CN106414490A - 使用基于膜的细胞截留系统增强重组蛋白的表达 - Google Patents
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Abstract
本文公开的本发明提供了基于膜的外部细胞截留系统与灌注细胞培养联合而用于改善重组蛋白的细胞表达的新型用途，其中所述重组蛋白尤其是凝血蛋白，比如rFVIII、缺失B结构域的rFVIII、rFIX或者rFVII/rFVIIa。由于截留系统操作期间所诱导的机械力，比如泵抽经流纤维时所诱导的细胞循环，在高细胞密度时应用这种系统产生更均质的细胞培养物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请基于2014年2月17日提交的US 61/940,493，并要求其优先权。
技术领域
已经使用细胞培养程序来生产重组蛋白，按分批或者按照连续的(灌注)模式来操作所述细胞培养程序。因为相较于分批模式的操作而言，灌注模式能够维持更高的细胞密度，因此灌注模式产生更高的体积产量(每体积每天所产生的产物量)。
背景技术
在工业中，灌注操作已被用来生产重组生物制品，比如单克隆抗体、血液因子包括凝血蛋白、酶和其他治疗性蛋白。对于使用灌注系统的主要驱动在于在生物反应器中保留细胞，从而显著提高了每体积生物反应器所生产的产物量。市场上有多种类型的细胞截留装置，已成功实现了实验室和商业规模的生产。据我们所知，尽管在文献中已证实了细胞密度的增加，却未曾报道过由于采用了外部细胞截留膜的灌注系统对细胞生产率的提高。
这方面值得注意的两篇文献是：1)S.S.Ozturk和D.S.Kompala,Optimization ofHigh cell Density Perfusion Bioreactors,in Cell Culture Technology forPharmaceutical and Cell-Based Therapies,Sadettin S.Ozturk和Wei-Shou Hu主编,CRC出版社，2005,387-416页；以及2)W.M.Woodside、B.D.Bowen和J.M.Piret,MammalianCell Retention Devices for Stirred Perfusion Bioreactors,Cytotechnology,1998,November；28(1-3):163-175。
上述第一个文献，Ozturk等人2005讨论了对比恒化器生物反应器，高细胞密度灌注生物反应器的好处，以及操作这种生物反应器的方法。灌注系统涉及养分的持续流入以及旧介质的流出，而细胞完全或者部分保留在生物反应器中。灌注生物反应器的主要优点之一是高的蛋白生产率。有许多灌注生物反应器的内部和外部的细胞截留的方法。用于异源培养的这样的系统，详见于这篇文献中，并且包括固定(固定化的)床、陶瓷基体(matrix)固定、中空纤维反应器、微包囊和大孔基体流化系统。用于均质培养的细胞截留系统常用于工业中的哺乳动物细胞培养，是因为由于所用悬浮培养中可见的一致性环境，而相对容易规模化、监测和控制。
对用于哺乳动物细胞培养的一些细胞截留装置进行了讨论，包括旋转过滤器(在生物反应器内部)和外部过滤，比如交替切向流、细胞沉降(包括垂直沉降和倾斜沉降)、离心、超声波分离和水力旋流器(hydro cyclone)。
平板和中空纤维筒(cartridge)已用于外部过滤。装置的堵塞可成为问题，但是当堵塞使流体降低至可接受的限度以下时，可以更换外部过滤器，一般在每5至7天之间。
上述第二篇文献，Woodside等人1998，Cytology也讨论了用于搅拌型灌注生物反应器的哺乳动物细胞截留装置。Woodside指出灌注反应器设计和操作的显著问题在于细胞截留装置的可靠性，因为细胞培养系统中的变化会导致大的治疗性蛋白中不一致的翻译后修饰，这使得有必要证明工艺性能和产品质量的一致性，以获得蛋白上市的监管部门批准。
中空纤维和平板筒是错流(cross-flow)过滤器类型。在使用中，悬浮液从生物反应器泵至外部筒，并且在流经膜时进行浓缩。浓缩的悬浮液流循环至反应器，而无细胞的渗透液形成排放(effluent)流(参见Woodside，164-166页)。
除了上述那些文献被认为和本方法相关以外，本发明人还注意到其它的三篇文献。1)US2009/0263866，受让予Novo Nordisk,Inc.的US专利申请，2)WO2011/012727，受让予Baxter Healthcare SA和Baxter International Inc.的国际申请，以及3)瑞典FSACT2001上WAVE BioTech的陈述。
USSN'866针对哺乳动物细胞中重组FVII的工业规模无血清生产。该申请概述了所用的细胞培养的各种方法，包括分批、补料分批和灌注。一些细胞截留装置建议用在培养容器中，包括外部沉头(settling head)、内部沉头、连续离心机、内部或者外部旋转过滤器、外部过滤器或者中空纤维筒、超声波细胞分离装置和一段培养容器内的管(7页，0106-0113)。所用细胞系是CHO。该申请主要关注的是将微载体用作细胞截留系统。
WO'725针对在连续细胞培养中生产感兴趣的多肽或者病毒的方法。该申请中描述了“恒化器样”连续细胞培养系统，其结合了灌注开放系统和恒化器开放系统的优势。这种混合系统用于培养哺乳动物细胞。提到的细胞截留系统是大孔微载体，例如纤维素基颗粒。
感兴趣的具体多肽是解聚素样的以及金属肽酶，和1型血小板反应蛋白基序13(ADAMTS 13)蛋白。
WAVE Biotech的陈述公开了一次性生物反应器中的灌注细胞培养，并尤其涉及“新概念-浮滤器(floating filter)”。这种灌注浮滤器随着内部的波动而移动。
在所有这些文献中，主要的焦点在于使用灌注来提高细胞密度，因此达到更高体积生产率。还讨论了灌注的优势是为了更好的产物质量和一致性。利用本发明来提高细胞生产率，这通过采用并操作联合了灌注细胞培养系统的基于膜的外部细胞截留系统而实现。
发明内容
本文提供一种提高哺乳动物细胞的细胞表达的方法，其包括使用和灌注生物反应器联合的基于膜的外部细胞截留系统。优选的哺乳动物细胞是CHO、BHK以及人细胞。重组蛋白是利用基于膜的细胞截留系统来进行表达的尤其有利的候选者。这种系统可用于灌注细胞培养来生产凝血蛋白，所述凝血蛋白选自：重组因子IX(rFIX)、重组因子VIII(rFVIII)、B结构域缺失的重组VIII(BDD rFVIII)、重组因子FVII以及重组因子VIIa(rFVII/rFVIIa)。通过应用一次性灌注系统来优化方法，其中所述一次性灌注系统包含一次性生物反应器以及一次性基于膜的外部细胞截留系统。优选的基于膜的细胞截留系统由中空纤维组成。
附图说明
图1在x轴上显示天，以及在y轴上显示产物BDD rFVIII的相对(归一化的)滴度。图2在x轴上显示天，以及在y轴上显示(归一化的)特定的生产率。
具体实施方式
膜系统获自Refine Technologies(Pine Brook,NJ)。各个图中的实心方块显示常规的、非-基于膜的细胞截留系统(获自Applikon(福斯特市，CA)的BioSep)的结果。各个图中的空心圈显示获自Refine Technologies(Pine Brook,NJ)的基于膜的细胞截留系统的结果。对于CHO细胞系，在相同条件下运行生物反应器，CHO细胞系能够产生感兴趣的重组蛋白，B结构域缺失的rFVIII。
当使用基于膜的截留系统，并且和常规的、非-基于膜的细胞截留系统比较，于2012年获得本数据。图显示基于膜的截留系统中细胞的滴度和特定生产率明显加倍。使用相同的细胞、介质运行这些生物反应器，并且使用相同的pH、温度等进行操作。
细胞生产率(每个细胞每天产生的产物量)是细胞的固有性质，预期不随着操作模式而变化。在此处，我们提出了一种灌注细胞培养系统，通过控制生物反应器中的细胞环境和细胞生理状态，其能够真正地直接影响细胞的蛋白表达。通过利用外部细胞截留膜和灌注系统的联合，本发明提供了改善的细胞生产率，尤其在哺乳动物细胞中，所述外部细胞截留膜不仅截留细胞，还有培养物中源自细胞的因子。本发明适用于很多哺乳动物细胞培养，比如CHO、BHK以及人细胞系，尤其是CHO，还适用于表达多种重组蛋白，例如抗体和凝血蛋白，比如重组因子IX(rFIX)、重组因子VIII(rFVIII)、B结构域缺失的重组FVIII(BDDrFVIII)、重组因子VII以及重组因子VIIa(rFVII/rFVIIa)。细胞截留膜可以是平的膜，或者，优选中空纤维膜。
在和合作者讨论的过程中，在2011年提出了基于膜的细胞截留系统用于重组蛋白细胞培养的用途。一些专家不屑于这一想法，但是对比另一种(非-膜)细胞截留系统进行了测试，证实基于膜的细胞截留系统提供了至少50％至高达100％(两倍)的生产率显著改善。
在优选的模式中，生物反应器以及细胞截留膜系统由一次性材料制成，提供了单次的使用，没有清洗、没有蒸汽也没有硬质管路系统。优选的细胞截留膜在生物反应器外部，并且由中空纤维组成。
能够用作生物反应器的适合的一次性容器可购自一些商业来源，比如GEHealthcare，商品名为Wave或者Xcellerex；以及来自ThermoFisher，商品名为HycloneSUB；以及来自Sartorius，商品名为Biostat STR。
平板细胞膜以及中空纤维膜用于外部细胞截留筒，可源自GE Healthcare(Boston,MA)、Spectrum Labs(Rancho Dominguez,CA)、Refine Technologies(PineBrook,NJ)或者Pall Corporation(Port Washington,NY)。
实施例
在相同条件下(pH、温度、细胞密度、溶解氧、体积流速(volumetric flow rate)、介质、细胞系等)操作两套灌注生物反应器，一个用基于膜的灌注系统(生物反应器运行3D53)，一个用非-膜系统(生物反应器运行3D51)。这些生物反应器中的细胞密度控制在相同水平，监测生物反应器每日的生产率，测量滴度(产物浓度)。基于细胞密度和生物反应器生产率，计算细胞特定的(细胞)生产率。
膜系统获自Refine Technologies(Pine Brook,NJ)。常规的非-膜系统BIOSEP获自Applikon(福斯特市，CA)。
图显示基于膜的截留系统中细胞的滴度和特定生产率明显翻倍。图1和2中的实心方块显示常规的、非-基于膜的细胞截留系统(获自Applikon(福斯特市，CA)的BioSep)的结果。各个图中的空心圈显示获自Refine Technologies(Pine Brook,NJ.)的基于膜的细胞截留系统的结果。
考虑到以上公开，认为本领域技术人员将进行众多变化。因此，意图上述公开和实施例应当解释为仅仅是示例性的，并且本发明的范围应当仅受限于随后的权利要求。
Claims (9)
1.一种提高哺乳动物细胞的细胞表达的方法，其包括和灌注细胞培养联合使用的基于膜的外部细胞截留系统。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述提高哺乳动物细胞的细胞表达的方法用于生产重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所表达的重组蛋白是凝血蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所表达的凝血蛋白选自：重组因子IX、重组FVIII、B结构域缺失的重组因子FVIII、重组VII以及重组因子VIIa。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自CHO、BHK以及哺乳动物细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述和灌注细胞培养联合使用的基于膜的外部细胞截留系统能够表达B结构域缺失的重组因子VIII，并且相比未采用膜过滤系统的细胞截留系统所得的生产而言，在B结构域缺失的重组FVIII蛋白的生产中提供至少50％的提高。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在一次性的生物反应器中进行灌注细胞培养。
8.根据权利要求1所述的方法，其中基于膜的细胞截留系统是一次性的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中细胞培养系统是一次性的，因为包含灌注系统的所述生物反应器以及所述基于膜的外部细胞截留系统均是一次性的。
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