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CN106417599B - 一种添加有植物乳杆菌增殖剂的发酵产品及其制作方法 - Google Patents

一种添加有植物乳杆菌增殖剂的发酵产品及其制作方法 Download PDF

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CN106417599B CN201610826426.1A CN201610826426A CN106417599B CN 106417599 B CN106417599 B CN 106417599B CN 201610826426 A CN201610826426 A CN 201610826426A CN 106417599 B CN106417599 B CN 106417599B
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Shanghai Bright Dairy and Food Co Ltd
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Abstract

本申请公开了一种添加有植物乳杆菌增殖剂的发酵产品，该植物乳杆菌增殖剂是通过蛋白酶或含有蛋白酶的物质降解植物蛋白反应后的酶解混合物，该发酵产品中含有植物乳杆菌增殖剂质量百分比为0.1‑20％。通过添加植物乳杆菌增殖剂，发酵产品可以是发酵乳或活菌饮用水或活菌化妆品。本申请的发酵产品具有以下优点：(1)该增殖剂属于天然可食用混合物，发酵产品中添加后对人体不会产生副作用；(2)通过该增殖剂的使用，可以大大缩短发酵产品的发酵时间，避免了有害杂菌的污染；(3)通过该增殖剂的添加可以实现发酵产品中的活菌数达到1.0×109cfu/g，活菌数大大高于其他增殖剂所产生的活菌数；(4)该增殖剂的使用降低了高活菌数发酵产品的成本。

Description

一种添加有植物乳杆菌增殖剂的发酵产品及其制作方法
技术领域
本发明属于微生物发酵及食品加工技术领域中,特别是在发酵类食品中，利用一种植物乳杆菌增殖剂制作的发酵产品及其制作方法。
背景技术
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域，其益生功能越来越受广大消费者的认同和欢迎。植物乳杆菌属于益生菌中的一种，它能够有效耐受人体消化系统,具有调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收、调节胆固醇、调节血脂、增强人体免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等益生保健功能。因此,开发高活菌数的纯植物乳杆菌产品,对于提高消费者健康具有积极意义。目前市场上的益生菌产品主要是以嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为主要发酵剂，同时添加其它有功能的益生菌，纯益生菌发酵产品少之又少，且所有活菌产品都未进行杂菌检测。
由于植物乳杆菌在牛乳中生长缓慢，产酸能力差，难以凝乳。国内外有不少研究尝试解决此问题，但都存在一些缺陷，实际生产困难。论文《植物乳杆菌ST-Ⅲ在脱脂乳体系中生长限制因子的研究》[陈帅等,食品与发酵工业,2008,34(10):53～57]以及《有效外源添加物鱼蛋白胨组分的分级分离研究》[陈帅等,乳业科学与技术,2010,4:201～204〕研究了鱼蛋白胨中不同蛋白组分等对植物乳杆菌在乳中发酵的促进作用,但所用的鱼蛋白胨为试剂级的；同时发酵时间较长(24h),成本高，难以满足实际产品生产要求。专利《一种活性植物乳杆菌饮品及其制备方法》[马成杰等，CN102715235A：2012-10-10]公开了一种活性植物乳杆菌增殖剂配方，植物乳杆菌活含量高。但所用试剂组成复杂，发酵时间较长(24-72h)。专利《一种植物乳杆菌发酵乳及其制备方法》[马成杰等,CN103004984A：2013-04-03]公开了一种植物乳杆菌发酵乳及其制备方法，主要是添加适量氨基酸、核苷酸，解除了植物乳杆菌在乳中生长繁殖的限制性因子。但添加剂组成复杂，成本高；且纯植物乳杆菌发酵时发酵时间较长(15h)。论文《植物乳杆菌ST-Ⅲ脱脂乳的发酵工艺优化》[华宝珍等，农业工程学报,2014,30(23711):276-284]研究了大豆多肽对植物乳杆菌的增殖作用，活菌数较高；但发酵时间较长(48h)。
国外研究植物乳杆菌增殖的较少,其中有家日本公司利用谷物酒糟提取物增殖植物乳杆菌,但只对部分植物乳杆菌有增殖作用,且发酵时间较长(大于16h)，特别是对有些植物乳杆菌(如植物乳杆菌ST-Ⅲ)增殖效果不理想。这主要是因为植物乳杆菌基因差异较大，不同菌株营养需求不一样。
以上国内外研究都忽略植物乳杆菌纯发酵产品中的杂菌污染检测。如果所研究的增殖方法即使具有发酵时间短，活菌数高的特点，但没有检测杂菌，都是没有意义的。大家知道乳及常见食品中常含有耐热的芽孢杆菌污染，难以杀灭，如果植物乳杆菌不能尽快生长从而抑制杂菌生长，发酵乳中的杂菌将大大超标；特别是一些有害菌如蜡状芽孢杆菌、葡萄球菌等将严重危害人体健康。这就要求所研究的植物乳杆菌的增殖方法不但有增菌效果好，活菌数高；而且要生长快速，从而抑制杂菌生长。
利用植物乳杆菌增殖剂制作的发酵产品，首先是要在产品活菌数上有较高要求，同时要求其发酵时间短，尽量降低其他有害杂菌的含量；另外，在保藏时间内活菌数较高，保证其产品的长期有效性。
发明内容
本申请的技术方案要解决的技术问题是通过发酵产品中添加一种植物乳杆菌增殖剂以显著提高含有植物乳杆菌发酵产品中的活性菌含量，同时保证发酵产品的发酵时间尽可能缩短、口感良好、有害杂菌污染尽量降低，解决了发酵活菌产品制备的技术难题。
实现上述发明目的技术方案为：一种添加有植物乳杆菌增殖剂的发酵产品，该植物乳杆菌增殖剂是通过蛋白酶或含有蛋白酶的物质降解植物蛋白反应后的酶解混合物，该发酵产品中含有植物乳杆菌增殖剂质量百分比为0.1-20％。上述植物乳杆菌增殖剂中的蛋白酶是植物蛋白酶、动物蛋白酶或者微生物蛋白酶中一种或混合物；含有蛋白酶的物质是含有植物蛋白酶的物质、动物蛋白酶的物质或者微生物蛋白酶的物质中一种或混合物。
该发酵产品是发酵乳或活菌饮用水或活菌化妆品。
植物蛋白可以选择大豆蛋白、绿豆蛋白、鹰嘴豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、扁豆蛋白、小麦蛋白或上述蛋白的混合物。上述植物蛋白酶通常选择水果蛋白酶、蔬菜蛋白酶、药用植物蛋白酶(如罗汉果蛋白酶、山药蛋白酶)或其混合物。含有这些植物蛋白酶的物质是水果、蔬菜或药用植物。若选择动物蛋白酶，则具体可以是胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。
若选择微生物蛋白酶，则可以具体为地衣芽孢杆菌蛋白酶、黑曲霉蛋白酶、解淀粉芽孢杆菌蛋白酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶、米黑根毛霉蛋白酶、米曲霉蛋白酶、乳克鲁维酵母蛋白酶、微小毛霉蛋白酶、蜂蜜曲霉蛋白酶、寄生内座壳(栗疫菌)蛋白酶中的一种或其混合物。
上述发酵乳的制作方法步骤是：(1)牛奶和植物乳杆菌增殖剂按照质量比100：0.1-20混合；(2)灭菌，冷却至37℃；(3)接种达到植物乳杆菌终浓度为1.0×105-1.0×108cfu/g；(3)发酵至凝乳，发酵时间不超过12h。
上述活菌饮用水的制作方法步骤是：(1)纯净水和植物乳杆菌增殖剂按照质量比100：0.1-20混合；(2)上步混合液预热升温在65℃、20MPa下实现均质，灭菌，冷却至37℃；(4)接种、发酵16h达到植物乳杆菌终浓度为2.0×109cfu/g；(5)在(4)步的产物中按照200mg/100ml添加维生素C，并用纯净水进行稀释至植物乳杆菌终浓度2.0×108cfu/g。
上述活菌化妆品的制作方法为步骤是：(1)将化妆品与植物乳杆菌增殖剂按质量比100：0.1-20混合；(2)灭菌；(3)接种、发酵。
本发明的发酵产品具有以下优点：(1)该增殖剂属于天然可食用混合物，发酵产品中添加后对人体不会产生副作用；(2)通过该增殖剂的使用，可以大大缩短发酵产品的发酵时间，避免了有害杂菌的污染；(3)通过该增殖剂的添加可以实现发酵产品中的活菌数达到1.0×109cfu/g，活菌数大大高于其他增殖剂所产生的活菌数；(4)该增殖剂的使用降低了高活菌数发酵产品的成本。
具体实施方式
为更清楚说明本发明技术方案，下面具体进行介绍。植物乳杆菌增殖剂采用蛋白酶降解植物蛋白反应后生成的酶解混合物；植物蛋白可以选择大豆蛋白或绿豆蛋白、鹰嘴豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、扁豆蛋白、小麦蛋白或上述蛋白的混合物。上述植物蛋白酶通常选择水果蛋白酶、蔬菜蛋白酶、药用植物蛋白酶(如罗汉果蛋白酶、山药蛋白酶)或其混合物。含有这些植物蛋白酶的物质是水果、蔬菜或药用植物。若选择动物蛋白酶，则具体可以是胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。
若选择微生物蛋白酶，则可以具体为地衣芽孢杆菌蛋白酶、黑曲霉蛋白酶、解淀粉芽孢杆菌蛋白酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶、米黑根毛霉蛋白酶、米曲霉蛋白酶、乳克鲁维酵母蛋白酶、微小毛霉蛋白酶、蜂蜜曲霉蛋白酶、寄生内座壳(栗疫菌)蛋白酶中的一种或其混合物。
上述植物乳杆菌增殖剂的制作方法是将植物蛋白和植物蛋白酶在水溶液中在25℃-80℃下酶解反应0.5～8h。
实施例1：
为确定该增殖剂的作用，将上述制备的植物乳杆菌增殖剂0.5-10％添加至牛奶中，在95℃下灭菌10min，接种得到了终浓度为1.0×105-1.0×108cfu/g植物乳杆菌ST-III，经发酵至凝乳(不超过12h)，通过LB平板计数好氧菌落总数检测污染情况、并通过MRS平板计数植物乳杆菌活菌数。方法制得的凝乳测试结果如表1：
表1.植物乳杆菌纯发酵乳实验结果
表1的实验结果证明，该增殖剂:能促进植物乳杆菌ST-Ⅲ在牛奶中快速生长凝乳，30天保质期内活菌数变化不大，无杂菌污染；且植物乳杆菌活菌计数较高。
实施例2：
采用大豆蛋白和无花果蛋白酶进行酶解反应生成增殖剂，用该增殖剂和生牛乳混合、接种、发酵，观察凝乳情况，样品梯度稀释计数，上述样品冷藏30天后再计数；为比较增殖剂的效果用大豆蛋白胨、胰蛋白胨做增殖剂进行对照试验，结果如表2。
表2.大豆蛋白胨、胰蛋白胨做增殖剂进行对照试验结果
增殖剂 凝乳情况 好氧菌落总数(cfu/g) 植物乳杆菌活菌计数(cfu/g)
本技术方案的增殖剂 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 1.2×10<sup>9</sup>
大豆蛋白胨 未凝乳 2.1×10<sup>3</sup> 3.1×10<sup>8</sup>
胰蛋白胨 未凝乳 2.1×10<sup>5</sup> 1.5×10<sup>8</sup>
由表2可知，本申请技术方案的增菌剂增菌效果远超了大豆蛋白胨、胰蛋白胨的效果。
实施例3：
采用类似上述实施例的方法，使用大豆蛋白和菠萝蛋白酶进行酶解反应生成增殖剂，利用该用该增殖剂和生牛乳混合、发酵、接种，观察凝乳情况，结果如表3。
表3.大豆蛋白和菠萝蛋白酶进行酶解反应生成增殖剂的实验效果
时间 凝乳情况 好氧菌落总数(cfu/g) 植物乳杆菌活菌计数(cfu/g)
0天 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 1.4×10<sup>9</sup>
30天后 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 5.0×10<sup>8</sup>
实施例4：
利用上述的大豆蛋白和菠萝全汁进行酶解反应生成增殖剂，利用该用该增殖剂和生牛乳混合、发酵、接种，观察凝乳情况，如表4。
表4.大豆蛋白和菠萝全汁进行酶解反应生成增殖剂实验效果
时间 凝乳情况 好氧菌落总数(cfu/g) 植物乳杆菌活菌计数(cfu/g)
0天 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 1.0×10<sup>9</sup>
30天后 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 4.5×10<sup>8</sup>
实施例5：
利用大豆蛋白和下述几种植物蛋白酶分别进行酶解反应制作增殖剂的测试结果如下表5。
表5.不同植物蛋白酶提取物效果
植物蛋白酶 凝乳情况 好氧菌落总数(cfu/g) 植物乳杆菌活菌计数(cfu/g)
木瓜蛋白酶 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 1.1×10<sup>9</sup>
无花果蛋白酶 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 1.0×10<sup>9</sup>
菠萝蛋白酶 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 9.5×10<sup>8</sup>
罗汉果蛋白酶 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 9.6×10<sup>8</sup>
实施例6：
上述大豆蛋白也可以替换为其他植物蛋白，将其和菠萝汁进行酶解反应制作增殖剂并测试结果如下表6。
表6.不同植物蛋白和菠萝汁进行酶解反应的增殖剂增菌实验效果
实施例7：
上述植物蛋白酶也可以替换为动物蛋白酶，将其和大豆蛋白进行酶解反应制作增殖剂，并测试，结果如下表7。
表7.不同动物蛋白酶增菌实验效果
蛋白酶 凝乳情况 好氧菌落总数(cfu/g) 植物乳杆菌活菌计数(cfu/g)
胰蛋白酶 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 9.2×10<sup>8</sup>
胃蛋白酶 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 9.6×10<sup>9</sup>
胰凝乳蛋白酶 凝乳 &lt;1×10<sup>1</sup> 8.3×10<sup>8</sup>
实施例8：
上述植物蛋白酶也可以替换为微生物蛋白酶，将其和大豆蛋白进行酶解反应制作增殖剂，并测试，结果如下表8。
表8.不同微生物蛋白酶增菌实验
实施例9:
植物乳杆菌增殖剂为大豆+菠萝全汁,植物乳杆菌ST-III也可以被替换为其他植物乳杆菌菌株。
表9.不同植物乳杆菌增殖试验
利用上述的植物乳杆菌增殖剂可以制作多种具有高活菌数的发酵产品，实施例10-18下面列举了几种发酵产品的制作过程。
实施例10:植物乳杆菌发酵乳
植物乳杆菌发酵乳配方:生牛乳80％，增殖剂2％(固形物含量)，增稠剂适量,蔗糖7％,橙汁5％。
制备方法:将上述混合料液预热升温,在65℃、20MPa下均质后,95℃保温杀菌10min,冷却至37℃。接种(ST-Ⅲ接种量终浓度1.0×106cfu/g),发酵至凝乳。结果植物乳杆菌活菌数为1.0×109cfu/g，21天保值期内活菌数大于3.0×108cfu/g，酸甜可口。目前国内外市场上还没有纯植物乳杆菌发酵乳产品。
实施例11:植物乳杆菌速溶发酵乳
先将实施例10获得的植物乳杆菌发酵乳喷雾干燥至含水量约为20％粉状物。喷雾干燥的进风温度为110℃,所述喷雾干燥的排风温度为37℃,所述粉料的出口温度在35℃；然后在低温50℃的流化床内进行流化干燥,使所述粉料中的含水量<5％的发酵乳粉。发酵乳粉发酵酸奶的使用方法,其包括下述步骤:将上述制得的发酵乳粉与温水(50℃)1:4的质量比混合,在保温半小时,即可制成速溶发酵乳。植物乳杆菌活菌数为3.0×108cfu/g。目前国内外市场上还没有植物乳杆菌速溶发酵乳产品。
实施例12:植物乳杆菌酸奶冰淇淋
原料:生牛乳40％，增殖剂6％(固形物含量)，白砂糖10％、脱脂乳粉10％、稀奶油20％、稳定剂4％(主要成分为羧甲基纤维素钠、淀粉)，所有原料混匀,65℃,在200bar的压力下进行均质，99℃杀菌10min；冷却至37℃接种(ST-Ⅲ接种量终浓度1.0×107cfu/g)发酵12h。发酵产物在45℃150转/min的转速下搅拌20min破乳，降温到15℃静置后熟16h。O℃静置老化12h，再O℃40bar的压力下进行均质。最后放入冰淇淋机-30℃制作酸奶冰淇淋。所获得的产品酸甜可口，且含有益生功能的植物乳杆菌活菌(3个月之内活菌数>4.0×108cfu/g)。目前国内外市场上还没有植物乳杆菌酸奶冰淇淋产品。
实施例13:植物乳杆菌活菌饮料
(1)发酵乳基料配方:脱脂奶粉15％，增殖剂4％(固形物含量)，增稠剂适量,蔗糖7％,果汁10％。发酵乳基料制备方法:将料液预热升温,均质后,105℃保温杀菌10min,冷却至37℃。接种(ST-Ⅲ接种量终浓度1.0×106cfu/g),发酵至凝乳。
(2)活菌型酸乳饮料制作
备料:白砂糖10％,水45％,稳定剂(果胶)0.5％，将按上述比例稳定剂与适量的白砂糖、水搅拌溶解，高压均质后杀菌冷却。加入发酵乳基料约40％，搅拌混匀，调酸到pH值4.4，调香。在20MPa下无菌均质，得到植物乳杆菌活菌饮料。4℃冷藏1个月，植物乳杆菌活菌数为>1.0×108cfu/g。目前市场上植物乳杆菌活菌饮料较少，一般用直投菌粉，成本高，活菌数少，只有2.0×107cfu/g。
实施例14:植物乳杆菌活菌水
植物乳杆菌高密度发酵乳配方:脱脂奶粉10％，增殖剂5％(固形物含量)。
制备方法:将料液预热升温,在65℃、20MPa下均质后,115℃保温杀菌10min,冷却至37℃。接种(ST-Ⅲ接种量终浓度5.0×106cfu/g),发酵16h，植物乳杆菌活菌数为2.0×109cfu/g。稀释添加到含有200mg/100ml维生素C以及0.2％果胶稳定剂的纯净水中，制成终浓度为2.0×108cfu/g的活菌水。目前国内外市场上还没有植物乳杆菌活菌水产品。
实施例15:植物乳杆菌益生菌制剂
植物乳杆菌高密度发酵乳配方:脱脂奶粉12％，增殖剂5％(固形物含量)。
制备方法:将料液预热升温,在65℃、20MPa下均质后,115℃保温杀菌10min,冷却至37℃。接种(ST-Ⅲ接种量终浓度2.0×107cfu/g),发酵12h，植物乳杆菌活菌数为1.5×109cfu/g。发酵液离心,菌泥中加入蔗糖5％,L-半胱氨酸0.01％，真空干燥或冷冻干燥得到的植物乳杆菌菌粉。将真空干燥得到的植物乳杆菌菌粉经过磨粉后与乳糖混合调配，压片或制成菌粉胶囊。活菌数为1.0×1010cfu/g，常温干燥保存一年后存活率大于40％。目前市场上的植物乳杆菌益生菌制剂所用培养基都是不能食用的，需要分离菌体，生产成本高。
实施例16:植物乳杆菌混合发酵乳
植物乳杆菌发酵乳配方:生牛乳80％，增殖剂2％(固形物含量)，增稠剂适量,蔗糖7％。
制备方法:将料液预热升温,在65℃、20MPa下均质后,90℃保温杀菌8min,冷却至37℃。接种(ST-Ⅲ接种量终浓度2.0×106cfu/g，保加利亚乳杆菌粉0.02g/kg,嗜热链球菌粉0.03g/kg),发酵至凝乳,添加或不添加果料如：草莓、猕猴桃等。结果植物乳杆菌活菌数为4.0×108cfu/g，21天保值期内活菌数大于2.0×108cfu/g，酸甜可口。目前市场上有的发酵乳中含有植物乳杆菌，一般是菌粉直投的，成本高，活菌数低(接近1.0×107cfu/g。)。
实施例17:含植物乳杆菌乳酸菌饮料
发酵乳基料：实施例10制作的发酵乳作为发酵乳基料。
备料:白砂糖10％,水45％,稳定剂(果胶)0.5％，将按上述比例稳定剂与适量的白砂糖、水搅拌溶解，高压均质后杀菌冷却。加入发酵乳基料(40％)，搅拌混匀，调酸到pH值4.4，调香。在20MPa下无菌均质，得到植物乳杆菌活菌饮料。4℃冷藏1个月，植物乳杆菌活菌数为>1.0×108cfu/g。由于植物乳杆菌难以在牛奶中增殖，目前市场上的植物乳杆菌乳酸菌饮料采用菌粉直投，成本高，活菌数低，小于1.0×107cfu/g。
实施例18:含植物乳杆菌的活菌化妆品
配方1：以凡士林甘油润肤霜作为基质,与实施例1制作的植物乳杆菌活菌按100:1-20混合制得。涂抹皮肤表面，具有抑制杂菌生长，祛痘美容效果。
配方2：以制作面膜材料作为基质(如蜂蜡、透明质酸钠、胶原蛋白),与实施例1制作的植物乳杆菌活菌按100:1-20混合制得。涂抹皮肤表面，具有抑制杂菌生长，祛痘美容效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种添加有植物乳杆菌增殖剂的发酵产品，其特征在于，所用植物乳杆菌增殖剂是通过蛋白酶或含有蛋白酶的物质降解植物蛋白反应后的酶解混合物，该发酵产品是发酵乳或活菌饮用水或活菌化妆品；
当该发酵产品是发酵乳时，其所含有植物乳杆菌增殖剂的质量百分数为0.5-20％，其所含活菌数不小于1.0×108cfu/g；
当该发酵产品是活菌饮用水时，其所含有植物乳杆菌增殖剂的质量百分数为5％，其所含活菌数不小于1.0×108cfu/g；
当该发酵产品是活菌化妆品时，其所含有植物乳杆菌增殖剂的质量百分数为1％-20％，其所含活菌数不小于1.0×108cfu/g。
2.一种制作权利要求1所述的添加有植物乳杆菌增殖剂的发酵产品的方法，其特征在于，当该发酵产品是发酵乳时，其方法步骤如下：(1)牛奶和植物乳杆菌增殖剂按照质量比100：0.5-20混合；(2)灭菌；(3)接种达到植物乳杆菌终浓度为1.0×105-1.0×108cfu/g；(3)发酵至凝乳，发酵时间不超过12h。
3.一种制作权利要求1所述的添加有植物乳杆菌增殖剂的发酵产品的方法，，其特征在于，当该发酵产品是活菌饮用水时，其方法步骤如下：(1)纯净水和植物乳杆菌增殖剂按照质量比100：5混合；(2)上步混合液预热升温在65℃、20MPa下实现均质，灭菌，冷却至37℃；(4)接种、发酵16h达到植物乳杆菌终浓度为2.0×109cfu/g；(5)在(4)步的产物中按照200mg/100ml添加维生素C，并用纯净水进行稀释至植物乳杆菌终浓度2.0×108cfu/g。
4.一种制作权利要求1所述的添加有植物乳杆菌增殖剂的发酵产品的方法，其特征在于，当该发酵产品是活菌化妆品时，其方法步骤如下：(1)将化妆品与植物乳杆菌增殖剂按照质量比100：1-20混合；(2)灭菌，冷却；(3)接种、发酵。
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