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CN106432644B - 一种亲水型聚合物功能化磁性纳米微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种亲水型聚合物功能化磁性纳米微球及其制备方法和应用 Download PDF

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CN106432644B CN201610844010.2A CN201610844010A CN106432644B CN 106432644 B CN106432644 B CN 106432644B CN 201610844010 A CN201610844010 A CN 201610844010A CN 106432644 B CN106432644 B CN 106432644B
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Abstract

本发明提供一种亲水型聚合物功能化磁性纳米微球及其制备方法和应用，以解决磁性亲水型基质种类少、制备条件苛刻、操作繁琐的问题。本发明解决的技术方案是，该磁性纳米微球是以四氧化三铁为核心，对其表面双键功能化以后，通过沉淀聚合反应，于四氧化三铁表面形成亲水聚合物。该磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：（1）、溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：（2）、磁性纳米微球表面双键修饰：（3）、亲水功能化磁性纳米微球制备:该磁性纳米微球作为吸附剂用于糖肽或糖蛋白的分离富集。本发明组分简单，易于生产，反应条件温和，高效高选择性的分离富集，并可以应用于复杂生物样品中糖肽或糖蛋白的富集，经济和社会效益显著。

Description

一种亲水型聚合物功能化磁性纳米微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药，特别是一种亲水型聚合物功能化磁性纳米微球及其制备方法和应用。
背景技术
糖蛋白在细胞的生理过程中有重要作用，糖蛋白参与细胞的粘连、运转代谢、信号传导、内吞、受体激活等过程，所以对糖蛋白组学的研究有助于探究癌的发生机理，对于癌症的发现、防治有重要意义。以软电离为基础的生物质谱已经成为蛋白组学研究的重要工具，目前shotgun策略是使用最为广泛的蛋白组学分析策略，主要包括：获得生物样品，对生物样品进行提取、标记、酶解、分离富集等，对肽段进行质谱鉴定，获得质谱数据进行分析。尽管质谱技术不断进步，但是在鉴定实际样品中低丰度蛋白、多肽，特别是翻译后修饰的蛋白、多肽还显得不足。低丰度蛋白、多肽不但浓度低，还受到高丰度蛋白、多肽的信号干扰，繁琐的样品处理过程往往会有样品的损失。所以对蛋白酶解样品进行有效的质谱前分离富集是shotgun策略蛋白组学研究的关键。由于复杂的生物样品中，蛋白表达的动态范围非常宽，高丰度非糖基化蛋白的存在会大大抑制低含量的糖基化蛋白的质谱信号，因此对生物样品中糖基化蛋白进行选择性富集分离是糖蛋白组学研究的关键之一。
基于糖基化蛋白的物理化学性质，其富集方法主要由以下几种：（1）凝集素亲和色谱法，（2）亲水色谱法，（3）硼酸亲和色谱法，（4）酰肼化学法。其中凝集素色谱法特异识别某种糖型的糖蛋白、肽，酰肼化学高选择性但反应条件剧烈破环糖链结构，硼酸化学较低选择性和灵敏度，这些因素都限制了它们的广泛应用。基于组分油-水两相分配比不同的亲水色谱，由于其操作简单、广谱富集及良好的质谱兼容性，另外大多数糖肽比非糖肽亲水，已经引起广泛的研究兴趣。通常表面含有羟基、氨基、磺酸等极性基团的基质可以作为亲水色谱的基质，例如琼脂糖、纤维素、多糖与两性离子聚合物已经用于糖肽的分离富集。
近年来，由于功能化磁性材料良好的磁性分离、生物兼容性及较大的结合容量等性能，已经被广泛用于蛋白质组学研究中蛋白、肽段分离富集。对于糖蛋白、肽分离富集，亲水型磁性基质的研究较少。报道的磁性亲水型基质主要是磁核包覆亲水复合物如糖、两性离子聚合物等，但是种类少、制备条件苛刻、操作繁琐等问题有待解决。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之不足，本发明提供一种亲水型聚合物功能化磁性纳米微球及其制备方法和应用，以解决磁性亲水型基质种类少、制备条件苛刻、操作繁琐的问题。
本发明解决的技术方案是，该磁性纳米微球是以四氧化三铁为核心，对其表面双键功能化以后，通过沉淀聚合反应，于四氧化三铁表面形成亲水聚合物。
该磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）、溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.0-3.0g六水合三氯化铁溶解于70-140ml乙二醇，超声5min，得到黄色透明状液体，再加入7.0-8.0g乙酸铵与0.6-1.0g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1h，将所得均匀溶液置于150-190℃油浴中搅拌1-2h，加热至160-200℃，反应12-24h，冷却至室温得颗粒，颗粒依次用无水乙醇和水清洗，于40-60℃下干燥12h得磁性纳米微球；
（2）、磁性纳米微球表面双键修饰：取400-600mg磁性纳米微球分散于50-60ml乙醇、10-12.5ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入0.8-1.0ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml浓氨水，于60℃下反应24h，所得产物用无水乙醇清洗，于40-60℃下干燥12h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）、亲水功能化磁性纳米微球制备:
取50-100mg双键修饰磁性纳米微球分散于30-50ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的体积比为6:4，向混合液中加入200-300mg单体甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、50-75mg交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺和5-10mg引发剂偶氮二异丁腈，超声溶解后放入油浴锅，经20-30min由室温加热至沸腾，蒸馏出20ml溶液停止反应，用磁铁回收微球，依次用乙醇和水洗涤，40-60℃下干燥12h，即得。
该磁性纳米微球作为吸附剂用于糖肽或糖蛋白的分离富集。
本发明组分简单，易于生产，反应条件温和，高效高选择性的分离富集，并可以应用于复杂生物样品中糖肽或糖蛋白的富集，经济和社会效益显著。
附图说明
图1（a）为IgG酶解样品直接上样人血清免疫球蛋白酶解液中糖肽与非糖肽分布图；
图1（b）为IgG酶解样品经亲水磁性纳米微球富集后人血清免疫球蛋白酶解液中糖肽与非糖肽分布图。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式做详细说明，
本发明在具体实施中可由以下实施例给出：
实施例1：该磁性纳米微球是以四氧化三铁为核心，对其表面双键功能化以后，通过沉淀聚合反应，于四氧化三铁表面形成亲水聚合物。
该磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）、溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.70g六水合三氯化铁溶解于140ml乙二醇，超声5min，得到黄色透明状液体，再加入7.70g乙酸铵与0.80g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1h，将所得均匀溶液置于170℃油浴中搅拌1h，加热至200℃，反应16h，冷却至室温得颗粒，颗粒依次用无水乙醇和水各清洗3次，于60℃下干燥12h得磁性纳米微球；
（2）、磁性纳米微球表面双键修饰：取400mg磁性纳米微球分散于50ml乙醇、12.5ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入0.8ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml浓氨水，于60℃下反应24h，所得产物用无水乙醇清洗3次，于50℃下干燥12h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）、亲水功能化磁性纳米微球制备：
取50mg双键修饰磁性纳米微球分散于40ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的体积比为6:4，向混合液中加入200mg单体甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、50mg交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺和5mg引发剂偶氮二异丁腈，超声溶解后放入油浴锅，经20min由室温加热至沸腾，蒸馏出20ml溶液停止反应，用磁铁回收微球，依次用乙醇和水各洗涤3次， 60℃下干燥12h，即得。
该磁性纳米微球作为吸附剂用于糖肽或糖蛋白的分离富集。
实施例2：该磁性纳米微球是以四氧化三铁为核心，对其表面双键功能化以后，通过沉淀聚合反应，于四氧化三铁表面形成亲水聚合物。
该磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）、溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.0g六水合三氯化铁溶解于70ml乙二醇，超声5min，得到黄色透明状液体，再加入7.0g乙酸铵与0.6g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1h，将所得均匀溶液置于150℃油浴中搅拌1h，加热至160℃，反应12h，冷却至室温得颗粒，颗粒依次用无水乙醇和水各清洗3次，于40℃下干燥12h得磁性纳米微球；
（2）、磁性纳米微球表面双键修饰：取400mg磁性纳米微球分散于50ml乙醇、10ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入0.8ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml浓氨水，于60℃下反应24h，所得产物用无水乙醇清洗3次，于40℃下干燥12h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）、亲水功能化磁性纳米微球制备:
取50mg双键修饰磁性纳米微球分散于30ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的体积比为6:4，向混合液中加入200mg单体甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、50mg交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺和5mg引发剂偶氮二异丁腈，超声溶解后放入油浴锅，经20min由室温加热至沸腾，蒸馏出20ml溶液停止反应，用磁铁回收微球，依次用乙醇和水各洗涤3次，40℃下干燥12h，即得。
该磁性纳米微球作为吸附剂用于糖肽或糖蛋白的分离富集。
实施例3：该磁性纳米微球是以四氧化三铁为核心，对其表面双键功能化以后，通过沉淀聚合反应，于四氧化三铁表面形成亲水聚合物。
该磁性纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）、溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取3.0g六水合三氯化铁溶解于140ml乙二醇，超声5min，得到黄色透明状液体，再加入8.0g乙酸铵与1.0g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1h，将所得均匀溶液置于190℃油浴中搅拌2h，加热至200℃，反应24h，冷却至室温得颗粒，颗粒依次用无水乙醇和水各清洗3次，于60℃下干燥12h得磁性纳米微球；
（2）、磁性纳米微球表面双键修饰：取600mg磁性纳米微球分散于60ml乙醇、12.5ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入1.0ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml浓氨水，于60℃下反应24h，所得产物用无水乙醇清洗3次，于60℃下干燥12h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）、亲水功能化磁性纳米微球制备:
取100mg双键修饰磁性纳米微球分散于50ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的体积比为6:4，向混合液中加入300mg单体甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、75mg交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺和10mg引发剂偶氮二异丁腈，超声溶解后放入油浴锅，经30min由室温加热至沸腾，蒸馏出20ml溶液停止反应，用磁铁回收微球，依次用乙醇和水各洗涤3次， 60℃下干燥12h，即得。
该磁性纳米微球作为吸附剂用于糖肽或糖蛋白的分离富集。
在亲水色谱模式下，高有机相上样溶液中亲水纳米微球与蛋白酶解物样品中的糖肽结合，通过洗涤除去非糖肽，而后通过洗脱液洗脱糖肽，所富集到的糖肽经PNGase F酶切去糖链后释放出的肽段或蛋白可直接用质谱进行分析。
透射电镜表征：四氧化三铁磁球相对比较均一，粒径主要分布在200-300 nm，进行亲水功能化后形貌差异显著，磁核表面包亲水覆聚合较均匀，厚度约40 nm左右。
有关试验资料如下：
一、样品的制备：
（1）标准蛋白，称取1 mg标准糖蛋白（IgG），溶解于1 mL 50 mmol L-1碳酸氢铵（pH=8.3）溶液，沸水中加热15 min进行变性，加入20 mmol二硫苏糖醇，60 ℃孵育还原1 h。加入7.2 mg碘代乙酰胺，室温下避光烷基化反应40 min，按酶与蛋白质质量比为1: 40比率加入胰蛋白酶，37 ℃酶解16 h。酶解结束后，分装冻干，-20 ℃冰箱中保存备用。
（2）五种标准混合糖蛋白（IgG, TRF, BF, COV, AGP），各取2 mg混合，首先用含8M 尿素的100 mM 碳酸氢铵缓冲液（pH 8.3）溶解，然后40 mMDTT 在60 ℃时还原1 h，再加入20 mM IAA 室温下避光反应40 min。反应结束后，加入100 mM 碳酸氢铵缓冲液（pH 8.3）将溶液中的尿素浓度稀释至1 M ，随后按照酶和底物的质量比为1:40的比例加入胰蛋白酶，37 ℃下反应16 h 。蛋白酶解液经TFA酸化后除盐，冷冻干燥后置于-20 ℃下保存。
(3) 人血清样品的制备与五种标准混合糖蛋白相同。
二、蛋白样品中糖肽的分离富集
（1）IgG蛋白酶解样品中糖肽富集：称取亲水磁性纳米微球50 µg用上样液(ACN/H2O/TFA, 88 : 11.9 : 0.1, v/v/v)洗涤两次，然后加入200 μL上样液（含有2 µg IgG 酶解液），室温孵育30 min，磁铁回收材料，依次用上样液（100μL）洗涤三次，除去非糖肽异吸附。然后加入20 μL洗脱液(ACN/H2O/TFA, 30 : 69.9 : 0.1, v/v/v)室温孵育10 min，洗脱被吸附糖肽。收集洗脱液用MALDI-TOF MS分析。分析结果：如图1(a)所示，IgG酶解样品直接上样分析，人血清免疫球蛋白酶解液中存在大量非糖肽，糖肽峰质谱信号被高丰度非糖肽峰质谱信号所抑制和掩盖，MALDI-TOF MS质谱图中仅有两个糖肽可以清晰鉴定。用亲水磁性纳米微球富集后如图1(b)，绝大多数非糖肽信号消除，糖肽信号显著增强。
（2）用于富集由五个标准蛋白酶解组成半复杂样品，操作流程同标准蛋白，富集后样品经过去乙酰化，上样10µg用nano LC-MS/MS进行分析。数据通过UniProt数据库匹配筛选。五个蛋白总共23个N糖基化位点鉴定，亲水磁球富集后鉴定到所有特征N糖基化位点中的17个，五个目标糖蛋白均被鉴定，鉴定到糖基化位点覆盖了绝大多数特征位点。以上结果再次证明亲水磁性纳米微球对糖肽优良的富集能力。
（3）把亲水磁球用于人血清中N糖基化蛋白组学分析。将1µL血清用亲水磁球富集后，用PNGase F酶切除糖链后，冻干后用0.1% FA复溶，用nano LC-MS/MS分析。质谱数据进行Uniprot数据库检索，根据肽段序列匹配鉴别N糖基化肽段，若肽段序列为NXS/T且X不为脯氨酸，则认证为N糖基化肽段。三次实验重复总共鉴定到347个N糖基化位点、414条糖肽和159个糖蛋白。
本发明具有如下优点：
(1)采用蒸馏沉淀聚合以甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱两性离子为单体制备亲水型磁性纳米微球，制备方法简单，亲水磁性纳米微球复合物呈规则的核壳结构，且具有良好的亲水性，水接触角为31度。
(2)甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱已被大量文献证实具有良好的生物兼容性，所以本发明所制备的亲水型聚合物功能化磁性纳米微球具有良好的生物兼容性。
(3)磁性纳米微球的超顺磁性使得材料在外磁场作用下容易从溶液中分离出来，磁场撤销后容易分散开，因而操作简单，操作过程绿色环保，而且可以减少离心等前处理步骤带来的样品损失。
(4）磁性纳米微球有较大的比表面积，且亲水复合物呈规则核壳结构，使得磁性亲水纳米微球具备了高效的富集能力，对富集糖肽有良好的选择性、高灵敏度，对糖肽的富集容量为40µg mg-1。

Claims (5)

1.一种亲水型聚合物功能化磁性纳米微球的制备方法，其特征是：所述的磁性纳米微球是以四氧化三铁为核心，对其表面双键功能化以后，通过沉淀聚合反应，于四氧化三铁表面形成亲水聚合物，其制备方法包括以下步骤：
（1）、溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.0-3.0g六水合三氯化铁溶解于70-140ml乙二醇，超声5min，得到黄色透明状液体，再加入7.0-8.0g乙酸铵与0.6-1.0g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1h，将所得均匀溶液置于150-190℃油浴中搅拌1-2h，加热至160-200℃，反应12-24h，冷却至室温得颗粒，颗粒依次用无水乙醇和水清洗，于40-60℃下干燥12h得磁性纳米微球；
（2）、磁性纳米微球表面双键修饰：取400-600mg磁性纳米微球分散于50-60ml乙醇、10-12.5ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入0.8-1.0ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml浓氨水，于60℃下反应24h，所得产物用无水乙醇清洗，于40-60℃下干燥12h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）、亲水功能化磁性纳米微球制备:
取50-100mg双键修饰磁性纳米微球分散于30-50ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的体积比为6:4，向混合液中加入200-300mg单体甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、50-75mg交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺和5-10mg引发剂偶氮二异丁腈，超声溶解后放入油浴锅，经20-30min由室温加热至沸腾，蒸馏出20ml溶液停止反应，用磁铁回收微球，依次用乙醇和水洗涤，40-60℃下干燥12h，即得。
2.根据权利要求1所述的亲水型聚合物功能化磁性纳米微球的制备方法，其特征是：包括以下步骤：
（1）、溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.70g六水合三氯化铁溶解于140ml乙二醇，超声5min，得到黄色透明状液体，再加入7.70g乙酸铵与0.80g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1h，将所得均匀溶液置于170℃油浴中搅拌1h，加热至200℃，反应16h，冷却至室温得颗粒，颗粒依次用无水乙醇和水各清洗3次，于60℃下干燥12h得磁性纳米微球；
（2）、磁性纳米微球表面双键修饰：取400mg磁性纳米微球分散于50ml乙醇、12.5ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入0.8ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml浓氨水，于60℃下反应24h，所得产物用无水乙醇清洗3次，于50℃下干燥12h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）、亲水功能化磁性纳米微球制备：
取50mg双键修饰磁性纳米微球分散于40ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的体积比为6:4，向混合液中加入200mg单体甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、50mg交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺和5mg引发剂偶氮二异丁腈，超声溶解后放入油浴锅，经20min由室温加热至沸腾，蒸馏出20ml溶液停止反应，用磁铁回收微球，依次用乙醇和水各洗涤3次， 60℃下干燥12h，即得。
3.根据权利要求1所述的亲水型聚合物功能化磁性纳米微球的制备方法，其特征是：包括以下步骤：
（1）、溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.0g六水合三氯化铁溶解于70ml乙二醇，超声5min，得到黄色透明状液体，再加入7.0g乙酸铵与0.6g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1h，将所得均匀溶液置于150℃油浴中搅拌1h，加热至160℃，反应12h，冷却至室温得颗粒，颗粒依次用无水乙醇和水各清洗3次，于40℃下干燥12h得磁性纳米微球；
（2）、磁性纳米微球表面双键修饰：取400mg磁性纳米微球分散于50ml乙醇、10ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入0.8ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml浓氨水，于60℃下反应24h，所得产物用无水乙醇清洗3次，于40℃下干燥12h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）、亲水功能化磁性纳米微球制备:
取50mg双键修饰磁性纳米微球分散于30ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的体积比为6:4，向混合液中加入200mg单体甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、50mg交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺和5mg引发剂偶氮二异丁腈，超声溶解后放入油浴锅，经20min由室温加热至沸腾，蒸馏出20ml溶液停止反应，用磁铁回收微球，依次用乙醇和水各洗涤3次，40℃下干燥12h，即得。
4.根据权利要求1所述的亲水型聚合物功能化磁性纳米微球的制备方法，其特征是：包括以下步骤：
（1）、溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取3.0g六水合三氯化铁溶解于140ml乙二醇，超声5min，得到黄色透明状液体，再加入8.0g乙酸铵与1.0g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1h，将所得均匀溶液置于190℃油浴中搅拌2h，加热至200℃，反应24h，冷却至室温得颗粒，颗粒依次用无水乙醇和水各清洗3次，于60℃下干燥12h得磁性纳米微球；
（2）、磁性纳米微球表面双键修饰：取600mg磁性纳米微球分散于60ml乙醇、12.5ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入1.0ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml浓氨水，于60℃下反应24h，所得产物用无水乙醇清洗3次，于60℃下干燥12h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）、亲水功能化磁性纳米微球制备:
取100mg双键修饰磁性纳米微球分散于50ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的体积比为6:4，向混合液中加入300mg单体甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、75mg交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺和10mg引发剂偶氮二异丁腈，超声溶解后放入油浴锅，经30min由室温加热至沸腾，蒸馏出20ml溶液停止反应，用磁铁回收微球，依次用乙醇和水各洗涤3次， 60℃下干燥12h，即得。
5.权利要求1或2-4任一项所述方法制备的亲水型聚合物功能化磁性纳米微球在糖肽或糖蛋白的分离富集中的应用。
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