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CN106282279A - 一种重组犬干扰素α标准品、其制备方法及效价测定方法 - Google Patents

一种重组犬干扰素α标准品、其制备方法及效价测定方法 Download PDF

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CN106282279A
CN106282279A CN201610725125.XA CN201610725125A CN106282279A CN 106282279 A CN106282279 A CN 106282279A CN 201610725125 A CN201610725125 A CN 201610725125A CN 106282279 A CN106282279 A CN 106282279A
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interferon
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符修乐
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马腾飞
王利利
高耀辉
汪良青
周炜
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Abstract

本发明公开了一种重组犬干扰素α标准品、其制备方法及效价测定方法。将表达重组犬干扰素α的BL21/pET‑28α‑rCaIFNα重组菌进行发酵和诱导，后直接收集菌体破碎后上清提取总蛋白；然后采用三步纯化法后得到该制剂的纯品，向纯品中加入冻干保护剂进行真空冷冻干燥后得到标准品，其效价为1.0×104IU/mL；SDS‑PAGE检测其纯度为97.34％；HPLC检测其纯度为99.79％；相对分子量为33KD。此方法制备的重组犬干扰素α作为标准品可用于重组犬干扰素α特性鉴别和效价测定的比对，以此为标准可使不同批次测定的重组犬干扰素α效价检测结果更为可靠可信。

Description

一种重组犬干扰素α标准品、其制备方法及效价测定方法
技术领域
本发明涉及一种重组干扰素标准品的制备方法，具体涉及一种重组犬干扰素α标准品、其制备方法及效价测定方法。
背景技术
随着社会进步和人民生活方式的改变，犬作为伴侣动物已成为人们生活的一部分。犬瘟热、犬细小等病毒性传染病严重危害养犬业的发展，目前无有效治疗药物，主要用疫苗接种进行预防，但免疫效果欠佳。同时，狂犬病等人畜共患病也引起人们的重视，因此，采用一种安全无副作用的药物来预防和治疗犬病毒病就显得尤为重要。
干扰素是一类由病毒及脂多糖等物质诱导机体产生的具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的蛋白质，1957年由Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤等的活性。按照干扰素的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三种型。现已知，干扰素α在体内可有选择性地作用于病毒感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用，但对正常宿主细胞无作用。
Himmler等在1987年首先对犬干扰素α进行了研究，我国也在1999年开始进行了相关研究，并得到了一系列犬干扰素相关产品。
对于生物制品来说，其质量评价的有效性指标多采用生物学方法，如动物法和细胞法等进行检测，这些方法本身变异性较大，因此，标准品是生产中必不可少的组成部分，在生物制品标准化、质量控制和效力评价中，标准品是药品质量评价的标尺，起着非常重要的作用。
目前已有人干扰素标准品面世，猪的干扰素标准品已获得发明专利，然而目前国际国内均没有重组犬干扰素α的标准品，由于干扰素具有种属特异性，人或者猪的的干扰素标准品并不适用于犬干扰素，这给犬干扰素在防治病毒性疾病中应用研究和生产工作带来很多不便。
发明内容
本发明提供了一种重组犬干扰素α标准品的制备方法，按照此方法制备的重组犬干扰素α抗病毒活性标准品效价为：1.0×104IU/mL；SDS-PAGE检测其纯度为97.34％；HPLC检测其纯度为99.79％；相对分子量为33KD。
本发明还提供了按照上述制备方法制备得到的重组犬干扰素α标准品，其N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CHLPDTHSLRWRVLTL。
本发明还提供了重组犬干扰素α标准品的效价测定方法。
本发明采取的技术方案为：
一种重组犬干扰素α标准品的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将重组犬干扰素α的重组菌进行发酵和诱导，直接收集菌体破碎后上清提取总蛋白，所述重组犬干扰素α的重组菌为BL21/pET-28α-rCaIFNα工程菌；
(2)总蛋白经亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化、分子筛层析纯化，即可得到重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液；
(3)重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液过滤除菌、稀释后加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制得重组犬干扰素α标准品。
所述步骤(1)具体包括以下步骤：
(1-1)培养工程菌BL21/pET-28α-rCaIFNα，得到工程菌菌液；
(1-2)将工程菌菌液按体积比1：10接种到LB培养基中，培养后作为发酵种子菌液；
(1-3)发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中进行发酵、诱导，得到发酵液；
(1-4)发酵液离心、破碎后收集上清液，即可得到重组犬干扰素α蛋白。
所述步骤(1-3)具体包括以下步骤：将发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中，发酵种子菌液与LB培养基的体积比为1:10，设置温度为37℃、溶氧为30％、转速为200～220r/min、pH为7.0～7.4条件下发酵；当发酵罐内的OD600达到1.0时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L，继续诱导表达4～6h，得到发酵液。
所述步骤(1-3)还包括：接种发酵种子菌液之前，装有LB培养基的发酵罐要进行原位灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。
所述步骤(1-4)具体包括以下步骤：将发酵液4℃条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200ml生理盐水重悬菌体，在900bar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次，4℃条件下8000r/min离心15min，收集上清；重复离心一次，收集上清液，即可得到重组犬干扰素α蛋白。
所述亲和层析纯化所用的洗脱液为50mMTris与20mM～500mM咪唑组成的混合液，pH为8.0～9.0。梯度洗脱，20mM～200mM咪唑洗脱杂蛋白，200mM～500mM咪唑洗脱目的蛋白。此步骤可以去除80％杂蛋白，使纯度达到80％。然后透析于50mM Tris与50mM NaCl组成的混合液,pH为6.5。
所述阴离子交换层析所用的洗脱液为50mM Tris与500mM NaCl组成的混合液，其pH值为6.5。洗脱下来的目的蛋白纯度在90％以上。
所述分子筛层析所用的洗脱液为50mM Na2HPO4与0.15M NaCl组成的混合液，其pH值为7.4。此步既可以更换缓冲液为磷酸盐缓冲液，又可以去除小分子杂蛋白，洗脱下来的目的蛋白纯度在98％左右。
采用以上三种层析柱进行纯化，既可以使得目的蛋白纯度达到95％以上，又可以去除大量的内毒素。
所述步骤(3)具体包括以下步骤：将重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，用PH值为7.4的10mmol/L PBS稀释后加入终浓度达10％(质量百分浓度)甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂混匀后，以2.2ml西林瓶容量分装，真空冷冻干燥后即可制得重组犬干扰素rCaIFN-α标准品。
本发明还提供了按照上述制备方法制备得到的重组犬干扰素α标准品，其N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CHLPDTHSLRWRVLTL。
所述重组犬干扰素α标准品的效价为1.0×104IU/mL；SDS-PAGE检测其纯度为97.34％；HPLC检测其纯度为99.79％；相对分子量为33KD。
本发明提供了重组犬干扰素α标准品的效价测定方法，牛肾细胞作为测试细胞，重组犬干扰素α标准品作为供试品，重组人干扰素α标准品作为对照品，将供试品和对照品分别制成不同的稀释度，在MDBK/VSV系统上对重组犬干扰素α标准品效价进行标定。
按照本发明方法制得的重组犬干扰素α标准品为冻干制剂，其优点为：效价高、稳定，以现有人标准干扰素作为参比准确，生产成本低廉。
目前国际国内均没有重组犬干扰素α的标准品，本发明提供一种重组犬干扰素α生物学活性检测用标准品的制备方法，为建立重组犬干扰素α质量标准奠定基础。
按此方法制备的重组犬干扰素α作为标准品可用于重组犬干扰素α特性鉴别和效价测定的比对，以此为标准可使不同批次测定的重组犬干扰素α效价检测结果更为可靠可信。
附图说明
图1为重组犬干扰素αHPLC C18反相层析C蛋白纯度检测结果图
图2为重组犬干扰素α免疫印迹检测结果图
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明均为自常规生化试剂商店购买得到的；所涉及的PBS缓冲溶液的pH值均为7.4；工程菌BL21/pET-28α-rCaIFNα的构建方法参见2008年1月9日公开的中国专利CN101100664。
实施例1
重组犬干扰素α标准品的制备
1.重组犬干扰素α蛋白溶液的制备
1.1将工程菌BL21/pET-28α-rCaIFNα接种于含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃培养16～24小时，将阳性克隆接种至3ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃摇床震荡培养18h，得到菌液；
1.2将步骤1.1得到的菌液接种至50ml培养基中，菌液与培养基的体积比为1:10，置37℃摇床培养18h，转速为200r/min，作为发酵种子菌液；
1.3将配好的LB培养基加到发酵罐中，连接pH探针、溶氧探针进行原位灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；
1.4将发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中，发酵种子菌液与LB培养基的体积比为1:10，设置温度为37℃、溶氧为30％、转速为220r/min、pH为7.2条件下发酵；当发酵罐内的OD600达到1.0时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L，继续诱导表达4h，得到发酵液；
1.5将发酵液4℃条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200ml生理盐水重悬菌体，在900bar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次，4℃条件下8000r/min离心15min，收集上清；重复离心一次，收集上清液，即可得到重组犬干扰素α蛋白。
2.重组犬干扰素α蛋白溶液的纯化
2.1His亲和层析
粗制的重组犬干扰素α用0.22μm孔径的滤膜过滤后，上样通过连接在AKTAexplorer 100蛋白纯化系统上，用Binding Buffer(PBS)平衡好的His亲和层析柱，用PBS缓冲液洗去未结合的蛋白，直到A280nm稳定，再用由Tris、咪唑组成的洗脱液洗脱，Tris的浓度为50mM，咪唑的浓度为20mM～500mM，收集rCaIFN-α蛋白峰。
2.2DEAE阴离子交换层析
将经过His亲和层析纯化后收集的蛋白置换到Binding BufferⅡ(50mMTrispH6.5)中后，上样通过用Binding BufferⅡ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，再用BindingBufferⅡ过柱至A280nm值稳定后用Elution BufferⅡ(50mMTris,500mM NaCl,pH6.5)线性梯度洗脱，收集rCaIFN-α蛋白峰。
2.3分子筛层析
将离子交换层析收集到的样品浓缩后上样通过用Binding BufferⅢ(50mMNa2HPO4 0.15M NaCl pH7.4)平衡好Superdex 200分子筛层析柱，用Binding BufferⅢ洗脱，收集rCaIFN-α蛋白峰。
3.重组犬干扰素α标准品的制备
将重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，用PH值为7.4的10mmol/L PBS稀释后加入终浓度达10％甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂混匀后，以2.2ml西林瓶容量分装。分装后迅速冷冻真空干燥，按制品冷冻真空干燥法进行，即可制得重组犬干扰素rCaIFN-α标准品。
实施例2
重组犬干扰素α标准品的检测
1.蛋白质含量测定
对上述纯化后的rCaIFN-α标准品用Lowry法检测蛋白浓度，其蛋白含量为0.4mg/ml。
2.SDS-PAGE进行纯度鉴定
对rCaIFN-α标准品进行SDS-PAGE鉴定纯度，其纯度为97.34％。
3.HPLC纯度鉴定
rCaIFN-α标准品经μRPC C18ST 4.6/100反相层析柱进行分析只得到一个主吸收峰如图2，有1个峰为杂峰。通过计算峰面积得出主峰面积占总面积的99.79％(图1)。
4.N-端氨基酸序列测定
4.1酶切：取纯化后的rCaIFN-α蛋白200μg，加4单位重组肠激酶，与酶切缓冲液中4℃条件下酶切16小时。
4.2SDS-PAGE电泳：取酶切产物进行SDS-PAGE电泳，上样前先将配置好的聚丙烯酰胺凝胶装到垂直电泳仪上，用50V恒压空跑30min。
4.3转膜：将蛋白电转到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上，电转缓冲液用CAPS缓冲液。
4.4立春红染色：将PVDF膜放到立春红染液中染色，待看到蛋白条带后拿出，用水洗去背景颜色。
4.5将目的条带剪下放于Eppendorf管中，-20℃保存，用Edman降解法进行N端氨基酸测序。
4.6N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CHLPDTHSLRWRVLTL。
实施例3
重组犬干扰素α标准品的效价测定
本检测方法根据rCaIFN-α可以保护牛肾细胞(MDBK)免受水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的侵害作用的原理，以干扰素抑制病毒致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)现象作为检测其活性的方法。即以每毫升干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的稀释度的倒数定为干扰素单位(或称效价)，常以单位(U)表示，并用国家标准品校正结果。该结果经用结晶紫染料对存活MDBK细胞染色观察后，根据着色深浅，按Reed-Munch公式计算出所测定干扰素的效价。
1.实验材料
重组人干扰素α标准品：购自北京中国食品药品鉴定研究院，干扰素α国家标准品，批号：97/04，下称标化干扰素；
细胞：牛肾细胞(MDBK)，购自ATCC；
病毒：攻击病毒为水疱性口炎病毒(VSV)，由安徽医科大学临床病毒研究所惠赠。
96孔细胞培养板：其编号方法为：从左至右的12列分别用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12进行编号；从上至下的前五行分别用A、B、C、D、E、F进行编号。
2.主要操作步骤和方法
2.1供试品溶液的制备
在无菌条件下操作，将重组犬α干扰素标准品加入1ml PBS溶解后，用测定培养液1:102稀释后，在96孔细胞培养板中，从1:2稀释度开始做2倍递增系列稀释，共10个稀释度(横排放，为1-10孔)，每个稀释度加2孔，第11孔为MDBK细胞对照组，第12孔为VSV病毒对照组。病毒对照和细胞对照不加干扰素(设为C、D行)。
2.2对照重组人干扰素α的制备
在无菌条件下操作，将人干扰素对照品按标示量在96孔细胞培养板中稀释，从同样稀释度开始，做2倍递增系列稀释，共计制作10个稀释度，每个稀释度加入2孔，第11孔为MDBK细胞对照组，第12孔为VSV病毒对照组，病毒对照和细胞对照不加干扰素(设为A、B行)。
2.3效价测定
取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后，消化和收集细胞，用营养培养液配制成每毫升含4×105～5×105个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。
将配制完成的不同稀释度对照品溶液移入接种MDBK细胞的96孔细胞培养板的A、B行的1-10列中，每孔加入100μl，将配制完成的不同稀释度供试品溶液移入接种MDBK细胞的96孔细胞培养板的C、D行的1-10列中，每孔加入100μl，于37℃、5％CO2条件下培养18～24h。
弃去细胞培养板中的上清液，将保存的水疱性口炎病毒(VSV，－70℃保存)用培养液稀释至约100TCID50/ml，移入接种MDBK细胞的96孔细胞培养板的A、B、C、D行的1-10及12列中，每孔100μl，于37℃、5％CO2条件下培养24h(镜检供试品溶液的50％病变点在1U/ml)。
2.4结果观察
将置温箱24h培养物于倒置显微镜下观察。首先观察“细胞对照孔”和“病毒对照孔”，每孔中出现的CPE用“+”表示。当病毒对照孔出现“+++或++++”，即病毒对照孔中的细胞出现75～100％的明显病变，正常细胞对照孔中的细胞全部生长良好无病变时，则表明本次实验对照系统合格，否则弃去重做。
当干扰素保护孔CPE不再进展，即可观察结果。
将上述细胞板盖打开，弃去各孔内液体于消毒液中，加结晶紫染色液1～2滴/孔，3～5min后用细水流冲洗孔内残余染液，干燥后即可记录结果：
++++表示全部细胞病变；+++表示75％细胞病变；
+++表示50％细胞病变；+表示25％细胞病变。
2.6结果观察
重组犬干扰素α标准品效价(IU)计算方法及结果。供试品组结果记录如下表1、2：
表1.某批重组犬干扰素α标准品结果以“+”“－”记号记录形式
表2. 50％保护细胞的干扰素稀释度计算(Reed Muench计算)
据Reed-Munch公式计算
按表2中，此次重组犬干扰素α标准品能保护半数(50％)细胞不被病毒损害的最高稀释度在1：64×102～1：128×102。
即此次重组犬干扰素α标准品稀释到2-6.65×102(1:1.0×104)时，能保护半数细胞免受“攻击病毒”损害。即此次犬干扰素α标准品的工作单位为1.0×104IU/ml。
经过测试，制备的重组犬干扰素α标准品工作效价达到1.0×104IU/ml。
上述参照实施例重组犬干扰素α标准品、其制备方法及效价测定方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组犬干扰素α标准品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将重组犬干扰素α的重组菌进行发酵和诱导，直接收集菌体破碎后上清提取总蛋白，所述重组犬干扰素α的重组菌为BL21/pET-28α-rCaIFNα工程菌；
(2)总蛋白经亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化、分子筛层析纯化，即可得到重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液；
(3)重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液过滤除菌、稀释后加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制得重组犬干扰素α标准品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括以下步骤：
(1-1)培养工程菌BL21/pET-28α-rCaIFNα，得到工程菌菌液；
(1-2)将工程菌菌液按体积比1：10接种到LB培养基中，培养后作为发酵种子菌液；
(1-3)发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中进行发酵、诱导，得到发酵液；
(1-4)发酵液离心、破碎后收集上清液，即可得到重组犬干扰素α蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1-3)具体包括以下步骤：将发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中，发酵种子菌液与LB培养基的体积比为1:10，设置温度为37℃、溶氧为30％、转速为200～220r/min、pH为7.0～7.4条件下发酵；当发酵罐内的OD600达到1.0时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L，继续诱导表达4～6h，得到发酵液。
4.根据根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述亲和层析纯化所用的洗脱液为50mM三羟甲基氨基甲烷与20mM～500mM咪唑组成的混合液。
5.根据根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述阴离子交换层析所用的洗脱液为50mM三羟甲基氨基甲烷与500mM NaCl组成的混合液，其PH值为6.5。
6.根据根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分子筛层析所用的洗脱液为50mM Na2HPO4与0.15M NaCl组成的混合液，其PH值为7.4。
7.根据根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下步骤：将重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，用PH值为7.4的10mmol/L PBS稀释后加入终浓度达10％甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂混匀后，以2.2ml西林瓶容量分装，真空冷冻干燥后即可制得重组犬干扰素rCaIFN-α标准品。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的制备方法制备得到的重组犬干扰素α标准品，其特征在于，所述重组犬干扰素α标准品的N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CHLPDTHSLRWRVLTL。
9.根据权利要求8所述的重组犬干扰素α标准品，其特征在于，所述重组犬干扰素α标准品的效价为1.0×104IU/mL；SDS-PAGE检测其纯度为97.34％；HPLC检测其纯度为99.79％；相对分子量为33KD。
10.根据权利要求8所述的重组犬干扰素α标准品的效价测定方法，其特征在于：牛肾细胞作为测试细胞，重组犬干扰素α标准品作为供试品，重组人干扰素α标准品作为对照品，将供试品和对照品分别制成不同的稀释度，在MDBK/VSV系统上对重组犬干扰素α标准品效价进行标定。
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