(例如组织)获得的样本。样本可以是任何生物组织或流体，利用其可以测定本文所述的生物标志物。通常，样本将是“临床样本”，即源自患者的样本。这样的样本包括但不限于身体流体，例如唾液，呼吸，尿，血液，血浆或血清；和具有已知诊断，治疗和/或结果历史的档案样本。术语生物样本还包括通过处理身体样本所得到的任何材料。身体样本的处理可涉及过滤，蒸馏，萃取，浓缩，干扰组分的失活，试剂的添加等中的一种或多种。
如本文所用，术语“正常”和“健康”可互换使用。它们是指没有显示任何神经损伤症状，并且没有被诊断出患有神经损伤的个体或个体组。优选地，正常个体(或个体组)不服用影响神经损伤的药物。在一些实施方案中，正常个体与获得待测试样本的个体相比具有相似的性别、年龄、体重指数。术语“正常”在本文中也用于限定从健康个体分离的样本。
如本文所用，术语“对照”或“对照样本”是指从正常(即健康)个体或个体组分离的一个或多个生物样本。术语“对照”，“对照值”或“对照样本”还可以指从分类为正常的一个或多个个体和/或诊断有神经损伤的一个或多个个体的样本得到的数据的汇编。
如本文所用，当应用于身体样本中至少一PDH的量时，术语“指示神经损伤”是指诊断神经损伤的水平或量，从而发现水平或量通常在具有损伤的受试者中比在没有受伤的受试者中(如使用常规统计学方法设定置信水平至少95％所确定的)显著更多。优选地，指示神经损伤的水平或量在至少约60％的具有神经损伤的受试者中被发现，并且在小于约10％的没有神经损伤的受试者中发现。更优选地，指示神经损伤的水平或量在至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约约95％或更多的具有神经损伤的受试者被发现并且在小于约10％，小于约8％，小于约5％，小于约2.5％或小于约1％的不具有神经损伤的受试者中被发现。
本文所描述的实施例用于确定、识别、量化和/或确定身体样本中神经损伤诸如创伤性脑损伤的生物标志物的检测系统和试管内化验，以及涉及用于在患有神经损伤如创伤性脑损伤或疑似患有神经损伤如创伤性脑损伤的受试者中诊断、识别、补给和/或监测神经损伤如创伤性脑损伤的检测系统和试管内化验。
本文所描述的检测系统和方法提供了用于利用通过非侵入性或微创手段获得的身体样本如身体流体来进行诸如TBI的神经损伤的简单的临床当场即时、实时评估的单次使用的、一次性的和成本效益高的方式，其最小化用于检测和监测TBI和相关脑震荡的复杂的临床操作。已经尝试使用基于试纸的免疫测定试验检测TBI的化学生物标志物。不幸的是，这种测试仍然需要昂贵和不便携的分光光度设备。此外，评估是更定性的，而不是定量的和不确定的。
在一些实施方案中，本文所描述的检测系统和化验或方法包括：至少一种反应溶液，其能够用语生成可检测和/或可量化分析物，该分析物指示疑似患有神经损伤的受试者的身体样本中的丙酮酸脱氢酶的量、浓度或水平；以及生物传感器，其用于检测反应溶液中的分析物的量、水平或浓度。
丙酮酸脱氢酶(PDH)的检测可以采用如下反应机制：
在上述反应中，在反应溶液中提供丙酮酸盐和NADH，它们的量有效地作为与混合有反应溶液的身体样本中的PDH反应以及用于产生NAD+的衬底。NAD+是电化学活性物质，其可以在给定吉布斯自由能或继而电化学电势下被还原。还原电流可用于在固定丙酮酸和NADH浓度下将参与反应的PDH定量。可以使用生物传感器测量从怀疑患有神经损伤的受试者获得的身体样本中的反应溶液和PDH的生化反应产生的NAD+的量，浓度或水平，以确定在体液中PDH的量，浓度或水平，因此确定受试者是否具有神经损伤。
从怀疑患有神经损伤的受试者获得的身体样本中的PDH的量可以直接影响NAD+的产生。因此，可以将生成的NAD+的定量水平与对照值或预定值进行比较，以确定身体样本中PDH的水平，以及受试者是否具有神经损伤，例如TBI。例如，与对照值相比，与反应溶液混合的身体样本中检测到的NAD+水平的升高表示受试者具有神经损伤，例如TBI。
例如，可以通过将量的丙酮酸盐和NADH与磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)混合，使得丙酮酸盐和NADH的摩尔比为约1:1来制备反应溶液。具有6.5的pH的PBS溶液可以是通过将一碱价和二碱价磷酸钠与去离子水混合而制备，并且可以加入200mM氯化钾作为支持电解质以提高缓冲剂的导电性。有利地，反应溶液不包括潜在地有助于生物传感器的背景氧化电流并且损害所产生的NAD+的检测和定量的任何试剂或副产物。
如此形成的反应溶液可以与从受试者获得的身体样本，例如体液(例如，唾液，血液，血清，血浆或尿液)混合。在一些方面，体液可以是从患有或疑似患有神经损伤的受试者获得的唾液。从受试者获得的唾液的量可以是约0.1ml或更多。然后可将获得的唾液加入到反应溶液中。例如，加入到约6μl反应溶液中的唾液的量可以是约1μl或更少。
使用用于以侵入方式(即，直接来自受试者)或非侵入性地获得液体和/或固体身体样本的采样装置，例如注射器，拭子或其他采样装置，可以从受试者获得身体样本。然后可将这些样本储存在储存容器中。用于容纳所收集的样本的储存容器可以包括非表面反应性材料，例如聚丙烯。储存容器通常不由未处理的玻璃或其他样本反应性材料制成，以防止样本被玻璃容器的表面吸收或吸附。
收集在容器中的样本可以在冷藏温度下储存。对于较长的储存时间，收集的样本可以冷冻以阻止分解并便于储存。例如，从受试者获得的样本可以储存在猎鹰管中并冷却至约-80°的温度。
通过将含有PDH的身体样本与反应溶液混合而产生的NAD+是电化学活性物质，其可在适当条件下被氧化或还原，并使用NAD+生物传感器检测，以定量身体样本中的PDH水平，并且确定受试者是否具有神经损伤。在一些实施方案中，生物传感器可以包括两电极或三电极电化学生物传感器。
图1示出了根据本申请的实施例的生物传感器10。传感器10是三电极传感器，其包括形成在衬底的表面上的对电极12，工作电极14和参考电极16。介电层40覆盖工作电极12，对电极14和参考电极16的一部分。介电层40包括孔口20，其限定工作电极12，对电极14和参考电极16的暴露于其中检测到PDH水平的样本的检测区域。
电压源22连接到工作电极14和参考电极16。电流测量装置24连接到工作电极14和对电极12，以测量当反应溶液和身体样本的混合物接触传感器10的检测区域20时通过NAD+的氧化还原反应产生的电流。
工作电极14是NAD+的氧化还原反应且发生电荷转移的部位。对电极12的功能是完成电路，允许电荷流经传感器10。工作电极14和对电极12优选地由相同的材料形成，但是这不是要求。能够用于工作电极14和对电极12的材料的示例包括但不限于金，铂，钯，银，碳，其合金，及其复合物。
可用于形成参考电极16的材料的实例是银-氯化银和汞-汞氯化物(Calomel)。优选银-氯化银。银可以以银油墨的形式施加到衬底上，银油墨是市售的，或者可以使用细分散的金属颗粒，溶剂和粘合剂来制成。各个银接触垫30,32和34与电极12,14和16中的每一个连接。该参考电极可以厚膜印刷在工作电极和对电极的相同的衬底上，并且还可以在外部使用。
在一些实施方案中，工作电极14和对电极12可包括颗粒层，例如活性炭或多孔碳的微米，中等尺寸或纳米尺寸的颗粒。活性碳纳米颗粒可以与金属催化剂颗粒结合，所述金属催化剂颗粒提高与NAD+的电化学氧化还原反应的速率，并提供在比没有催化剂颗粒存在时更低的氧化电位下NAD+的检测。在实际应用中，金属催化剂颗粒可以缩短反应时间，降低用于反应溶液和生物样本的混合物中NAD+检测的所施加的电化学电位。降低所施加的电位通常导致电化学氧化的最小化或所呈现的其它物质的还原，导致由混杂物质的不希望的反应引起的干扰的最小化。结果，可以获得和生产高度特异性的生物传感器。
金属催化剂颗粒可以包括一元金属(M)，二元金属(M-X)，一元金属氧化物(MOy)，二元金属氧化物(MOy-XOy)，金属-金属氧化物复合材料(M-MOy)或其组合的纳米尺寸、中等尺寸或微米尺寸的颗粒，其中y小于3，M和X独立地选自Li，Na，Mg，Al，K，Ca，Cr，Mn，Fe，Co，Ni，Cu，Zn，Ga，Sr，Y，Zr，Nb，Mo，Ru，Rh，Pd，Ag，Cd，In，Sn，Ba，La，Ce，Pr，Nd，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Lu，Ta，W，Os，Ir，Pt，Au和Pb构成的组。在一个实施方案中，例如，金属催化剂颗粒可以由一元金属，一元金属氧化物，二元金属或二元金属氧化物构成，如铱，氧化铱，铂，钌，铂-钌，铂-镍和铂-金。
电压源可以向工作电极14和参考电极16和/或对电极12施加电压电位，取决于传感器10的设计。可利用测量装置或计量器来测量工作电极14与对电极16之间的电流。该电流是由于在工作电极12处反应溶液和身体样本的混合物中NAD+的还原引起的且提供在检测区域中。
所测量的电流的量或水平与反应溶液和身体样本的混合物中的NAD+的水平或量成比例。在一些实施方案中，样本是从患有或怀疑患有神经损伤的受试者获得的身体样本，一旦确定了用传感器测试的反应溶液产生的电流水平，则可以将该水平与预定值或对照值比较以提供用于诊断或监测受试者中的神经损伤的信息。例如，可以将电流水平与预定值或对照值进行比较，以确定受试者是否具有TBI。与预定值或对照值相比增加的电流水平可以指示受试者具有TBI；而与预定值或对照值相比相似或降低的电流水平可以指示受试者的TBI的不存在。
反应溶液和从受试者获得的身体样本的混合物所产生的电流水平可以与反应溶液和先前从受试者获得(例如在施用治疗剂之前)的身体样本的混合物的电流水平比较。因此，本文所述的方法可用于通过比较治疗方案之前和之后获得的电流水平来测量治疗与受试者的神经损伤相关的病症，病理学或病症的治疗方案的功效。另外，本文所述的方法可用于通过比较在给定时间段(例如天，周，月或年)内获得的身体样本中的电流水平来测量受试者中的神经损伤的进展。
由反应溶液和受试者的身体样本的混合物产生的电流水平也可以与预定值或对照值比较，以提供用于确定受试者中神经损伤的严重性的信息。预定值或对照值可以基于从健康或正常受试者或一般群体或从对照受试者的选择群体获得的可比较样本中的电流水平。
预定值可以采取各种形式。预定值可以是单个截止值，例如中值或平均值。预定值可以基于比较组来建立，诸如其中一个定义的组中的电流水平是另一个定义的组中的电流水平的两倍。预定值可以是这样的范围，例如，其中一般受试者群体被均等地(或不等地)划分成组或划分为象限，最低象限是具有最低电流水平的受试者，最高象限是具有最高电流水平的个体。在示例性的实施方案中，选择两个截止值以最小化错误肯定和错误否定结果的比率。
图1和图2中所示的生物传感器可以在由聚酯或其他非导电材料制作在衬底100上，例如其它聚合物材料，氧化铝(Al2O3)，陶瓷基材料，玻璃或半导电衬底(例如硅，氧化硅和其它覆盖的衬底)。因此，多个传感器器件102可以形成在公共衬底100(图2)上。如将理解的，可以设想电极的几何形状和尺寸的变化。
生物传感器可以使用薄膜，厚膜和/或喷墨印刷技术制造，特别是用于在衬底上沉积多个电极。薄膜工艺可以包括物理或化学气相沉积。用于其制造的电化学传感器和厚膜技术在C.C.Liu等人的美国专利No.4,571,292、C.C.Liu的美国专利No.4,655,880，以及共同未决的美国申请序号No.09/466,865中进行了论述，这些参考文献全部内容通过引用并入本文。例如，在碳电极的情况下，将活性炭与结合剂混合，如墨水一样沉积在衬底上，并使其干燥。
在一些实施例中，工作电极，对电极和参考电极可以使用激光烧蚀形成，该工艺可以产生具有小于千分之一英寸的特征的元件。激光烧蚀使得能够精确限定工作电极、对电极和参考电极以及电连接引线和其他特征，这是减小变异系数以及提供精确测量所需要的。可以使用激光烧蚀来照射金属化膜，例如Au，Pd和Pt或具有类似电化学性质的任何金属，其可以溅射或涂覆在塑料衬底(例如PET或聚碳酸酯或其它介电材料)上，以提供这些特征。
在一个实施例中，可以通过溅射技术沉积厚度为约300A至约2000A的金膜，从而产生非常均匀的层，该非常均匀的层可以被激光烧蚀以形成工作电极和对电极。对电极可以使用其它材料。然而，为了制造的简单性，对于工作电极和对电极使用相同的材料将简化制造工艺，从而提供在单个处理步骤中生产两个电极的可行性。然后，可以使用厚膜丝网印刷技术印刷Ag/AgCl参考电极、绝缘层和电连接部件。
图3和图4示出了检测系统可以用于检测溶液中的PDH。在初步测试中，使用3μM的丙酮酸溶液(浓度为375μM)和3μl的NADH(浓度为375μM)，其中PDH体积为2μl，浓度从0至7.5μM变化。结果如图3和图4所示，使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)。类似于PBS中的初步测试，在人工唾液而不是PBS中进行的、使用3μL丙酮酸溶液(浓度375μM)和3μL的NADH(浓度375μM)的基质材料和浓度从0-7.5μM变化的2μL的PDH体积的初始研究可以用于表明唾液是可以容易地用于实时检测TBI的生物流体。
在其他实施方案中，检测系统可以包括其他生物传感器，其可以检测指示来自受试者的身体样本中的神经损伤，例如创伤性脑损伤的除了PDH之外的其他生物标志物。这些其他生物标志物可包括例如S100B，神经元特异性烯醇化酶(NSE)和分泌肌动蛋白(例如SCGN，SEGN，CALBL或setgin)。这些生物传感器可以包括衬底，形成在衬底表面上的工作电极，形成在衬底表面上的对电极，覆盖工作电极和反电极的一部分并且限定暴露工作电极和反电极的其它部分的孔口的介电层。工作电极可以被官能化或化学官能化以包括用于至少一种感兴趣的生物标志物的受体。受体可以选择性结合来自受试者的身体样本中的指示神经损伤一种或多种感兴趣的生物标志物。
检测系统还可以包括用于向工作电极，对电极和/或参考电极施加电压电势并测量工作电极和对电极之间的电流的测量装置。可以使用电化学分析技术(例如循环伏安法(CV)，差分脉冲伏安法(DPV))检测生物标志物和受体的相互作用，以确定身体样本中生物标志物的存在以及受试者是否具有神经损伤或受试者的神经损伤的程度。
在一些实施方案中，选择性结合其指示神经损伤的生物标志物的受体是优先结合该生物标志物的分子(即，其对该生物标志物的结合亲和力大于其对任何其它生物标志物的结合亲和力)。其对感兴趣的生物标志物的结合亲和力可以比对于任何其它生物标志物的结合亲和力大2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，15倍，20倍，25倍，30倍，40倍，50倍，100倍或更多。除了其相对结合亲和力之外，受体还必须具有足够高以有效结合感兴趣的生物标志物的绝对结合亲和力(即，其必须具有足够的灵敏度)。具有皮摩尔至微摩尔范围内的结合亲和力的受体是合适的。这种相互作用可以是可逆的。
受体可以是任何性质(例如，化学，核酸，肽，脂质，其组合等)。指示神经损伤的生物标记物也可以是任何性质的，只要存在选择性与其结合并且在一些情况下具体地与其结合的受体即可。
本文所用的术语“官能化”或“化学官能化”是指通过化学反应将官能团加成到材料的表面上。如本领域技术人员容易理解的，官能化可以用于材料的表面改性，以实现所需的表面性质，例如生物相容性，润湿性等。类似地，本文所用的术语“生物官能化”，“生物官能化的”等意指对材料表面的改性，使得其具有所需的生物学功能，这将是本领域技术人员容易理解的，如生物工程。
受体可以共价或非共价地官能化为工作电极。受体与工作电极的共价附着可以是直接或间接的(例如通过连接子)。受体可以使用连接子固定在工作电极上。连接子可以是可用于连接多种实体的连接子。
在一些实施方案中，连接子可以是同双功能连接子或异双功能连接子，这取决于待缀合的分子的性质。同双功能连接子具有两个相同的反应基团。异双功能连接子具有两个不同的反应基团。各种类型的市售连接子与一个或多个以下基团反应：伯胺，仲胺，巯基，羧基，羰基和碳水化合物。胺特异性连接子的实例是双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯，双[2-(琥珀酰亚氨基氧基羰基氧基)乙基]砜，辛二酸二琥珀酰亚胺酯，酒石酸二琥珀酰亚胺酯，己二酸二甲酯2HCl，二甲基庚二酰亚胺2HCl，二盐酸二甲酯HCl，乙二醇双-[琥珀酰亚胺基-[琥珀酸]]，二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)和3,3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)。与巯基反应的连接子包括双马来酰亚胺己烷，1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]]丁烷，1-[对叠氮基水杨酰胺基]-4-[碘乙酰氨基]丁烷和N-[4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺。优选与碳水化合物反应的连接子包括叠氮苯甲酰肼。优选与羧基反应的连接子包括4-[对叠氮基水杨酰胺基丁胺]。
与胺和巯基反应的异双功能连接子包括N-琥珀酰亚胺基-3-[2-吡啶基二硫代]丙酸酯，琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯，琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯，m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯，6-[3-[2-吡啶基二硫代]丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯和4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯。与羧基和胺基反应的异双官能连接子包括1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳二亚胺盐酸盐。与碳水化合物和巯基反应的异双功能连接子包括4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧基酰肼HCl，4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼.2HCl和3-[2-吡啶基二硫基]丙酰肼。
可替代地，受体可以非共价地涂敷到工作电极上。受体至工作电极的非共价沉积可涉及使用聚合物基质。聚合物可以是天然存在的或非天然存在的，并且可以是任何类型的，包括但不限于核酸(例如DNA，RNA，PNA，LNA等或其模拟物，衍生物或组合)，氨基酸(例如肽，蛋白质(天然的或变性的)等)或其模拟物，衍生物或组合，脂质，多糖和官能化嵌段共聚物。受体可以吸附到和/或包埋在聚合物基质内。
可替代地，受体可以与聚合物共价缀合或交联(例如，其可以“接枝”到官能化聚合物上)。
合适的肽聚合物的实例是聚赖氨酸(例如聚-L-赖氨酸)。其它聚合物的实例包括包含聚乙二醇(PEG)，聚酰胺，聚碳酸酯，聚烷撑，聚亚烷基二醇，聚环氧烷，聚对苯二甲酸亚烷基酯，聚乙烯醇，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚乙烯卤化物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯，烷基纤维素，羟烷基纤维素，纤维素醚，纤维素酯，硝基纤维素，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，甲基纤维素，乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丁基甲基纤维素，乙酸纤维素，丙酸纤维素，乙酸丁酸纤维素，乙酸邻苯二甲酸纤维素，羧乙基纤维素，三乙酸纤维素，硫酸纤维素钠盐，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸乙酯，聚甲基丙烯酸丁酯，聚甲基丙烯酸异丁酯，聚甲基丙烯酸己酯，聚甲基丙烯酸异癸酯，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸异丙酯)，聚(丙烯酸异丁酯)，聚(丙烯酸十八酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚(乙二醇)，聚(环氧乙烷)，聚(对苯二甲酸乙二醇酯)，聚(乙烯醇)，聚乙酸乙烯酯，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚透明质酸，酪蛋白，明胶，谷蛋白，聚酐，聚丙烯酸，藻酸盐，壳聚糖，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸异丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸异癸酯)，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸异丙酯)，聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷基酯)，聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸酯，聚己内酯，聚酯酰胺，聚原酸酯，聚羟基丁酸，聚酐，聚(苯乙烯-b-异丁烯-b-苯乙烯)(SIBS)嵌段共聚物，乙烯乙酸乙烯酯，聚(甲基)丙烯酸，乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酸酐，聚(邻)酯，聚氨酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)和聚(丙交酯-共聚己内酯)，和天然聚合物如藻酸盐和其它多糖，包括葡聚糖和纤维素，胶原，白蛋白和其它亲水蛋白，玉米蛋白和其它谷醇溶蛋白和疏水蛋白，其共聚物和混合物，及其化学衍生物，包括化学基团的取代和/或添加，例如烷基，亚烷基，羟基化，氧化以及本领域技术人员常规制备的其它改性。
在一个具体实施方案中，工作电极可以包括化学交联或生物素化的工作电极，以允许连接抗体或含生物素的分子。金制工作电极可以例如与二硫醇双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)交联，其包含可与蛋白质和抗体的胺基团反应的胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。
应当理解，化学官能化的灵活性使得生物传感器可用于基本上连接对生物标记具有亲和性的任何配体。因此，具有亲和性的配体可连接到工作电极的生物标志物的实例包括但不限于DNA，寡核苷酸，蛋白质，生物素和链霉亲和素。蛋白质配体包括单克隆抗体(mAB)；然而酶基质也可以用作对相应酶的具有亲和力的配体。
在一些实施方案中，工作电极通过mAB上的反应性氨基用单克隆抗体或其抗原结合片段官能化。因为大多数抗体具有赖氨酸基团，所以它们可以在赖氨酸氨基处连接到装置。
化学官能化方法还使得能够具有氨基的DNA适体的生物缀合。这些适体可以潜在地结合小分子和蛋白质。一旦结合，工作电极表面上的电荷的变化将使得该装置能够检测靶生物分子或小分子。
类似于图1所示的用于检测PDH的生物传感器，用于检测指示神经损伤的除了PDH之外的其他生物标志物的生物传感器，可以使用特别是用于在衬底上沉积多个电极的薄膜，厚膜和/或喷墨印刷技术来制造。薄膜工艺可以包括物理或化学气相沉积。
在一些实施例中，这些传感器的工作电极，对电极和参考电极可以使用激光烧蚀形成，该工艺可以产生具有小于千分之一英寸的特征的元件。可以使用激光烧蚀来照射金属膜，例如Au，Pd和Pt或具有类似电化学性质的任何金属，其可以溅射或涂布在塑料衬底(例如PET或聚碳酸酯或其它介电材料)上，以提供这些特征。
在其他实施例中，检测系统可以包括可以以阵列形式设置在衬底的表面上的多个生物传感器。生物传感器阵列可以被配置为检测受试者的身体样本中的NAD+浓度变化以及指示性神经损伤的其他分析物的浓度。生物传感器阵列可以包括布置成多行和多列的多个生物传感器。每个生物传感器包括在工作电极和对电极上。工作电极可以被官能化或化学官能化以包括用于至少一种感兴趣分析物的受体。对于阵列的每个生物传感器，受体可以是相同的或不同的，并且可以选择性地结合一种或多种感兴趣分析物。阵列的生物传感器可以被配置为提供表示身体样本中分析物的存在和/或浓度的至少一个输出信号。对于所述多个列中的每一列或所述多个行中的每一行，所述阵列进一步包括经配置以向所述列或行中的相应生物传感器提供电压电位的列或行电路。行或列中的每个生物传感器可以潜在地检测不同的分析物和/或偏置以检测不同的分析物。
从本发明的上述描述，本领域技术人员将认识到改进、变化和修改。本领域技术内的这些改进、变化和修改旨在由所附权利要求覆盖。本申请中引用的所有参考文献、出版物和专利通过引用整体并入本文。

Claims (15)

1.用于确定身体样本中的丙酮酸脱氢酶(PDH)水平的检测系统，包括：
至少一种反应溶液，其用于在与所述身体样本中的PDH结合时生成NAD+，所述反应溶液包括丙酮酸盐和NADH；
以及生物传感器，其用于确定所生成的NAD+的水平，所述生物传感器包括形成在衬底的表面上的工作电极、形成在所述衬底的所述表面上的对电极以及用于对所述工作电极和对电极施加电压电位且测量所述工作电极与对电极之间的电流流动的测量装置，其中所述反应溶液不包括有助于生物传感器的背景氧化电流并且损害所产生的NAD+的检测和定量的其他试剂。
2.如权利要求1所述的检测系统，所述身体样本包括从由唾液，呼吸，血液，血浆，血清和尿构成的组中选出的身体流体。
3.如权利要求1所述的检测系统，适合于受试者中神经损伤的检测。
4.如权利要求3所述的检测系统，所述神经损伤包括创伤性脑损伤。
5.如权利要求1所述的检测系统，其中所述工作电极和所述对电极包括金属膜。
6.如权利要求1所述的检测系统，其中所述工作电极和对电极独立地包括金，铂，钯，银，其合金，以及碳及其复合物。
7.如权利要求5所述的检测系统，通过将所述膜溅射或涂敷到所述表面上而将所述金属膜设置在所述衬底的所述表面上，并且其中所述工作电极和所述对电极利用激光烧蚀来形成。
8.如权利要求1所述的检测系统，其中所述反应溶液包括在磷酸盐缓冲盐水溶液中摩尔比为1:1的丙酮酸盐和NADH。
9.用于检测受试者中的神经损伤的化验装置，包括：
至少一种反应溶液，其用于在与从所述受试者获得的身体样本的丙酮酸脱氢酶PDH结合时生成NAD+，所述反应溶液包括丙酮酸盐和NADH；
以及生物传感器，其用于确定所生成的NAD+的水平，所述生物传感器包括形成在衬底的表面上的工作电极、形成在所述衬底的所述表面上的对电极以及用于对所述工作电极和对电极施加电压电位且测量所述工作电极与对电极之间的电流流动的测量装置，其中所述反应溶液不包括有助于生物传感器的背景氧化电流并且损害所产生的NAD+的检测和定量的其他试剂。
10.如权利要求9所述的化验装置，所述身体样本包括从由唾液，呼吸，血液，血浆，血清和尿构成的组中选出的身体流体。
11.如权利要求9所述的化验装置，所述神经损伤包括创伤性脑损伤。
12.如权利要求9所述的化验装置，其中所述工作电极和所述对电极包括金属膜。
13.如权利要求9所述的化验装置，其中所述工作电极和对电极独立地包括金，铂，钯，银，其合金，以及碳及其复合物。
14.如权利要求12所述的化验装置，通过将所述膜溅射或涂敷到所述表面上而将所述金属膜设置在所述衬底的所述表面上，并且其中所述工作电极和所述对电极利用激光烧蚀来形成。
15.如权利要求9所述的化验装置，其中所述反应溶液包括在磷酸盐缓冲盐水溶液中摩尔比为1:1的丙酮酸盐和NADH。
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