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CN106456750A - CD‑64阻断剂作为抗TNF‑α抗体疗法的增强剂的用途 - Google Patents

CD‑64阻断剂作为抗TNF‑α抗体疗法的增强剂的用途 Download PDF

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CN106456750A
CN106456750A CN201580014576.6A CN201580014576A CN106456750A CN 106456750 A CN106456750 A CN 106456750A CN 201580014576 A CN201580014576 A CN 201580014576A CN 106456750 A CN106456750 A CN 106456750A
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CN
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tnf
polypeptide
antibody
scfv
therapy
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CN201580014576.6A
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迪米特里·赫里斯拖德洛夫
西奥菲勒斯·德潘
斯蒂芬·巴斯
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Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
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Abstract

本发明涉及一种具有至少10‑9M的对CD64的结合亲和力的多肽，所述多肽与抗TNF‑α抗体联合用于治疗与炎症有关的疾病A。

Description

CD-64阻断剂作为抗TNF-α抗体疗法的增强剂的用途
本发明属于用于治疗患者中的与炎症有关的疾病的多肽，所述患者不响应通过采用抗TNF-α抗体的疗法对炎症的治疗。
肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种参与几种炎性疾病的发病机制的关键的细胞因子，所述炎性疾病包括炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎(RA)和特应性皮炎(AD)(Roberts-Thomson et al.,Cells,cytokines and inflammatory bowel disease:a clinicalperspective.Expert Rev Gastroenterol Hepatol 2011.5:703-716；Upchurch,K.S.andKay,J.,Evolution of treatment for rheumatoid arthritis.Rheumatology(Oxford)2012.51；Numerof,R.P.and Asadullah,K.,Cytokine and anti-cytokine therapies forpsoriasis and atopic dermatitis.BioDrugs 2006.20:93-103)。它最初以跨膜蛋白(mTNF-α)产生，所述跨膜蛋白(mTNF-α)被膜驻留蛋白酶ADAM17切下以产生可溶性形式(Black,R.A.et al.,A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells.Nature 1997.385:729-733)。
两种形式都能结合两种已知的TNF受体之一(TNFR1或TNFR2)，因此活化NF-κB和AP-1(Liu,Z.G.,Molecular mechanism of TNF signaling and beyond.Cell Res2005.15:24-27.)，它们是促炎基因的调节物，所述促炎基因包括那些编码细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α自身的基因(Rogler,G.and Andus,T.,Cytokines ininflammatory bowel disease.World J Surg 1998.22:382-389)。
中和可溶性TNF-α的单克隆抗体(单抗)的开发已经导致许多中断促炎事件的下游级联的成功的疗法(Thalayasingam,N.and Isaacs,J.D.,Anti-TNF therapy.Best PractRes Clin Rheumatol 2011.25:549-567)。然而，一些患者不响应抗TNF-α疗法。最近，报告了非响应IBD患者中的单核细胞和巨噬细胞上的增加的CD64表达(Wojtal,K.A.et al.,Fcgamma receptor CD64modulates the inhibitory activity of infliximab.PLoS One2012.7:e43361)。英利昔单抗(Infliximab)和阿达木单抗(adalimumab)(两者都是举足轻重的抗TNF-α单抗)被CD64俘获，从而诱导促炎下游信号传导级联，其抵消通过中和TNF-α实现的积极作用。尽管已经报告了与纯化的IgGl Fcγ域的温育在实验室条件下改善这些单抗的效力(Bruhns,P.et al.,Specificity and affinity of human Fcgamma receptorsand their polymorphic variants for human IgG subclasses.Blood 2009.113:3716-3725)。然而，此方法在临床上是不合适的，因为低亲和力Fcγ受体CD32和CD16被阻断，这通过抑制抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导免疫抑制。CD32和CD16对于介导效应器功能(包括ADCC和CDC)，因此提供针对侵入性病原体的必要保护是必需的。阻断所有三种Fcγ受体将抑制免疫系统，并且使患者对机会性感染易感(Willcocks,L.C.et al.,Low-affinity Fcgamma receptors,autoimmunity andinfection.Expert Rev Mot Med 2009.13；及Nimmerjahn,F.and Ravetch,J.V.,Fc-receptors as regulators of immunity.Adv Immunol 2007.96:179-204)。这是一项特别的忧虑，因为抗TNF-α疗法已经可以诱导中等的免疫抑制，因此进一步损害免疫系统会是高度不想要的(Ford,A.C.and Peyrin-Biroulet,L.,Opportunistic infections withanti-tumor necrosis factor-alpha therapy in inflammatory bowel disease:meta-analysis of randomized controlled trials.Am J Gastroenterol 2013.108:1268-1276；Xie,X.,Li,F.,et al.,Risk of tuberculosis infection in anti-TNF-αlphabiological therapy:From bench to bedside.J Microbiol Immunol Infect 2013.30:005；及Ordonez,M.E.,Farraye,F.A.and Di Palma,J.A.,Endemic Fungal Infections inInflammatory Bowel Disease Associated with Anti-TNF Antibody Therapy.InflammBowel Dis 2013.19:2490-2500)。
WO 2014/029890A1公开了用于预测患者不响应通过TNF-α抗体进行的疗法的可能性的方法，其中在代表受影响的组织的样品中，测定CD64和/或CD16的表达水平，并且与标准品比较。类似地，公开了用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，其中组合物包含TNFα抗体和针对CD64和/或CD16的抗体，或非特异性抗体制剂。
WO 2005/052007A1涉及异源的重组制备的复合物和编码此类复合物的核酸和载体，所述复合物包含至少一种细胞毒性域和至少一种CD64特异性结合域(特别是人起源的)。它进一步涉及用根据本发明的复合物或用含有编码该复合物的核酸的载体影响CD64阳性细胞的细胞生长和生理学的方法。本发明进一步涉及用于产生根据本发明的复合物的载体和宿主。它进一步涉及基于根据本发明的复合物或编码该复合物的载体的药物的制备和分布，用于治疗基于结构限定细胞群体的病理学增殖和/或升高的活性的疾病。特别地，这适用于肿瘤疾病、变态反应、自身免疫性疾病、传染病、慢性炎症或移植(免疫抑制)。
WO 2006/002438A2公开了以高亲和力结合CD64的分离的单克隆抗体，特别是人抗体。还公开了编码本发明的抗体的核酸分子、用于表达抗体的表达载体、宿主细胞和方法以及包含本发明的抗体的免疫偶联物、双特异性分子和药物组合物。公开内容还提供了用于治疗自身免疫性病症、移植物排斥、移植物抗宿主病或癌症以及用于使用抗原和抗CD64抗体的偶联物的增强的抗原呈递的方法。
Randall T.Curnow在Cancer Immunology,Immunotherapy，1997年11月，第45卷，第3-4期，第210-215页中的综述文章中报告了用CD64指导的免疫疗法的临床经验。该综述概述了在癌症患者中用CD64指导的免疫疗法的临床经验，所述免疫疗法用双特异性抗体MDX-447[人源化Fab抗CD64x人源化Fab抗(表皮生长因子受体，EGFR)]和MDX-H210(人源化Fab抗DC64x Fab抗HER2/neu)，和用在体内调节单核细胞CD64中的抗CD64单克隆抗体(单抗)MDX-33(H22)。
发明概述
本发明的目的是提供用于增强用抗TNF-α抗体的疗法的方法。
另一个目的是提供用于治疗患者的方法，所述患者是通过抗TNF-α抗体治疗炎性疾病中的非响应者。
本发明的又一个目的是提供用于在增强用抗TNF-α抗体的疗法中的用途的化合物。
令人惊讶的是，这些目的通过具有至少10-9M的对CD64的结合亲和力的多肽实现。根据本发明，可以在与抗TNF-α抗体联合治疗与炎症有关的疾病中使用此多肽。
可以对不响应通过采用抗TNF-α抗体的疗法治疗炎症的患者或者对尚未开始治疗并且先前未暴露于抗TNF-α抗体的患者施用本发明的多肽。
在本发明的具体的实施方案中，用于根据本发明的用途的多肽，其中所述与炎症有关的疾病选自：炎性肠病，类风湿性关节炎，多发性硬化，狼疮，硬皮病(sclerodoma)；银屑病；胃肠疾病，例如移植物抗宿主病，克罗恩(Crohn)氏病，糖尿病，溃疡性结肠炎，急性和慢性移植排斥，结肠炎，肺泡炎，闭塞性细支气管炎，回肠炎，胰腺炎，肾小球肾炎，葡萄膜炎，关节炎，肝炎，皮炎，动脉粥样硬化，关节炎的所有形式，包括但不仅仅是类风湿性关节炎，多发性硬化，强直性脊柱炎，化脓性汗腺炎和特应性皮炎。
在一个具体的实施方案中，多肽是抗体或抗体片段，如scFv片段，特别是片段H22(scFv)，其以包含氨基酸序列或者由氨基酸序列组成的多肽表示，所述氨基酸序列由SeqID No.1的多核苷酸编码。
在本发明的又一个实施方案中，H22(scFv)化合物是具有SEQ ID No 2的重组多肽。
HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKLMAQPAMAQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFIFSDNYMYWVRQAPGKGLEWVATISDGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARGYYRYEGAMDYWGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTFT工SSLQPEDIATYYCHQYLSSWTFGQGTKLEIK
还有，本发明的主题是混合物，其包含本发明的多肽和跨膜TNF-α的阻断剂，如其抗体或衍生物、降低膜TNF-α的表达水平的siRNA/反义RNA。
还有，本发明的主题是治疗与炎症有关的疾病的方法，其通过对有此需要的患者施用与抗TNF-α抗体联合的本发明的多肽。
在本发明的一个实施方案中，患者是对采用抗TNF-α抗体的疗法中的炎症治疗的非响应者。
本发明的又一个实施方案是用于增强采用抗TNF-α抗体的疗法中的患者治疗的方法，特别对于作为对采用抗TNF-α抗体的疗法中的炎症治疗的非响应者的患者。
在本发明的方法的又一个实施方案中，与跨膜TNF-α的阻断剂联合施用本发明的多肽。
具体实施方式
为了解决本发明根本的技术问题，旨在开发CD64特异性治疗候选物以阻止Fcγ域的俘获。
虽然将人IgG1的Fcγ域替换为其IgG4对应物将是一项选择，因为相比CD32或CD16，IgG4以大>100倍的亲和力结合CD64(Bruhns,P.,Iannascoli,B.,England,P.,Mancardi,D.A.,Fernandez,N.,Jorieux,S.and Daeron,M.,Specificity and affinityof human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgGsubclasses.Blood 2009.113:3716-3725)，这导致发现了：IgG4能够降低抗TNF-α单抗被经刺激的HL-60细胞俘获，但是令人惊讶的是，该效应通过阻断CD16而非CD64介导，如最初预期。这可以反映经刺激的HL-60细胞表面上与CD64相比更大的CD16丰度。虽然这些体外结果确认CD16参与抗TNF-α单抗的俘获，并且与先前的观察一致，然而IgG4证明不适合于选择性阻断CD64。
已知IgG1-Fcγ域的遗传和酶促无糖基化(aglycosylated)形式丧失它们结合CD16和CD32的能力，但是保留残留的对CD64的结合亲和力(Jung,S.T.,Kang,T.H.,Kelton,W.and Georgiou,G.,By-passing glycosylation:engineering aglycosylated full-length IgG antibodies for human therapy.Curr Opin Biotechnol2011.22:858-867)。然而，与早期的报告形成直接对比，已经发现了无糖IgG1阻断CD32，而非CD64或CD16。阻断CD32不降低HL-60细胞俘获抗TNF-α单抗的能力，这指示CD32不影响患者无法响应抗TNF-α疗法。
最终，通过设计和表达重组CD64特异性抗体片段实现CD64特异性阻断，所述重组CD64特异性抗体片段最初从鼠全长单抗22衍生(Anderson,C.L.,Guyre,P.M.,Whitin,J.C.,Ryan,D.H.,Looney,R.J.and Fanger,M.W.,Monoclonal antibodies to Fcreceptors for IgG on human mononuclear phagocytes.Antibody characterizationand induction of superoxide production in a monocyte cell line.J Biol Chem1986.261:12856-12864)。在开发过程中，使单抗22人源化以产生全长单抗H22(Graziano,R.F.et al.,Construction and characterization of a humanized anti-gamma-Igreceptor type I(Fc gamma RI)monoclonal antibody.J Immunol 1995.155:4996-5002)，然后以单链片段重构(reformatted)以产生H22(scFv)。我们使用在我们的实验室中完善建立的应激诱导的周质蛋白表达方案在大肠杆菌(E.coli)中产生重组H22(scFv)(Barth,S.et al.,Compatible-solute-supported periplasmic expression offunctional recombinant proteins under stress conditions.Appl EnvironMicrobiol 2000.66:1572-1579)。对刺激的HL-60细胞添加重组H22(scFv)导致有力且特异性的CD64阻断，因此强烈降低细胞俘获抗TNF-α单抗的能力。此结果是意料不到的，因为已经显示了全长单抗22和H22结合CD64上位于Fcγ域结合位点外部的表位(Guyre,P.M.etal.,Monoclonal antibodies that bind to distinct epitopes on Fc gamma RI areable to trigger receptor function.J Immunol 1989.143:1650-1655)。然而，尽管在Fcγ域结合位点外部结合，已经显示了H22结合不依赖于人血清中的其它IgG分子的存在(Graziano,R.F.et al.,Construction and characterization of a humanized anti-gamma-Ig receptor type I(Fc gamma RI)monoclonal antibody.J Immunol 1995.155:4996-5002)。另外，H22有效阻断CD64介导的对调理的红细胞的吞噬，并且强烈下调生理学条件下的CD64表达(Wallace,P.K.et al.,Humanized mAb H22binds the human highaffinity Fc receptor for IgG(FcgammaRI),blocks phagocytosis,and modulatesreceptor expression.J Leukoc Biol 1997.62:469-479)。是否可以通过位阻解释H22(scFv)的阻断效应仍然不清楚；然而，此独特的抗CD64抗体的所有上文提及的特征强调其结合、阻断CD64以及降低CD64的表面水平(甚至在血清条件下)的能力。这使H22(scFv)成为用于慢性炎性疾病的一种特定的令人感兴趣的治疗候选物。
另外，通过联合施用本发明的多肽和跨膜TNF-α的阻断剂进一步改善根据本发明的治疗。
令人感兴趣的是，细胞因子TNF-α以可溶形式和膜结合形式两者存在。虽然可溶形式在慢性炎性状况下是病理性的并且是抗TNF-α单抗的治疗靶标，但是mTNF-α的作用没有得到完全了解。发明人仅在经刺激的(促炎)HL-60细胞上检查了mTNF-α的表面表达。已经发现了阻断CD64和mTNF-α两者完全消除经刺激的HL-60细胞俘获抗TNF-α单抗的能力，从而指示CD64和mTNF-α两者都对抗TNF-α疗法的成功具有重大影响(图9)。
总之，CD64阻断性抗体，特别是CD64阻断性抗体片段H22(scFv)阻止抗TNF-α单抗被CD64的俘获，所述CD64在炎性单核细胞和巨噬细胞表面上的过表达与一些患者对抗TNF-α疗法的应答不良有关。CD64阻断性抗体，特别是CD64阻断性抗体片段H22(scFv)通过增强抗TNF-α单抗的活性来促进它们的治疗效力。本发明还基于下述发现：增加的mTNF-α表达有助于抗TNF-α单抗经其Fab域的俘获。因此，与特异性阻断mTNF-α的抗体联合的CD64阻断性抗体甚至进一步增强抗TNF-α疗法的效力，并且相应地减少非响应者群体。
本发明的多肽可以是衍生化的，尤其是在N端、C端和/或在肽链中。N端的衍生化可以包括部分或完全烷基化、酰化或另一种N修饰。C端的衍生化可以包括末端羧基基团的酰胺化、酯化或另一种修饰。特别地，多肽链的衍生化可以包括改善根据本发明的多肽的特性的修饰，例如PEG化、HES化等。如果需要的话，则根据本发明的多肽也可以与对生物体的细胞结构具有结合亲和力的结构单元偶联，针对所述细胞结构有待采用根据本发明的多肽。适合于实现多肽的经修饰的特性的衍生化是本领域技术人员已知的。根据本发明，也要求保护具有提及的活性的根据本发明的多肽的衍生物。
特别地，本发明的多肽与本发明的多肽序列显示至少90％同一性。
因此，根据本发明，多肽是本发明的实施方案，其源自序列的截短或进一步的氨基酸残基的添加或缺失。此外，有可能采用已经添加了另外的序列元件(例如以实现以重组形式制备中的更高产率或促进的纯化)的多肽变体。
除去个别氨基酸残基，或者将它们替换为不同氨基酸的残基可以是有利的。额外的氨基酸残基的插入也是可能的。当从多肽的截短或延伸的变体开始时，此类变化也是可能的。特别地，将个别氨基酸残基替换为那些具有相似的物理化学特性的氨基酸残基可以是有利的。因此，大体上，氨基酸残基在以下组内互相可互换：
精氨酸和赖氨酸；
谷氨酸和天冬氨酸；
谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸；
甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸；
亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸；
丝氨酸和苏氨酸。
以技术人员已知的各种方式将肽配制为药物。药学可接受赋形剂可以存在于此类药物中。适合于作为载体或稀释剂使用的药学可接受赋形剂是本领域中公知的，并且可以在多种配制剂中使用。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,A.R.Gennaro编,Mack Publishing Company(1990)；Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第20版,A.R.Gennaro编,Lippincott Williams&Wilkins(2000)；Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,A.H.Kibbe编,AmericanPharmaceutical Association,Pharmaceutical Press(2000)；以及Handbook ofPharmaceutical Additives,Michael和Irene Ash编,Gower(1995)。
本领域普通技术人员可以使用公众可获得的材料和方案容易地确定本药物中的本发明的多肽的治疗有效量。例如，多肽的量可以以约0.1mg/mL至约100mg/ml的量存在于配制剂中。在一些实施方案中，本发明的多肽以约1mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，本发明的多肽以约10mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，本发明的多肽以约20mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，本发明的多肽以约25mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，本发明的多肽以约30mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，本发明的多肽以约50mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，本发明的多肽以约75mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，本发明的多肽以约80mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，本发明的多肽以约85mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，本发明的多肽以约90mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，本发明的多肽以约100mg/mL的浓度存在。
在本公开内容的多个实施方案中，药物配制剂具有通过中和配制剂获得的pH。如本文中使用，术语“中和”意指使组合物具有更中性的pH(即，将组合物的pH改变为约6.8至约7.5的pH)。例如，对碱性组合物添加酸性物质可以使碱性组合物具有更中性的pH(即约6.8-7.5)。同样地，对酸性组合物添加碱性物质可以使酸性组合物具有更中性的pH(即约6.8-7.5)。
在本公开内容的一些实施方案中，通过在组合本发明的多肽和一种或多种赋形剂后中和配制剂获得药物配制剂的pH。在一个实施方案中，通过添加本发明的多肽实现中和。在另一个实施方案中，通过添加药学可接受的酸或碱实现中和。在一个实施方案中，药学可接受的酸或碱是氢氧化钠。在另一个实施方案中，药学可接受的酸或碱是乙酸钠。在又一个实施方案中，药学可接受的酸或碱是柠檬酸钠。在另一个实施方案中，药学可接受酸或碱是苯甲酸钠。
在本公开内容的多个实施方案中，经由冻干制备本发明的多肽。术语“冻干”，又称为冷冻干燥，是一种通常用于呈现蛋白质的技术，该技术用来从感兴趣的蛋白质制备物除去水。冻干是首先冷冻要干燥的材料，然后通过在真空环境中升华除去冰或冷冻的溶剂的方法。
在本公开内容的其它实施方案中，描述了用于制备本发明配制剂的多肽的方法。方法包括组合本发明的多肽和一种或多种赋形剂的步骤，其中在组合后，将配制剂中和到大于约6.8的pH，其中6.8-8.0的范围是可接受的。药物配制剂的先前描述的实施方案，包括赋形剂、pH的范围和特定的pH值，以及中和技术适用于制备配制剂的方法。
在本公开内容的其它实施方案中，描述了通过用于制备本发明配制剂的多肽的方法制备的产物。可以通过包括组合本发明的多肽和一种或多种赋形剂的步骤的方法制备产物，其中在组合后，将配制剂中和到大于约6.8的pH，其中6.8-8.0的范围是可接受的。药物配制剂的先前描述的实施方案，包括赋形剂、pH的范围和特定的pH值，且中和技术适用于通过制备配制剂的方法制备的产物。
根据本公开内容，可以通过适合于蛋白质或肽的任何常规路径施用含有本发明的多肽的配制剂，所述路径包括但不限于胃肠外，例如注射，包括但不限于皮下或静脉内或任何其它注射或输注形式。可以通过许多路径施用含有本发明的多肽的配制剂，所述路径包括但不限于口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下、血管内、乳房内或直肠手段。也可以经由脂质体施用含有本发明的多肽的配制剂。一般地，此类施用路径和合适的配制剂是本领域技术人员已知的。也可以将含有单独或与其它合适的组分组合的本发明的多肽的配制剂制备成要经由吸入施用的气雾剂配制剂(即它们可以被“喷雾”)。可以将气雾剂配制剂置于加压的可接受推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。
适合于胃肠外施用(例如经由关节内、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、和皮下路径施用)的含有本发明的多肽的配制剂包括含水和非含水的等张无菌注射溶液(其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使配制剂与目标接受者的血液等张的溶质)、和含水和非含水的无菌悬浮液(其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。含有本发明的多肽的配制剂可以在单位剂量或多剂量密封容器，如安瓿和管形瓶中呈现。含有本发明的多肽的配制剂也可以在注射器，如载药注射器中呈现。
通过以下非限制性实施例进一步解释本发明。
与临床上使用的完全人(阿达木单抗)或嵌合(英利昔单抗)抗TNF-α单抗形成对比，由于利用度问题使用了小鼠衍生的抗人TNF-α单抗。已经报告了小鼠IgG1-Fcγ对人CD64具有低亲和力，这会显著影响实验设置。然而，与文献中找到的数据形成对比，在基于实验细胞的体外系统中，人CD64(以及CD16和CD32)可以强烈俘获本文使用的小鼠抗人TNF-α单抗，从而允许研究CD64阻断分子对抗TNF-α俘获的影响。
材料和方法
抗体和细胞因子
针对CD16、CD32、CD64和TNF-α的抗体购自eBioscience(Frankfurt,德国)。人抗IgG4获自AbD Serotec(Duesseldorf，德国)。内部产生人无糖IgG1。抗mTNF-α(Gerspach,J.et al.,Detection of membrane-bound tumor necrosis factor(TNF):an analysisof TNF-specific reagents.Microsc Res Tech 2000.50:243-250)购自Hycultec GmbH(Beutelsbach，德国)。小鼠抗His5和小鼠抗His5-Alexa Fluor488获自Qiagen(Hilden，德国)。缀合有碱性磷酸酶的抗小鼠IgG获自Sigma(Steinheim，德国)。山羊抗小鼠藻红蛋白(GAM-PE)来自Dianova(Hamburg，德国)。人IFN-γ和人TNF-α分别获自Peprotech(Hamburg，德国)和eBioscience。
H22(scFv)的产生
将H22(scFv)的开放读码框与pelB前导肽序列和纯化和检测标签His10(Hristodorov et al.,Microtubule-associated protein tau facilitates thetargeted killing of proliferating cancer cells in vitro and in a xenograftmouse tumour model in vivo.British Journal of Cancer 2013:1-9)以符合读码框的方式插入细菌表达载体pMT(Matthey,B.et al.,A new series of pET-derived vectorsfor high efficiency expression of Pseudomonas exotoxin-based fusionproteins.Gene 1999.229:145-153)中。
通过测试消化和测序确认成功的克隆。如先前描述(Hristodorov et al.,Microtubule-associated protein tau facilitates the targeted killing ofproliferating cancer cells in vitro and in a xenograft mouse tumour model invivo.British Journal of Cancer 2013:1-9；Barth,S.et al.,Compatible-solute-supported periplasmic expression of functional recombinant proteins understress conditions.Appl Environ Microbiol 2000.66:1572-1579)，实施表达、纯化和蛋白质分析。
细胞培养
在补充有10％(v/v)胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、50μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中在37℃、100％湿度和5％CO2培养人前髓细胞性HL-60细胞系(ATCC：CCL-240)和人霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤细胞系L540cy(DＳMZ：ACC 72)。在每项实验前24小时用50U/ml IFN-γ刺激HL-60细胞。
通过流式细胞术对细胞结合的分析
通过流式细胞术来分析每种抗体的细胞结合活性。我们将4x105个细胞与含有2mMEDTA和0.5％(w/v)BＳA的PBS(pH 7.4)中的已知量的抗体在冰上温育30分钟，接着用PBS清洗。在冰上在黑暗中使用抗His5-Alexa Fluor 488(1∶100)或GAM-PE(1∶100)达30分钟，检测未缀合的一抗。然后，用PBS清洗细胞两次，并且在FACS Calibur流式细胞仪(BectonDickinson，Heidelberg，德国)上分析。
RNA分离、cDNA合成和实时PCR分析
使用SV总RNA分离系统(Promega，Mannheim，德国)分离RNA。使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)产生互补的DNA(cDNA)。使用SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)进行实时PCR。循环条件是：阶段1(50℃，2min)；阶段2(95℃，10min)；阶段3：35个重复(95℃，15s；60℃，1min)。使用比较阈值循环法相对于GAPDH的表达水平使靶基因的表达水平标准化。使用下述的引物：IL-1β_f：
ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA，IL-1β-r：GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT，IL-6_f：GGTACATCCTCGACGGCATCT，IL-6_r：GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC，IL-8_f：ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC，IL-8_r：AACCCTCTGCACCCAGTTTTC，GM-CSF_f：CACTGCTGCTGAGATGAATGAAA，GM-CSF_r：GTCTGTAGGCAGGTCGGCTC，TNF-α_f：GGAGAAGGGTGACCGACTCA，TNF-α_r：CTGCCCAGACTCGGCAA，GAPDH_f：TGCACCACCAACTGCTTAGC，和GAPDH_r：GGCATGGACTGTGGTCATGAG。使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software，LaJolla，CA，USA)分析数据。一式三份实施所有实验。
实施例1
IgG4降低抗TNF-α单抗的俘获，但是这是通过阻断CD16介导的。
已经显示了人IgG1-Fcγ片段阻断CD64，因此挽救抗TNF-α单抗的抑制活性(Wojtal,K.A.et al.Fc gamma receptor CD64modulates the inhibitory activity ofinfliximab.PLoS One 2012.7:e43361)。然而，这些片段也阻断CD16和CD32，这介导初次免疫应答的重要组分。与人IgG1形成对比，相比于针对CD64，人IgG4具有更低的针对CD16和CD32的亲和力(Bruhns,P.et al.,Specificity and affinity of human Fcgammareceptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses.Blood2009.113:3716-3725)。使用无关的人IgG4单抗来优先阻断CD64，同时保留CD16和CD32的大部分活性。IgG4能够实质性降低抗TNF-α单抗的俘获，但是与我们的预期形成对比，此效果是由CD16而非CD64或CD32介导的(图1，上图)。
使用人无糖IgG1(aglycoIgG1)单抗特异性阻断CD64，因为先前已经显示了聚糖的丧失会消除CD16和CD32结合，但是保留残留的针对CD64的亲和力(Jung,S.T.et al.,Bypassing glycosylation:engineering aglycosylated full-length IgG antibodiesfor human therapy.Curr Opin Biotechnol 2011.22:858-867)。令人感兴趣地，经IFN-γ刺激的HL-60细胞与无糖IgG1的预温育导致CD32，而非CD64或CD16的阻断。然而，这没有降低抗TNF-α单抗的俘获，提示了仅CD64和CD16参与此过程(图1下图)。
实施例2
血清不影响IgG4和无糖IgG1对CD64的结合。
CD64对IgG分子的Fcγ部分具有高亲和力(10-7-10-8M)(Bruhns,P.et al.,Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphicvariants for human IgG subclasses.Blood 2009.113:3716-3725)。
因此，在血清的存在下，CD64与其配体的结合-解离速率是短暂的，这导致受体被IgG的几乎永久结合。关于CD64无法结合IgG4和无糖IgG1(如上文显示)的一种可能的解释是用于培养HL-60细胞的含有血清的培养基中存在IgG。因此，在无血清培养基中培养HL-60细胞2周，并且重复流式细胞术实验。然而，IgG4或无糖IgG1都未结合CD64，即使是在缺乏血清的情况下(图2)。
实施例3
CD64特异性抗体片段H22(scFv)的产生和分析
产生名称为H22(scFv)的单链抗体片段，其特异性结合CD64。将H22(scFv)编码序列与N端pelB前导肽和His10标签以符合读码框的方式融合(图3a)。使用周质应激表达方案(Barth,S.et al.,Compatible-solute-supported periplasmic expression offunctional recombinant proteins under stress conditions.Appl EnvironMicrobiol 2000.66:1572-1579)在大肠杆菌中成功表达蛋白质。获得0.14mg纯化蛋白/g细菌团粒的产率。通过SDS-PAGE以随后用考马斯亮蓝染色凝胶，以及通过聚组氨酸特异性抗体的Western印记确认纯化的H22(scFv)的身份(图3b)。另外，流式细胞术显示了H22(scFv)特异性结合CD64+靶细胞(图3b)，对CD64-L540cy细胞无结合(数据未显示)。
实施例4
减少的抗TNF-α单抗俘获与通过H22(scFv)的CD64特异性阻断定量相关。
在添加抗TNF-α抗体前，使用重组H22(scFv)特异性阻断HL-60细胞表面上的CD64。流式细胞术显示了H22(scFv)能够阻断CD64(图4a)，因此降低抗TNF-α单抗的俘获，并且该效果与全长抗CD64抗体的效果相当(图4b)。
通过测量使细胞表面上的所有CD64分子饱和所需要的抗CD64单抗的浓度，对CD64阻断进行量化，揭示了>50nM的最小饱和浓度(图5a)。由于H22(scFv)是单价的，而全长抗CD64单抗是二价的，100nM H22(scFv)在理论上必须足以阻断所有CD64分子。这通过针对培养的HL-60细胞直接滴定H22(scFv)确认(图5b)，并且发现了用H22(scFv)阻断CD64与降低的抗TNF-α单抗的俘获定量相关(图5c)。
实施例5
H22(scFv)结合不诱导促炎下游信号传导。
抗TNF-α单抗的Fcγ部分在它结合CD64时可以诱导促炎基因的表达，包括那些编码TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和GM-CSF的基因(Wojtal,K.A.et al.Fc gamma receptorCD64modulates the inhibitory activity of infliximab.PLoS One2012.7:e43361)。为了测试H22(scFv)是否也诱导下游细胞因子产生，将未刺激的和经IFN-γ刺激的HL-60细胞与100nM H22(scFv)或抗TNF-α单抗温育，或者与H22(scFv)预温育，然后补充抗TNF-α单抗。使用没有额外试剂的经IFN-γ刺激的HL-60细胞作为对照。通过使用基因特异性引物的实时PCR，测量细胞因子基因表达的诱导。虽然当将细胞仅与抗TNF-α单抗温育时细胞因子基因被诱导，但在仅存在H22(scFv)的情况下没有诱导，并且通过与H22(scFv)的预温育会强烈减弱抗TNF-α单抗诱导促炎细胞因子的能力(图6)。一些患者对抗TNF-α疗法的不良响应与CD64的过表达有关，所述CD64的过表达会导致抗TNF-α单抗的俘获和促炎应答的诱导(Wojtal,K.A.et al.Fc gamma receptor CD64 modulates the inhibitory activity ofinfliximab.PLoS One 2012.7:e43361)。用H22(scFv)阻断CD64，降低抗TNF-α单抗的俘获，因此也限制下游促炎效应。
实施例6
mTNF-α的表达在经IFN-γ刺激的HL-60细胞中上调。
TNF-α以可溶性细胞因子和跨膜蛋白两者存在，后者缺乏其可溶性对应物的系统性炎性效应。由于炎性CD64高单核细胞/巨噬细胞可能表达高水平的mTNF-α，抗TNF-α单抗的俘获将经由其抗原结合Fab域而增加。使用选择性识别跨膜形式的单抗，对经IFN-γ刺激的(促炎)和未刺激的HL-60细胞测试mTNF-α的表达(Gerspach,J.et al.,M.,Detection ofmembrane-bound tumor necrosis factor(TNF):an analysis of TNF-specificreagents.Microsc Res Tech 2000.50:243-250)。发现了仅经刺激的HL-60细胞表达mTNF-α(图7)，指示俘获抗TNF-α单抗的另外的机制的存在。
实施例7
抗TNF-α单抗的俘获通过CD64和mTNF-α介导。
为了确定mTNF-α是否参与抗TNF-α单抗的俘获，使用上文描述的mTNF-α特异性抗体，在经刺激的HL-60细胞的表面上预先阻断mTNF-α，之后测量细胞俘获抗TNF-α单抗的能力。如预期，阻断mTNF-α降低细胞俘获抗TNF-α单抗的能力(图8a-c)，并且发现通过H22(scFv)和抗mTNF-α的阻断的叠加效应与经刺激的HL-60细胞俘获抗TNF-α单抗的总能力相匹配(图8d)。此结果确认了抗TNF-α单抗的俘获依赖于CD64和mTNF-α两者的表达。

Claims (14)

1.一种具有至少10-9M的对CD64的结合亲和力的多肽，所述多肽与抗TNF-α抗体联合用于治疗与炎症有关的疾病。
2.用于权利要求1所述的用途的权利要求1所述的多肽，其中所述与炎症有关的疾病选自：炎性肠病，类风湿性关节炎，多发性硬化，狼疮，硬皮病；银屑病；胃肠疾病，例如移植物抗宿主病，克罗恩氏病，糖尿病，溃疡性结肠炎，急性和慢性移植排斥，结肠炎，肺泡炎，闭塞性细支气管炎，回肠炎，胰腺炎，肾小球肾炎，葡萄膜炎，关节炎，肝炎，皮炎，动脉粥样硬化，关节炎的所有形式，包括但不仅仅是类风湿性关节炎，多发性硬化，强直性脊柱炎，化脓性汗腺炎和特应性皮炎。
3.用于权利要求1所述的用途的权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽是抗体。
4.用于权利要求1所述的用途的权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽是抗体片段，特别是scFv抗体片段。
5.用于权利要求1所述的用途的权利要求4所述的多肽，其中H22(scFv)抗体片段由SEQID No.1的多核苷酸编码。
6.用于权利要求1所述的用途的权利要求4或5所述的多肽，其中H22(scFv)化合物是重组多肽。
7.用于权利要求1所述的用途的权利要求4至6中任一项所述的多肽，所述多肽包含SeqID No.2的氨基酸序列或者由Seq ID No.2的氨基酸序列组成。
8.在患者中用于权利要求1所述的用途的权利要求1至7所述的多肽，所述患者是对采用所述抗TNF-α抗体的疗法的非响应者。
9.一种混合物，所述混合物包含用于权利要求1所述的用途的权利要求1至8中任一项所述的多肽和跨膜TNF-α和/或可溶性TNF-α的阻断剂。
10.一种治疗与炎症有关的疾病的方法，所述方法通过对有此需要的患者施用与抗TNF-α抗体联合的权利要求1至8中任一项所述的多肽进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述患者是对采用抗TNF-α抗体的疗法中的炎症治疗的非响应者。
12.一种用于增强采用抗TNF-α抗体的疗法中的患者治疗的方法。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述患者是采用抗TNF-α抗体的疗法中的炎症治疗的非响应者。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中与跨膜TNF-α的阻断剂联合施用权利要求1至8中所述的多肽。
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