CN106404952B - 一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物检测技术领域，具体来说，涉及到一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法。所述测定方法具体步骤为：采用十八烷基硅烷键合硅胶柱或N‑氧化石松碱M键合硅胶柱，以磷酸盐缓冲液‑乙腈为流动相，进行梯度洗脱，检测波长为250‑280nm，柱温为10‑30℃，流速为0.8‑3ml/min，进样量为20‑70uL。与现有技术相比，本发明所述溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法实现了溴芬酸钠与其有关物质的分离与分析，并且分离度好，专属性强、灵敏度高，可以采用不加校正因子的自身对照法对这三个已知杂质进行定量。该测定方法对于溴芬酸钠滴眼液的质量控制具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体来说，涉及到一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法。
背景技术
溴芬酸钠是2-氨基-3-苯甲酰基苯乙酸类衍生物，其结构与酮洛芬和双氯芬酸类似，能抑制环氧合酶介导的前列腺素类炎症介质的合成，是最有效的环氧合酶抑制剂之一，具有强力消炎镇痛作用，作用强度是其它的非甾体抗炎药(NSAIDs)的10倍。药理实验显示,溴芬酸钠对花生四烯酸、角叉菜胶所致的大鼠实验性急性结膜浮肿有抗炎作用；几乎完全抑制家兔前房穿刺后激光照射所致的房水蛋白浓度增加。日本已于2000年批准Senju公司溴芬酸钠滴眼液上市，商品名为XibromTM，规格为5ml:5mg，临床用于外眼部及前眼部的炎症性疾病的对症治疗：眼睑炎、结膜炎、强膜炎(包括上强膜炎)、术后炎症等。
溴芬酸钠滴眼液在放置的过程中，会产生降解杂质，而影响产品的质量。这几个杂质即药物质量控制中的有关物质，对于溴芬酸钠滴眼液控制的杂质主要有三个：杂质1：2-氨基-3-(4-溴代苯甲酰基)苯甲酸、杂质2：2-氨基-3-(4-溴代苯甲酰基)苯甲酰甲酸、杂质3：7-(4-溴代苯甲酰基)吲哚啉-2,3-二酮。对与降解产生的有关物质，在制剂中需要进行质量控制的，因此，实现溴芬酸钠与其有关物质的分离与分析，对于溴芬酸钠滴眼液的质量控制具有重要的现实意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种分离度好，专属性强、灵敏度高的溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法。
本发明所述的一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法，所述测定方法具体步骤为：采用十八烷基硅烷键合硅胶柱或N-氧化石松碱M键合硅胶柱，以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，进行梯度洗脱，检测波长为250-280nm，柱温为10-30℃，流速为0.8-3ml/min，进样量为20-70uL。
本发明所述的一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法，所述柱温为室温；所述检测波长为266nm；
本发明所述的一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法，所述流速为调节溴芬酸钠的出峰时间为18min；所述进样量为60uL。
本发明所述的一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法，所述洗脱梯度：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 20.1 | 100 | 0 |
| 60.1 | 10 | 90 |
| 60.2 | 100 | 0 |
| 80 | 100 | 0 |
其中所述的流动相A为磷酸盐缓冲液:乙腈＝75:25；流动相B为磷酸盐缓冲液-乙腈＝30:70；所述磷酸盐缓冲液为取磷酸氢二铵2.64g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至7.3所得。
本发明所述的一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法，所述N-氧化石松碱M键合硅胶柱的制备步骤为：1)取20g活化的硅胶于500mL三口瓶中，再量取100mL甲苯和40mL的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，120℃下油浴，搅拌回流13h，待冷却后，产物依次用甲苯，乙醇洗涤抽滤至无胶状物存在；在60℃下干燥24h，干燥箱内冷却；2)在500mL的单口瓶中加入步骤1)的产物，然后依次加入120mL 35％的甲醛溶液和2mL的乙酸溶液，室温搅拌反应2h，经无水乙醇抽滤后，置于500mL三口瓶中备用；取N-氧化石松碱M 4g溶于适量水溶液中，调节溶液的pH值至8.0，加入上述三口瓶中，60℃搅拌下反应10h；待产物冷却，依次用大量二次水、无水乙醇洗涤抽滤至滤液清亮；60℃恒温干燥6h，于干燥箱内冷却后装棕色瓶内得N-氧化石松碱M键合硅胶；3)将N-氧化石松碱M键合硅胶常规装柱，即得。
本发明所述的一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法，所述测定方法具体步骤为：
1)精密量取溴芬酸钠滴眼液5ml，置50ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；
2)精密称取溴芬酸钠水合物对照品25mg，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，制成每1ml中约含无水溴芬酸钠0.93mg的溶液，摇匀，作为对照品溶液贮备液；另精密量取对照品溶液贮备液1ml，置200ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
3)精密称取聚维酮K30对照品200mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成每1ml中含20mg的溶液，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为空白溶液；
4)精密量取对照品溶液、对照溶液、空白溶液和供试品溶液各60μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其他单一杂质峰面积与对照溶液主峰面积相比较；除聚合物外，各杂质峰面积的和与对照溶液主峰面积相比较；
5)计算公式
式中：SK为空白溶液中聚维酮K30的峰面积；
SX为供试品溶液中与空白溶液聚维酮K30峰保留时间相对应峰的峰面积；
S对为对照品溶液的峰面积；
C样为供试品溶液的标示浓度；C对为对照品溶液的浓度；
W对为对照品的重量，mg；
1.076为溴芬酸钠的水合物与无水溴芬酸钠的换算因子。
式中：S杂、S对分别为其它单个杂质峰面积与对照溶液的主峰面积；
S和为除聚合物外，各杂质峰面积的和。
与现有技术相比，本发明所述溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法实现了溴芬酸钠与其有关物质的分离与分析，并且分离度好，专属性强、灵敏度高，可以采用不加校正因子的自身对照法对这三个已知杂质进行定量。该测定方法对于溴芬酸钠滴眼液的质量控制具有重要的现实意义。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明所述溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法做进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
利用液相色谱法分析溴芬酸钠滴眼液的有关物质，采用N-氧化石松碱M键合硅胶柱，以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，进行梯度洗脱，检测波长为266nm，流速为调节溴芬酸钠的出峰时间为18min左右，柱温为室温，进样量为60uL；洗脱梯度程序具体为：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 20.1 | 100 | 0 |
| 60.1 | 10 | 90 |
| 60.2 | 100 | 0 |
| 80 | 100 | 0 |
其中所述的流动相A：磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二铵2.64g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至7.3)-乙腈(75:25)；流动相B：磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二铵2.64g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至7.3)-乙腈(30:70)。
所述N-氧化石松碱M键合硅胶柱的制备步骤为：1)取20g活化的硅胶于500mL三口瓶中，再量取100mL甲苯和40mL的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，120℃下油浴，搅拌回流13h，待冷却后，产物依次用甲苯，乙醇洗涤抽滤至无胶状物存在；在60℃下干燥24h，干燥箱内冷却；2)在500mL的单口瓶中加入步骤1)的产物，然后依次加入120mL 35％的甲醛溶液和2mL的乙酸溶液，室温搅拌反应2h，经无水乙醇抽滤后，置于500mL三口瓶中备用；取N-氧化石松碱M 4g溶于适量水溶液中，调节溶液的pH值至8.0，加入上述三口瓶中，60℃搅拌下反应10h；待产物冷却，依次用大量二次水、无水乙醇洗涤抽滤至滤液清亮；60℃恒温干燥6h，于干燥箱内冷却后装棕色瓶内得N-氧化石松碱M键合硅胶；3)将N-氧化石松碱M键合硅胶常规装柱，即得。
确证试验：
1.波长的选择
精密称取杂质1、杂质2和杂质3各约10mg，分别置100ml量瓶中，均用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，于200～400nm进行紫外扫描，杂质1、杂质2和杂质3在266nm波长处有较大吸收。
2.分离专属性试验
供试品溶液：精密称取溴芬酸钠原料约10mg，置100ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为供试品溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
中间体Ⅴ溶液：精密称取中间体Ⅴ约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为中间体Ⅴ溶液。
杂质1溶液：精密称取杂质1约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为杂质1溶液。
杂质2溶液：精密称取杂质2约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为杂质2溶液。
杂质3溶液：精密称取杂质2约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为杂质3溶液。
空白辅料溶液：按处方量的辅料，配制空白辅料溶液。
混合溶液：精密称取溴芬酸钠原料约20mg，置200ml量瓶中，加入上述杂质溶液各1ml，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含溴芬酸钠0.1mg、杂质各0.5μg的溶液，作为混合溶液。
取对照溶液60μl注入液相色谱仪，调整流速使溴芬酸钠水合物的保留时间约为18分钟，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％～30％；再取空白辅料溶液、杂质1溶液、杂质2溶液、杂质3溶液、中间体Ⅴ溶液、混合溶液及供试品溶液各60μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序为杂质1、溴芬酸钠、杂质2、杂质3、中间体Ⅴ。试验结果表明，和以往采用十八烷基硅烷键合硅胶柱相比，采用N-氧化石松碱M键合硅胶柱后，各杂质峰之间分离更好，溶剂峰及辅料峰不影响主峰及杂质峰的检出，同时对流动相的梯度洗脱条件选择性要求相对可以更低。
3.检出限
(1)溴芬酸钠精密称取溴芬酸钠约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置200ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，精密吸取60μl注入液相色谱仪，从图中可看出，此时信噪比(S/N)约为3，即在该色谱条件下，溴芬酸钠的检测限为0.15ng，相对于供试品溶液中溴芬酸钠的定量限为0.0025％。
(2)杂质1精密称取杂质1约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，再精密吸取2ml，置10ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，精密吸取60μl注入液相色谱仪，记录色谱图，从图中可看出,此时信噪比(S/N)约为3，即在该色谱条件下，杂质1的最小检出量为0.24ng，相对于供试品溶液中溴芬酸钠的最小检出限为0.004％。
(3)杂质2精密称取杂质2约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置100ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，精密吸取60μl注入液相色谱仪，记录色谱图，从图中可看出，此时信噪比(S/N)约为3，即在该色谱条件下，杂质2的最小检出量为0.24ng，相对于供试品溶液中溴芬酸钠的最小检出限为0.004％。
(4)杂质3精密称取杂质Ⅲ约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置100ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，精密吸取60μl注入液相色谱仪，记录色谱图，从图中可看出，此时信噪比(S/N)约为3，即在该色谱条件下，杂质3的最小检出量为0.24ng，相对于供试品溶液中溴芬酸钠的最小检出限为0.004％。
4.定量限
(1)溴芬酸钠精密称取溴芬酸钠约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，精密吸取60μl注入液相色谱仪，从图中可看出，此时信噪比(S/N)约为10，即在该色谱条件下，溴芬酸钠的定量限为0.6ng，相对于供试品溶液中溴芬酸钠的定量限为0.01％，测定液连续进样6次的标准偏差RSD小于2.0％。
(2)杂质1精密称取杂质1约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，精密吸取60μl注入液相色谱仪，记录色谱图，此时信噪比(S/N)约为10，即在该色谱条件下，杂质1的定量限为0.6ng，相对于供试品溶液中溴芬酸钠的定量限为0.01％，测定液连续进样6次的标准偏差RSD小于2.0％。
(3)杂质2精密称取杂质2约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，精密吸取60μl注入液相色谱仪，记录色谱图，此时信噪比(S/N)约为10，即在该色谱条件下，杂质2的定量限为0.6ng，相对于供试品溶液中溴芬酸钠的定量限为0.01％，测定液连续进样6次的标准偏差RSD小于2.0％。
(4)杂质3精密称取杂质3约10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，精密吸取60μl注入液相色谱仪，记录色谱图，此时信噪比(S/N)约为10，即在该色谱条件下，杂质3的定量限为0.6ng，相对于供试品溶液中溴芬酸钠的定量限为0.01％，测定液连续进样6次的标准偏差RSD小于2.0％。
5.杂质校正因子的测定
精密称取溴芬酸钠对照品、杂质1、杂质2和杂质3各约10mg，分别置100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，各精密量取1ml，分别置200ml量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀。
分别精密取上述溶液各60μl进样，记录色谱图，同法，分别测定六次，具体结果见下表。
由以上数据可知，杂质1、杂质2和杂质3相对响应因子均在0.9-1.1范围内，所以可以采用不加校正因子的自身对照法对这三个已知杂质进行定量。
Claims (5)
1.一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法，其特征在于，所述测定方法具体步骤为：采用N-氧化石松碱M键合硅胶柱，以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，进行梯度洗脱，检测波长为250-280nm，柱温为10-30℃，流速为0.8-3mL/min，进样量为20-70μL；
所述洗脱梯度：
其中所述的流动相A为磷酸盐缓冲液:乙腈＝75:25；流动相B为磷酸盐缓冲液-乙腈＝30:70；所述磷酸盐缓冲液为取磷酸氢二铵2.64g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至7.3所得。
2.根据权利要求1所述的一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法，其特征在于，所述柱温为室温；所述检测波长为266nm。
3.根据权利要求1所述的一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法，其特征在于，所述流速为调节溴芬酸钠的出峰时间为18min；所述进样量为60μL。
4.根据权利要求1所述的一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法，其特征在于，所述N-氧化石松碱M键合硅胶柱的制备步骤为：1)取20g活化的硅胶于500mL三口瓶中，再量取100mL甲苯和40mL的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，120℃下油浴，搅拌回流13h，待冷却后，产物依次用甲苯，乙醇洗涤抽滤至无胶状物存在；在60℃下干燥24h，干燥箱内冷却；2)在500mL的单口瓶中加入步骤1)的产物，然后依次加入120mL 35％的甲醛溶液和2mL的乙酸溶液，室温搅拌反应2h，经无水乙醇抽滤后，置于500mL三口瓶中备用；取N-氧化石松碱M 4g溶于适量水溶液中，调节溶液的pH值至8.0，加入上述三口瓶中，60℃搅拌下反应10h；待产物冷却，依次用大量二次水、无水乙醇洗涤抽滤至滤液清亮；60℃恒温干燥6h，于干燥箱内冷却后装棕色瓶内，得N-氧化石松碱M键合硅胶；3)将N-氧化石松碱M键合硅胶常规装柱，即得。
5.根据权利要求1所述的一种溴芬酸钠滴眼液有关物质的测定方法，其特征在于，所述测定方法具体步骤为：
1)精密量取溴芬酸钠滴眼液5mL，置50mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1mL，置200mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；
2)精密称取溴芬酸钠水合物对照品25mg，置25mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，制成每1mL中约含无水溴芬酸钠0.93mg的溶液，摇匀，作为对照品溶液贮备液；另精密量取对照品溶液贮备液1mL，置200mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
3)精密称取聚维酮K30对照品200mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成每1mL中含20mg的溶液，摇匀，精密量取5mL，置50mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为空白溶液；
4)精密量取对照品溶液、对照溶液、空白溶液和供试品溶液各60μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其他单一杂质峰面积与对照溶液主峰面积相比较；除聚合物外，各杂质峰面积的和与对照溶液主峰面积相比较。
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: Tongji Science and Technology Industrial Park, high tech Zone, Jining City, Shandong Province Patentee after: Shandong Chenxin Fodu Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: Tongji Science and Technology Industrial Park, high tech Zone, Jining City, Shandong Province Patentee before: Chenxin Fudu Pharmaceutical (Wenshang) Co.,Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |