CN106282379B - 杂交黄颡鱼的ch4酶切鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，利用PCR扩增后的CH4基因片段在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼之间具有种间序列差异，以限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT，采用RFLP方法分析鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代。从分子生物学层面上将形态上不易区分的杂种和纯种进行区分，具有实验快捷，操作简便，鉴定直观，无需测序的优点。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类杂种的鉴定方法，具体涉及水产养殖黄颡鱼杂种的CH4分子标记鉴定方法。
背景技术
黄颡鱼属鱼类属于杂食性底层鱼类，以肉食为主，是鱼类进化中最发达的真骨鱼类之一。黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)和瓦氏黄颡鱼 (Pelteobaggrus vachelli)均属于鲇形目、鲿科、黄颡鱼属，两者味道鲜美、营养价值高，是重要的养殖鱼类。黄颡鱼分布于我国长江、黄河、珠江及黑龙江、辽宁等流域，喜栖息于开敞水体，营底栖生活，湾沱、河底砾石河段都适合它们栖息，1～2龄鱼生长较快，以后生长缓慢，其个体小、但对环境的适应能力强。瓦氏黄颡鱼分布于长江、珠江、钱塘江、淮河、黄河及其支流，长期与大型河流相通的大型湖泊中也有分布，为底栖性鱼类，栖息于江河缓流或湖泊静水环境中，1～3龄鱼生长快，之后相对缓慢，其个体在黄颡鱼属中最大，且肉质细嫩、刺少，具有重要的经济价值。
为了满足社会生产的需要，获得兼有以上两种鱼优良性状的苗种，王卫民等(黄颡鱼♀与瓦氏黄颡鱼♂的杂交研究[J].淡水渔业，2002.32(3):3-5) 开展了黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的杂交育种试验，对杂交和自交的卵受精率、孵化率和出苗率进行了对比分析。之后赵文学等(黄颡鱼属物种的RAPD分子鉴定及杂种遗传分析[J].2006.30(1):101-105)进行了黄颡鱼属及其杂交种的种质鉴定，然而，该鉴定工作所采用的RAPD标记，受方法本身的限制，检测效率低且重复性不高，严重影响了这一方法的推广使用。鉴于此，有必要丰富黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代的分子标记及鉴定技术，为黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂种的养殖和育种实践提供参考。
发明内容
本发明为了鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种(本发明涉及的杂交种均为♀黄颡鱼X瓦氏黄颡鱼♂所产生的杂交种)，提供了一种杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，从分子生物学层面上将形态上不易区分的杂种和纯种进行区分。
本发明以黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代为研究对象，在黄颡鱼属鱼类中筛选了CH4基因片段作为分子标记，应用CH4基因片段的RFLP分析，成功鉴定了黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代。
为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：
杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，利用PCR扩增后的CH4基因片段在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼之间具有种间序列差异，以限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT，采用RFLP方法分析鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代。
CH4基因片段是免疫球蛋白重链编码基因外显子的一部分，在近缘种间高度保守。本发明发现CH4基因片段在黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼之间存在种间序列差异，将CH4基因片段的RFLP分析用于黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代的鉴定，具有实验快捷，操作简便，鉴定直观，无需测序的优点。
本发明所述杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，具体包括以下步骤：
A、取待测鱼的组织样本，提取基因组DNA；
B、以提取到的基因组DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；
C、对扩增出的目的基因片段采用限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT；
D、琼脂糖凝胶电泳检测PCR-RFLP产物，经电泳检测，在同一个泳道上只有一条带，即未被酶切的，为瓦氏黄颡鱼；在同一泳道上有两条带，即被完全酶切的，为黄颡鱼；在同一泳道上有三条带，即来自黄颡鱼的基因片段被酶切，而来自于瓦氏黄颡鱼的基因片段未被酶切的，为杂交种。
优选地，在一个泳道上同时出现长度为300bp、140bp和160bp的三条DNA 标记条带的，为瓦氏黄颡鱼和黄颡鱼的杂交种。
所述B步骤中的专用引物为CH4基因片段专用引物，引物对为：
正向引物(SEQID NO:3)5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’；
反向引物(SEQID NO:4)5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’。
采用所述专用引物扩增得到黄颡鱼的CH4基因片段的核苷酸序列为SEQID NO:1。
采用所述专用引物扩增得到瓦氏黄颡鱼的CH4基因片段的核苷酸序列为 SEQIDNO:2。
所述的C步骤中，使用PCR仪进行酶切实验，限制性酶切CH4基因片断的步骤为：8μLCH4-PCR扩增产物，加入1-1.5μL酶切反应缓冲液，0.5-1μL限制性核酸内切酶HindⅢ，37℃酶切2.5h，酶切位点为A↓AGCTT。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的鉴定方法是依据目的基因序列，找出黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼中 CH4基因的差异位点，设计限制性内切酶的酶切位点A↓AGCTT，据此筛选出只能限制性酶切黄颡鱼CH4基因片段的限制性内切酶为HindⅢ，通过酶切产生长度不等的酶切片段，有效研究黄颡鱼的种群种质、鉴定杂种。
2、本发明采用DNA序列作为分子标记，因此可以准确快速地将形态上不易区分的杂种黄颡鱼和纯种黄颡鱼进行区分，并确定出杂交黄颡鱼(♀黄颡鱼X 瓦氏黄颡鱼♂)。采用CH4基因片段的RFLP分析鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代，与RAPD分子鉴定进行比较，由于RAPD使用的是随机引物，在对近缘种进行PCR扩增后得到的序列极有可能相同，所以需要使用多个随机引物，且还需要使用带谱组合法对其进行分析才能确保结果的可靠性。而本发明是使用特定的引物进行PCR扩增，对扩增得到的CH4片段进行测序，并使用了MEGA5对序列结果进行了比对分析，种内的相似度接近100％；酶切后观察电泳条带的数量得出种内结果完全一致的结论，种间差异明显，其结果更加可靠，重复性强，且实验快捷，操作简便，无需测序。
附图说明
图1为HindIII酶切分析黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代(♀黄颡鱼X瓦氏黄颡鱼♂)的CH4基因条带。
图中标记为：图1左侧数字均表示DNA片段的分子量，H0表示未进行酶切的黄颡鱼基因片段，H1～H7表示进行了酶切反应的黄颡鱼基因片段；Z0表示未进行酶切的杂交种的基因片段，Z1～Z7表示进行了酶切反应的杂交种的基因片段； W0表示未进行酶切的瓦氏黄颡鱼的基因片段，W1～W7表示进行了酶切反应的瓦氏黄颡鱼的基因片段。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
实施例1
杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，利用PCR扩增后的CH4基因片段在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼之间具有种间序列差异，以限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT，采用RFLP方法分析鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代。
实施例2
杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，具体包括以下步骤：
A、取待测鱼的组织样本，提取基因组DNA；
B、以提取到的基因组DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；
C、对扩增出的目的基因片段采用限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT；
D、琼脂糖凝胶电泳检测PCR-RFLP产物，经电泳检测，在同一个泳道上只有一条带，为瓦氏黄颡鱼；在同一泳道上有两条带，为黄颡鱼；在同一泳道上有三条带，为杂交种。
实施例3
杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，具体包括以下步骤：
A、取待测鱼的组织样本，提取基因组DNA；
B、以提取到的基因组DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；
C、对扩增出的目的基因片段采用限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT；
D、琼脂糖凝胶电泳检测PCR-RFLP产物，经电泳检测，在同一个泳道上只有一条带，为瓦氏黄颡鱼。
所述B步骤中的专用引物为CH4基因片段专用引物，引物对为：
正向引物5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’；
反向引物5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’。
实施例4
杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，具体包括以下步骤：
A、取待测鱼的组织样本，提取基因组DNA；
B、以提取到的基因组DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；
C、对扩增出的目的基因片段采用限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT；
D、琼脂糖凝胶电泳检测PCR-RFLP产物，经电泳检测，在同一泳道上有两条带，为黄颡鱼。
所述B步骤中的专用引物为CH4基因片段专用引物，引物对为：
正向引物5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’；
反向引物5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’。
所述的C步骤中，使用PCR仪进行酶切实验，限制性酶切CH4基因片断的步骤为：8μLCH4-PCR扩增产物，加入1μL酶切反应缓冲液，0.5μL限制性核酸内切酶HindⅢ，37℃酶切2.5h，酶切位点为A↓AGCTT。
实施例5
杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，具体包括以下步骤：
A、取待测鱼的组织样本，提取基因组DNA；
B、以提取到的基因组DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；
C、对扩增出的目的基因片段采用限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT；
D、琼脂糖凝胶电泳检测PCR-RFLP产物，经电泳检测，在同一泳道上有三条带，为瓦氏黄颡鱼和黄颡鱼的杂交种。
所述B步骤中的专用引物为CH4基因片段专用引物，引物对为：
正向引物5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’；
反向引物5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’。
所述的C步骤中，使用PCR仪进行酶切实验，限制性酶切CH4基因片断的步骤为：8μLCH4-PCR扩增产物，加入1.5μL酶切反应缓冲液，1μL限制性核酸内切酶HindⅢ，37℃酶切2.5h，酶切位点为A↓AGCTT。
实施例6
杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，具体包括以下步骤：
A、取待测鱼的组织样本，提取基因组DNA；
B、以提取到的基因组DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；
C、对扩增出的目的基因片段采用限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT；
D、琼脂糖凝胶电泳检测PCR-RFLP产物，经电泳检测，在一个泳道上同时出现长度为300bp、140bp和160bp的三条DNA标记条带，为瓦氏黄颡鱼和黄颡鱼的杂交种。
所述B步骤中的专用引物为CH4基因片段专用引物，引物对为：
正向引物5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’；
反向引物5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’。
所述的C步骤中，使用PCR仪进行酶切实验，限制性酶切CH4基因片断的步骤为：8μLCH4-PCR扩增产物，加入1.2μL酶切反应缓冲液，0.6μL限制性核酸内切酶HindⅢ，37℃酶切2.5h，酶切位点为A↓AGCTT。
实施例7
水产养殖杂交黄颡鱼的CH4分子标记RFLP鉴定方法，以黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交F1代作为研究对象，包括以下步骤：
第一步，分别取黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代样本，提取DNA。
基因组DNA提取：
用海洋组织DNA提取试剂盒(Tiangen公司)提取黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼、杂交样本的基因组DNA。
琼脂糖凝胶电泳检测模板DNA：
制备1％的琼脂糖凝胶，并将3μL DNA溶液加入点样缓冲液并混匀上样电泳。110V电压电泳15min。电泳后根据紫外透射检测仪上电泳带的亮度来确定模板DNA的浓度，并相应稀释模板，使DNA模板的浓度最终约为50～100ng/μL。
第二步，分别以黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代样本的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增。
(1)PCR扩增
PCR用来扩增黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的免疫球蛋白M的重链保守区DNA外显子序列CH4。CH4引物采用CH4-F(5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’)和CH4-R(5’ -CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’)，均由TSINGKE公司合成。
CH4-F和CH4-R为扩增CH4目的片段的引物对，其中的F代表上游引物(或正向引物)，R代表下游引物(或反向引物)。
反应体系为26μL，将各组分按以下顺序依次在0.15mL的PCR管中混合：
扩增步骤为：
(2)PCR产物检测与测序
用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选择结果较好的产物送到生物公司进行测序。
测序验证其序列信息，发现CH4基因片断存在种间序列差异，进行后期RFLP 鉴定杂种的实验。
第三步，特异酶切片断标记的产生。
(1)数据分析及限制性酶切设计
采用DNAMAN Vers ion 6对黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼的CH4测序结果分别进行比对，应用引物设计软件Primer 5.0查找序列中的可用酶切位点并筛选其中高度稳定的位点。CH4基因片段选取限制性核酸内切酶HindⅢ(Takara公司)，酶切位点为A↓AGCTT，限制性酶切黄颡鱼CH4基因。
杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，利用PCR扩增后的CH4基因片段在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼之间具有种间序列差异，通过Primer5软件筛选出合适的内切酶，对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代的CH4基因片段进行鉴别。筛选过程中，先分别筛选出黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼各自的限制性内切酶，然后排除两者中相同的内切酶，得到只能特异性内切黄颡鱼CH4基因片段的内切酶和只能特异性内切瓦氏黄颡鱼CH4基因片段的内切酶，之后对这些酶的酶切位点进行比较分析。由于该片段短，仅有303bp，若该酶的酶切位点不只一个，酶切后片段会小于100bp，在进行电泳鉴定时其条带易与引物二聚体混淆，得到的鉴定效果不好，所以应尽量选择只有一个酶切位点的内切酶，且其酶切后的基因片段大于100bp，这样电泳鉴定时效果最佳。经过筛选，决定以限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT，采用RFLP方法分析鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代。
(2)PCR制备酶切底物
在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代中PCR扩增CH4基因片段，PCR体系和参数同上。经1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将检测良好的产物用于后续酶切实验，检测不佳的优化PCR扩增条件后重新制备。
在冰上配制酶切反应体系，按以下顺序依次添加：
使用PCR仪进行酶切实验。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR-RFLP产物：
制备约2.5％的琼脂糖凝胶，将6μL酶切产物加入点样缓冲液并混匀，上样电泳，恒压100V电泳30min。电泳后用凝胶成像系统显现目的条带，对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交F1代进行PCR-RFLP分析。
结果显示：黄颡鱼的基因片段被完全酶切，杂交种的基因片段被部分酶切，瓦市黄颡鱼的基因片段未被酶切。
本发明选择了八尾黄颡鱼、十二尾瓦氏黄颡鱼进行CH4片段扩增，为了筛选酶切位点，对扩增得到的CH4片段进行了测序，并使用了MEGA5对序列结果进行了比对分析，种内的相似度接近100％；进行酶切时，选择了黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代8个个体进行试验，每一种设置一个对照组，酶切后观察电泳条带的数量即可得出结论，种内的结果完全一致，种间差异明显，说明其结果可靠，重复性强，且之后进行鉴定时实验快捷，操作简便，无需测序。
本发明的琼脂凝胶制备方法如下：
1％的琼脂糖凝胶的制备方法
用天平称取0.5g琼脂糖，倒入50ml的1×TAE缓冲液中，摇匀后置于微波炉中加热至完全溶解，取出待稍凉后(防止高温使EB挥发)，加入EB 1μL。将制胶板(Bio-Rad公司)放置于水平位置，然后插入样品梳子。将之前配制的琼脂糖凝胶倒入制胶板内槽。冷却半小时待凝胶凝固后取出梳子，将凝胶放入电泳槽(Bio-Rad公司)内并加入1×TAE电泳缓冲液使其浸没凝胶。
2.5％的琼脂糖凝胶的制备方法
用天平称取1.25g琼脂糖，倒入50ml的1×TAE缓冲液中，摇匀后置于微波炉中加热至完全溶解，取出待稍凉后(防止高温使EB挥发)，加入EB 1μL。将制胶板(Bio-Rad公司)放置于水平位置，然后插入样品梳子。将之前配制的琼脂糖凝胶倒入制胶板内槽。冷却半小时待凝胶凝固后取出梳子，将凝胶放入电泳槽(Bio-Rad公司)内并加入1×TAE电泳缓冲液使其浸没凝胶。
本发明使用的主要仪器如下：
离心机(eppendorf公司，Centrifuge5424)
PCR仪(BIO-RAD公司,S1000Thermal Cycler)
电泳装置(BIO-RAD公司)
照胶仪(BIO-RAD公司，Universal Hood II)
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法
<130> 2016
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 303
<212> DNA
<213> 黄颡鱼
<400> 1
tccccaaggt ttacttgctc gctccaccag agggttcaaa ggacctggtg accctgactt 60
gctatgtaaa agacttctac cctaaggagg tggctgtgtc ttggcttgtt aacgatgaac 120
taaagaaatc agatccaagc ttcgtgcaga acaccactaa tgttattgag aatgacaacc 180
tcttttcggt ttacagccag cttattttcg atgctacaca ctgggatagt ggctctgttt 240
tcacctgtgg ggtttaccat gagtccattg aggatcctgt gcgccacata tccagatcca 300
tcg 303
<210> 2
<211> 303
<212> DNA
<213> 瓦氏黄颡鱼
<400> 2
tccccaaggt ttacttgctc gctccaccag agagttcaga gggcaggttg accctgactt 60
gctatgtaaa aggcttctac cctaaggagg tggctgtgtc ttggcttgtt aacgatgaac 120
aagtggattc agattcaaac tacgtgcaga gcaccactaa tgctattgag aaaaacaacc 180
tcttttcggt ttacagccag cttattttcg atgctgcacg ctggaatgat ggctctgttt 240
tcacctgcag ggttttccat gagtccattg aggatcctgt gcgccacata tccagatcca 300
tcg 303
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 3
tccccaaggt ttacttgctc gctcc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 4
cgatggatct ggatatgtgg cgcac 25
Claims (5)
1.杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，其特征在于，利用PCR扩增后的CH4基因片段在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼之间具有种间序列差异，以限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT，采用RFLP方法分析鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交子代；
具体包括以下步骤：
A、取待测鱼的组织样本，提取基因组DNA；
B、以提取到的基因组DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；
C、对扩增出的目的基因片段采用限制性核酸内切酶HindⅢ进行酶切，酶切位点为A↓AGCTT；
D、琼脂糖凝胶电泳检测PCR-RFLP产物，经电泳检测，在同一个泳道上只有一条带，为瓦氏黄颡鱼；在同一泳道上有两条带，为黄颡鱼；在同一泳道上有三条带，为杂交种；
所述B步骤中的专用引物为CH4基因片段专用引物，引物对为：
正向引物 5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’；
反向引物 5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’。
2.根据权利要求1所述杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，其特征在于，在一个泳道上同时出现长度为300bp、140bp和160bp的三条DNA标记条带的，为瓦氏黄颡鱼和黄颡鱼的杂交种。
3.根据权利要求1所述杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，其特征在于，采用所述专用引物扩增得到黄颡鱼的CH4基因片段的核苷酸序列为SEQID NO:1。
4.根据权利要求1所述杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，其特征在于，采用所述专用引物扩增得到瓦氏黄颡鱼的CH4基因片段的核苷酸序列为SEQID NO:2。
5.根据权利要求1所述杂交黄颡鱼的CH4酶切鉴定方法，其特征在于，所述的C步骤中，使用PCR仪进行酶切实验，限制性酶切CH4基因片断的步骤为：8μL CH4-PCR扩增产物，加入1-1.5μL酶切反应缓冲液，0.5-1μL限制性核酸内切酶HindⅢ，37℃酶切2.5h，酶切位点为A↓AGCTT。
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| 用RAPD和SCAR复合分子标记对黄颡鱼属进行物种鉴定;童芳芳;《水生生物学报》;20050720;第29卷(第4期);465-468 * |
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