CN106421806A - 一种逐级响应纳米自组装树枝状前药及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种逐级响应纳米自组装树枝状前药及制备方法和应用，能够逐级对体内多重生物学信号响应，引起前药生物学功能的改变和抗肿瘤药物的释放。树枝状前药是以多肽为骨架的双亲性树状大分子，通过环境响应的化学键将亲水端、疏水端以及树状分子骨架连接，其中疏水端为疏水药物，通过敏感键将其与树状分子骨架连接。本发明利用自组装纳米前药克服抗肿瘤药物递送过程中的多重生理屏障，实现药物的高效递送，同时能够避免外排蛋白的识别，实现肿瘤多药耐药的逆转。

Description

一种逐级响应纳米自组装树枝状前药及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物及其制备方法，特别是通过自组装构建的逐级响应的纳米前药组装体制备方法及其应用。

背景技术

目前，抗肿瘤药物在体内递送过程中面临着多重的生理屏障，例如，在血液循环过程中面临被内皮网状系统清除的可能；通过血管进入肿瘤组织后由于肿瘤组织间质压较高，阻碍药物向肿瘤深处的渗透；进入细胞时，细胞膜会阻碍药物的摄取；对于多药耐药细胞，药物进入细胞后，细胞表面的外排蛋白会将药物排出，降低药效，等等。因此逐级克服这些生理屏障成为化疗药物系统传递亟待解决的问题。目前，树枝状超分子组装体在纳米材料和纳米药物方面引起了广泛的关注，其机械结构稳定、表面官能团丰富，生物相容性良好。我们在树状大分子组装基元中引入肿瘤外基质、肿瘤细胞质和溶酶体中逐级敏感的化学键，构建逐级响应树枝状纳米组装体，希望能够通过这种分子设计，攻克多重生理屏障，实现药物的高效递送。

发明内容

本发明的目的是克服现有纳米载体难以突破生理屏障的缺陷，提供一种在系统递送过程中能够逐级响应，克服生理屏障的一种逐级响应纳米自组装树枝状前药(即纳米前药组装体)。

本发明的目的是这样实现的：一种逐级响应纳米自组装树枝状前药，前药由双亲性肽类树状分子构成，其亲水片段通过肿瘤微环境响应的敏感多肽或敏感键与树状分子骨架连接，其疏水片段通过溶酶体内响应的敏感键或多肽将抗肿瘤药物与树状分子骨架偶联；亲水片段与疏水片段通过肿瘤细胞质内响应的敏感键或多肽连接。

上述前药的分子结构式如下：

其中，R₁代表肿瘤微环境响应的多肽或敏感键，选自MMP-2敏感肽(多肽序列为：GPLGLAG，GPQGIWGQ或GPLGIAGD)或肿瘤微环境弱酸性敏感基团，选自2,3-二甲基马来酸酐、2,2,3,3-四甲基马来酸酐；

R₂代表肿瘤细胞质中响应的多肽或敏感键，选自凋亡蛋白(caspase-3/7)敏感多肽(DEVD)或GSH敏感键(二硫键或二硒键)；

R₃代表溶酶体中响应的多肽或敏感键，选自酯键、组织蛋白酶敏感多肽(GFLA)或溶酶体pH 5.0环境可断裂的腙键；抗肿瘤药物Drug偶联在R3上。

上述前药为通过自组装形成100-200nm的粒子；所述抗肿瘤药物Drug选自盐酸阿霉素、喜树碱或紫杉醇。

本发明的另一目的是提供一种逐级响应纳米自组装树枝状前药的制备方法。

本发明的另一目的是这样实现的：一种逐级响应纳米自组装树枝状前药的制备方法，包括以下制备步骤：

1)制备双亲性肽类树状前药分子，它由抗肿瘤药物偶联在双亲性肽类树状分子的化学键上组成；

2)将一定浓度的亲性肽类树状前药分子溶解于良溶剂中，在超声作用下将上述溶液滴入去离子水中，通过亲疏水作用进行自组装，构建逐级响应的粒径100～200nm的纳米粒子；

3)利用透析方法纯化，然后冷冻干燥得到纳米粒子的前药。

上述步骤1)的具体制备方法为：

a)对氨基酸进行保护：根据所要制备肽类树状大分子支化单元的不同对氨基或联氨进行保护；

b)制备二代肽类树状分子：按照比例称取芴甲氧羰基(Fmoc)保护的谷氨酸，上述a)中氨基含有保护基团的谷氨酸(3倍当量)、缩合剂(3倍当量)、催化剂(3倍当量)和有机碱(12倍当量)，氮气保护及0℃条件下加入溶剂反应；室温下反应，反应结束后，所得溶液通过洗涤，干燥，减压浓缩，利用柱层析得到带有保护基团的二代肽类树状分子；

c)脱保护：精确称取二代肽类树状大分子，加入脱保护试剂(40倍当量)及溶剂，在氮气保护下反应12h，减压浓缩，通过沉淀，获得二代肽类树状分子；

d)抗肿瘤药物的偶联：将上述二代肽类树状分子和抗肿瘤药物在氮气保护下加入溶剂溶解，在催化剂下反应，随后加入蒸馏水溶解，最后经冷却冻干燥制得成品。

上述抗肿瘤药物选自盐酸阿霉素、喜树碱或紫杉醇；所述溶剂为甲醇，所述催化剂为冰醋酸。

本发明的再一目的是提供上述前药的应用。

本发明的再一目的是这样实现的：一种逐级响应纳米自组装树枝状前药的应用，前药在肿瘤外基质高表达的酶(如金属基质蛋白酶(MMPs))或特定的理化环境(如弱酸性环境、低氧等)的作用下能够断裂脱去亲水端的聚乙二醇。

上述前药在肿瘤细胞质内酶(如凋亡蛋白)或特定理化环境(如高浓度的GSH)作用下能够断裂，引起组装体的崩解。

上述前药在肿瘤细胞溶酶体内酶(如组织蛋白酶)或特定理化环境(如pH 5.0)作用下能够断裂释放抗肿瘤原药(如阿霉素(DOX)、喜树碱和紫杉醇等)。

本发明的有益效果：本发明在双亲性树状大分子中引入环境响应的化学键或酶敏感的多肽，利用化学键将药物连接在双亲性树状大分子的疏水端，通过自组装构建逐级响应的纳米前药组装体。

1、本发明所述的逐级响应纳米自组装树枝状前药，将肽类树状大分子与抗肿瘤药物偶联，通过自组装所得到的纳米组装体具有良好的稳定性，强的肿瘤渗透及肿瘤抑制效果。同时，多级响应的前药组装体能够更好的克服递送过程中的生理屏障，实现药物的高效递送。

2、本发明所述的逐级响应纳米自组装树枝状前药组装体在生理条件下能够依赖外层负电性的聚乙二醇外壳抵抗血液中的蛋白吸附，提高血液循环时间。

3、本发明所述的逐级响应纳米自组装树枝状前药组装体，能够自组装形成100-200nm的粒子，通过肿瘤的高通透性和滞留效应在肿瘤部位富集。

4、本发明所述的逐级响应纳米自组装树枝状前药组装体，能够利用肿瘤部位高表达的酶(如，金属基质蛋白酶)或特定的生理环境(如，弱酸性)的作用下脱去带有负电的聚乙二醇外壳，从而增加肿瘤细胞的摄取。

5、本发明所述的逐级响应纳米自组装树枝状前药组装体，能够在细胞质内酶(如，凋亡蛋白)或高水平谷胱甘肽(10mM)的作用下解组装，形成尺寸较大的聚集体，有助于药物在肿瘤细胞内的富集。

6、本发明所述的逐级响应纳米自组装树枝状前药组装体，能够在溶酶体内酶(如，组织蛋白酶)或弱酸性(pH 5.0)的条件下释放抗肿瘤原药，发挥其抗肿瘤作用。

7、本发明所述的逐级响应纳米自组装树枝状前药组装体，提供了一种克服药物递送过程中多种生理屏障的普适性方法，可应用于其他生物医学领域。

8、这种前药组装体能够克服多重生理屏障，实现药物的高效递送。另外，前药设计能够避免药物被外排蛋白识别，克服多药耐药。

附图说明

图1本发明所述逐级响应纳米自组装树枝状前药组装体药物递送过程示意图。

图2实施例1中所述亲水端一代树状分子的合成。

图3实施例1中所述亲水端二代树状分子的合成。

图4实施例1中所述疏水端树状分子骨架的合成。

图5实施例1中所述亲水和疏水的偶联。

图6实施例1中所述药物分子的偶联。

图7-1、7-2和7-3为实施例1中所述两亲性树枝状前药分子的中间产物及终产物的质谱及核磁表征。

图8实施例2中所述的高效液相色谱。

图9实施例2中所述的质谱。

图10实施例2所述的DNs的圆二色谱。

图11实施例2中所述的DNs的粒径及TEM照片。

图12实施例5中所述的不同生理环境下DNs的粒径变化。

图13实施例5中所述的不同生理环境下DNs的形貌变化。

图14实施例6中所述的不同条件下DOX的释放曲线。

图15实施例7中所述MCF7R细胞与不同浓度DNs、DOX、DOX.HCl和未接DOX的树状分子孵育48h后的细胞毒性。

图16实施例8中所述的MCF7R细胞分别与DOX、DOX.HCl和DNs(DOX浓度：10μg/mL)孵育2h后的DOX阳性细胞数量和各组的平均荧光强度。

图17实施例8中所述的在加入MMP-2或MMPs抑制剂(Phen)后MCF7R对DNs的摄取量。

图18实施例9中所述的DNs在递送过程研究的激光共聚焦图片。

图19实施例10中所述的体外细胞球渗透研究的激光共聚焦照片。

图20实施例11中所述的治疗过程中的肿瘤体积。

图21实施例12中所述的DOX.HCl和DNs的活体成像照片。

图22实施例13中所述的DOX.HCl、DNs、L-DNs在小鼠体内的药物代谢动力学曲线。

图23实施例14中所述的DOX.HCl和DNs在体内的渗透效果。

具体实施方式

一种逐级响应纳米自组装树枝状前药，具有式1所示结构：

作为可选方式，R1(肿瘤微环境响应的化学键或多肽)为：

中的一种。

作为可选方式，R2(肿瘤细胞内敏感的化学键或多肽)为： 中的一种。

作为可选方式，R2(溶酶体内敏感的化学键或多肽)为 中的一种。

作为可选方式，Drug为阿霉素、紫杉醇、喜树碱中的一种。

本发明还提供了一种制备上述逐级响应纳米自组装树枝状前药的方法，具体步骤如下：

1)制备两亲性肽类树状前药分子

2)将一定浓度的两亲性肽类树状前药分子溶解于良溶剂中，在超声条件下将上述溶液缓慢滴入去离子水中，通过亲疏水作用进行组装。

3)在通过透析的方法出去有机溶剂，利用冷冻干燥制得纳米粒子。

作为可选方式，步骤1)中两亲性肽类树状前药分子可通过收敛法、发散法或收敛-发散结合的方法制备。

作为可选方式，步骤1)中两亲性肽类树状前药分子的具体制备方法为：

a)对氨基酸进行保护：根据所要制备肽类树状大分子支化单元的不同对氨基或联氨进行保护；

b)制备二代树状分子：按照比例称取芴甲氧羰基(Fmoc)保护的谷氨酸，上述a)中氨基含有保护基团的谷氨酸(3倍当量)、缩合剂(3倍当量)、催化剂(3倍当量)和有机碱(12倍当量)，氮气保护及0℃条件下加入溶剂反应；室温下反应，反应结束后，所得溶液通过洗涤，干燥，减压浓缩，利用柱层析得到带有保护基团的二代肽类树状分子；

c)脱保护：精确称取二代肽类树状大分子，加入脱保护试剂(40倍当量)及溶剂，在氮气保护下反应12h，减压浓缩，通过沉淀，获得二代肽类树状大分子；

本发明还提供了一种逐级响应纳米自组装树枝状前药在制备抗肿瘤药物中的应用。

实施例1：两亲性肽类树状前药分子的制备(合成路线如图1所示)

a)肿瘤微环境金属基质蛋白酶敏感衣壳的合成(NH₂-GPLGLAG-mPEG)

精确称取2.00g Boc-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly-COOH(Boc-GPLGLAG)，3.52g聚乙二醇单甲醚(平均分子量：750)，0.90g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和0.63g 1-羟基苯并三唑(HOBT)于带有支管的单口瓶中，在氮气保护下加入二氯甲烷(DCM)溶解，冰浴下加入2.1mL N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)。室温下反应24小时后，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，经柱层析分离得到Boc-GPLGLAG-mPEG。

脱叔丁氧羰基(Boc)保护

精确称取2.00g Boc-GPLGLAG-mPEG置于带有支管的单口瓶中，氮气保护下加入DCM溶解，然后加入1.0mL三氟乙酸(TFA)。室温反应10小时，所得溶液经减压浓缩后，加入冰冷的无水乙醚沉淀，得到白色粉末状的化合物1。

b)一代树状分子的合成

精确称取1.38g NH₂-GPLGLAG-mPEG、0.10g Boc-Glu-OH、0.62g六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)和0.12g HOBT置于带有支管的单口瓶中，氮气保护下加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，冰浴下加入0.79mL DIPEA.室温反应36小时后，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，经柱层析分离得到化合物2。

脱保护

将1.50g Boc-Glu-(GPLGLAG-mPEG)₂置于带有支管的单口瓶中，氮气保护下加入DCM溶解，然后加入0.60mL三氟乙酸(TFA)。室温反应10小时，所得溶液经减压浓缩后，加入冰冷的无水乙醚沉淀，得到白色粉末状的化合物3。

c)二代树状分子的合成

重复一代树状分子的合成步骤，将其中的NH₂-GPLGLAG-mPEG换成化合物3，合成得到化合物4，Boc保护脱除后得到化合物5。

d)水合肼-谷氨酸的合成

精确称取1.75g叔丁氧羰基肼、2.00g Fmoc-Glu-OH、5.02g 1-羟基苯并三唑和1.79g HOBT置于带有支管的单口瓶中。氮气保护下加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，冰浴下加入8.74mL DIPEA.室温反应48小时后，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，经柱层析分离得到化合物6。

脱保护

将1.00g Fmoc-Glu-(hyd-Boc)₂置于单口瓶中，加入1M的氢氧化钠甲醇溶液(16.75mL)。室温反应4小时，所得溶液经减压浓缩后加入蒸馏水溶解，用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩后得到化合物7。

e)亲水片段与疏水片段的偶联

精确称取1.00g化合物7,0.56g 3,3`-二硫代二丙酸，0.51g EDC.HCl和0.36gHOBT置于带有支管的单口瓶中，氮气保护下加入DCM溶解，然后加入2.6mL DIPEA。室温反应24小时，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，经柱层析分离得到化合物8。

将1.00g化合物5，0.153mg化合物8，0.141g PyBOP和36.50mg HOBT置于带有支管的单口瓶中，氮气保护下加入DMF溶解，然后加入178μL DIPEA。室温反应24小时，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，经柱层析分离得到化合物9。

脱保护

将1.00g化合物9置于带有支管的单口瓶中，氮气保护下加入DCM溶解，然后加入123μL三氟乙酸(TFA)。室温反应10小时，所得溶液经减压浓缩后，加入冰冷的无水乙醚沉淀，得到白色粉末化合物10。

f)抗肿瘤药物的偶联

精确称取0.5g化合物10和115.83mg盐酸阿霉素置于带有支管的单口瓶中，氮气保护下加入甲醇溶解，并加入催化量的冰醋酸。室温反应72小时，减压浓缩，加入蒸馏水溶解。将溶液置于截留分子量为2000Da的透析袋中透析，然后冷冻干燥得到化合物11(DPs)。

实施例2：双亲性树状前药分子的分子敏感

将DPs溶液分别在含有2μg/mL金属基质蛋白酶-2、10mM DTT和pH 5.0不同条件下孵育3小时。利用高效液相色谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱观察不同条件作用后的分子片段。如图7和图8所示，上述条件作用后均观察到了色谱峰的位移以及相应分子片段的质谱。

实施例3：多级响应型前药组装体的制备

称取10.00mg双亲性前药分子溶解于1mL良溶剂二甲基亚砜中，配置成10.00mg/mL溶液。在超声条件下将上述溶液滴入去离子水中进行组装，透析(MWCO 2000Da)除去有机溶剂，然后冷冻干燥得到多级响应型前药组装体(DNs)。

实施例4：DNs的表征

a)圆二色谱分析

将DNs溶解于水中，利用圆二色谱仪测定190nm–250nm的圆二色性。如图9所示，DNs具有典型的二级结构，12.4％α-螺旋,40.7％β-折叠,15.2％β-转角和31.7％无规卷曲。

b)粒径及形貌表征

配置100μg/mL DNs溶液，利用动态光散射法(DLS)测定DNs的粒径及zeta电位。如图10所示，DNs的粒径为124.5nm。

配置100μg/mL DNs溶液，将其滴在铜网上，室温干燥，然后用透射电镜(TEM)观察其纳米结构。如图10所示，其结构为球型纳米粒子，分布均匀，粒径与DLS数据吻合。

实施例5：不同生理环境下粒径的变化

配置DNs(100μg/mL)溶液，将其分别在含有2μg/mL金属基质蛋白酶-2、10mM DTT和pH 5.0不同条件下孵育3小时。利用DLS测定不同条件作用后的粒径及电位的变化。通过TEM观察作用后DNs的形貌变化。

如图11和图12所示，2μg/mL金属基质蛋白酶-2作用后由于其外围亲水PEG脱除，DNs的粒径减小至70nm。10mM DTT作用后，连接亲水和疏水片段的二硫键断裂，引起疏水片段的聚集成为约800nm的粒子，亲水片段组成较约250nm的粒子。pH 5.0条件下，腙键断裂释放出疏水药物阿霉素，DNs解组装。

实施例6：DNs的体外药物释放研究

将200μg/mL DNs分别溶解于1mL pH7.4、2μg/mL金属基质蛋白酶-2、10mM DTT、10μM DTT、pH 6.8和pH 5.0的TCNB缓冲液，并转移至截留分子量为1000Da的透析袋中。分别将上述透析袋置于20mL相应的缓冲液中，37℃摇床中孵育。在设定的时间点取出1mL外液，并补充1mL相应的新鲜TCNB缓冲液。溶液中的阿霉素含量用荧光光谱进行定量分析。

结果如图13所示，pH 7.4、2μg/mL MMP-2和10μM DTT条件下，96小时时阿霉素的累积释放量约为10％。10mM DTT条件下，96小时时阿霉素的释放量不足15％。pH5.0条件下，能够快速释放药物，96小时时累积释放96％。表明该双亲性纳米前药能够避免药物在正常生理条件、肿瘤微环境及细胞质中提前释放，而到达溶酶体时，能够快速释放药物。

实施例7：体外抗肿瘤效果

将人乳腺癌阿霉素耐药细胞系(MCF7R)以1×10⁴细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板，培养24小时。配置不同阿霉素浓度(0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100μg/mL)的DOX、DOX.HCl和DNs的DMEM高糖培养基溶液与细胞孵育48小时。将细胞用PBS洗三次，加入含10％CCK-8的无血清培养基，37℃孵育2小时。然后用酶标仪测定每个孔450nm处的吸光值。每个浓度设置6个平行样。利用一下公式计算细胞存活率：

Cell Viability＝(OD_sample-OD_background)/(OD_control-OD_background)×100％

如图14所示，抑制率为50％时所需DNs相应的DOX浓度为17.8μg/mL，与DOX.HCl相比降低了9.6μg/mL，表明DNs能够有效提高抗肿瘤效果。未与DOX偶联的树状分子在较高浓度的时细胞存活率依然接近100％，表明其良好的生物相容性。

实施例8：细胞摄取

将MCF7R细胞以3×10⁵细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养板，培养24小时。将阿霉素浓度为10μg/mL的DOX、DOX.HCl和DNs的培养基溶液于细胞孵育2h。将细胞用PBS洗三次，用胰酶消化收集细胞。用离心的方法除去培养基，加入300μL PBS缓冲液，通过流式细胞仪测定阿霉素的摄取量。

如图15所示，与其DOX和DOX.HCl相比DNs大大提高了肿瘤细胞对阿霉素的摄取量。另外，在外加金属基质蛋白酶-2后细胞对药物的摄取量增加，而加入金属基质蛋白酶抑制剂后阻碍PEG的脱除降低了细胞的摄取。

实施例9：细胞内递送过程

细胞摄取过程

将MCF7R细胞以8000细胞/皿的密度接种于玻底皿中，培养24小时。加入含有10μg/mL DOX的DOX、DOX.HCl和DNs培养基溶液与细胞孵育2小时。去除药物后将细胞用PBS洗两次，然后加入3％的甲醛溶液室温固定5min。除去甲醛溶液后将细胞用PBS洗两次，加入DiD染液对细胞膜进行染色。染色30min后用PBS将细胞洗三次，然后用激光共聚焦显微镜观察。

如图16所示，DNs能够有效促进DOX的入胞。而在相同浓度和时间下，DOX.HCl和DOX组细胞内的荧光均较弱。

溶酶体逃逸

将MCF7R细胞以8000细胞/皿的密度接种于玻底皿中，培养24小时。加入含有10μg/mL DOX的DNs培养基溶液分别与细胞孵育6h和8h小时。去除药物后将细胞用PBS洗两次，然后加入溶酶体染色液(Lysotracker)，染色50min。将细胞用PBS洗三次后用激光共聚焦显微镜观察。

如图16所示，在6h时能够观察到DOX和溶酶体的荧光几乎完全重叠，说明组装体在溶酶体中富集。在8h时，DOX的荧光和溶酶体的荧光大部分分离，说明DOX在肽类树状分子的质子海绵效应的作用下实现溶酶体逃逸。

对核释放

将MCF7R细胞以8000细胞/皿的密度接种于玻底皿中，培养24小时。加入含有5μg/mL DOX的DNs培养基溶液分别与细胞孵育48h小时。去除药物后将细胞用PBS洗两次，然后加入细胞核染色液(Hoechst 33342)，染色20min。将细胞用PBS洗三次后用激光共聚焦显微镜观察。

如图16所示，DOX能够与细胞核的荧光大部分重叠，说明DOX能够有效进入细胞核发挥抗肿瘤作用。

实施例10：体外渗透效果评价

利用肿瘤多细胞球模型考察药物的肿瘤渗透能力。将1％的琼脂糖凝胶经高压灭菌后以1.5mL/孔加入6孔细胞培养板中，然后将MCF7R细胞以2×10⁴个/孔接种。培养一周后肿瘤多细胞球直径约为200μm，将细胞球转移至玻底皿中加入DOX、DOX.HCl和DNs(DOX浓度为5μg/mL)孵育两个小时，用PBS洗两次后，利用激光共聚焦显微镜观察。

如图17所示，DNs能够将DOX递送至肿瘤细胞球内部，且荧光强度较强。金属基质蛋白酶-2作用后DNs的渗透能力进一步增强，然而在加入金属基质蛋白酶抑制剂菲啰啉后DNs的渗透能力降低。

实施例11：体内抗肿瘤研究

动物饲养：所有的动物在25℃、55％湿度的条件下饲养。所有的动物实验操作符合四川大学有关动物饲养规范管理条例的规定。

MCF7R肿瘤模型的建立：将MCF7R细胞以2×10⁶细胞/只的数量接种于BALB/c裸鼠的右后腿上部，当肿瘤长至50mm³时将小鼠随机分为3组，每组6只，分别通过尾静脉注射生理盐水，DOX.HCl和DNs，给药量为5mg DOX/kg，每三天给药一次，共给4次，并测量肿瘤体积。给药结束后再测量5次至24天。

如图18所示，DNs能够有效抑制肿瘤的生长，24天时DNs的肿瘤抑制率达到了69.02％，而DOX.HCl的仅为32.45％。

实施例12：体内药物分布

将MCF7R细胞以2×10⁶细胞/只的数量接种于BALB/c裸鼠的右侧腋下，当肿瘤长至100mm³时，通过尾静脉注射生理盐水，DOX.HCl和DNs，给药量为10mg DOX/kg。使用CRiMaestro EX活体成像仪，观察注射后1h，3h，6h和12h的DOX分布，激发波长和发射波长分别为455nm和605nm。如图19所示，注射后1h DNs组的DOX荧光主要分布在肿瘤部位，而且随时间延长而增强。而DOX.HCl组难以观察到药物的分布。

实施例13：药物代谢动力学研究

将BALB/c小鼠随机分为两组每组18只，通过尾静脉注射DOX.HCl和DNs，药物浓度为10mg DOX/kg。在给药后2min,30min,1h,6h和12h，通过小鼠眼球取血将血液样品收集于含肝素钠的采血管中。将上述样品在4℃条件下3000g离心10min。取出100μL血浆加入50μL的5M盐酸，50℃孵育1.5h。样品冷却后加入50μL氢氧化钠溶液(1M)。用氯仿/异丙醇(体积比为4:1)将药物萃取至有机相。有机溶剂挥发干后加入100μL乙腈，用高效液相色谱分析药物浓度。如图20所示，DNs能够明显增加药物的血液循环时间。

实施例14：体内渗透效果

将建有MCF7R肿瘤的小鼠静脉注射DOX.HCl和DNs，药物浓度为10mg DOX/kg。注射12h后将小鼠断颈处死，取出肿瘤。将肿瘤组织冰冻切片，用AF594-CD31抗体标记肿瘤组织的血管。利用激光共聚焦显微镜观察DOX在肿瘤组织的分布。如图21所示，DOX.HCl仅分布于血管周围，不能达到距离血管较远的肿瘤深。而DNs能够将DOX递送至肿瘤深处，而且肿瘤组织的药物浓度明显增加。

Claims (9)

1.一种逐级响应纳米自组装树枝状前药，其特征在于：前药由双亲性肽类树状分子构成，其亲水片段通过肿瘤微环境响应的敏感多肽或敏感键与树状分子骨架连接，其疏水片段通过溶酶体内响应的敏感键或多肽将抗肿瘤药物与树状分子骨架偶联；亲水片段与疏水片段通过肿瘤细胞质内响应的敏感键或多肽连接。

2.根据权利要求1所述的一种逐级响应纳米自组装树枝状前药，其特征在于：所述前药的分子结构式如下：

其中，R₁代表肿瘤微环境响应的多肽或敏感键，选自MMP-2敏感肽(多肽序列为：GPLGLAG，GPQGIWGQ或GPLGIAGD)或肿瘤微环境弱酸性敏感基团，选自2,3-二甲基马来酸酐、2,2,3,3-四甲基马来酸酐；

R₂代表肿瘤细胞质中响应的多肽或敏感键，选自凋亡蛋白(caspase-3/7)敏感多肽(DEVD)或GSH敏感键(二硫键或二硒键)；

R₃代表溶酶体中响应的多肽或敏感键，选自酯键、组织蛋白酶敏感多肽(GFLG)或溶酶体pH 5.0环境可断裂的腙键；抗肿瘤药物Drug偶联在R3上。

3.根据权利要求2所述的一种逐级响应纳米自组装树枝状前药，其特征在于：所述前药为通过自组装形成纳米粒子；所述抗肿瘤药物Drug选自盐酸阿霉素、喜树碱或紫杉醇。

4.一种根据权利要求1或2或3所述的一种逐级响应纳米自组装树枝状前药的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

1)制备双亲性肽类树状前药分子，它由抗肿瘤药物偶联在双亲性肽类树状分子的化学键上组成；

2)将一定浓度的双亲性肽类树状前药分子溶解于良溶剂中，在超声作用下将上述溶液滴入去离子水中，通过亲疏水作用进行自组装，构建逐级响应的纳米粒子；

3)利用透析方法纯化，然后冷冻干燥得到纳米粒子的前药。

5.根据权利要求4所述的一种逐级响应纳米自组装树枝状前药的合成和制备方法，其特征在于：所述步骤1)的具体制备方法为：

a)对氨基酸进行保护：根据所要制备肽类树状大分子支化单元的不同对氨基或联氨进行保护；

b)制备二代肽类树状分子：按照比例称取芴甲氧羰基(Fmoc)保护的谷氨酸，上述a)中氨基含有保护基团的谷氨酸(3倍当量)、缩合剂(3倍当量)、催化剂(3倍当量)和有机碱(12倍当量)，氮气保护及0℃条件下加入溶剂反应；室温下反应，反应结束后，所得溶液通过洗涤，干燥，减压浓缩，利用柱层析得到带有保护基团的二代肽类树状分子；

c)脱保护：精确称取二代肽类树状大分子，加入脱保护试剂(40倍当量)及溶剂，在氮气保护下反应12h，减压浓缩，通过沉淀，获得二代肽类树状分子；

d)抗肿瘤药物的偶联：将上述二代肽类树状分子和抗肿瘤药物在氮气保护下加入溶剂溶解，在催化剂下反应，随后出去溶剂，加入蒸馏水溶解，透析，最后经冷却冻干燥制得成品。

6.根据权利要求5所述的一种逐级响应纳米自组装树枝状前药的制备方法，其特征在于：所述抗肿瘤药物选自盐酸阿霉素、喜树碱或紫杉醇；所述溶剂为甲醇有机溶剂，所述催化剂为冰醋酸或缩合剂。

7.一种如权利要求1或2或3所述的一种逐级响应纳米自组装树枝状前药的应用，其特征在于：所述前药在肿瘤外基质高表达的酶(如金属基质蛋白酶(MMPs))或特定的理化环境(如弱酸性环境、低氧)的作用下能够断裂脱去亲水端的聚乙二醇。

8.根据权利要求7所述的一种逐级响应纳米自组装树枝状前药的应用，其特征在于：所述前药在肿瘤细胞质内酶(如凋亡蛋白)或特定理化环境(如高浓度的GSH)作用下能够断裂，引起组装体的崩解。

9.根据权利要求7所述的一种逐级响应纳米自组装树枝状前药的应用，其特征在于：所述前药在肿瘤细胞溶酶体内酶(如组织蛋白酶)或特定理化环境(如pH 5.0)作用下能够断裂释放抗肿瘤原药(如阿霉素(DOX)、喜树碱和紫杉醇)。