CN106455542A

CN106455542A - 用于人造血干/祖细胞的离体扩增的组合物和方法

Info

Publication number: CN106455542A
Application number: CN201580027546.9A
Authority: CN
Inventors: 柴力; 立津央; 丹尼尔·杰弗里·特南; 詹姆斯·艾略特·布拉德讷; 亚历山大·费德拉提恩
Original assignee: National University of Singapore; Dana Farber Cancer Institute Inc; Massachusetts Eye and Ear Infirmary
Current assignee: National University of Singapore; Dana Farber Cancer Institute Inc; Massachusetts Eye and Ear
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2017-02-22
Also published as: CN112063586A; US20200121721A1; JP2022113722A; EP3122181A4; EP3122181A1; JP2020124212A; US20170173083A1; JP2017511132A; EP3777534A1; WO2015148716A1

Abstract

本文描述了使造血细胞(例如造血干细胞(HSC)以及造血干祖细胞(HSPC))有效地离体扩增的方法和组合物。使用小分子药物和靶向细胞中的表观遗传状态的生长因子/生长因子/细胞因子的组合，观察到细胞(包括分离自人脐带血的细胞或外周流动的干/祖细胞)扩增的显著改善。HSPC功能中涉及的多个基因不受干扰，并且在处理后使用慢病毒的基因组编辑的效率极大地提高。除了有益于基因治疗技术之外，这些新方法可在治疗上用于多种造血移植环境。

Description

用于人造血干/祖细胞的离体扩增的组合物和方法

政府支持

本发明是在由美国国立卫生研究院授予的NIH R01 HL092437的政府支持下作出的。美国政府对本发明拥有一定的权利。

技术领域

本文描述的是应用于再生医学领域中的方法和组合物，所述方法和组合物对造血细胞提供了有效的离体扩增并在造血移植环境中建立治疗方法。

背景技术

造血干细胞(HSC)拥有自我更新并产生血液和免疫系统内的所有类型的成熟细胞的独特能力。尽管HSC的主要来源(人骨髓、流动的外周血和脐带血)仍然被限制为供体供给物(donor supply)，这些特征提供了HSC移植的广泛的临床实用性。由于需要对接受者寻找良好匹配的供体，使此类问题加剧，从而在确保供体材料合适且可靠供应方面增加了的升高的复杂性。此外，患有由基因突变引起的疾病的患者将极大地受益于基因治疗技术，其中对自体材料进行离体操作，并在纠正的基因缺陷得到纠正后将其返回。在各种类型的移植类别中，开发用于离体扩增和HSC基因操作的有效技术能够提供现有的供体基础构造之外的现成可再生资源，并建立新的基因治疗技术以治疗由遗传突变引起的疾病。

众所周知，HSC自我再生由内在和外在的信号调控。尽管在理解支持体内造血系统的自我更新和分化的分子因素方面取得了重大进展，但是关于如何调节控制HSC和更原始的人造血干/祖细胞(HSPC)的离体自我更新的因素则知之甚少。此外，与胚胎干细胞(ESC)的情况不同，培养物中的HSC和/或HSPC的扩增通常以损失“干性”为代价。新兴研究已经表明了建立离体培养条件的可能性，该条件使一些HSC群(例如表达CD34和CD90标志物的HSC群)自我更新和扩增，其看起来与骨髓再生潜能一致。外在因素是否可被应用于进一步增强HSC群的扩增而不损失“干性”是未知的。此类细胞是否接受基因组修饰也是不清楚的，基因组修饰将极大地有益于离体培养的HSC在治疗应用中的应用。因此，仍然需要用于产生和扩增大量的人HSC的方法，以提高细胞作为可再生治疗资源用于移植的可用性。

本文描述的是使造血干祖细胞有效地离体扩增的方法和组合物。使用小分子药物和靶向细胞中的表观遗传状态的生长因子/细胞因子/生长因子的组合，本发明人发现用多种化合物(例如TSA、MS-275或DOT1抑制剂)处理的HSPC扩增至少10倍。重要的是，这些结果可扩展到人脐带血和外周流动的干/祖细胞(PBSC)。此外，在用诸如TSA或MS 275的化合物处理后，HSPC功能涉及的多个基因(如HoxA9、HoxB4、GATA-2和SALL4)不受干扰，并且在处理后使用慢病毒的基因组编辑的效率大大提高。这些新方法可潜在地在治疗上用于在移植环境中扩增脐带血HSPC以及基因修饰，例如基因治疗或其它基因组编辑/工程化过程(例如转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR))。

发明内容

本文描述的是扩增造血细胞的方法，所述方法包括提供一批量(a quantity of)的造血细胞，并在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下对所述一批量的造血细胞进行培养，其中所述至少一种小分子和至少一种生长因子能够扩增造血细胞。在另一实施方式中，所述造血细胞是造血干细胞(HSC)。在另一实施方式中，所述造血细胞是造血干祖细胞(HSPC)。在另一实施方式中，所述造血细胞分离自脐带血。在另一实施方式中，所述造血细胞分离自骨髓。在另一实施方式中，所述造血细胞是分离自外周血。在另一实施方式中，所述至少一种小分子是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)。在另一实施方式中，所述HDACi包括选自曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA和HDAC6抑制剂161的一种或多种HDACi。在另一实施方式中，所述至少一种小分子包括选自5-氮杂胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ、dmPGE2和UM171的一种或多种小分子。在另一实施方式中，所述至少一种生长因子包括选自干细胞因子(SCF)、flt3配体(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)的一种或多种生长因子。

本文进一步描述的是基因组编辑的方法，所述方法包括提供一批量的造血细胞，并在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下对所述一批量的造血细胞进行培养，使所述细胞与一种或多种载体(各载体编码至少一种选择盒(selection cassette)和/或至少一种核酸酶)接触，以及选择表达所述选择盒和所述核酸酶的造血细胞，其中表达所述选择盒和所述核酸酶的细胞包含经编辑的基因组。在另一实施方式中，所述细胞是造血干细胞(HSC)。在另一实施方式中，多能干细胞是造血干组细胞(HSPC)。在另一实施方式中，所述至少一种核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。在另一实施方式中，所述至少一种核酸酶是转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)。在另一实施方式中，所述至少一种核酸酶是CRISPR-相关蛋白(Cas)核酸酶。在另一实施方式中，所述一种或多种载体包括编码至少一种选择盒和至少一种核酸酶的载体。在另一实施方式中，所述量的造血细胞分离自脐带血、骨髓或外周血。在另一实施方式中，所述方法包括向受试者给予所选择的造血细胞。在另一实施方式中，所述造血细胞与受试者免疫相容。

本文进一步描述的是通过基因组编辑的方法产生的一批量的细胞，所述方法包括提供一批量的造血细胞，并在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下对所述量的造血细胞进行培养，使所述细胞与一种或多种载体(各载体编码至少一种选择盒和/或至少一种核酸酶)接触，以及选择表达所述选择盒和所述核酸酶的造血细胞，其中表达所述选择盒和所述核酸酶的细胞包含经编辑的基因组。

本文另外描述的是扩增造血细胞的离体方法，所述方法包括从脐带血、骨髓或外周血获得一批量的造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC)，以及通过在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下通过培养HSC或HSPC将HSC或HSPC扩增至少48小时的时间段，从而使HSC或HSPC得以扩增，所述至少一种小分子选自曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA、HDAC6抑制剂161、5-氮杂胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ、dmPGE2和UM171，所述至少一种生长因子选自干细胞因子(SCF)、flt3配体(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)。在另一实施方式中，获得一批量的HSPC包括对表达CD34+和/或CD90+的细胞进行分离。在另一实施方式中，所述至少48小时的时间段包括72小时、96小时、120小时、144小时或168小时。

附图说明

在参考的附图中对示例性的实施方式进行说明。旨在将本文公开的实施方式和附图视为说明性的、而非限制性的。

图1用增加CD34+CD90+细胞的化合物进行筛选。(A)在培养后的化合物对CD34和CD90表达的影响。各值代表两次独立实验的平均值±标准误。(B)用所述化合物培养的CD34+CD90+细胞的绝对数。各值代表两次独立实验的平均值±标准误。

图2 UM171影响CD34+细胞的分裂。使用商业化和合成的(以home标记)UMI171及其中间体的50nM至500nM(1uM)之间的总细胞数非常相似。

图3 TSA影响CD34+细胞的分裂。(A)在细胞因子/生长因子/生长因子的存在下，用TSA、MS275或DMSO培养的CD34+细胞的细胞生长。所示数据是三次独立实验的平均值。(B)在细胞因子/生长因子/生长因子的存在下，将用TSA或DMSO处理的CSFE-标记的CD34+细胞培养7天。该子图显示了培养5天和7天后的CFSE荧光强度的代表性流式细胞术概图(2个实验中的1个)。箭头表示已经历较少细胞分裂的细胞的分数。(C)该子图显示了培养5天后的CD34+CD90+细胞和CD34+CD90-细胞的CFSE荧光强度的代表性流式细胞术概图。(D)该子图显示了培养7天后的CD34+CD90+细胞和CD34+CD90-细胞的CFSE荧光强度的代表性流式细胞术概图。(E)在细胞因子/生长因子/生长因子的存在下，用TSA、MS275或DMSO培养的膜联蛋白V阳性细胞。所示数据是两次独立实验的平均值。

图4用TSA处理CB细胞增强了骨髓再增殖潜能。散点图显示了在用DMSO、TSA或MS275进行培养后，用2×10⁴个CD34+细胞的后代移植2周后的NSG小鼠的PB中植入的人CD45+细胞的水平。

图5用TSA处理HSPC增强了骨髓再增殖潜能。散点图显示了在移植8周后，在NSG小鼠的PB(A)和BM(B)中植入的人CD45+细胞的水平。

图6用TSA处理CD34+细胞调节干细胞相关基因的表达。通过实时定量PCR测量野生型肽处理对基因(GATA1、GATA2、NOTCH1、BMI1、HOXB4、C-MYC、PU.1、BCL2、P53、P21、P27、MPO、TPO和CD34)的相对转录水平的影响。在细胞因子/生长因子/生长因子的存在下，从用TSA或DMSO培养3天获得的细胞中提取总RNA。通过实时PCR确定经TSA处理的细胞相对于经DMSO处理的细胞的相对mRNA水平。将GAPDH用作内部校准物(对照基因)。使用2个独立试样以两重复获得测量值。

图7人干细胞中的CD34+CD90+扩增的示意模型。(A)即使细胞处于含有细胞因子/生长因子/生长因子的培养基的刺激条件下，HSPC倾向于分化。在含有细胞因子/生长因子/生长因子的培养基中，经组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)处理的HSPC得到扩增而非分化。(B)CD34+CD90+细胞的分裂模型的示意模型。

图8分析CD34+CD90+细胞的流程的图解。通过使用Ficoll-Paque、CD34+阳性筛选试剂盒(磁珠)获得CB CD34+细胞。然后用肽处理细胞1小时，接着加入细胞因子/生长因子/生长因子(CC100；SCF、FL、IL3和IL6)和胎牛血清(FBS)。随后，在体外和体内对细胞进行分析。

图9用增加CD34+CD90+细胞的化合物进行筛选的实例。用所述化合物处理后，细胞扩增的特性的各种实例。

图10用增加CD34+CD90+细胞的化合物进行筛选。左侧示出了化合物对培养后的CD34和CD90表达的影响。该结果是2次实验中的1次的代表性数据。右侧描述了在细胞因子/生长因子/生长因子的存在下用所述化合物培养的CD34+细胞的细胞生长。所示数据是两次独立实验的平均值。

图11用TSA或MS275进行的离体培养期间的CD34+CD90+表达的变化。通过流式细胞术对CD34+细胞进行分选和分析。描述了后代的数量(平均值±SDV)。该子图显示了代表性的流式细胞术的概图。

图12在离体培养期间用TSA或MS275处理CD34+细胞扩增了CD34+CD90+细胞。(A)用DMSO或TSA培养的CD34+细胞的百分比。(B)用DMSO或TSA培养的CD34+CD90+细胞的百分比。(C)用DMSO或TSA培养的CD34+细胞的绝对数。(D)用DMSO或TSA培养的CD34+CD90+细胞的绝对数。(E)用DMSO或MS275培养的CD34+细胞的百分比。(F)用DMSO或MS275培养的CD34+CD90+细胞的百分比。(G)用DMSO或MS275培养的CD34+细胞的绝对数。(H)用DMSO或MS275培养的CD34+CD90+细胞的绝对数。各值表示三次独立实验的平均值±标准误。

图13经处理细胞的表征。(A)用TSA培养后的大集落以及用DMSO培养后的小集落。所示数据代表三次独立实验。(B)将集落分为大集落(>50聚类)和小集落(50-5聚类)。白色棒表示小聚类。黑色棒表示大聚类。(C)野生型肽处理对集落形成细胞(CFC)的数量的影响。对原代CD34+细胞以及用DMSO、TSA和MS275处理的细胞的CFU含量进行测定。各值代表三次独立实验的平均值。

图14暴露至TSA或MS275一天限制了CD34+CD90+细胞的表达。用DMSO(右上)、TSA(右中)或MS275(右下)将细胞培养24小时，然后将细胞用PBS洗涤或不洗涤。在第3天和第5天对CD34+CD90+表达进行评价。

图15用TSA处理PBMC CD34+细胞提高了基因插入方法的效率。(A)用TSA或MS275将细胞培养72小时，然后在含有慢病毒颗粒的培养基中感染细胞。然后将培养基移除并用新鲜培养基代替。(B)在第5天用CD34和CD90表达对GFP表达进行分析。(C)具有或不具有CD34表达的GFP阳性细胞。(D)CD34+CD90+细胞和CD34+CD90-细胞的GFP表达。

具体实施方式

本文中引用的所有参考文献都以引用的方式整体并入本文进行充分阐述。除非另外定义，否则本文使用的科技术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。Allen等，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第22版，Pharmaceutical Press(2012年9月15日)；Hornyak等，Introduction to Nanoscience andNanotechnology，CRC Press(2008)；Singleton和Sainsbury，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第3版，修订版，J.Wiley&Sons(New York，NY2006)；Smith，March’s Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms andStructure，第7版，J.Wiley&Sons(New York，NY 2013)；Singleton，Dictionary of DNAand Genome Technology，第3版，Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；以及Green和Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring HarborLaboratory Press(Cold Spring Harbor，NY 2012)，为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指导。关于如何制备抗体的参考文献，参见Greenfield，Antibodies ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY，2013)；和Milstein，Derivation of specific antibody-producing tissue cultureand tumor lines by cell fusion，Eur.J.Immunol.1976年7月，6(7):511-9；Queen和Selick，Humanized immunoglobulins，美国专利号5,585,089(1996年12月)；以及Riechmann等，Reshaping human antibodies for therapy,Nature，1988年3月24日，332(6162):323-7。

本领域技术人员将认识到可用于本发明的实践中、与本文描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料。实际上，本发明并不限于所描述的方法。出于本发明的目的，下面对以下术语进行定义。

本文所使用的“给予(“Administering”和/或“administer”)”是指用于将药物组合物递送至患者的任何途径。递送途径可包括非侵入性口服途径(经口)、局部途径(皮肤)、经粘膜途径(鼻部、颊/舌下、阴道、眼部和直肠)和吸入途径及胃肠外途径以及本领域已知的其它方法。胃肠外途径是指通常与注射相关的递送途径，包括眼眶内注射、输注、动脉内注射、颈动脉内注射、囊内注射、心内注射、皮内注射、肌内注射、腹膜内注射、肺内注射、脊髓内注射、胸骨内注射、鞘内注射、子宫内注射、静脉注射、蛛网膜下注射、囊下注射、皮下注射、经粘膜注射或经气管注射。通过胃肠外途径，组合物可处于用于输注或注射的溶液或悬浮液的形式，或作为冻干的粉末。

本文所使用的“调节(“Modulation”或“modulates”或“modulating”)”是指响应的上调(即激活或刺激)、下调(即抑制或遏制)或两者组合或分开。

本文所使用的“药学上可接受的载体”是指可用于本发明中的常规的药学上可接受的载体。

本文所使用的“促进(“Promote”和/或“promoting”)”是指细胞或生物体的特定行为的增加。

本文所使用的“受试者”包括所有的动物，包括哺乳动物和其它动物，包括但不限于宠物、家畜和动物园动物。术语“动物”可包括任何活的多细胞脊椎动物生物体，包括例如哺乳动物、鸟、猿、狗、猫、马、牛、啮齿动物等种类。同样，术语“哺乳动物”包括人和非人哺乳动物。

本文所使用的“治疗有效量”是指足以在所治疗的受试者中实现期望效果的组合物中的特定组合物或活性剂的量。治疗有效量可根据多种因素而变化，包括但不限于受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应性、期望的临床效果)和给予途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量。

本文所使用的“治疗(“Treat”、“treating”和“treatment”)”是指治疗性处理和预防性或防治性(prophylactic/preventative)措施，其中目的在于预防或减缓(减轻)目标病症、疾病或疾患(统称为“病痛”)，即使治疗最终不成功。需要治疗的对象可包括已患病痛的对象以及易于患病痛的对象或者待预防病痛的人。

造血干细胞(HSC)的特性和临床应用。造血干细胞(HSC)以及它们的原始人造血干/祖细胞(HSPC)对应物拥有在血液和免疫系统内自我更新并产生成熟细胞的独特能力。虽然造血干细胞(HSC)明确在体内发生自我更新分裂，但是体外自我更新的诱发是困难的。即使经过数十年的研究，对刺激体外自我更新的因素的探求仍在继续。HSC和HSPC的自我更新通过内在信号和外在信号调控。已经识别了其作用与HSC和HSPC的自我更新相关的多种因素，包括Notch配体、Wnt3a、血管生成素样蛋白、前列腺素E2、多效生长因子和SALL4以及同源框蛋白B4。尽管在对支持体内造血系统的自我更新和分化的分子因素的了解方面取得了重大进展，但是关于如何调节管控HSC和HSPC的体外和离体自我更新的因素则知之甚少。

HSC和HSPC的广泛的通用性在科学上引起极大兴趣，其不仅可获得自成体外周血(PB)、骨髓、脐带血(CB)，而且可在体外产生自多能干细胞(PSC)。尽管为了充分确认来自这些类来源中各来源的细胞都相同或至少高度相似需要进行大量研究，但明确的是，所述细胞都将从促进其自我更新和扩增能力的技术中大大受益。首先，这种能力的展示将有助于在功能上表征差异和相似性。其次，这些细胞群的增加的生产将使它们能够进行进一步研究，并有助于实现治疗上相关数量的细胞的生产，该生产迄今为止难以实现。

值得注意的是，近年来已在临床环境中观察到CD移植的使用方面的增加，从而为离体扩增的进一步研究呈现了有吸引力的领域。然而，CB作为造血干细胞(HSC)来源的使用受到移植中包含的HSC数量和可能的原始HSPC群的限制。为了改善结果并扩展CB移植的适用性，一个潜在的解决方案是CB的离体扩增。这也是基因治疗方法中的HSC的体外操作的关键。

尽管为了富集新鲜分离的HSC和可能的原始HSPC，除CD34之外，已对细胞表面标志物(例如CD38、CD45RA、CD49f和CD90)进行了研究，还认为具有CD34和CD90的共同表达的细胞对离体培养后的骨髓再增殖潜能负责。因此，有兴趣了解CD34+CD90+是否能够决定骨髓再增殖细胞的扩增。

表观遗传状态在命运决定中的作用。重要的是，如果HSC和HSPC命运通过在离体扩增期间被下调的转录因子(TF)加以掌控，TF则能够在细胞分裂期间通过“标记”表观遗传记忆起到维持HSC和HSPC识别性的作用。因此，细胞因子/生长因子/生长因子和表观遗传修饰因子的组合能够在细胞分裂期间扩增HSC和HSPC或有利于自我更新，这被认为至少部分通过维持的TF介导。

鉴于CD34+CD90+细胞的有希望的候选群的扩增能力，本文描述的是聚焦于人CD34+CD90+细胞的人HSC的自我更新特性，以评价足以维持和扩增HSC和HSPC细胞的离体培养条件的可能性。如果能够建立此类方法，可通过对以下的靶向、特异性修饰来进一步提高基因治疗方法的效率(包括传统的基因治疗方法)：HSPC的遗传学信息或基因组、或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或与成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶蛋白(Cas)系统。建立离体扩增方法以及改进的基因组编辑方法将提供免疫学上可变的移植材料的可再生资源，从而满足长期未实现的迫切和紧急的临床需求。

基因组编辑。鉴于需要确立移植材料的免疫相容性，基因组工程学是用于再生医学应用的强大工具。位点特异性染色体整合可靶向期望的核苷酸变化，包括：在染色体内的安全着陆位点引入治疗性基因盒、破坏特定的等位基因的编码或非编码区域以及校正遗传突变以逆转疾病表型。最近开发的使用核酸酶(例如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)以及与成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶蛋白(Cas)系统)的方法学能够使双链断裂以提高基因靶向的频率。

简言之，使用诸如ZFN的工具进行的基因组编辑可基于位点特异性的DNA DSB向感兴趣的基因座中的引入，。该过程的关键是经由同源介导修复(HDR)或非同源末端结合(NHEJ)途径用于有效修复DSB的细胞修复机制。这些DNA修复途径的机制可产生限定的遗传结果。例如，NHEJ修复可快速且有效地连接两个断裂末端，提供获得或丧失遗传信息的机会，使得能够在断裂位点处进行小的插入和/或删除，从而能够将靶基因破坏。或者，与ZFN组合提供了特异性设计的同源供体DNA，这一模板可引起基因校正或插入。

由于需要细胞或组织移植(例如HSC移植)的人数远远大于适于移植的细胞和组织的可得到的供应，用于临床应用的HSC中的基因组编辑的一个实例包括建立与受体在免疫学上相容的细胞。HLA是细胞表面上的蛋白，该蛋白帮助免疫系统将细胞识别为自身的或非自身的(外来的或来自体外)，并且通过形成位于人染色体6上的区域(称为主要组织相容性复合物或MHC)的基因簇编码，从而认识到MHC基因座编码的蛋白在移植排斥中的重要作用(因此，HLA蛋白也被称为MHC蛋白)。对于没有匹配的相关供体的患者，通过搜索供体库可向人提供匹配的HLA类型，尽管获得受体的MHC蛋白与移植物的MHC蛋白之间的良好匹配几乎是不可能的。为了提供与更大的患者群组具有广泛的免疫相容性的细胞，HSC的产生和操作(例如建立同源或半合子的HLA细胞)将极大地有助于移植材料的可用性。在用于输血的可用血液中存在类似需求，对于具有独特血型的患者(Rh+的患者)来说尤其如此。O型和Rh阴性的造血细胞的产生可通用于输血。产生和操作HSC的能力将极大地有益于人类疾病的治疗和管理。额外的实例包括用于患有遗传突变导致的疾病的患者的基因治疗技术。基因组编辑的增强的机会将使离体改变自体供体材料的目标得到充分实现，以在校正遗传缺陷后将其返回。

目前限制基因靶向方法的是HR在大多数细胞中发生的频率极低。与小鼠和酵母中使用的HR诱导靶向的常规方法相比，各种ZFN、TALEN和Cas系统特别是在靶基因座中的基因组内产生位点特异性DSB能够通过将HR的频率提高数倍来促进基因靶向。这些新技术对于基因组工程学而言具有巨大前景，尽管产生特异性的ZFN、TALEN或Cas系统在技术上仍然极具挑战性且耗时，因此限制了研究人员对它们的广泛使用。这些基因组工程学方法仍然受限于HR事件(尤其是在人多能干细胞(PSC)、HSPC和HSC中)的低频率。

如本文进一步描述的，观察到小分子药物和细胞因子/生长因子/生长因子的组合可潜在地应用于经纯化的CD34+CD90+人脐带血或外周流动的干/祖细胞(PBSC)CD34+细胞的扩增，包括用诸如TSA、MS-275或DOT1抑制剂的药物化合物进行处理。当与经对照处理的组比较时，经药物化合物处理的CD34+细胞在体外产生的扩增为原始HSPC(CD34+CD90+)的11倍至16倍。TSA还促进CD34+细胞的离体的慢病毒转导。此外，在TSA或MS 275药物处理后，本发明人观察到牵涉HSPC功能的HoxA9、HoxB4、GATA-2和SALL4基因的表达增高。这些结果表明表观遗传修饰因子可以影响HSPC功能以及许多关键基因的表达。

本文描述的是扩增造血细胞的方法，所述方法包括：(a)提供一批量的造血细胞；以及(b)在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下对所述量的造血细胞进行培养，其中，所述至少一种小分子和至少一种生长因子能够扩增造血细胞。在不同的实施方式中，造血细胞是造血干细胞(HSC)。在不同的实施方式中，造血细胞是造血干祖细胞(HSPC)。任选地，HSPC是表达CD34+和/或CD90+的细胞。在其它实施方式中，造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))表达一种或多种标志物，包括Lin-、CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-。在其它实施方式中，造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))表达HOXB4、BMI1、GATA2、p21、p27、c-myc和MPO。

在不同的实施方式中，所述造血细胞分离自脐带血。在不同的实施方式中，所述造血细胞分离自骨髓。在不同的实施方式中，所述造血细胞分离自外周血。在不同的实施方式中，所述至少一种小分子是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)。在不同的实施方式中，所述HDACi包括选自下组的一种或多种HDACi：曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA和HDAC6抑制剂161。在不同的实施方式中，所述至少一种小分子包括选自下组的一种或多种小分子：5-氮杂胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ、dmPGE2和UM171。在各种实施方式中，这些小分子的浓度可包括约2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM以上，或约25nM、50nM、100nM、150nM、250nM、500nM以上，或约500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1000nM以上，或约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM以上，在图1中示出了多种实施例。在不同的实施方式中，所述至少一种生长因子包括选自下组的一种或多种生长因子：干细胞因子(SCF)、flt3配体(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)。在各种实施方式中，这些生长因子的浓度可包括例如约100ng/ml FL、约100ng/ml SCF、约20ng/ml IL-3和约20ng/ml IL-6。在其它实施方式中，这些生长因子的浓度可包括约200ng/ml-500ng/mlFL、约20ng/ml-1000ng/ml SCF、约5ng/ml-500ng/ml IL-3和约5ng/ml-500ng/ml IL-6。在其它实施方式中，所述生长因子包括早期的细胞因子/生长因子/生长因子，例如EPO、TPO、FL、VEGF、BMP(如BMP2、BMP4和BMP7)、GM-CSF、G-CSF和HOXB4。在一些实施方式中，在甲基纤维素培养基的存在下对造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))进行培养，以促进成血管细胞生长。在不同的实施方式中，在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下对所述一批量的造血细胞进行培养，其中，所述至少一种小分子和至少一种生长因子存在至少48小时、72小时、96小时、120小时、144小时或168小时的时间段。

本文进一步描述的是所述方法还涉及造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))的体外扩增，以产生用于各种商业和临床应用的的大量细胞。这包括例如至少10,000个、100,000个或500,000个细胞。在一些实施方式中，细胞制剂包含至少1×10⁶个造血细胞。在其它实施方式中，细胞制剂包含至少2×10⁶个造血细胞，且在进一步的实施方式中，包含至少3×10⁶个造血细胞。在另外的实施方式中，细胞制剂包含至少4×10⁶个造血细胞。

本发明涉及包含10,000个至4百万个以上的人造血细胞的溶液、制剂和组合物。此类溶液、制剂和组合物中的造血细胞的数量可以是10,000至4百万以上的范围内的任何数量。该数量可以是例如20,000、50,000、100,000、500,000、1百万等。本发明进一步涉及生产、储存和分配造血细胞的方法。在一些实施方式中，本发明提供了造血细胞在制备药物中的用途，以治疗有需要的患者中的病症。或者，本发明提供了细胞培养物在制备药物中的用途，以治疗有需要的患者中的病症。本发明还提供了药物制剂在制备药物中的用途，以治疗有需要的患者中的病症。

在各种实施方式中，扩增人造血细胞包括从任何来源(包括来自胎盘或脐带组织的脐带血、外周血、骨髓、胚胎干细胞、诱发的多能干细胞或其它组织)或通过本领域已知的任何其它方法获得造血细胞。在一些实施方式中，造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))可进一步分化为造血细胞(包括但不限于血细胞(如巨核细胞、血小板、红细胞))、或免疫细胞(如天然杀伤细胞或树突细胞)。此类细胞可用于移植或输血。本发明的方法使得造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))能够进行离体扩增，以用于可将自体组织移植用来治疗疾病和/或病症的多种治疗方法。在其它示例中，异源组织移植可用来治疗疾病和/或病症，包括例如受试者的家族亲属。在一些示例中，这包括例如基因治疗的作用。

本文进一步描述的是基因组编辑的方法，所述方法包括：(a)提供一批量的造血细胞；以及(b)在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下对所述量的造血细胞进行培养；(c)使所述细胞与一种或多种载体接触，各载体编码至少一种选择盒和/或至少一种核酸酶，以及选择表达所述选择盒和所述核酸酶的造血细胞，其中表达所述选择盒和所述核酸酶的细胞包含经编辑的基因组。

在不同的实施方式中，细胞是造血干细胞(HSC)。在不同的实施方式中，多能干细胞是造血干祖细胞(HSPC)。任选地，HSPC是表达CD34+和/或CD90+的细胞。在其它实施方式中，造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))表达一种或多种标志物，包括Lin-、CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-。在其它实施方式中，造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))表达HOXB4、BMI1、GATA2、p21、p27、c-myc和MPO。在不同的实施方式中，至少一种核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。在不同的实施方式中，至少一种核酸酶是转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。在不同的实施方式中，至少一种核酸酶是与CRISPR相关的蛋白(Cas)核酸酶。在不同的实施方式中，一种或多种载体包括编码至少一种选择盒和至少一种核酸酶的载体。在不同的实施方式中，所述量的造血细胞分离自脐带血、骨髓或外周血。

本文还描述了基因组编辑的方法，所述方法包括：(a)提供一批量的造血细胞；以及(b)在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下对所述量的造血细胞进行培养；(c)使所述细胞与一种或多种载体接触，各载体编码至少一种选择盒和/或至少一种核酸酶，以及选择表达所述选择盒和所述核酸酶的造血细胞，其中表达所述选择盒和所述核酸酶的细胞包含经编辑的基因组；以及(d)向受试者中给予所选择的造血细胞。在不同的实施方式中，造血细胞与受试者免疫相容。

本文还描述了通过基因组编辑的方法生产的一批量的细胞，所述方法包括：(a)提供一批量的造血细胞；以及(b)在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下对所述量的造血细胞进行培养；(c)使所述细胞与一种或多种载体接触，各载体编码至少一种选择盒和/或至少一种核酸酶，以及选择表达所述选择盒和所述核酸酶的造血细胞，其中表达所述选择盒和所述核酸酶的细胞包含编辑的基因组。

本文进一步描述了离体扩增造血细胞的方法，所述方法包括：(a)从脐带血、骨髓或外周血获得一批量的造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC)；以及(b)在(i)至少一种小分子和(ii)至少一种生长因子的存在下，通过培养HSC或HSPC将HSC或HSPC扩增至少48小时的时间段，从而使HSC或HSPC得以扩增，所述至少一种小分子选自曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA、HDAC6抑制剂161、5-氮杂胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ和dmPGE2的组，所述至少一种生长因子选自干细胞因子(SCF)、flt3配体(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)的组。在各种实施方式中，这些生长因子的浓度可包括例如约100ng/ml FL、约100ng/ml SCF、约20ng/ml IL-3和约20ng/ml IL-6。在其它实施方式中，生长因子包括早期的细胞因子/生长因子/生长因子，例如EPO、TPO、FL、VEGF、BMP(如BMP2、BMP4和BMP7)、GM-CSF、G-CSF和HOXB4。在一些实施方式中，在甲基纤维素培养基的存在下培养造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))，以促进成血管细胞生长。在其它实施方式中，这些生长因子可包括如下的浓度：约200ng/ml-500ng/ml FL、约20ng/ml-1000ng/ml SCF、约5ng/ml-500ng/ml IL-3和约5ng/ml-500ng/ml IL-6。在不同的实施方式中，获得一批量的HSPC包括对表达CD34+和/或CD90+的细胞进行分离。在不同的实施方式中，至少48小时的时间段包括72小时、96小时、120小时、144小时或168小时。

本文进一步描述了治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：(a)从来自需要治疗疾病或病症的受试者的脐带血、骨髓或外周血获得一批量的造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))；(b)通过在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下进行培养，对所述量的造血细胞进行扩增，其中所述至少一种小分子和至少一种生长因子能够扩增所述造血细胞；以及(c)向受试者给予所述造血细胞。在不同的实施方式中，所述造血细胞与受试者免疫相容。在一些实施方式中，在向受试者中给予所述造血细胞之前，使所述细胞与一种或多种载体接触，各载体编码至少一种选择盒和/或至少一种核酸酶，以及选择表达所述选择盒和所述核酸酶的造血细胞，其中表达所述选择盒和所述核酸酶的细胞包含经编辑的基因组。在一些实施方式中，造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))获得自需要治疗的受试者的家族亲属。

在不同的实施方式中，造血细胞是造血干细胞(HSC)。在不同的实施方式中，造血细胞是造血干祖细胞(HSPC)。任选地，HSPC是表达CD34+和/或CD90+的细胞。在其它实施方式中，造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))表达一种或多种标志物，包括Lin-、CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-。在其它实施方式中，造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))表达HOXB4、BMI1、GATA2、p21、p27、c-myc和MPO。

在不同的实施方式中，至少一种小分子是组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)。在不同的实施方式中，HDACi包括选自下组的一种或多种HDACi：曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA和HDAC6抑制剂161。在不同的实施方式中，至少一种小分子包括选自下组的一种或多种小分子：5-氮杂胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ、dmPGE2和UM171。在各种实施方式中，这些小分子的浓度可包括(图1中示出了多种实例)：约2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM以上，或约25nM、50nM、100nM、150nM、250nM、500nM以上，或约500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1000nM以上，或约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM以上。在不同的实施方式中，至少一种生长因子包括选自下组的一种或多种生长因子：干细胞因子(SCF)、flt3配体(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)。在各种实施方式中，这些生长因子的浓度可包括例如约100ng/ml FL、约100ng/ml SCF、约20ng/ml IL-3和约20ng/ml IL-6。在其它实施方式中，这些生长因子可包括如下浓度：约200ng/ml-500ng/mlFL、约20ng/ml-1000ng/ml SCF、约5ng/ml-500ng/ml IL-3和约5ng/ml-500ng/ml IL-6。在其它实施方式中，生长因子包括早期的细胞因子/生长因子/生长因子，例如EPO、TPO、FL、VEGF、BMP(如BMP2、BMP4和BMP7)、GM-CSF、G-CSF和HOXB4。在一些实施方式中，在甲基纤维素培养基的存在下培养造血细胞(例如造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC))，以促进成血管细胞生长。在不同的实施方式中，在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下对所述量的造血细胞进行培养，其中所述至少一种小分子和至少一种生长因子用于至少48小时、72小时、96小时、120小时、144小时或168小时的时间段。

实施例

实施例1

CB和PBMC CD34+细胞的分离和离体培养

根据由DF/HCC机构审查委员会设立的规章，从Dana-Faber癌症研究所(Dana-Faber Cancer Institute，DF/HCC；Boston，MA)的细胞操作核心设施(Cell ManipulationCore Facility)获得新鲜的CB集合。在Ficoll-Paque(Stem Cell Technologies，Vancouver，BC，加拿大)上通过密度离心对CB细胞进行分离，并使用CD34阳性细胞分离试剂盒(Stem Cell Technologies)对该细胞进行富集。CD34+细胞纯度的范围为60％至90％。将细胞分配为2×10⁴/孔，并在含有30％胎牛血清(FBS；GIBCO)的IMDM中孵育，所述胎牛血清补充有CC100(SCF、FL、IL3和IL6；Stem Cell Technologies)。

除非另有说明，贯穿所描述的方法，适当时将结果表示为平均值±SDV。使用学生t检验评价统计学差异，显著性p为0.05以下。

实施例2

CB CD3+细胞的CFU分析

将H4434(Stem Cell Technologies)培养基的试管在4℃的冰箱中解冻过夜。第二天早晨，以所需的终浓度的10倍准备CB CD34+细胞。制备2000个细胞/0.3mL的细胞悬浮液。将细胞加入至3mL培养基中用于两重复培养。使用连接至3cc注射器的16号平端针，将细胞和培养基分配到培养皿中。各个35mm培养皿分配1.1mL细胞。将两个培养皿放置于100mm的有盖培养皿中，另外放入含有3mL无菌水的第三个无盖的35mm培养皿。然后将这3个培养皿均覆盖在所述的100mm的有盖培养皿中。将细胞在37℃以及5％CO₂和≥95％湿度下孵育14天-16天。以亮视野观察BFU-E、CFU-GM和CFU-混合集落。在显微镜下对CFU进行计数。

实施例3

流式细胞术分析

用如下对细胞进行染色：缀合至藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白(APC)的抗人CD34单克隆抗体；缀合异硫氰酸荧光素(FITC)或APC、CD38APC、CD3三色(TC)、CD19TC、CD11b TC、CD41TC、CD45FITC和小鼠CD45APC的抗人CD90抗体。使用FACS Calibur流式细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA，USA)收集流式细胞术数据，和/或使用FLOWJO软件对其进行分析。

实施例4

标记羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯以评估细胞分裂

将原代CD34+细胞在37℃下用0.5μM的处于PBS中的羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CSFE；Invirtogen，NY，USA)标记10分钟。培养9天后，将细胞用CD34PE标记，并使用FACS Calibur流式细胞仪对CSFE的荧光强度的进行性下降进行分析。

实施例5

NSG小鼠中的CD34+细胞的植入

将NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ，The Jackson Laboratory，ME，USA)小鼠在波士顿儿童医院动物设施中饲养和维持。所有动物工作均已根据10-101832协议下的IACUC的规章批准并完成。通过尾静脉，将用野生型肽和混杂肽处理的CB CD34+细胞经静脉注射到亚致死性照射的(220rads)8-16周龄的NSG小鼠中。在照射后24小时内进行植入。在移植后2周和8周监测外周血(PB)嵌合状态。在移植后8周，监测骨髓(BM)嵌合状态。随后使用FITC-缀合的抗人CD45抗体和APC-缀合的抗小鼠CD45抗体(eBiosciences，CA，USA)使这些样品接受流式细胞术分析。按照以下计算人CD45+细胞的百分比：人CD45+细胞％＝人CD45+细胞数/(人CD45+细胞数+小鼠CD45+细胞数)×100。将0.1％人CD45+细胞的阈值设定为阳性植入的可靠预测值。

实施例6

实时PCR

本发明人使用TRIzol(Invitrogen)从用野生型或混杂的肽处理的细胞中制备RNA。本发明人使用iScript cDNA Synthesis试剂盒(Bio-Rad，CA，USA)合成cDNA。为了定量mRNA表达的水平，本发明人使用具有SYBER Green(Bio-Rad)的iScript one-step RT-PCR试剂盒进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，并通过使用SYBR green技术(ABI，Foster City，CA，USA)对PCR产物进行检测。将GAPDH用作内源对照。所有试样以两重复进行操作。热循环仪条件为：50℃2分钟，95℃10分钟，95℃0.30分钟进行45个循环，以及60℃1分钟。结果作为循环阈值(Ct)获得，并将其归一化为用GAPDH进行的基因表达。使用CFX Manager软件(Bio-Rad)基于2-ΔΔCT方法来分析数据。对于QPCR引物，参见表1。

表1.QPCR引物

实施例7

慢病毒生产和转导

通过用慢病毒载体pLL3.7、pHR'8.9ΔVPR和pCMV-VSVG对293T细胞进行瞬时共转染来产生慢病毒颗粒。在含有慢病毒颗粒和8μg/ml鱼精蛋白的培养基中感染CD34+细胞。然后将培养基移除并用新鲜培养基代替。

实施例8

包括表观遗传修饰因子的化合物的筛选，所述化合物增多CD34+CD90+细胞

据报道一些化合物(如TSA、具有5氮杂胞苷的TSA、丙戊酸、Chlamydocin和Trapoxin)扩增CD34+CD90+细胞。为了识别或确认扩增CD34+CD90+细胞的分子，本发明人使用来自PBSC的原代人CD34+细胞开发了分析法，并在培养4天或5天后通过高通量流式细胞术评价了CD34和CD90表达。

使用这一分析法，本发明人对FDA批准的446种化合物和14种小分子药物进行筛选，包括表2所示的一组表观遗传修饰因子。将人PBSC CD34+细胞进行纯化并在具有胎牛血清(FBS；GIBCO；终浓度为30％)和CC100(含有如下的CD34维持培养基；Stem CellTechnologies：干细胞因子，SCF；Flt3配体，FL；白介素-3，IL3；以及白介素-6，IL6)的IMDM中进行培养。在图8中总结了离体培养方法。

观察到与经DMSO处理的CD34+细胞相比，TSA、DLS3、MS275、SAHA、UNC0638或SR1扩增了CD34+CD90+群(图1A、图9和图10)，而FDA批准的446种化合物的调查针对这一目的未产生潜在命中(数据未示出)。

由于这些化合物的大多数影响后代的总细胞数，对CD34+CD90+细胞的绝对数进行计算。TSA、MS275和JY1扩增的CD34+CD90+细胞的绝对数超过了其它化合物扩增的该细胞的绝对数(图1B)。

这些发现表明表观遗传修饰因子(特别是除HDAC6抑制剂之外的组合蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi))优先扩增CD34+CD90+细胞，而FDA批准的446种化合物并未扩增CD34+CD90+细胞。

表2.分析法中的表观遗传修饰因子

名称	功能
		TSA	泛HDAC抑制剂
DLSJ	HDAC112抑制剂
		MS275	HDAC113抑制剂
SAHA	泛HADC抑制剂：HDAC6
		161	HDAC6抑制剂
5-氮杂胞苷	低甲基化剂
		JQ1-S	BET抑制剂
JY1	DOT1L抑制剂
		UNC0638	H3K9me2甲基转移酶抑制剂
JMJDJ	组蛋白HJ Lys 27(H3K27)脱甲基酶抑制剂
		JQ-EZ-05	EZH2抑制剂；H3K27me3甲基转移酶抑制剂
SR1	芳烃受体的拮抗剂
		DBZ	γ分泌酶抑制剂
dmPGE2	稳定的前列腺素E2(PGE2)衍生物

实施例9

在离体培养期间，PBMC CD34+细胞中的TSA或MS-275使CD34+CD90+细胞优先扩增

为了进一步研究TSA或MS-275在PBSC CD34+细胞扩增中的作用，如图11、图12B和图12F所示，与经DMSO处理的细胞相比，TSA处理使CD34+CD90+细胞在第3天、第5天和第7天优先扩增(p<0.05)。

与经DMSO处理的细胞相比，在经MS275处理的细胞中看到类似的结果(p<0.05)。相反，用TSA和MS275的生长率比起用DMSO的生长率低约2倍(图3A；DMSO 10.7×10⁴±1.12vsTSA 28.3×10⁴±0.49；p<0.05，vs MS275 16.7×10⁴±1.06)。通过定量CD34+(图11、图12C和图12G)和CD34+CD90+(图11、图12D和图12H)亚群的绝对细胞数，观察到通过TSA或MS275处理的CD34+CD90+细胞的绝对数从第5天至第7天增加。

为了评估经TSA处理的培养物中观察到的较低的总的有核细胞数是否归因于分化或增殖方面的延迟，本发明人进行了细胞-分裂-监测染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)分析、荧光细胞质染色，这使得在体外培养后能够对CD34+细胞的细胞分裂进行计数。虽然66.0％的未处理的CD34+细胞在第5天时分裂至少超过4次，但仅9.02％的经TSA处理的细胞经历了类似数量的细胞分裂(图3B)。在第7天观察到类似的结果(图3B)。

然后，本发明人研究了TSA处理是否如表面标志物所评估的通过自我更新增殖使CD34+CD90+细胞增加。使用CD34+CD90-细胞作为对照群，在体外培养5天和7天后，使用CSFE分析法对TSA处理时的CD34+CD90+细胞的细胞分裂概况进行分析。有趣的是，虽然31.4％的CD34+CD90+细胞分裂较少，但在第5天时约66.7％的细胞比起CD34+CD90-细胞分裂得更多。在第7天观察到类似的结果(图3D)。

为了研究在经TSA处理的培养物中观察到的较低的总的有核细胞数是否可能归因于细胞凋亡，在第3天、第5天和第7天对经TSA、MS275或DMSO处理的细胞进行膜联蛋白V染色。观察到50nM TSA和500nM MS275并没有显著增加凋亡的细胞(图3E)。

总之，经TSA处理的CD34细胞的较低扩增率似乎是起因于较慢的细胞分裂，而非起因于细胞凋亡的诱发。所述数据表明，TSA处理诱发CD34+CD90+细胞的自我更新增殖，虽然细胞分裂速率较慢且分化趋势较弱。

实施例10

用TSA或MS-275处理CB CD34+细胞增强了体内骨髓再生潜能

由于CD34+CD90+细胞是具有严重的联合免疫缺陷(SCID)再增殖活性(SRA)的CD34+亚群，本发明人接下来测试了通过TSA或MS-275处理介导的此类细胞的优先扩增是否能够产生增加的体外造血分化/增殖和SRA体内植入。本发明人首先用TSA或MS-275处理对PBMCCD34+细胞进行了处理，接着对甲基纤维素中的体外集落形成进行了评估。涂布后8天，衍生自CFU-GM的大多数的经TSA或MS275处理的集落比起对照组大得多(图13A)。为了对大集落和小集落定量，本发明人分别将大集落分类为>50聚类，并将小集落分类为5-50聚类。然而经细胞因子/生长因子处理的细胞产生高比例的小集落，经TSA处理的细胞主要产生大集落(图13B)。涂布后14天，与其它对照组相比，PBMC CD34+细胞的处理产生集落形成细胞(CFC)含量的类似分布(图13C)，其中尽管BFU-E的百分比略微增加，大多数集落仍是CFUGM。

在用细胞因子/生长因子以及用单独的细胞因子或TSA对CB CD34+细胞进行培养期间，从第5天到第7天总细胞数显著增加。基于上述的体外表型分析，在用单独的细胞因子或TSA培养5天或7天后，本发明人将细胞移植到NSG小鼠中，以评价作为增强的HSPC功能的量度的免疫缺陷(SCID)再增殖活性(SRA)。由于Vanheuden等报道了通过体外培养后的CD34+CD38CD90+CD45RA-细胞介导了严重的联合免疫缺陷(SCID)再增殖活性(rSRA)，本发明人在移植2周后首次分析了外周血(PB)中的SRA活性。本发明人观察到，与用细胞因子处理的CB CD34+细胞的后代相比，用TSA处理的2×10⁴个CB CD34+细胞的第5天的后代移植的小鼠具有更高的人CD45+植入百分比(通过≥0.1％人CD45+细胞定义)(图4)。

实施例11

用TSA处理PBMC CD34+细胞增加了基因插入方法的效率

接下来，本发明人研究了通过TSA进行的CD34+CD90+细胞的扩增是否能够影响慢病毒转导效率。将编码绿色荧光蛋白(GFP)的转移载体用于评价慢病毒转导。用或不用TSA对PBMC CD34+细胞培养3天，接着用鱼精蛋白进行两次48小时的慢病毒转导(图15A)。

观察到用TSA处理的CD34+GFP+细胞的百分比比起未处理的细胞的百分比更高(图15B和图15C)。有趣的是，与CD34+CD90+细胞相比，CD34+CD90-细胞中的GFP阳性细胞的百分比更高(图15B和图15D)。这些数据表明TSA促进了离体CD34+细胞的慢病毒转导。

实施例12

用TSA处理PBSC CD34+细胞调节干细胞相关基因的表达

接下来，为了研究对TSA处理后观察到的功能性HSC和HSPC扩增负责的分子机制，本发明人使用实时PCR检查了参与干细胞的自我更新或分化的许多基因的表达水平。

本发明人在用TSA处理的细胞中观察到GATA1、GATA2、HOXA9、HOXB4、PTEN、SALL4、p53、TPO和CD34基因的更高水平的转录物(图6；p<0.05)，表明这些因子在PBSC CD34+细胞中有助于增强的增高的自我更新性质。

实施例13

讨论

将在异种移植中起始植入的造血细胞在操作上被定义为SCID再增殖细胞(SRC)。这一模型为测量人HSC活性提供了体内直接定量分析，且Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-脐带血部分在SRC活性方面得到增强。在其它方面，据报道新鲜干细胞在培养后失去自我更新功能，而CD34+CD38-细胞方面的增加与SRC无关。因此，其它HSC标志物(如CD90)已被用于确认培养物中的原始HSPC候选亚群。

在用细胞因子/生长因子进行的CD34+细胞体外培养期间，SCID再增殖细胞活性与分裂不超过2次的CD90+细胞相关。多个研究人员报道，原始HSC比起相对定向的细胞分裂更慢。虽然HSC在体内缓慢循环，但在各种细胞因子组合的存在下，CD34+细胞快速循环并在培养中经历重复的细胞分裂，通常导致产生大量的分化的祖细胞，但骨髓再增殖细胞的数量下降。

有趣的是，即使已在细胞因子/生长因子的存在下在培养中经历了5到10次细胞分裂后，暴露至表观遗传调节剂(例如5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5azaD)和曲古抑菌素(TSA))的脐带血CD34+CD90+细胞维持了可分析的SRC，并具有人的多系造血细胞植入的证据。这表明在合适的离体培养条件下，人们或许能够扩增HSC和/或HSPC而不牺牲它们的干细胞特性。多个报道进一步显示出用HDAC抑制剂处理脐带血CD34+细胞诱发了组蛋白H4乙酰化和自我更新基因的表达以及CD34+CD90+群的扩增。

本发明人观察到，尽管与对照相比总的有核细胞以及CD34+细胞的扩增率较低，TSA使培养中的CD34+CD90+细胞缓慢扩增，并增加了SRA。CD34+CD90+细胞的扩增和缓慢分裂的这些特征与原始HSPC的固有特性一致。据报道通过在培养中的CD34+CD38-CD90+CD45RA-细胞介导了快速的严重的联合免疫缺陷(SCID)再增殖活性(rSRA)，并且长期SRC(LT-SRC)限于处于培养细胞中的CD34+CD90+细胞。虽然为了了解HSPC自我更新、较缓慢的细胞分裂和HDAC之间的关系需要进一步的研究，但是所描述的数据表明PBMC CD34+处理的HDACi处理可使原始HSPC扩增以及CD90共表达。

在对肽介导的HSPC扩增的潜在机制的探寻中，本发明人已对基因表达谱进行了检查。PBMC CD34+细胞中的多种关键的HSPC功能相关基因的表达受到TSA处理的影响，而GATA-1驱使造血祖细胞分化为血细胞谱系的亚群，GATA-2主要在造血干细胞和早期祖细胞中表达并在自我更新中发挥关键作用。这可能是增加HSPC样特性的影响因素之一。过表达HOXB4(基因同源框家族的成员)已经成为HSPC扩增的有效刺激物。HOXB4转录物在具有TSA的CD34+细胞中的更强表达与HSPC自我更新中提出的作用一致。本发明人还将其基因表达谱与从用5Aaza/TSA进行的处理获得的基因表达谱进行了比较。据报道在用5Aza/TSA处理的CB CD34+细胞中，HOXB4、BMI1、GATA2、p21、p27、c-myc和MPO的表达水平增加。不受任何特定的限制，当在HDACi和细胞因子/生长因子的组合下进行离体培养时，转录因子介导CD34+CD90+扩增是可能的(图5)。

上述多种方法和技术提供了实施本发明的多种方式。当然，将理解的是，根据本文所述的任何特定实施方式，并非所述的所有目标和优点均必需实现。因此，例如，本领域技术人员将认识到，可通过实现或优化如本文教导的一个优点或一组优点而不必实现如本文教导或暗示的其它目标或优点的方式来实施本方法。本文提及了多种有利和不太有利的替代方式。将理解的是，一些优选的实施方式具体包括一种、其它或多种有利的特征，而其它的实施方式则具体地排除一种、其它或多种不利的特征，然而还有其它实施方式通过包括一种、其它或多种有利特征而特定地缓和当前的不太有利特征。

此外，技术人员将认识到来自不同实施方式的多种特征的适用性。相似地，本领域的普通技术人员能够将上述公开的多种要素、特征和步骤以及各此类要素、特征或步骤各自的其它已知等同物混合并匹配，以根据本文所述的原理实施方法。在多种要素、特征和步骤之中，一些将被具体地包括在不同的实施方式之中，而其它的则被具体地排除在不同的实施方式之外。

虽然本发明已在一些实施方式和实施例的上下文中进行了公开，但是本领域的技术人员将会理解的是，本发明的实施方式延伸到具体公开的实施方式之外，并延伸至其它替代性实施方式和/或用途、以及其修改物和等同物。

在本发明的实施方式中已经公开了许多变化和替代性要素。进一步的变化和替代性要素对于本领域技术人员来说将是显而易见的。其中，这些变化为但不限于扩增造血细胞的方法、修饰所述技术中使用的造血细胞的方法、通过上述技术产生的造血细胞的组合、与本发明的教导相关的疾病和/或病症的治疗、其中所使用的技术方案的用途和组成和技术以及通过本发明的教导产生的产物的具体用途。本发明的各种实施方式可特定地包括或排除这些变化或要素中的任一者。

在一些实施方式中，用于描述和请求保护本发明的一些实施方式的表示成分、特性(如浓度、反应条件等)的量的数字将被理解为在一些示例中通过术语“约”修饰。因此，在一些实施方式中，在书面描述和所附的权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可根据具体实施方式所寻求获得的期望特性而变化。在一些实施方式中，数值参数应当根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明的一些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在特定实施例中尽可能精确地报道了所阐述的数值。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可能包含一些误差，该误差必然地由它们各自的测试测量中发现的标准偏差产生。

在一些实施方式中，在描述本发明特定实施方式的上下文中(尤其是在如下的一些权利要求的上下文中)使用的术语“一”、“一个”、“所述/该”和类似的提法可被解释为涵盖单数和复数。本文列举的值的范围仅意在用作单独提及的落在该范围内的各单独值的速记方法。除非本文另外指明，否则每个单独的值均被并入本说明书，就像在本文中单独列举一样。除非本文另外指明或上下文明显冲突，否则本文所述的所有方法可以按任何合适的顺序实施。关于本文的一些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意在更好地阐明本发明，并不对本发明另外保护的范围造成限制。本说明书中的语言不应解释为是表示实践本发明所必需的任何未请求保护的要素。

本文所公开的本发明的替代性要素或实施方式的分组不应解释为限制。各组成员可单独或者与本文出现的该组的其它成员或其它要素任意组合而被提及和请求保护。出于方便和/或可专利性的原因，组的一个或多个成员可被包含在组中或从组中删除。当任何此类包含或删除发生时，认为本文的说明书包含经修饰的组，从而实现所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。

本文对这一发明的优选实施方式进行了描述，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在本领域的普通技术人员阅读上述说明时，这些优选实施方式的变型将变得显而易见。在考虑之列的是，技术人员可在适当时采用此类变型，并且本发明可按本文具体描述之外的方式加以实践。因此，如可适用的法律所允许的，这一发明的许多实施方式包括所附权利要求书中列出的主题的所有修改物和等同物。此外，除非在本文中另外指明，或除非与上下文明显冲突，本发明涵盖上述要素在其所有可能的变型中的任何组合。

此外，在贯穿这一说明书中对专利和印刷出版物进行了许多参考。以引用的方式将上述引用的参考文献和印刷出版物中的各自以其整体并入本文。

最后，将理解的是，本文所公开的发明的实施方式是对本发明的原理的说明。可采用的其它修改形式可在本发明的范围内。因此，举例来说，而非加以限制，本发明的实施方式的替代构造可根据本文的教导而使用。因此，本发明的实施方式不限于如精确地示出和描述的内容。

序列表

<110> THE BRIGHAM AND WOMEN'S HOSPITAL, INC.

DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC.

NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE

CHAI, Li

FEDERATION, Alexander

TATETSU, Hiro

TENEN, Daniel G.

BRADNER, James

<120> 用于人造血干/祖细胞的离体扩增的组合物和方法

<130> 043214-081011

<150> 61/970,787

<151> 2014-03-26

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

agtacctgaa ccggcacct 19

<210> 2

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<212> DNA

<213> 智人

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cagccaggag aaatcaaaca g 21

<210> 3

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<212> DNA

<213> 智人

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gcgctttgct tgctgagttt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 智人

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ctcctcctgc ttgtgacctc 20

<210> 6

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cccaagctaa agtccacagc 20

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caaacacgca cctcaaagc 19

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gaggcgtggc agactatgc 19

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cttgtactcc gtcagcgtga 20

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tggctctaat gaagatagag g 21

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ttccgatcca atctgttctg 20

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acaagatgaa tgggcagaac 20

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tactgacaat cagcgcttc 19

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gatacccacc tatccctcct atgtg 25

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gtggcaccac agttgacaca ctc 23

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tcccactccg cgtgcaaaga 20

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gccggcgtaa ttggggttta 20

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gtcttgtacc cttgtgcctc 20

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ggtagaaatc tgtcatgctg g 21

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accctcatcc aacccttc 18

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gtcaatgcca ccttccag 18

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tttaattggg tctcaggcaa actct 25

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ccgtctgaaa cattttcttc tgttc 25

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tcctcggatt ctctgctctc 20

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cttgttcctc ctcagagtcg 20

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tctccttcgc gggcttg 17

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ccgacagcgg ttgaggtt 18

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tgttacaggc gtgcaaaatg gaagg 25

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ctcgtgcgtt tggcgttggt ataga 25

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<213> 智人

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tggaaggact catgaccaca 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 32

ttcagctcag ggatgacctt 20

Claims

1.一种扩增造血细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供一批量的造血细胞；以及

(b)在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下对所述量的造血细胞进行培养，其中，所述至少一种小分子和至少一种生长因子能够扩增所述造血细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述造血细胞包括造血干细胞(HSC)。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述造血细胞包括造血干祖细胞(HSPC)。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述造血细胞分离自脐带血。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述造血细胞分离自骨髓。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述造血细胞分离自外周血。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种小分子包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述HDACi包括选自于由曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA和HDAC6抑制剂161所组成的组中的一种或多种HDACi。

9.如权利要求1的方法，其中，所述至少一种小分子包括选自于由5-氮杂胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ、dmPGE2和UM171所组成的组中的一种或多种小分子。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种生长因子包括选自于由干细胞因子(SCF)、flt3配体(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)所组成的组中的一种或多种生长因子。

11.一种基因组编辑的方法，所述方法包括：

(a)提供一批量的造血细胞；以及

(b)在至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下对所述量的造血细胞进行培养；

(c)使所述细胞与一种或多种载体接触，各载体编码至少一种选择盒和/或至少一种核酸酶；以及

(d)选择表达所述选择盒和所述核酸酶的造血细胞，其中，表达所述选择盒和所述核酸酶的细胞包含经编辑的基因组。

12.如权利要求11所述的方法，其中，所述细胞包括造血干细胞(HSC)。

13.如权利要求11所述的方法，其中，所述多能干细胞包括造血干祖细胞(HSPC)。

14.如权利要求11所述的方法，其中，所述至少一种核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)。

15.如权利要求11所述的方法，其中，所述至少一种核酸酶包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。

16.如权利要求11所述的方法，其中，所述至少一种核酸酶包括与CRISPR相关的蛋白(Cas)核酸酶。

17.如权利要求11所述的方法，其中，所述一种或多种载体包括编码至少一种选择盒和至少一种核酸酶的载体。

18.如权利要求11所述的方法，其中，所述量的造血细胞分离自脐带血、骨髓或外周血。

19.如权利要求18所述的方法，所述方法包括：

(e)向受试者给予所选择的造血细胞。

20.如权利要求19所述的方法，其中，所述造血细胞与所述受试者免疫相容。

21.通过权利要求11所述的方法生产的一批量的细胞。

22.一种扩增造血细胞的离体方法，所述方法包括：

(a)从脐带血、骨髓或外周血获得一批量的造血干细胞(HSC)或造血干祖细胞(HSPC)；以及

(b)在如下的至少一种小分子和至少一种生长因子的存在下，通过培养所述HSC或HSPC将所述HSC或HSPC扩增至少48小时的时间段，从而使所述HSC或HSPC得以扩增：

(i)所述至少一种小分子选自于由曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA、HDAC6抑制剂161、5-氮杂胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ、dmPGE2和UM171所组成的组；以及

(ii)所述至少一种生长因子选自于由干细胞因子(SCF)、flt3配体(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)所组成的组。

23.如权利要求22所述的方法，其中，获得一批量的HSPC包括分离表达CD34+和/或CD90+的细胞。

24.如权利要求22所述的方法，其中，所述至少48小时的时间段包括72小时、96小时、120小时、144小时或168小时。