CN106456575A - 蜜蜂螨破坏性化合物及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本公开描述了影响蜜蜂螨(狄斯瓦螨)嗅觉响应的化合物及其使用方法。所述化合物不杀灭狄斯瓦螨且由此与杀螨剂相比不可能产生狄斯瓦螨抗性。这些化合物能够与其它螨控制方法联合起作用，例如底板隔绝器和粘性板控制器并且可以增强其它形式的螨控制方法的性能，同时减少与之相关的缺陷。

Description

蜜蜂螨破坏性化合物及其应用方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2014年03月24日提交的美国专利申请No.61/969,742的权益，将该文献的公开内容完整地引入本文参考。

背景

狄斯瓦螨(Varroa destructor)(“瓦螨属(Varroa)”)是导致广泛群体损耗的蜜蜂(西方蜜蜂(Apis mellifera))外寄生虫。瓦螨属因两个主要原因破坏蜂群：螨以蜜蜂血淋巴为食，由此使其虚弱；且它们传染病原体，例如以色列急性麻痹病病毒(IAPV)和致残性翼瓣病毒，它们可以导致摧毁性蜜蜂疾病。这些螨不易于检测到且它们可以导致表面健康和多产性的蜂群在几周内瓦解。

瓦螨属目前被视为对世界范围内的养蜂业最显著的威胁之一。例如，在加拿大，在1989年在新不伦瑞克首次检测到瓦螨属。在2013年，在加拿大的所有省份中都存在这种螨和报道的对由于抗击它们的处理产生抗性的螨。在以色列，瓦螨属在1984年被首次检测到。实际上，由于瓦螨属将宿主从亚洲的蜜蜂(东方蜜蜂(Apis cerana))迁移到欧洲的蜜蜂(西方蜜蜂)，所以这些螨几乎扩散到全世界。同样在2010年中，仅几个岛屿或分离的区域例如澳大利亚、新西兰南部、纽芬兰和马达加斯加不存在所述螨。此外，由于当地的温热气候条件，所以瓦螨属繁殖年复一年持续，使得在没有有效瓦螨属控制的情况下不能使蜜蜂生长。

几种不同的合成杀螨剂已经应用于抗瓦螨属螨。然而，在数年内，瓦螨属对拟除虫菊酯发生抗性且近期对库马磷(CheckMite+)发生抗性，使得这些杀螨剂无效且由此给当地的养蜂业遗留了一个实际问题。

目前可利用的化学控制方法存在一些缺陷。例如，阿米曲士(一种杀螨剂)导致抗性瓦螨属和蜜蜂污染问题；氟胺氰菊酯(例如条)、拟除虫菊酯导致抗性瓦螨属问题；库马磷(例如CheckMite+^TM条，一种有机磷酸盐)导致抗性瓦螨属问题并且其与氟胺氰菊酯的相互作用导致蜜蜂死亡；天然啤酒花提取物(例如)导致潜在的瓦螨属抗性；百里香精油也导致潜在的瓦螨属抗性；且甲酸和草酸可以导致蜜蜂死亡并且在控制低侵袭水平方面具有可变的成功，但在严重侵袭情况下无效，且对于具有热气候的地区中的应用而言存在问题。

目前可利用的物理控制方法也存在缺陷。例如，精糖粉可以用于清除瓦螨属角质层，然而，它在从无控制到适度减少瓦螨属的控制瓦螨属方面具有高度可变的有效性。在另一个实例中，巢框加热器可以用于利用瓦螨属和蜂子的差别热敏感性(瓦螨属对热比蜂子更敏感)，然而，其应用劳动强度极大且对蜂群具有破坏性。雄蜂子巢框可能被主动除去和被毁坏，特别是归因于瓦螨属在雄蜂子上更普遍存在。然而，雄蜂子巢框除去和毁坏仅对少量螨控制有效、劳动强度极大且无法完全除去螨。作为另一个实例，底板隔绝器和粘性板降低了从蜜蜂中掉落的瓦螨属可能再进入蜂房的可能性。然而，底板隔绝器和粘性板仅除去一些螨。

如上所述，可利用的破坏性化合物和方法通常无法提供对瓦螨属的高效率控制。然而，认为化学线索可能在调节宿主-寄生虫相互作用方面起重要作用。例如，寄生虫经常偷听其宿主的化学信号并且依赖于这些信号对宿主进行检测和选择。群居昆虫的寄生现象是特别复杂的情况，因为大量称作信息化学物质的化学信号对于群居功能而言是重要的，包括其保护寄居动物。尽管信息化学物质是在群体附着和集群环境中害虫处置的至始至终的工具，但是宿主与寄生虫之间的亲近性对在不损害宿主(例如西方蜜蜂)情况下的寄生虫(例如瓦螨属)控制而言呈现了一种阻碍。

瓦螨属生命周期通常可以被分成两个主要期：寄生(phoretic)期，其中瓦螨属寄生在成熟蜜蜂上；和繁殖期，其中瓦螨属在密封的蜂子室(brood cell)中繁殖。这些阶段之间瓦螨属在巢脾(comb)表面上自由地运动。受精的瓦螨属雌虫进入蜂子室与蜜蜂幼虫发育阶段同步并且恰好在蜂子室被封盖前出现。认为信息化学物质在瓦螨属发现宿主及其偏好中起主要作用。例如，在实验室的生物测定中，已经证实瓦螨属可以在来自不同任务组的蜜蜂之间区分并且对保育蜂的偏好超过采集蜂。宿主偏好显然基于具有低挥发性的化合物，例如角质层烃类和由蜜蜂及其环境发射出的挥发性化合物(例如幼虫食物和蜂子信息素)。尽管在引导瓦螨属的宿主嗅觉线索鉴定中取得了重大进展，但是迄今为止既未找到有效的引诱剂，也未发现驱除剂。鉴于在利用蜂房信息化学物质在瓦螨属控制方面的成功有限，所以合成的破坏性化合物的应用可能是对抗螨的另一种方法。

此外，瓦螨属的嗅觉器官位于其前腿的远端部分上，类似于在蜱中发现的感觉窝(哈氏器)。尽管在螨的感觉窝中的化学传感器显然类似于在昆虫中所述的那些，但是远不了解通常螨且特别是瓦螨属中的气味检测背后的机制。在文献中仅举出了几种来自瓦螨属前腿的电生理学记录的尝试。

因此，对于通过靶向瓦螨属的嗅觉系统破坏瓦螨属-蜜蜂相互作用的化合物和评价瓦螨属对所述化合物的敏感性的方法存在需求。这类化合物应当干扰瓦螨属，同时将蜂群中的蜜蜂沟通的破坏减少到最低限度。本公开寻求满足这些需求并且提供另外相关的优点。

概述

提供本概述是为了以简便形式引入在下文详细描述中进一步描述的理念的选择。并不预期本概述用于鉴定要求保护的主题的关键特征，也不预期它用作有助于确定要求保护的主题的范围。

在一个方面，本公开的特征在于处理蜂群中狄斯瓦螨感染的方法，所述方法包括：(A)提供式(I)的化合物：

其中OR²是在OR¹的邻位、间位或对位的取代基，R¹选自C_1-6烷基和C_2-6烯基，且R²选自C_1-6烷基和C_2-6烯基；和(B)将式(I)的化合物放入蜂群外壳(enclosure)中。

在另一个方面，本公开的特征在于处理蜂群中狄斯瓦螨感染的方法，所述方法包括：(A)提供式(Ic)的化合物：

其中R¹选自C_1-6烷基和C_2-6烯基，且R²选自C_1-6烷基和C_2-6烯基；和(B)将式(Ic)的化合物放入蜂群外壳中。

在另一个方面，本公开的特征在于处理蜂群的狄斯瓦螨感染的方法，所述方法包括：(A)提供式(II)的化合物：

其中R³选自C_1-6烷基和C_2-6烯基，且R⁴选自C_1-6烷基和C_2-6烯基；和(B)将式(II)的化合物放入蜂群外壳中。

实施方案可以包括如下特征的一个或多个。

所述方法还可以包括将杀螨剂放入蜂群外壳；将有机酸放入蜂群外壳；在将式(I)的化合物、式(Ic)的化合物或式(II)的化合物放入蜂群外壳后从蜂群外壳中取出雄蜂子脾(brood comb)；在将式(I)的化合物、式(Ic)的化合物或式(II)的化合物放入蜂群外壳后热处理雄蜂俘获巢脾(trapping comb)；在将式(I)的化合物、式(Ic)的化合物或式(II)的化合物放入蜂群外壳后取出和热处理工蜂；在将式(I)的化合物、式(Ic)的化合物或式(II)的化合物放入蜂群外壳之前、过程中或之后限制蜂王；将粘性俘获螨的底板放入蜂群外壳；将狄斯瓦螨基因沉默dsRNA从蜂群传递至狄斯瓦螨；将信息化学物质例如狄斯瓦螨性信息素、DEET、橙花酸(nerolic acid)或其任意组合放入蜂群外壳；和/或选择蜂群，例如卫生蜂群和/或狄斯瓦螨-耐受性蜂群。

在一些实施方案中，将本公开的化合物放入蜂群外壳可以在1周或更长的期限内抑制狄斯瓦螨对保育蜂顶空气味的电生理学响应和/或阻止狄斯瓦螨接近蜂群中的保育蜂群体。

附图描述

当结合附图时，本发明的上述方面和许多附带优点更易于被视为同样参照下文详细描述得到更好地理解，其中：

图1A-1C显示本公开的化合物实施方案的结构。图1A显示二烷氧基苯类的结构。图1B显示5(2'-甲氧基乙基)环戊-2-烯-1-烷氧基二醚类(cy{R³,1}化合物)的结构。且图1C显示cy{R³,1}化合物的合成。缩写：rt＝室温；TBDMSCl＝叔丁基二甲基甲硅烷基氯；THF＝四氢呋喃。

图2A是用在缸瓶中新近捕捉的蜜蜂的顶空挥发性物质刺激的分离的瓦螨属前腿的电生理学方案的实例的图解描述。

图2B是显示瓦螨属前腿对空气(左侧)和蜜蜂挥发性物质(右侧)的响应的典型痕迹的实例的示意图。

图2C是显示瓦螨属前腿电生理学响应振幅的棒形图。从左至右，棒形图表示瓦螨属对不同数量蜜蜂顶空的响应：无蜜蜂(排空的缸瓶)、1只蜜蜂、5只蜜蜂和10只蜜蜂。ANOVA(变异性分析)重复测量值：由不同字母标记的棒形图具有显著性差异，p<0.05，n＝6。

图3A是显示用于评价瓦螨属前腿刺激的化学品次序和用于相应响应的术语的示意图。每次化学品刺激之间的时间间隔为30s，另有描述的除外。化学刺激物为：空气、5只保育蜂的顶空(蜜蜂刺激物)、蜜蜂刺激物与测试化合物(蜜蜂刺激物+化合物)或己烷对照(蜜蜂刺激物+己烷)。刺激物下的斜体字是结果中呈现的数值名称。

图3B是显示瓦螨属前腿对不同刺激物的电生理学响应的初步筛选的棒形图，均以10μg载入刺激物柱图(校准值与对空气的响应％，平均值+SE)。对于蜜蜂刺激物，使用来自5只保育蜂的顶空。不同字母标记的棒形图是具有显著性差异的ANOVA重复测量值，p<0.05，n＝10。

图3C是来自共混物HCO-2169(cy{1,1}、cy{2,1}、cy{3,1}、cy{4,1}和cy{5,1})的实例在10μg剂量下的各个成分的评价结果的棒形图(n＝10)。

图3D是显示来自二乙氧基苯的3种异构体在10μg剂量下的结果的棒形图(n＝6)。

图4A-4C是长期抑制性化合物cy{4,1}、3b{2,2}和cy{2,2}的实例的剂量响应、特别是瓦螨属前腿对用不同量的各化合物和来自5只保育蜂的顶空刺激的响应的棒形图(校准值与对空气的响应％，平均值+SE)。用不同字母标记的每个剂量内的棒形图是具有显著性差异的ANOVA重复测量值，p<0.05，n＝7。

图5A-5B是显示活性化合物实施方案的长期抑制作用的详细评价结果的棒形图。图5A显示0.1μg cy{4,1}(左侧)或3b{2,2}(右侧)与和不与同时来自5只保育蜂的顶空挥发性物质的刺激物对瓦螨属前腿的电生理学响应的作用。数据是校准值(％，平均值+SE)：用不同字母标记的棒形图是具有显著性差异的ANOVA重复测量值，p<0.05，p<0.05，n＝6。图5B显示0.1μg实施例化合物cy{4,1}(左侧)或0.1μg(右侧)实施例化合物3b{2,2}对瓦螨属前腿的电生理学响应的抑制作用的寿命。混合刺激物(蜜蜂+化合物)与纯蜜蜂刺激物之间的时间间隔可变。数值对空气响应(％，平均值+SE)校准：用不同字母标记的棒形图是具有显著性差异的ANOVA重复测量值，p<0.05；n＝6。

图6A-6D是显示本公开化合物实施方案对保育蜂与采集蜂之间的瓦螨属宿主选择的作用的图解表示和棒形图。图6A是用于研究选择的化合物对保育蜂与采集蜂之间的瓦螨属宿主选择的作用的实验方案的图解描述。图6B是cy{4,1}对瓦螨属宿主选择的作用的棒形图：数据是在己烷(对照)或不同剂量(0.01μg、0.1μg、10μg)的破坏性化合物cy{4,1}的存在下选择特定宿主的瓦螨属的百分比。棒形图内的数字表示选择各宿主的瓦螨属的数量。图6C是显示3b{2,2}对瓦螨属宿主选择的作用的棒形图。图6D是3c{2,2}对瓦螨属宿主选择的作用的棒形图。

图7是显示瓦螨属前腿电生理学响应振幅、特别是对5只蜜蜂顶空的3次依次刺激响应之间的比较的棒形图。ANOVA重复测量，然后是Tukey-Kramer因果检验。用不同字母标记的棒形图具有显著性差异，F(2,12)＝0.0407，p＝0.96(n＝7)。

图8A是显示本公开化合物(cy{2,2})实施方案对保育蜂与采集蜂之间的瓦螨属宿主选择的作用的棒形图。测试不同剂量下的化合物(0.01μg、0.1μg、10μg)(OR＝54，(95％CI15.3-231.9)：数据是在己烷(对照)或破坏性化合物的存在下从本实验开始180min的选择特定宿主的瓦螨属的百分比。棒形图内的数字显示选择各宿主的瓦螨属数量。

图8B-8C是分别显示长期抑制性化合物3a{2,2}、3c{2,2}和3c{1,1}的实施例的剂量响应的棒形图。显示瓦螨属前腿对使用不同用量的各化合物和来自5只保育蜂的顶空刺激的响应(对空气响应％校准的数值，平均值+SE)。ANOVA重复测量，然后是Tukey-Kramer因果检验。用不同字母标记的棒形图具有显著性差异，p<0.05，(n＝6)。

图9显示本公开化合物实施方案对选择生物测定中从本实验开始180min螨到达任意宿主的百分比的作用。数值是在己烷(对照)或3种测试剂量(0.01μg、0.1μg、10μg)的破坏性化合物各自的存在下活螨的百分比。卡方检验，ns。

详细描述

本公开提供影响瓦螨属嗅觉响应的化合物及其使用方法。所述化合物不杀灭瓦螨属且由此与杀螨剂相比不可能产生瓦螨属抗性。这些化合物与其它螨控制方法联合起作用，例如底板隔绝器和粘性板控制器并且可以增强其它形式的螨控制方法的性能，同时减少与之相关的缺陷。此外，本公开的化合物可以可再现地合成，且批量与批量之间几乎没有变异性。因此，这些化合物的可用性不依赖于农作物，例如啤酒花或百里香，并且不受天然产物提取方法影响。

化合物

本公开特别地提供了式(I)的化合物：

其中：

OR²是苯基上在OR¹的邻位、间位或对位的取代基；

R¹选自C_1-6烷基和C_2-6烯基，且

R²选自C_1-6烷基和C_2-6烯基。

在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ia)

其中：

R¹选自C_1-6烷基和C_2-6烯基，且

R²选自C_1-6烷基和C_2-6烯基。

在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ib)

其中：

R¹选自C_1-6烷基和C_2-6烯基，且

R²选自C_1-6烷基和C_2-6烯基。

在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(Ic)

其中：

R¹选自C_1-6烷基和C_2-6烯基，且

R²选自C_1-6烷基和C_2-6烯基。

在一些实施方案中，R¹选自C_1-3烷基和C_2-3烯基。

在一些实施方案中，R¹是C_1-6烷基。

在一些实施方案中，R¹是C_1-4烷基。

在一些实施方案中，R¹是C_1-3烷基。

在一些实施方案中，R¹是C_1-2烷基。

在一些实施方案中，R¹是丙基。

在一些实施方案中，R¹是甲基。

在一些实施方案中，R¹是乙基。

在一些实施方案中，R¹是C_2-4烯基。

在一些实施方案中，R¹是C_2-3烯基。

在一些实施方案中，R²选自C_1-3烷基和C_2-3烯基。

在一些实施方案中，R²是C_1-6烷基。

在一些实施方案中，R²是C_1-4烷基。

在一些实施方案中，R²是C_1-3烷基。

在一些实施方案中，R²是C_1-2烷基。

在一些实施方案中，R²是甲基。

在一些实施方案中，R²是乙基。

在一些实施方案中，R²是丙基(例如正丙基)。

在一些实施方案中，R¹是C_2-4烯基。

在一些实施方案中，R²是C_2-3烯基。

在一些实施方案中，R¹选自C_1-3烷基和C_2-4烯基，且R²选自C_1-3烷基和C_2-4烯基。

在一些实施方案中，R¹选自C_1-3烷基和C_2-3烯基，且R²选自C_1-3烷基和C_2-3烯基。

在一些实施方案中，R¹是C_1-3烷基，且R²是C_1-3烷基。

在一些实施方案中，R¹是C_1-3烷基，且R²是C_1-2烷基。

在一些实施方案中，R¹是C_1-2烷基，且R²是C_1-3烷基。

在一些实施方案中，R¹是C_1-2烷基，且R²是C_1-2烷基。

本公开还特别地提供式(II)的化合物：

其中：

R³选自C_1-6烷基和C_2-6烯基，且

R⁴选自C_1-6烷基和C_2-6烯基。

在一些实施方案中，R³是C_1-6烷基。

在一些实施方案中，R³是C_1-5烷基。

在一些实施方案中，R³是C_1-4烷基。

在一些实施方案中，R³是C_1-3烷基。

在一些实施方案中，R³是甲基。

在一些实施方案中，R³是乙基。

在一些实施方案中，R³是丙基(例如正丙基)。

在一些实施方案中，R³是丁基(例如正丁基)。

在一些实施方案中，R³是戊基(例如正戊基)。

在一些实施方案中，R³是C_2-4烯基。

在一些实施方案中，R³是C_2-3烯基。

在一些实施方案中，R⁴是C_1-6烷基。

在一些实施方案中，R⁴是C_1-4烷基。

在一些实施方案中，R⁴是C_1-3烷基。

在一些实施方案中，R⁴是C_1-2烷基。

在一些实施方案中，R⁴是甲基。

在一些实施方案中，R⁴是乙基。

在一些实施方案中，R⁴是C_2-4烯基。

在一些实施方案中，R⁴是C_2-3烯基。

在一些实施方案中，R³是C_1-5烷基和C_2-4烯基，且R⁴选自C_1-3烷基和C_2-4烯基。

在一些实施方案中，R³是C_1-5烷基和C_2-3烯基，且R⁴选自C_1-3烷基和C_2-3烯基。

在一些实施方案中，R³是C_1-5烷基，且R⁴是C_1-3烷基。

在一些实施方案中，R³是C_1-5烷基，且R⁴是C_1-2烷基。

在一些实施方案中，R³是C_1-3烷基，且R⁴是C_1-3烷基。

在一些实施方案中，R³是C_1-3烷基，且R⁴是C_1-2烷基。

在一些实施方案中，式(II)的化合物在环戊烯环上具有顺式-取代基并且是外消旋的。例如，式(II)的化合物可以具有式(IIa)或(IIb)：

其中R³和R⁴如上述所定义。

在一些实施方案中，式(I)的化合物选自

在一些实施方案中，式(II)的化合物选自

环戊烯环上的烷氧基取代基彼此可以是顺式的。

在一些实施方案中，本发明的化合物富含对映异构体，即给出的式(IIa)和(IIb)的化合物的混合物是具有对映异构体过量的式(IIa)的化合物或式(IIb)的化合物，其中R³和R⁴如上述所定义。对映异构体过量可以在例如0％(即外消旋)-99％(例如0％-80％、0％-60％、0％-40％、0％-20％、0％-10％)的范围。

在一些实施方案中，本公开的化合物有效地破坏瓦螨属对蜜蜂顶空的嗅觉响应。可以通过测定瓦螨属对保育蜂气味的电生理学响应来监测瓦螨属的嗅觉响应，包括敏感性，正如图2A中所示例的和在下文实施例1中进一步所述的。在一些实施方案中，瓦螨属对保育蜂和对蜂子室的偏好可以在本公开化合物的存在下被阻止。因此，本公开的化合物可以阻止瓦螨属接触保育蜂群体和蜂子室。可以使用如图6A中所示例和在下文实施例1中进一步描述的实验性生物测定方案评价瓦螨属在本公开化合物的存在下对保育蜂或采集蜂的偏好。

定义

在本说明书的不同位置上，以组或范围的方式公开了本公开化合物的取代基。特别预期，本公开包括这类组和范围成员的每种和每一单个的亚组合。例如，术语“C_l-6烷基”特别地预期各自公开了甲基、乙基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基和C₆烷基。

进一步预期，本公开的化合物是稳定的。本文所用的“稳定的”是指足以稳定地存在以便从反应混合物中分离至有用的纯度的化合物。

进一步可以理解地，为清楚起见，单独实施方案背景下所述的本公开的一些特征也可以与单一实施方案组合提供。相反，为简便起见，单一实施方案背景下所述的不同特征也可以单独地或以任意适当亚组合的方式提供。

“任选取代的”基团可以指，例如可以被另外的官能团取代或未取代的官能团。例如，当基团未被取代时，它可以称作该基团名称，例如烷基或芳基。当基团被另外的官能团取代时，它可以更进一步地称作取代的烷基或取代的芳基。

本文所用的术语“烷基”是指为直链(例如线性)或支链的饱和烃基。实例烷基基团包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如正丙基和异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、叔丁基)、戊基(例如正戊基、异戊基、新戊基)等。例如，烷基基团可以包含1-约10、1-约8、1-约6、1-约4或1-约3个碳原子。

本文所用的术语“亚烷基”是指连接的烷基基团。

本文所用“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的烷基基团。烯基基团可以是直链的或支链的。实例烯基基团包括乙烯基、丙烯基等。例如，烯基基团可以包含2-约10、2-约8、2-约6或2-约4个碳原子。

本文所用“亚烯基”是指连接的烯基基团。

本文所用“烷氧基”是指-O-烷基基团。实例烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如正丙氧基和异丙氧基)、叔丁氧基等。

本文所用“对映异构体过量”是指样品包含含量大于另一个的一个对映异构体的程度。例如，外消旋混合物具有5％的对映异构体过量。纯对映异构体具有100％的对映异构体过量。具有80％的一种对映异构体和20％的另一种对映异构体的样品具有60％的对映异构体过量。

包含不对称取代的碳原子的本公开的化合物可以被分离成旋光或外消旋形式。有关如何从旋光原料制备旋光形式的方法是本领域公知的，例如通过拆分外消旋混合物或通过立体选择性合成。烯烃类等的许多几何异构体也可能存在于本文所述的化合物中并且全部这类稳定的异构体均是本公开所关注的。

本公开的化合物还可以包括出现在中间体或最终化合物上的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子数、但不同原子量的那些原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。

在一些实施方案中，本公开的化合物及其盐是基本上分离的。所谓“基本上分离的”是指该化合物至少部分或基本上从形成它或检测它的环境中分离。部分分离可以包括，例如，富含本公开化合物的组合物。基本上分离可以包括包含至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％重量的本化合物或其盐的组合物。用于分离化合物及其盐的方法是本领域常规的。

除非另有定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有本领域技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可以用于实施或测试本公开，但是下面描述的是适合的方法和材料。将部位举出的全部出版物、专利申请、专利和其它参考文献完整地引入参考。在有争议的情况中，本说明书、包括定义加以控制。此外，所述材料、方法和实例仅为示例性的且不预期起限定作用。

合成

可以通过有机合成领域普通技术人员所公知的各种方式制备本公开的化合物。可以使用如下所述和实施例1中所述的方法与作为本领域技术人员可以理解的合成有机化学领域公知的合成方法或其变化形式合成本公开的化合物。

例如，可以如Paduraru等人，J.Comb.Chem 10：123-134所述合成本公开的化合物，例如取代的烷氧基苯类。例如，可以如Chen等人，(2010)Bioorg Med Chem 18：2920-2929和Chen H.，Plettner E.，(2012)Tetrahedron Letters 53：2059-2062所述合成取代的环戊烯类。

图1C提供了用于制备式(II)的化合物实施方案的通用合成方案。参照图1C，可以通过与叔丁基二甲基甲硅烷基氯(TBDMSCl)和咪唑在二氯甲烷中反应单独地保护二醇1。可以使被单保护的二醇2与金属钾在四氢呋喃(THF)中反应，然后添加适合的烷基溴或烷基碘(R₃Br或R₃I)，得到化合物3。使用氟化四丁基铵(TBAF)在THF中使该中间体脱保护，得到化合物4。使这种化合物与钾在THF中反应，然后与碘甲烷反应，得到终产物。

可以由易于得到的原料制备本公开的化合物。应当理解，如果给出典型或优选工艺条件(即反应温度、时间、反应剂的摩尔比、溶剂、压力等)；则还可以使用另外的工艺条件，另有描述的除外。最佳反应条件可以根据所用具体反应剂或溶剂的不同而改变，但这类条件可以由本领域技术人员通过常规的优化方法确定。

可以根据本领域公知的任意适合的方法监测本文所述的方法。例如，可以通过分光镜方法，例如核磁共振波谱法(例如¹H或¹³C)、红外光谱法、分光光度法(例如UV-可见)或质谱法或通过色谱法、例如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法监测产物形成。

化合物的制备可以包括各种化学基团的保护和脱保护。保护和脱保护和适合的保护基的选择易于由本领域技术人员确定。例如，保护基化学可以在Greene等人，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第4版，Wiley&Sons，2006中找到。

可以在易于由有机合成领域普通技术人员选择的适合的溶剂中进行本文所述方法的反应。适合的溶剂可以是在进行该反应的温度下基本上不与原料(反应剂)、中间体或产物反应，即可以在溶剂冻结温度至溶剂的沸腾温度范围内的温度。指定反应可以在一种溶剂或一种以上溶剂的混合物中进行。根据具体反应步骤的不同，可以选择用于特定反应的适合的溶剂。

可以通过本领域公知的大量方法的任意一种对化合物的外消旋混合物进行拆分。实例方法包括使用为旋光的成盐有机酸的“手性拆分酸”的分解重结晶。用于分级重结晶方法的适合的试剂是，例如旋光酸，例如酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸的D和L形式；或各种旋光樟脑磺酸。还可以通过用旋光拆分试剂(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)填充的柱洗脱进行外消旋混合物拆分。适合的洗脱溶剂组合物可以由本领域技术人员确定。作为另一个实例，酯酶反应可以用于前体化合物(例如二醇，例如图1C中的化合物)，例如，正如在Chen，H.等人，Tetrahedron Asymmetry，2009，20，449-456中所述的。

制剂

在一些实施方案中，本公开的一种或多种化合物可以与一种或多种载体、抗氧化剂和/或防腐剂合并，得到制剂。该制剂可以是液体、糊状物、固体或凝胶形式。在一些实施方案中，该制剂是控释制剂，使得所述化合物在一定时间期限内释放(即被挥发)。示例性的载体包括油；聚合物(例如聚乙二醇、聚甲基丙烯酸酯类、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚烯烃类(例如聚丙烯)、硅酮类、基于乳酸和乙醇酸的聚合物及其共聚物)；微囊(例如二氧化硅微囊)；镜片；凝胶；陶瓷制品；和蜡。

与本公开的一种或多种化合物一起使用的示例性油包括、但不限于来源于植的油，例如植物油和胡桃油；或非植物衍生的油，例如矿物油。所述油包括饱和、单不饱和多不饱和脂肪酸，其可溶于许多组合物，尤其是极性较低或非极性组合物。

示例性的防腐剂包括，例如山梨酸及其盐、苯甲酸及其盐、丙酸钙、亚硝酸钠、亚硫酸盐(二氧化硫、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等)和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。其它示例性的防腐剂包括乙醇和甲基氯异噻唑啉酮、盐、糖、醋、醇、硅藻土和蓖麻油、柠檬酸和抗坏血酸、维生素C和维生素E。

示例性的抗氧化剂包括、但不限于生育酚类(例如I-生育酚、γ-生育酚等)、抗坏血酸以及合成抗氧化剂，例如丙基没食子酸丙酯、叔丁基氢醌、丁羟甲苯(BHT)、丁羟茴醚(BHA)、酚醇类、类黄酮物质、儿茶酚、其相关分子和花青苷类及其糖苷类。所述抗氧化剂可以溶于大部分组合物且可以有效地与调配系统中的氧反应，且由此提供减少制剂氧化、分解和聚合的方式。在一些实施方案中，所述氧化剂也可以是防腐剂。

尽管上文已经列出了有代表性的载体、防腐剂和抗氧化剂，但是应当理解，还可以属于上文未具体列出的另外的载体、防腐剂和抗氧化剂。

在一些实施方案中，所述制剂是控释制剂，使得其中包含的本公开的一种或多种化合物可以在延长的时间期限内(例如1-4周、1-3周或1-2周；约1周、约2周、约3周或约4周)缓慢地释放。所述制剂可以包含在可透过本公开的一种或多种化合物的调配器中(例如袋、多孔管或开放性容器)。在一些实施方案中，所述调配其由塑料、纸、蜡和/或木材构成。

使用方法

上述化合物和制剂在放入蜂群外壳内部时可以用于处理(即减轻或消除)蜂群中的瓦螨属感染。

蜂群外壳

所述蜂群外壳可以是任意种类的包封结构，在其中蜂群生活和使其幼虫生长。蜂群外壳的内部结构可以包括致密填充的一组由蜂蜡构成的六角形室(即蜜脾或巢脾)。所述室用于储存食物(例如蜂蜜和花粉)并且寄居蜂子(即卵、幼虫和蛹)。

在一些实施方案中，所述蜂群外壳可以是被蜂群占据的天然存在的结构，例如空心树。在一些实施方案中，所述蜂群可以是家养的并且生活在人造的蜂房中，其可以是在养蜂场中。作为实例，人造的蜂房可以包括如下部分：

(1)蜂房支架，在其上部安置蜂房构件。蜂房支架为蜜蜂提供装载板并且有助于防止底板腐朽和冷转移。

(2)具有蜜蜂进入蜂房的入口的底板。

(3)一个或多个蜂子箱(brood box)。所述一个或多个蜂子箱典型地是蜂房的下部箱且其中蜂王产卵。每个蜂子箱包括子脾，其为六角形室的蜂蜡结构，其中蜂王产卵(即蜂子室)。

(4)蜜蜂上部箱，其通常短于蜂子箱，但为最高的箱，其中蜂蜜被储存在蜜脾中。蜜脾是六角形室的蜂蜡结构，其中储存蜂蜜。

(5)巢框和巢础，其为带有具有蜜脾印记的具有蜡或塑料片的木制的或塑料的框架，其中蜜蜂构建蜡蜜脾。

(6)内部覆盖物，其提供与过热或过冷的外罩隔离并且可以用作喂养或其它目的的贮存架。

(7)外罩，其提供对于蜂房的天气防护。

瓦螨属处理

本公开的化合物和制剂可以单独使用或与一种或多种另外的瓦螨属控制方法联用，以便处理蜂群中的瓦螨属感染。

通常将所述化合物和制剂施用于蜂群外壳或蜂群外壳的特定部分。在一些实施方案中，将所述化合物和制剂施用于蜂子区域，例如一个或多个蜂子室或蜂子箱，以便提供对瓦螨属宿主被吸引至蜂子室的集中和局限性的阻止，并且破坏瓦螨属对蜂子箱中以更大数量存在的保育蜂的嗅觉响应。

所述化合物(或制剂)可以释放装置的形式被提供，其可以在一定时间期限内缓慢地释放所述化合物。释放装置的实例包括条状物(例如化合物浸渍的例如由纸或压膜纸制成的条状物)或易于安装、监测和替换的其它形式。在一些实施方案中，可以将所述化合物或制剂用蒸发器、作为喷雾剂由垫或作为喷洒剂在蜂群外壳内调配。在一些实施方案中，用垫在蜂群外壳内调配所述化合物或制剂。在一些实施方案中，将包含所述化合物(或制剂)的释放装置安装在子脾之间的空间内。在一些实施方案中，当释放装置是条状物时，将该条状物设计成与蜂群外壳中的巢框顶端配合。如果将该释放装置安装和/或围绕子脾区域和相邻区域上，则新出现的瓦螨属将暴露于该化合物。

本公开的化合物可以以至少300μg/子脾之间体积/月(例如至少400μg/子脾之间体积/月、至少500μg/子脾之间体积/月或至少600μg/子脾之间体积/月)的量释放。当释放入蜂群外壳或部分蜂群外壳(例如蜂子箱)时，本公开的化合物可以在1周或更长(例如2周或更长、3周或更长或4周或更长)期限内抑制瓦螨属对保育蜂顶空气味的电生理学响应(即嗅觉响应)。

在一些实施方案中，除本公开的化合物(或制剂)外，还可以使用一种或多种另外的瓦螨属感染控制方法。另外的瓦螨属感染控制方法的实例包括杀螨剂、有机酸、生物技术控制方法、蜜蜂繁殖、RNA干扰控制方法、瓦螨属寄生虫控制方法、瓦螨属采集蜂控制方法和信息化学物质控制方法，它们各自可以单独使用或以与本公开的化合物(或制剂)的任意组合使用。

本化合物(或制剂)与另外的感染控制方法的共同应用可以包括众多优点，例如：(1)改善与这些感染控制方法相关的各种缺陷；(2)使不同的瓦螨属感染控制方法以协同方式起作用，使得瓦螨属群体随应用两种或以上方法的减少高于单独使用每种方法时的累加减少；和(3)降低雄蜂、蜂王或工蜂甚至在瓦螨属被控制时也可能被杀死的可能性。使用本公开化合物(或制剂)的瓦螨属控制和一种或以上另外的感染控制方法的实例在下文中提供。

在一些实施方案中，本公开的化合物与杀螨剂同时应用于蜂群外壳中。不希望受到理论约束，认为尽管杀螨剂可以高效地用于减少瓦螨属群体，但是它们发生耐受性，可以导致蜜蜂死亡，可以导致蜜蜂中的亚致死效应，可以导致刺激蜂群和/或因杀螨剂污染蜂蜜而可能影响蜂蜜质量和味道。在一些情况中，瓦螨属控制水平可能是变化的。本公开的化合物可以缓解任何不可预测的毒性并且通过使得瓦螨属远离蜂子室增加杀螨剂对蜂子的有效性，使得它们被位于蜂群外壳中另外部位上的杀螨剂靶向。例如，可以将本公开的化合物放入蜂子箱并且阻止瓦螨属进入蜂子室，使得瓦螨属可以接触放置在高于蜂子箱最外面巢框至少10cm(例如至少20cm或至少30cm)或接近该巢框的杀螨剂。在一些实施方案中，将杀螨剂放置在高于蜂子箱最外面巢框至少一个巢框高度(例如约30cm)或接近该巢框(约10-15cm)处。本公开的化合物在作为整合的耐受性处置方案(“IRM”)的组成部分使用时，还可以降低耐受性发生的可能性，其中不同控制方法与杀螨剂结合用于随后的年度中。在一些实施方案中，杀螨剂可以作为整合的耐受性处置治疗计划的组成部分使用，只要瓦螨属(Varro)对杀螨剂的耐受性不完全。在一些实施方案中，本公开的化合物可以减少有效瓦螨属控制所需的杀螨剂的量，由此减少因存在杀螨剂导致的可能在蜂群中发生的刺激；和/或通过降低杀螨剂污染蜂蜜的可能性而增加从蜂群外壳中提取的蜂蜜的质量和味道。

在一些实施方案中，将杀螨剂置于距离蜂群外壳中的蜂子室至少10cm(例如至少20cm、至少30cm、至少40cm)处。杀螨剂的实例包括拟除虫菊酯、甲脒和有机磷酸盐。在一些实施方案中，杀螨剂是麝香草酚、桉树脑、樟脑、薄荷醇、水杨酸甲酯或其任意组合。在一些实施方案中，杀螨剂可以是植物提取物，例如精油。植物提取物的非限制性实例包括香茅油、香叶油、熏衣草油、丁香油、Eupatorium buniifolium叶提取物、蛇麻酮、啤酒花提取物、月桂叶提取物、1,8-桉叶油素、甘牛至提取物、薄荷油、印度楝树油、牛至油和冬青油。

作为一个实例，印度楝树油是杀螨剂，但是对蜂子和蜂王具有毒性。因此，它不能用于子脾。通过将本公开的化合物(例如来自释放装置)释放在蜂子室附近并且远离蜂子室施用印度楝树油，瓦螨属可以从远离子脾处移动至老龄蜜蜂居留和印度楝树油存在的边缘处。由此印度楝树油的副作用可以被缓解，同时利用其杀螨作用。

作为另一个实例，可以配制成片剂或凝胶的挥发性化合物麝香草酚是杀螨剂。然而，麝香草酚是对蜜蜂具有强烈刺激。通过将本公开的化合物放置在蜂子室处并且远离蜂子室施用麝香草酚，寄生期瓦螨属可以远离子脾。因此，麝香草酚对蜜蜂的副作用可以被缓解，同时可以保持麝香草酚的杀螨有益性。其它杀螨剂可以按照类似方式与本公开的化合物结合使用。

在一些实施方案中，本公开的化合物与有机酸同时应用于蜂群外壳中。不希望受到理论约束，认为尽管有机酸可以有效地通过熏蒸作用杀灭蜂房微生物群落，但是高浓度的有机酸可能对蜂群产生毒性。本公开的化合物可以缓解对蜂群的缺陷和/或通过引导瓦螨属远离位于蜂群外壳中另外部位上的蜂子室增强有机酸在瓦螨属控制中的有效性。在一些实施方案中，需要少量有机酸以便有效地在本公开的化合物的存在下进行瓦螨属控制。例如，可以将本公开的化合物放入蜂子室并且阻止瓦螨属接触蜂子箱内的蜂子室，使得瓦螨属可以接触置于蜂群外壳中的蜂子箱外部的有机酸。有机酸的实例包括甲酸、草酸、乳酸和抗坏血酸。

作为实例，挥发性化合物甲酸杀灭寄生的瓦螨属。然而，甲酸还导致蜜蜂死亡。通过将本公开的化合物释放在蜂子室附近并且在远离蜂子室处施用甲酸(例如浸渍甲酸的垫的形式)，可以使瓦螨属远离蜂子室并且到达年长蜜蜂居留和甲酸定位的周围。甲酸的副作用可能因由此被缓解，同时利用其杀灭寄生瓦螨属的能力。

作为另一个实例，草酸蒸汽(使用作为喷雾器的蒸发器从垫中或作为喷射器调配)可以杀灭寄生的瓦螨属。当与本公开的化合物一起使用时，所述化合物可以通过使瓦螨属从保育蜂(可以使螨到达它们再生的新蜂子室)到达采集蜂(使螨远离子脾)延长寄生周期。因此，与不使用本公开的化合物处理相比，在本公开的化合物的存在下，更大量的瓦螨属可以被杀灭。

在一些实施方案中，抗坏血酸可以喂养糖浆液中的蜜蜂时用于改善蜜蜂中的免疫应答。当与本公开的化合物联用时，蜂群的总体健康可以改善，因为瓦螨属被阻止接近蜂子室且蜜蜂获得了抵抗瓦螨属的更强免疫应答。

在一些实施方案中，本公开的化合物与生物技术控制方法同时使用。然而，生物技术控制方法不能有效地处理瓦螨属生命周期的某一期限并且可能破坏群落的生产密集性，且可能对蜂群(例如蜂子、蜂王、工蜂或雄峰)产生应激性。本公开的化合物可以通过使得瓦螨属远离蜂子室而到达蜂群外壳中的其它区域、通过延长瓦螨属寄生期而增强生物技术控制方法在瓦螨属控制中的有效性，并且因联合控制方法的有效性增加而可以导致对群落的破坏性和应激性较低。例如，本公开的化合物在接近工蜂蜂子室放置时，可以使得瓦螨属远离工蜂蜂子室，使得瓦螨属可以被定向于和集中于蜂群外壳的其它区域，由此可以实施生物技术方法。

生物技术方法的实例包括取出雄峰子脾，热处理雄峰俘获巢脾，热处理工蜂(从秋季无蜂子群落中取出的)，限制蜂王和在蜂群外壳中应用粘性底板。

作为一个实例，取出雄峰子脾可以用于除去许多再生的瓦螨属及其来自蜂群的卵。该方法通过将雄峰俘获巢脾插入蜂群外壳并且在雄峰蜂子被密封在室内部时(将俘获巢脾插入蜂群外壳后约20天)取出雄峰俘获巢脾而利用瓦螨属对雄峰室的偏好超过再生的工蜂室10-12倍。当取出雄峰巢脾有效地除去大量再生瓦螨属及其来自群落的卵时，并不能极为有效地处理寄生期瓦螨属，也不能找到工蜂室内再生的瓦螨属。通过对工蜂蜂子室同时应用本公开的化合物，可以使瓦螨属远离工蜂蜂子室并且可以使其集中于例如雄峰俘获巢脾，可以将其除去。因此，使用取出雄峰巢脾的瓦螨属控制通过使用本公开的化合物而可以被赋予更高的有效性。

在一些实施方案中，可以通过使用选择性地被包埋入雄峰俘获巢脾的脾加热器加热雄峰俘获巢脾，而不是取出雄峰俘获巢脾，可以杀灭雄峰俘获巢脾中的瓦螨属。

作为另一个实例，除使用本公开的化合物外，可以使蜂王暂时性地限制在瓦螨属俘获脾中。可将蜂王限制工蜂蜂子一代。当存在的工工蜂蜂子出现时，仅寄生期瓦螨属存在，可以使用靶向寄生期瓦螨属的方法(例如草酸)控制它们。本公开的化合物可以导致寄生期瓦螨属从存在的蜂子或俘获脾中出现，以便运动至采集蜂，使得任何寄生期瓦螨属控制方法可以集中于子脾边缘，由此增强寄生期瓦螨属控制方法的有效性。

作为另一个实例，瓦螨属控制方法可以包括使用本公开的化合物以阻止瓦螨属接近蜂子室并且使得瓦螨属定向于工蜂，然后可以将工蜂取出并且热处理以便杀灭其机体上的瓦螨属(瓦螨属在40-48℃温度下被杀灭，但蜜蜂可以在处理下存活)。本公开的化合物由此可以增强作为瓦螨属控制方法的工蜂热处理的有效性。

作为另一个实例，本公开的化合物在与俘获螨的粘性底板一起应用于蜂群外壳中时可以增强瓦螨属控制。可以将本公开的化合物放置在接近蜂子室处并且使得瓦螨属离开蜂子室。当瓦螨属通过蜂群外壳移动时，它们可以落在粘性底板上并且被其俘获。

在一些实施方案中，本公开的化合物与用于瓦螨属控制的蜜蜂繁殖方法同时使用。繁殖方法的实例包括应用卫生学蜜蜂品系和瓦螨属耐受性蜜蜂品系。本公开的化合物可以增强蜜蜂繁殖方法在减少瓦螨属群体中的有效性。例如，可以繁殖至更活跃地除去患病蜂子的卫生学蜜蜂品系可以与本公开的化合物结合使用，以便更好地控制瓦螨属群体。作为另一个实例，瓦螨属耐受性蜜蜂品系可以与本公开的化合物一起使用，以确保蜂群的长期健康。

在一些实施方案中，本公开的化合物与RNA干扰方法同时应用于瓦螨属控制。例如，可以用特异性双链RNA喂养蜜蜂，然后传递给瓦螨属，它具有衰减瓦螨属和减少瓦螨属群体的潜能。在一些实施方案中，可以给蜜蜂接种变形翼病毒特异性双链RNA，以强化蜜蜂抵抗以瓦螨属为媒介的翼病毒感染。可以给蜜蜂喂养以瓦螨属为靶的RNA，可以将该核酸传递给瓦螨属。在一些实施方案中，将RNA喂养器置于巢房边缘并且被采集蜂摄取。通过使用本公开的化合物，可以引导瓦螨属移动至采集蜂，由此确保更好地引导来自采集蜂的RNA至瓦螨属。

在一些实施方案中，本公开的化合物与不同于本化合物的信息化学物质结合使用。所述信息化学物质可以破坏交配行为、阻止繁殖、将瓦螨属对保育蜂宿主的偏好转移至采集蜂、从蜂子室中除去瓦螨属、排除瓦螨属、吸引瓦螨属和/或阻止瓦螨属寻找蜂子室。然而，所述信息化学物质可以导致对蜜蜂的意识模糊，只要它们也用于蜜蜂沟通。通过使用本公开的化合物，可以使用更少的另外的信息化学物质，由此导致对蜂群的破坏程度较低。

信息化学物质的实例包括瓦螨属性信息激素(例如油酸、棕榈酸和硬脂酸和少量其相应的乙酯类的共混物)、瓦螨属繁殖终止信号(例如脂肪酸甲酯类的共混物：棕榈酸甲酯、油酸甲酯、硬脂酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯)、DEET、橙花酸。在一些实施方案中，所述信息化学物质是利他素(kairomone)，它是由生物体发射的信息化学物质，其按照有益于接受它的另一种类的个体、但不益于发射者的方式介导种间相互作用。

作为一个实例，将繁殖的正确定时信号传导给瓦螨属的蜂子利他素已经用于诱导准备繁殖的雌性螨(即瓦螨属雌螨)跳过一个繁殖周期，甚至在与蜂蛹在一个室内时。因此，蜜蜂蜂子利他素与本公开的化合物的组合可以降低繁殖率，因为蜂王与蜜蜂再度出现，与它们是否已经繁殖无关。本公开的化合物由此可以与蜂子利他素一起起协同作用：利他素破坏瓦螨属定时产卵，而本公开的化合物对瓦螨属寄生阶段有效。

作为另一个实例，瓦螨属信息素可以与本公开的化合物结合使用。在没有瓦螨属信息素的存在下，雄性瓦螨属仅与幼小的新出现的雌性瓦螨属交配。添加瓦螨属信息素可以通过促进雄性瓦螨属无法成功地与瓦螨属雌螨或老龄雌螨交配破坏交配选择过程。本公开的化合物还可以引导瓦螨属远离蜂子室，由此进一步减少瓦螨属群体。

作为另一个实例，所述信息化学物质可以是滞留素，其为使瓦螨属中停止活动的信息化学物质。可以将该滞留素与杀螨剂一起调配在巢室边缘，同时可以使本公开的化合物释放在蜂子室附近。本公开的化合物可以与滞留素和杀螨剂一起起协同作用，通过阻止瓦螨属进入蜂子室并且引导瓦螨属定向于边缘处的采集蜂来进行，其中滞留素和杀螨剂可以终止和杀灭瓦螨属。

尽管本公开的化合物如上所述可以与上述一种另外的瓦螨属控制方法结合使用，例如杀螨剂、有机酸、生物技术方法、蜜蜂繁殖控制方法、RNA干扰、瓦螨属寄生虫、瓦螨属采集蜂或信息化学物质，但是应当理解，所述化合物可以与本文所述的两种或以上瓦螨属控制方法按照任意组合结合使用。

下面的实施例描述了瓦螨属-破坏性化合物和使用这些化合物的方法。在一些化合物的存在下，瓦螨属化学感觉器官对蜜蜂顶空挥发性物质的响应明显减少。这种效应是剂量依赖性的并且可以长久持续(>1min)。此外，破坏瓦螨属挥发性物质检测伴随瓦螨属的偏好从保育蜂逆转至采集蜂。长期抑制螨对测试化合物的电生理学响应是用于螨宿主偏好改变的良好预测者。

实施例

嗅觉器官的一般位置在螨和昆虫中是不同的。在蜜蜂中，如在所有昆虫中，触角是主要的嗅觉器官，而螨缺乏触角，且由此瓦螨属的嗅觉器官位于其前腿的远端部位上，类似于在蜱中发现的感觉窝(哈氏器)。尽管在螨感觉窝中的化学传感器显然类似于昆虫中所述的化学感受器，但是对有关通常在螨中且特别是在瓦螨属中气味检测后面的机制远不了解。在文献中仅举出了来自瓦螨属前腿的电生理学记录的少量尝试。此外，器官对蜜蜂挥发性物质的响应在先并未证实。在本实施例中，建立了瓦螨属前腿对宿主(蜜蜂)挥发性物质响应的测量。还评价了潜在的破坏性化合物(例如5(2'-羟乙基)环戊-2-烯-1-醇或二氢醌、间苯二酚或儿茶酚的醚类)对这种响应以及对瓦螨属区分两种宿主类型(保育蜂和采集蜂)的能力的作用。

实施两种方法以便评价潜在破坏性化合物的作用：(1)电生理学用于评价化合物对瓦螨属化学感觉器官对蜜蜂挥发性物质的敏感性的作用；和(2)还使用行为生物测定法检验了化合物改变瓦螨属对保育蜂超过采集蜂的偏好的能力。

生物材料

将蜂群(A.mellifera liguistica)维持在Bet Dagan，ARO the Volcani Center，Israel的实验养蜂场。维持实验蜂群不进行任何针对瓦螨属的处理，但接受季节性糖喂养和针对微粒子虫属(Nosema)的Fumagilin处理。

从在蜜蜂群底部上的筛网下的托盘上采集雌性成年瓦螨属螨并且将其保持在室温下湿滤纸上至多4小时，然后进行本实验。采集两个任务组的成年蜜蜂(保育蜂和采集蜂)用于本实验。将观察到倾向于蜂子室的蜜蜂视为保育蜂，同时根据Kather等人,(2011)J.Chem.Ecol.37：205-212所述从蜜蜂群的入口采集携带花粉团的花粉采集蜂。通过在-20℃冷冻1小时杀死蜜蜂。在进行行为生物测定前，通过使用镊子在立体显微镜(Olympus DFPLAPO 1XPF JAPAN)下从采集蜂中完全取出花粉团。从蜂房中取得保育蜂使用。

化学化合物合成

测试化合物包括4种对-二烷氧基苯类(图1A)、顺式5-(2'-羟乙基)环戊-2-烯-1-醇的二烷基醚类的(cy{1-5,1}，代码HC 2-169)5-化合物库和各个库成员(图1B)。

如Paduraru等人,J.Comb.Chem 10：123-134中所述合成所述化合物，而如Chen等人，(2010)Bioorg Med Chem 18：2920-2929和Chen H.,Plettner E.，(2012)TetrahedronLetters 53：2059-2062中所述合成脂环族醚类。

外消旋cy{R ³ ,1}化合物的合成方法和光谱数据

图1C提供了用于制备cy{R³,1}化合物的通用合成方案。参照图1C，通过与叔丁基二甲基甲硅烷基氯(TBDMSCl)和咪唑在二氯甲烷中反应单一地保护二醇1。使单保护的二醇2与金属钾在四氢呋喃(THF)中反应，然后添加适合的烷基溴或烷基碘(R₃Br或R₃I)，得到化合物3。使用在THF中的氟化四丁基铵(TBAF)使该中间体脱保护，得到化合物4。使该化合物与钾在THF中反应，然后与碘甲烷反应，得到终产物cy{R³,1}。

(±)-顺式-5-[2-(叔丁基-二甲基-甲硅烷氧基)-乙基]环-戊-2-烯醇2的合成

将化合物1(1.5g，11.7mmol)、三乙胺(1.42g，14.0mmol)、DMAP(142mg，1.17mmol)、叔丁基二甲基甲硅烷基氯(2.11g，14.0mmol)在CH₂Cl₂中的溶液在0℃搅拌12h。用CH₂Cl₂稀释该反应混合物，用水和盐水洗涤。用MgSO₄干燥有机层，过滤，真空浓缩。通过硅胶快速色谱法纯化粗产物(EtOAc/己烷3:7)，得到纯的醇2，为无色油状物(2.26g，80％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ_H 6.05(m,1H)，5.95(m,1H)，4.72(dt，J＝7.2，1.8Hz,1H)，3.71(m，1H)，3.55(m，1H)，3.07(d，J＝3.2，-OH)，2.49-2.41(dddd，J＝12.0，9.6，4.8，2.9Hz，1H)，2.29-2.21(ddd，J＝14.5，13.0，13.0Hz，1H)，2.20-2.12(dddd，J＝11.4，9.4，4.4，2.8Hz，1H)，2.01-1.92(m，1H)，1.84-1.73(ddd，J＝14.4，12.9，12.9Hz，1H)，0.89(s，9H)，0.02(s，3H)，0.00(s，3H)。

用于制备化合物3b-3e的通用方法

在0℃将化合物2(1mmol)在6ml干THF中的溶液滴加到KH(1.1mmol)在20ml干THF中的混悬液中。将该混合物在0℃搅拌30min。在0℃滴加烷基化试剂(2.2mmol)。添加完成后，将该反应混合物温热至室温，保持再搅拌3h。用饱和NH₄Cl溶液使反应停止。用MgSO₄干燥有机溶液，真空浓缩。通过硅胶快速色谱法纯化残余物(己烷/EtOAc9:1)，得到期望的化合物。

化合物3b的合成

根据上述通用方法，用KH(90mg，2.272mmol)和溴乙烷(450mg，4.132mmol)处理化合物2(500mg，2.07mmol)，得到纯的产物3b(无色油状物，400mg，72％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ_H 6.04(m，1H)，5.94(m，1H)，4.25(dt，J＝7.2，1.8Hz，1H)，3.71(m，2H)，3.44(m，1H)，3.32(m，1H)，2.49-2.41(dddd，J＝12.0，9.6，4.8，2.9Hz，1H)，2.29-2.21(ddd，J＝14.5，13.0，13.0Hz，1H)，2.20-2.12(dddd，J＝11.4，9.4，4.4，2.8Hz，1H)，2.01-1.92(m，1H)，1.84-1.73(ddd，J＝14.4，12.9，12.9Hz，1H)，1.17(t，J＝7.2Hz，3H)，0.89(s，9H)，0.02(s，6H)。

化合物3c的合成

根据上述通用方法，用KH(90mg，2.27mmol)和1-溴丙烷(507mg，4.128mmol)处理化合物2(500mg，2.07mmol)，得到纯的产物3c(无色油状物，400mg，68％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ_H 6.01(m，1H)，5.95(m，1H)，4.23(dt，J＝7.2，1.8Hz，1H)，3.69(m，2H),3.44(m，1H)，3.32(m，1H)，2.49-2.41(dddd，J＝12.0，9.6，4.8，2.9Hz，1H)，2.29-2.21(ddd，J＝14.5，13.0，13.0Hz，1H)，2.20-2.12(dddd，J＝11.4，9.4，4.4，2.8Hz，1H)，2.01-1.92(m，1H)，1.84-1.73(ddd，J＝14.4，12.9，12.9Hz，1H)，1.53-1.63(m，2H)，0.91(t，J＝7.2Hz，3H)，0.90(s，9H)，0.02(s，6H)。

化合物3d的合成

根据上述通用方法，用KH(90mg，2.27mmol)和1-溴丁烷(566mg，4.132mmol)处理化合物2(500mg，2.07mmol)，得到纯的产物3d(无色油状物，425mg，69％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ_H 6.01(m，1H)，5.95(m，1H)，4.22(dt，J＝7.2，1.8Hz，1H)，3.68(m，2H),3.44(m，1H)，3.32(m，1H)，2.43-2.35(dddd，J＝12.0，9.6，4.8，2.9Hz，1H)，2.34-2.25(ddd，J＝14.5，13.0，13.0Hz，1H)，2.20-2.13(dddd，J＝11.4，9.4，4.4，2.8Hz，1H)，2.01-1.92(m，1H)，1.73-1.64(ddd，J＝14.4，12.9，12.9Hz，1H),1.61-1.51(m，2H),1.43-1.33(m，2H)，0.91(t，J＝7.2Hz，3H)，0.90(s，9H)，0.01(s，6H)。

化合物3e的合成

根据上述通用方法，用KH(90mg，2.27mmol)和1-溴戊烷(818mg，4.132mmol)处理化合物2(500mg，2.07mmol)，得到纯的产物3e(无色油状物，439mg，68％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ_H 6.01(m，1H)，5.95(m，1H)，4.22(dt，J＝7.2，1.8Hz，1H)，3.69(m，2H),3.45(m，1H)，3.32(m，1H)，2.43-2.35(dddd，J＝12.0，9.6，4.8，2.9Hz，1H)，2.34-2.25(ddd，J＝14.5，13.0，13.0Hz，1H)，2.20-2.13(dddd，J＝11.4，9.4，4.4，2.8Hz，1H)，2.01-1.92(m，1H)，1.73-1.64(ddd，J＝14.4，12.9，12.9Hz，1H)，1.60-1.52(m，2H)1.37-1.28(m，4H)，0.91(t，J＝7.2Hz，3H)，0.90(s，9H)，0.01(s，6H)。

用于合成化合物4b-4e的通用方法

在室温向搅拌的化合物3b-3e(1mmol)在10ml THF中的溶液中加入氟化叔丁基铵(TBAF)(2mmol)。12h后，用EtOAc稀释该反应混合物，分离有机层，用饱和NH₄Cl和盐水溶液洗涤。用MgSO₄干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化粗产物(己烷/EtOAc 7:3)，得到期望的产物。

用于外消旋cy{R ³ ,1}化合物的通用方法

在0℃将化合物4b-4e(1mmol)在6ml THF中的溶液滴加到KH(1.1mmol)在20ml干THF中的混悬液中。将该混合物在0℃搅拌30min。在0℃滴加烷基化试剂(2.2mmol)。添加完成后，将该反应混合物温热至室温，保持再搅拌3h。用饱和NH₄Cl溶液使反应停止。用MgSO₄干燥有机溶液，真空浓缩。通过硅胶快速色谱法纯化残余物(己烷/EtOAc9:1)，得到期望的化合物。

cy{1,1}的合成

根据上述部分中所述的通用方法，用KH(34mg，0.859mmol)和碘甲烷(424mg，3.124mmol)处理化合物1(100mg，0.78mmol)，得到纯的产物cy{1,1}(无色油状物，30mg，25％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ_H 6.01(m，1H)，5.95(m，1H)，4.14(dt，J＝7.2，1.8Hz，1H)，3.48(td，J＝6.4，2.1Hz，1H)，3.37(s，3H)，3.34(s，3H)，2.43-2.35(dddd，J＝12.0，9.6，4.8，2.9Hz，1H)，2.34-2.25(ddd，J＝14.5，13.0，13.0Hz，1H)，2.20-2.13(dddd，J＝11.4，9.4，4.4，2.8Hz，1H)，2.01-1.99(m，1H)，1.73-1.64(ddd，J＝14.4，12.9，12.9Hz，1H)；MS m/z(相对强度)：157(M+1,10％)，149(25％)，109(50％)，69(100％)。

cy{2,1}的合成

根据上述部分中所述的通用方法，用KH(76mg，19.2mmol)和碘甲烷(454mg，3.2mmol)处理化合物4b(250mg，1.6mmol)，得到纯的产物cy{2,1}(无色油状物，220mg，81％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ_H 6.01(m，1H)，5.94(m，1H)，4.25(dt，J＝7.2，1.8Hz，1H)，3.60-3.52(m，1H)，3.52-3.43(m，3H)，3.37(s，3H)，2.43-2.35(dddd，J＝12.0，9.6，4.8，2.9Hz，1H)，2.34-2.25(ddd，J＝14.5，13.0，13.0Hz，1H)，2.20-2.13(dddd，J＝11.4，9.4，4.4，2.8Hz，1H)，2.01-1.92(m，1H)，1.73-1.64(ddd，J＝14.4，12.9，12.9Hz，1H)，1.20(t，J＝7.2Hz，3H)；MS m/z(相对强度)：171(M+1，1％)，169(M-1，25％)，125(100％)。

cy{3,1}的合成

根据上述部分中所述的通用方法，用KH(120mg，3mmol)和碘甲烷(734mg，5.176mmol)处理化合物4c(440mg，2.58mmol)，得到纯的产物cy{3,1}(无色油状物，300mg，63％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ_H 6.01(m，1H)，5.95(m，1H)，4.23(dt，J＝7.2，1.8Hz，1H)，3.55-3.42(m，3H),3.41-3.33(m，1H),3.38(s，3H)，2.43-2.35(dddd，J＝12.0，9.6，4.8，2.9Hz，1H)，2.34-2.25(ddd，J＝14.5，13.0，13.0Hz，1H)，2.20-2.13(dddd，J＝11.4，9.4，4.4，2.8Hz，1H)，2.01-1.92(m，1H)，1.73-1.64(ddd，J＝14.4，12.9，12.9Hz，1H),1.63-1.54(m，2H)，0.91(t，J＝7.2Hz，3H)；MS m/z(相对强度)：185(M+1，1％)，125(75％)，93(100％)。

cy{4,1}的合成

根据上述部分中所述的通用方法，用KH(130mg，3.26mmol)和碘甲烷(771mg，5.43mmol)处理化合物4d(500mg，2.71mmol)，得到纯的产物cy{4,1}(无色油状物，438mg，82％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ_H6.01(m，1H)，5.95(m，1H)，4.22(dt，J＝7.2，1.8Hz，1H)，3.54-3.44(m，3H),3.41(m，1H)，3.38(s，3H)，2.43-2.35(dddd，J＝12.0，9.6，4.8，2.9Hz，1H)，2.34-2.25(ddd，J＝14.5，13.0，13.0Hz，1H)，2.20-2.13(dddd，J＝11.4，9.4，4.4，2.8Hz，1H)，2.01-1.92(m，1H)，1.73-1.64(ddd，J＝14.4，12.9，12.9Hz，1H)，1.61-1.51(m，2H)，1.43-1.33(m，2H)，0.91(t，J＝7.2Hz，3H)；MS m/z(相对强度)：197(M-1，2.5％)，125(25％)，109(75％)，93(100％)。

cy{5,1}的合成

根据上述部分中所述的通用方法，用KH(67mg，1.696mmol)和碘甲烷(401mg，2.228mmol)处理化合物4e(280mg，1.414mmol)，得到纯的产物cy{5,1}(无色油状物，220mg，74％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ_H 6.01(m，1H)，5.95(m，1H)，4.22(dt，J＝7.2，1.8Hz，1H)，3.53-3.44(m，3H),3.43-3.36(m，1H)，3.38(s，3H)，2.43-2.35(dddd J＝12.0，9.6，4.8，2.9Hz，1H)，2.34-2.25(ddd，J＝14.5，13.0，13.0Hz，1H)，2.20-2.13(dddd，J＝11.4，9.4，4.4，2.8Hz，1H)，2.01-1.92(m，1H)，1.73-1.64(ddd，J＝14.4，12.9，12.9Hz，1H)，1.60-1.52(m，2H)1.37-1.28(m，4H)，0.91(t，J＝7.2Hz，3H)；MS m/z(相对强度)：211(M-1，2.5％)，159(50％)，91(100％)。

电生理学生物测定

对瓦螨属前腿上的嗅觉感觉器官进行电生理学(EP)记录。将前腿在基底部分开并且固定在填充KCl溶液(0.1N)的两个玻璃毛细管之间，它们各自包含银记录电极，由此闭合电路。使用刺激流量控制器(型号CS-05；Syntech，Hilversum，the Netherlands)以100ml/min的速率将恒定流的活性炭过滤和加湿的空气吹向该器官。

相对于对阳性刺激物(蜜蜂顶空)的响应测量破坏性化合物对EP响应的作用。通过将活性炭过滤的空气喷射(1000ml/min，1秒)过玻璃缸瓶呈现顶空，所述玻璃缸瓶包含保持在受控环境(32-34℃，62-70％)中的新鲜冷冻-杀死的保育蜂(测试1、5或10只蜜蜂)。将保持在相同条件下的空缸瓶的顶空用作对照(图2A)。同一前腿用于测试全部处理。

图2A显示用于评价使用分离的瓦螨属前腿的电生理学(EP)的实验方案，所述分离的前腿用在缸瓶中新鲜捕捉的蜜蜂的顶空挥发性物质刺激。图2B显示对空气(左)和蜜蜂挥发性物质(右)的瓦螨属前腿响应的典型痕迹。图2C显示瓦螨属前腿的电生理学响应振幅。图2D显示对不同数量的蜜蜂的顶空的响应之间的比较：1、5和10只蜜蜂和无蜜蜂(空缸瓶)，正如使用重复ANOVA测量、然后是Tukey-Kramer事后检验所分析的。用不同字母标记的棒形图具有显著性差异，p<0.05(n＝6)。

为了准备潜在破坏性化合物的EP柱，将溶于己烷的1μl该化合物吸移在一张滤纸上(Whatman No 1)，将其放入玻璃巴斯德吸管并且暴露于空气30s，以使溶剂蒸发。测试3种不同刺激物：“阳性刺激物”(5只蜜蜂的顶空)、“阳性刺激物+化合物”、对照刺激物“空气”(空缸瓶)和己烷。

在全部实验中，如图3A中所呈现的，按照相同次序将所述刺激物给予同一前腿。当测试一种以上化合物时，将化合物按照随机次序施用。对于每一实验，测试至少6个不同的瓦螨属前腿(来自每个个体的一个)。

用PC通过用于数据获取的IDAC-232、应用“EAG 2000”和“GCEAD-2000”软件(均为Syntech)放大和记录EP响应(mV)。对于恢复和阻止改变的器官，在每次刺激之间允许30秒间隔，另有指定的除外。

将响应振幅相对于同一器官对对照刺激物的响应校准(方程式1)。在暴露于所述化合物前仅显示对“阳性刺激物”的响应高于对对照刺激物响应的个体用于统计学分析。相对于对“阳性刺激物”的响应评价化合物的作用，然后暴露于测试化合物。评价两种类型的作用：在所述化合物的存在下发生的作用称作“短期作用”，而在施用所述化合物之后、而并非在其存在下的作用称作“长期作用”。

校准方程式1.Res-对刺激物的响应振幅(mV)，Air-对空气的响应振幅(mV)，N-相对于对空气的响应校准的响应振幅(％)。

行为生物测定

在两种选择生物测定中测试化合物对瓦螨属宿主偏好的作用。在该生物测定中，将单一螨放入测试台(arena)(90mm直径和17mm深度的玻璃培养皿)中心并且提供新鲜杀死的采集蜂或保育蜂的选择，将它们分别置于测试台的相对侧。实验在受控黑暗环境中、在34-35℃和60-70％相对湿度(RH，在蜜蜂蜂房中的模拟条件)下进行。在溶于1μl己烷的0.01μg、0.1μg和10μg的化合物或在1μl纯己烷作为对照的存在下检验瓦螨属选择。将所述化合物或己烷置于恰好放置在覆盖板(用于缓释的一片石蜡膜(5*5mm，Bemis，USA)上)内侧上的瓦螨属上方。至少在3次重复实验中测试每种剂量；在每次实验中，对于每次处理测试10-19只螨(化合物或己烷)。在120分钟后记录保育蜂、采集蜂上螨的位置，或另外的位置。将瓦螨属对采集蜂与保育蜂之间的宿主偏好计算为占到达任意宿主的螨总数的百分比。将瓦螨属到达任意宿主的能力计算为截至到本实验结束时活螨在总测试螨数中的百分比。

统计学分析

为了进行电生理学测定，使用ANOVA重复测量、然后使用事后Tukey-Kramer检验分析以mV计的原始数据或以百分比计的校准数据。当需要时，使用Bonferroni校正。

为了进行行为测定，将逻辑回归分析用于评价化合物对瓦螨属宿主偏好的剂量效能。报告比值比和95％置信区间。使用卡方检验对到达任意宿主的螨在活螨中的比例评价化合物对瓦螨属到达任意宿主的能力的可能的作用。使用SASStart统计程序7.0.2进行全部统计学程序。

分子模型化

用ChemDraw画出结构并且输入ChemBio3D Ultra v.11(CambridgeSoft，Cambridge，Massachusetts，USA)。首先使用MM2分子力学模型、且然后使用PM3模型(一种半经验方法)将每个模型最小化。在两种最小化中，允许所有的原子自由运动，且PM3最小化使用封闭壳波函数即EF优化程序进行，直到RMS梯度为≤0.1。初始最小化在真空中进行，然后在水和氯仿中进行最小化。在3种环境之间未观察到显著性差异，因此，在氯仿中得到的结构(模拟蛋白质上或内部潜在结合位点的疏水环境)用于进一步研究。为了建立极小值宽度，对于所有组的相邻C和/或O原子构建双二面角图，围绕所述相邻原子能够自由旋转。在二面角研究之间，模型在700K被短分子动力学轨道“加热”(1000次重复)，此后，再用PM3使最终的结构最小化。为了覆盖结构，应用软件覆盖算法，使用总体能力最低的两种结构。使用cy{4,1}作为目标结构或使用3b{2,2}作为目标进行覆盖。两种覆盖模拟描绘了类似的空间。

结果

电生理学

为了测试对瓦螨属宿主检测的破坏，将保育蜂的顶空选作阳性刺激物。用来自不同数量蜜蜂(1、5或10只)的顶空刺激瓦螨属前腿显示，尽管一个蜜蜂顶空在瓦螨属腿中引起一些响应，但是仅5和10只蜜蜂的刺激引起明显高于空气的响应(F(3,15)＝4.75，p＝0.016，ANOVA重复测量，然后是Bonferroni校正；图2C)。因为10只蜜蜂顶空不累加响应振幅的显著增加时，所以5只蜜蜂顶空用于进一步实验。

图3A-3D显示来自化合物的电生理学筛选的结果。图3A显示瓦螨属前腿刺激的次序和用于相应响应的术语。每次刺激之间的时间间隔为30s，另有描述的除外。刺激物为：空气、5只蜜蜂顶空(“蜜蜂刺激物”)、蜜蜂刺激物与所述化合物(“蜜蜂刺激物+化合物”)或己烷对照刺激物(“蜜蜂刺激物+己烷”)。在刺激物下面的斜体字是结果中呈现的数值名称。图3B显示来自瓦螨属对不同刺激物的电生理学响应的初步筛选的结果，所述不同刺激物均以10mg载入刺激物柱。对于蜜蜂刺激物，使用来自5只蜜蜂的顶空。(针对空气响应的校准值％，平均值+SE)(n＝10)。图3C显示在10mg剂量下共混物HCO-2169的各个成分的测试(n＝10)。图3D显示来自使用在10μg剂量下的二乙氧基苯的3种异构体的实验结果。ANOVA重复测量后进行Tukey-Kramer事后检验。用不同字母标记的棒形图具有显著性差异，p<0.05，(n＝5-6)。

图4A-4C分别显示长期抑制性化合物cy{4,1}、3b{2,2}和cy{2,2}的剂量响应。瓦螨属前腿对使用不同量的每种化合物和来自5只保育蜂的顶空刺激的响应(针对空气响应的校准值％，平均值+SE)。ANOVA重复测量后进行Tukey-Kramer事后检验。用不同字母标记的棒形图具有显著性差异，p<0.05，(n＝6-7)。

图5A-5B显示对最具有活性的化合物的长期抑制作用的详细评价。图5A显示0.1μgcy{4,1}(左)和3b{2,2}(右)与和不与来自5只保育蜂的同时顶空挥发性物质刺激物对瓦螨属前腿的电生理学响应的作用。数据是校准值(％，平均值+SE)：用不同字母标记的棒形图具有显著性差异，ANOVA重复测量，p<0.05，n＝6。图5B显示0.1μg cy{4,1}(左)或0.1mg 3b{2,2}(右)对瓦螨属前腿电生理学响应的抑制作用的期。化合物刺激与纯蜜蜂刺激之间的时间间隔可变。(针对空气响应的校准值％，平均值+SE)。ANOVA重复测量后进行Tukey-Kramer事后检验。用不同字母标记的棒形图具有显著性差异，p<0.05，(n＝6)。

图6A-6D显示选择的化合物对瓦螨属在保育蜂与采集蜂之间的宿主选择的作用。图6A描述实验方案。测试化合物不接触螨，而螨可以在周围活动并且在新鲜杀死的保育蜂或采集蜂之间选择。图6B显示cy{4,1}在不同剂量下(0.01μg、0.1μg、10μg)的作用(p<0.0001、OR＝82.8、(95％CI 0.49-1.02)：数据是在己烷(对照)或破坏性化合物的存在下从本实验开始后180min选择特定宿主的瓦螨属百分比。棒形图内的数量显示选择每种宿主的瓦螨属数量。图6C显示3b{2,2}的作用(p<0.0001。OR＝35.1，(95％CI 0.4-0.82)。图6D显示3c{2,2}的作用(p<0.0048，OR＝5.41(95％CI 0.09-0.48)。逻辑回归，p<0.001。

瓦螨属对蜜蜂顶空依次刺激的响应

为了检查瓦螨属对蜜蜂挥发性物质的可能的习惯化和随时间的响应稳定性，在30秒间隔喷入5只蜜蜂顶空的连续刺激物。比较7只不同瓦螨属螨中的响应振幅，发现在响应振幅之间无显著性差异(F(2,12)＝0.0407，p＝0.96，ANOVA重复测量)且该响应保持稳定至少20min。

图7显示瓦螨属前腿对5只蜜蜂顶空3次连续刺激的电生理学响应的比较。ANOVA重复测量后进行Tukey-Kramer事后检验。用不同字母标记的棒形图具有显著性差异，F(2,12)＝0.0407，p＝0.96(n＝7)。

化合物对瓦螨属对蜜蜂顶空响应的作用

通过用空气、蜜蜂顶空或混合的蜜蜂顶空+化合物刺激物依次刺激前腿测试6种不同化合物对瓦螨属前腿对蜜蜂顶空的电生理学响应的破坏性作用(图3A)。

对于大部分测试化合物而言，对感觉器官的显著抑制作用是显而易见的，除外在10μg下的己烷对照和3c{2,3}(ANOVA重复测量，p<0.05)。抑制性化合物对螨对蜜蜂顶空响应的影响并不相同。对于化合物3c{2,2}和cy{2,2}发现显著性的短期抑制作用(F(2,16)＝8.92，p＝0.002；F(2,16)＝42.8，p<0.0001)，而使用3c{1,1}、cy{2,2}和共混物HCO-2169观察到显著的长期作用(F(2，16)＝3.89，p＝0.04；F(2，16)＝19，p<0.0001)(图3B)。对于cy{2,2}和HCO-2169，这种长期抑制作用显然强于短期作用，但在使用空气刺激后施用的蜜蜂顶空的第4次刺激中消除(数据未显示)。在本研究中，对于短期和长期作用，存在3种不同的结构-活性相关性。例如，3c{1,1}、3c{2,2}和cy{2,2}在其短期作用方面类似，而3c{2,3}无活性。在长期作用方面，活性为：HCO-2169和3c{2,3}无活性。

HCO2169是甲基-取代的cy化合物的共混物：cy{1-5,1}。为了揭示出抑制作用的结构-活性相关性，研究HCO-2169的成分：cy{1,1}、cy{2,1}、cy{3,1}、cy{4,1}和cy{5,1}。按照随机次序测试不同成分以及整个混合物(HCO-2169，作为阳性对照)。除外cy{1,1}，全部测试化合物对瓦螨属对蜜蜂顶空的响应均具有长期抑制作用(图3C)。3种最有效的化合物依次是：cy{4,1}、cy{3,1}和cy{2,1}(F(2，18)＝10.7，p＝0.0009；F(2，18)＝4.1，p＝0.03；F(2，18)＝14.6，p＝0.0002)。为了追踪二烷氧基苯类的结构-活性相关性，使用二乙氧基苯的3种异构体3a{2,2}、3b{2,2}和3c{2,2}以及cy{2,2}和3c{1,1}进行实验。二乙氧基苯的异构体在其活性方面存在差异：3c{2,2}是最佳短期抑制剂，但未显示出长期抑制作用，而3b{2,2}相反，且3a{2,2}显示出长期抑制作用(F(2，10)＝9.9。p＝0.004；F(2，10)＝16.8，p＝0.001；F(2，10)＝5.9，p＝0.026)(图3D)。化合物cy{2,2}显示适度长期抑制作用(参见下文)。对于3c{1,1}，证实在1或10μg的较高剂量下具有长期抑制作用(图8B)。

图8A显示cy{2,2}对瓦螨属在保育蜂于采集蜂之间的宿主选择的作用。测试不同剂量下的该化合物(0.01μg、0.1μg、10μg)(OR＝54，(95％CI 15.3-231.9)：数据是在己烷(对照)或破坏性化合物的存在下从本实验开始后180min选择特定宿主的瓦螨属百分比。棒形图内的数量显示选择每种宿主的瓦螨属数量。图8B显示长期抑制性化合物3a{2,2}、3c{2,2}和3c{1,1}的剂量响应。瓦螨属前腿对使用不同量的每种化合物和来自5只保育蜂的刺激的响应(针对空气响应的校准值％，平均值+SE)。ANOVA重复测量后进行Tukey-Kramer事后检验。用不同字母标记的棒形图具有显著性差异，p<0.05，(n＝6)。

进一步评价了瓦螨属腿对cy{4,1}响应的特异性，因为它在挥发性方面低于cy{2,1}、cy{3,1}或3b{2,2}，且由此更易于共同起作用。首先，测定剂量响应。0.01μg剂量无短期和长期活性(F(2，12)＝2.9，p＝0.08)。0.1μg和以上剂量均具有长期活性，而仅对于1μg剂量具有短期活性(F(2，12)＝14.9，p＝0.0005)(图4)。最佳剂量显然为0.1μg。该剂量用于随后使用cy{4,1}的实验。类似地，对于另外两种长期抑制剂cy{2,2}和3b{2,2}得到了剂量响应。对于3b{2,2}，发现在所有剂量下均具有长期抑制作用(0.01μg F(2，10)＝20.4，p＝0.0001；0.1μg F(2，10)＝15.4，p＝0.001；1μg F(2，10)＝23.4，p＝0.0001；10μg F(2，10)＝16.8，p＝0.001)，而对于0.1μg剂量仅观察到短期抑制作用。另一方面，cy{2,2}仅在0.1和1μg剂量下具有长期活性(F(2，10)＝13，p＝0.002；F(2，10)＝9.7，p＝0.005)。当单独给予0.1μg cy{4,1}刺激物时，该化合物引起大于对空气响应的响应并且于蜜蜂顶空相比无显著性差异(图5A)。然而，随后使用蜜蜂顶空的刺激被长期抑制(F(2,10)＝14.3，p＝0.001)，这于共同施用两种刺激物时的情况类似(F(2,10)＝25.6，p＝0.0001)。这种抑制作用对化合物的作用具有特异性，因为这种抑制作用无一在给予己烷于蜜蜂顶空的对照组中观察到(F(2,10)＝0.016，p＝0.98)。这种活性不同于使用舞毒蛾触角研究的长期抑制剂的作用，即那些化合物仅在混合刺激后具有抑制作用，但并非它们自身的。通过改变两组刺激物之间的时间间隔检验cy{4,1}的抑制作用期限：“化合物”和“化合物的蜜蜂：30、45或60s。结果启示，所述化合物的作用持续60s以上(30s F(2，10)＝14.3，p＝0.001；45s F(2，10)＝19.4，p＝0.0004；60s F(2，10)＝11.8，p＝0.002)(图5B)。

抑制EAG的化合物对瓦螨属宿主选择的作用

螨对保育蜂或采集蜂的选择显然取决于处理。正如可以在图6B中观察到的，在180min后，在溶剂己烷(对照)的存在下，大部分螨(84％)选择保育蜂，而在破坏性化合物cy{4,1}的存在下，仅少量螨选择保育蜂超过选择采集蜂。选择采集蜂超过保育蜂的程度是剂量依赖性的：在10μg下，发现约94％的瓦螨属选择采集蜂，而分别在0.1μg和0.01μg剂量下，75％和71％的瓦螨属选择采集蜂(OR＝82.8，(95％CI19.2-456.2)；图6B)。化合物3b{2,2}和cy{2,2}显示出类似活性(OR＝35.1，(95％CI 10.8-136.9)；OR＝54，(95％CI 15.3-231.9)；图6C和图8)，而化合物3c{2,2}不会改变螨对保育蜂的天然偏好超过对采集蜂的天然偏好(OR＝5.41，(95％CI 1.7-18.3)；图6D)。

瓦螨属在开始本实验后迅速开始分散，而甚至在180分钟后，仅43-73％的螨到达任意的宿主(图9)。在本实验过程中仅少量死亡。然而，在任意处理过程中，在螨到达任意宿主的能力方面没有显著性减少(卡方检验，cy{4,1}χ²(3)＝2.01，n＝192，p＝0.57；3b{2,2}χ²(3)＝3.9，n＝180，p＝0.27；cy{2,2}χ²(3)＝1.04，n＝180，p＝0.79)。

结构-活性相关性

图9显示在选择生物测定中，从本实验开始180min 3种选择的化合物对螨到达任意宿主的百分比的作用。数据是在己烷(对照)或3种测试剂量每种(0.01μg、0.1μg、10μg)的破坏性化合物存在下活螨的百分比，卡方检验，ns。还对cy{4,1}和3b{2,2}进行了能量最小化构象异构体的分子模型化覆盖。化合物cy{4,1}和3b{2,2}是用于长期抑制和螨选择性改变的最具有活性的同源物。推定它们以或接近其能量最小值发挥其作用，扭转的“V-形”活性空间(active space)被描绘为cy{4,1}和3b{2,2}的覆盖结构。显然提供活性的表位是：1)具有π电子密度的平面或接近平面的环；2)醚部分的氧原子；和3)烷基取代基。两种最具有活性的化合物可以配置环并且彼此相对放置在相似区域中的氧。

无活性化合物无法填充活性位点(例如cy{1,1})或不能在所述区域中放置活性所需的两个氧和环。例如3c{1,3}(未显示)、3c{2,2}、3c{2,3}在长期抑制作用和螨宿主选择性改变方面均为无活性的。在填充醚烷基取代基袋的程度方面显然存在一定的灵活性。例如，cy{2,1}和cy{3,1}作为长期抑制剂均具有活性。然而，在烷基袋可以容纳的基团大小方面显然存在限制：cy{5,1}过大且由此无活性。化合物3a{2,2}具有两个乙氧基基团，其彼此过于接近，且由此难以在活性空间的两个袋之间放置第二个乙氧基基团。这种化合物在长期抑制作用方面显然不具有活性。化合物cy{2,2}呈现了有意义的情况：它可以配合在两个反向手性中心上具有立体化学的活性空间。甚至随后环戊烯环1位上的乙基基团投射到烷基袋的外部，且更重要地，氧原子位于来自覆盖的cy{4,1}和3b{2,2}空间的不同位置上。因此，化合物cy{2,2}是具有适度活性的且具有活性的对映异构体应当与活性cy{4,1}对映异构体相对。

已经在单独的研究中测试了DEET(3-甲基-N,N-二乙基苯甲酰胺，一种众所周知的昆虫驱避剂)，并且发现它在高剂量下抑制瓦螨属对蜜蜂顶空的响应，而短期抑制作用不显著。有意义地，DEET不会配合两种最具有活性的长期抑制剂和改变宿主偏好的化合物cy{4,1}和3b{2,2}所描绘的活性空间，正如通过分子模型化所评价的。

这些数据共同启示，电生理学测定中的长期抑制作用是用于改变行为测定中宿主选择性的良好预测者，并且长期抑制作用所描绘的活性空间也是用于改变螨的宿主选择性偏好的活性空间。

尽管已经示例和描述了示例性实施方案，但是应当理解，可以在不脱离本发明精神和范围的情况下对其中进行各种改变。

Claims (37)

1.其中要求保护排他性或独占性的本发明的实施方案定义如下：

处理蜂群中狄斯瓦螨(Varroa destructor)感染的方法，包括：(A)提供式(I)的化合物：

其中：

OR²是在OR¹的邻位、间位或对位的取代基；

R¹选自C_1-6烷基和C_2-6烯基，且

R²选自C_1-6烷基和C_2-6烯基；和

(B)将式(I)的化合物放入蜂群外壳中。

2.权利要求1的方法，其中所述化合物是式(Ic)的化合物：

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中R¹是C_1-6烷基。

4.权利要求1或权利要求2的方法，其中R¹是C_1-5烷基。

5.权利要求1或权利要求2的方法，其中R¹是C_1-2烷基。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中R²是C_1-6烷基。

7.权利要求1-5任一项的方法，其中R²是C_1-5烷基。

8.权利要求1-5任一项的方法，其中R²是C_1-3烷基。

9.处理蜂群中狄斯瓦螨感染的方法，包括：

(A)提供式(II)的化合物：

其中：

R³选自C_1-6烷基和C_2-6烯基，且

R⁴选自C_1-6烷基和C_2-6烯基；和

(B)将式(II)的化合物放入蜂群外壳中。

10.权利要求9的方法，其中R³是C_1-6烷基。

11.权利要求9的方法，其中R³是C_1-5烷基。

12.权利要求9的方法，其中R³是C_1-3烷基。

13.权利要求9-12任一项的方法，其中R⁴是C_1-6烷基。

14.权利要求9-12任一项的方法，其中R⁴是C_1-3烷基。

15.权利要求9-12任一项的方法，其中R⁴是甲基或乙基。

16.权利要求9-12任一项的方法，其中R⁴是甲基。

17.上述权利要求任一项的方法，还包括减少蜂群中蜂子群体内的狄斯瓦螨感染。

18.上述权利要求任一项的方法，还包括在1周或更长的期限内抑制狄斯瓦螨感染对保育蜂顶空气味的电生理学响应。

19.上述权利要求任一项的方法，还包括阻止狄斯瓦螨接触蜂群中的保育蜂群体。

20.上述权利要求任一项的方法，还包括将式(I)的化合物、式(Ic)的化合物或式(II)的化合物施用于蜂群外壳内的蜂子室。

21.上述权利要求任一项的方法，还包括将杀螨剂放入蜂群外壳中。

22.权利要求21的方法，其中在距离蜂群外壳中蜂子室至少10cm处放置所述杀螨剂。

23.权利要求21或权利要求22的方法，其中所述杀螨剂选自拟除虫菊酯、甲脒和有机磷酸盐。

24.权利要求21或权利要求22的方法，其中所述杀螨剂选自麝香草酚、桉树脑、樟脑、薄荷醇、水杨酸甲酯及其任意组合。

25.权利要求1-20任一项的方法，还包括将植物提取物放入蜂群外壳中。

26.权利要求25的方法，其中所述植物提取物包括精油。

27.权利要求26的方法，其中所述植物提取物选自香茅油、香叶油、熏衣草油、丁香油、Eupatorium buniifolium叶提取物、蛇麻酮、啤酒花提取物、月桂叶提取物、1,8-桉叶油素、甘牛至提取物、薄荷油、印度楝树油、牛至油和冬青油。

28.权利要求1-20任一项的方法，还包括将有机酸放入蜂群外壳中。

29.权利要求28的方法，其中所述有机酸选自甲酸、草酸、乳酸和抗坏血酸。

30.上述权利要求任一项的方法，还包括在将式(I)的化合物、式(Ic)的化合物或式(II)的化合物放入蜂群外壳后从蜂群外壳中取出雄蜂子脾。

31.上述权利要求任一项的方法，还包括在将式(I)的化合物、式(Ic)的化合物或式(II)的化合物放入蜂群外壳后热处理雄蜂俘获巢脾。

32.上述权利要求任一项的方法，还包括在将式(I)的化合物、式(Ic)的化合物或式(II)的化合物放入蜂群外壳后取出和热处理工蜂。

33.上述权利要求任一项的方法，还包括在将式(I)的化合物、式(Ic)的化合物或式(II)的化合物放入蜂群外壳之前、过程中或之后限制蜂王。

34.上述权利要求任一项的方法，还包括将俘获螨的粘性底板放入蜂群外壳中。

35.上述权利要求任一项的方法，其中所述蜂群选自卫生蜂群和狄斯瓦螨-耐受性蜂群。

36.上述权利要求任一项的方法，还包括将狄斯瓦螨-基因沉默dsRNA从蜂群传递至狄斯瓦螨。

37.上述权利要求任一项的方法，还包括将选自狄斯瓦螨性信息素、DEET、橙花酸及其任意组合的信息化学物质放入蜂群外壳中。