CN106191161A

CN106191161A - 一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法

Info

Publication number: CN106191161A
Application number: CN201610364194.2A
Authority: CN
Inventors: 鲍素敏; 毛兴艳; 吴波; 张鸿; 曾佳; 凃丽; 李利佳
Original assignee: Guangdong HEC Pharmaceutical
Current assignee: Dongguan dongyangguang biosynthetics Co., Ltd
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2016-12-07

Abstract

本发明公开了一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法，属于生物技术领域，本发明所述的培养方法包括种子扩培和静置发酵产膜两个阶段，在种子扩培阶段的种子培养基中添加纤维素酶以扩大培养，其中纤维素酶的最终浓度为0.12～0.20U/ml。该方法可有效的将种子扩培阶段纤维素包裹的菌种释放出来，从而可有效的将种子扩培和纤维素发酵完全的分开，且在不影响后期产纤维素膜干重的前提下使产膜周期缩短一半以上，接种量也可降至不添加纤维素酶的工艺接种量的20％以下，降低了生产成本，且适合大规模生产。

Description

一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法。

背景技术

细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是指在不同条件下，由醋酸菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)等中的某种微生物合成的纤维素的统称。与天然纤维素相比，细菌纤维素具有良好的吸水、透气性能、很强的亲水性、非凡的持水性(吸收600～700倍于其干基重的水分)、高纯度、高结晶度、高抗张强度及高持水能力等优点，被认为是目前世界上性能最好的纤维素。因此具有许多潜在的应用前景。目前在音响、食品、日化、医药、造纸等工业中已经实现了商业化应用，被认为是目前世界上性能最好的纤维素。自该产品面市以来，在国际市场上一直畅销不衰。现有细菌纤维素生产企业的生产能力远无法满足市场对细菌纤维素的大量需求。因此改进细菌纤维素的发酵工艺得到理想的产量已成为当今的研究热点。

目前，细菌纤维素的发酵均采用静置培养，周期一般为5～10天，有些周期甚至更长，主要原因是木醋杆菌在种子培养的过程中就开始产纤维素，菌液中的菌体容易被纤维素膜吸附，溶液中的菌体浓度一般都在10⁶～10⁸CFU/ml，整个种子培养阶段没有明显的菌种扩培现象，有些会呈现越培养菌液越澄清的现象，虽然纤维素膜包裹了大量菌体，但后期接种静置发酵用的是种子液，即使接种前通过剧烈震荡或搅拌仍然不能大幅度增加菌液中的浓度，也就是说种子液内的菌体浓度无法达到较高水平，这种菌体繁殖与发酵产纤维素两个阶段无法分开的现象导致大规模生产很难实现。有研究尝试在种子培养阶段提高转速，加大对菌体的剪切力，尽量阻滞纤维素的产生，但结果并不理想。

截至目前，只有为数不多的有关提高种子培养基中的菌浓的研究报道。中国专利CN200910193119公开了一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法，采用将木醋杆菌菌体增殖与发酵生产细菌纤维素两个阶段分开，于22～28℃，在发酵过程中不断通入无菌空气，并用100～200rpm搅拌下培养24h～72h，此时木醋杆菌活菌数为10⁸～10⁹cfu/ml，经过菌体增殖培养，尽量使细胞处于同步生长时期，然后在菠萝皮清汁的发酵培养基中，浅盘静止培养72h～168h，得到细菌纤维素产量为17.5g/L以上。该方法使细菌纤维素的生产周期大大缩短，将菠萝皮进行了综合利用，保护了环境，生产出的细菌纤维素质构致密、均匀。但是该方法受到原料来源的限制，一般菠萝只在南方部分地区生长，每年只有几个月的盛产时间。所以该方法对于大部分地区是不适于规模化生产的。

中国发明专利200710030072.0申请公开了“深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法”，该方法是将木醋杆菌接入20～100％的椰子水中进行84～132h(3.5～5.5天)的深层静态发酵，之后再装入浅盘进行 40～192h(1.7～8.0天)的产椰果的发酵，其优点是将木醋杆菌增值培养(非生产时间)与发酵产纤维素(生产时间)的两个阶段分开，在一定程度上可以缩短生产周期，提高生产效率。但是该工艺需要用到椰子水，对于生产同样会受到地域和时间的限制，不适于大规模稳定的生产。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷和不足，本发明提供了一种缩短细菌纤维素发酵生产周期的培养方法，该方法在种子培养基中添加纤维素酶，使得扩培阶段纤维素包裹的菌种被释放出来，从而使种子液中的菌浓提高，而且明显的将种子发酵与产膜发酵分成两个阶段，加快了细菌纤维素的合成速度，缩短了整个发酵周期。

为了实现上述技术目的，本发明的技术方案提供了一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法，包括种子扩培和静置发酵产膜两个阶段，在种子扩培阶段的种子培养基中添加纤维素酶。

在本发明的一些实施方式中，纤维素酶的最终浓度为0.12～0.20U/ml。

在本发明的一些实施方式中，种子扩培为先将斜面菌种接种于含纤维素酶培养基的摇瓶中培养，再将摇瓶培养后的菌液转接至种子罐中培养。

在本发明的一些实施方式中，摇瓶培养的振速为120～300rpm，温度为25～32℃，培养时间为2～5h。

在本发明的一些实施方式中，菌种选自木醋杆菌、醋化醋杆菌、产醋醋杆菌、巴氏醋杆菌、气杆菌属(Aerobacter)、根瘤杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属、假单胞杆菌属、产碱杆菌属、八叠球菌属或动胶菌属。

在本发明的一些实施方式中，种子罐中培养是在搅拌速度为100～200r/min，通气量为2-5vvm，罐压为28-32Kpa的条件下培养20～24h。

在本发明的一些实施方式中，所述静置发酵产膜阶段，种子液接种到发酵产膜培养基的体积为发酵产膜培养基体积的2％。

在本发明的一些实施方式中，静置发酵产膜是指将扩培后的种子液接种到静置发酵产纤维素的培养基混匀，然后，灌注到浅盘中静置培养，收膜即可。

在本发明的一些实施方式中，浅盘培养是在28～32℃静置培养2～3天，其中浅盘装液深度为5～10mm。

在本发明的一些实施方式中，纤维素酶可以一次性加入到摇瓶培养基中，也可以先在摇瓶培养基中添加一部分，转接至种子罐时再补充纤维素酶至终浓度为0.12～0.20U/ml。所述的一部分应保证摇瓶中纤维素酶的浓度为0.12U/ml以上。

在本发明的一些实施方式中，种子培养基各组分的质量/体积分数为：Na₂HPO₄·12H₂O 0.1～0.2％，MgSO4·7H₂O 0.01～0.03％，柠檬酸0.1～0.2％，葡萄糖0.5～2％，(NH₄)₂HPO₄ 0.2～0.4％，玉米浆干粉1～2％。

在本发明的一些实施方式中，发酵产膜培养基中各组分的质量/体积分数为：KH₂PO₄ 0.2％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，柠檬酸0.2％，蔗糖4％，大豆蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％。

在本发明的一些实施方式中，所用的器皿均为已灭菌的。

在本发明的一些实施方式中，所用的水均为纯化水。

除非明确地说明与此相反，否则，本发明引用的所有范围包括端值。例如，“纤维素酶的最终浓度为0.12～0.20U/ml”，表示纤维素酶的最终浓度为0.12≤C≤0.20U/ml。

本发明所述的“纤维素酶的最终浓度为”，指的是纤维素酶在种子罐中的终浓度。

本发明所述的“种子液”为在种子罐中扩培后的菌液。

本发明所述的“斜面菌种”为将生产菌种接种于斜面培养基上，于25℃～32℃静置培养2～3天，即得。斜面培养基的组分为(质量比)：蔗糖2％～4％，硫酸铵0.2％～0.6％，硫酸镁0.01％～0.05％，氯化钙0.01％～0.04％，七水硫酸亚铁0.0003％～0.0010％，乙酸钠0.04％～0.10％，酵母膏0.03％～0.10％，琼脂2％，其余为水。

本发明中的数字均为近似值，无论有否使用“大约”或“约”等字眼。数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减。

本发明使用的术语“或”表示备选方案，如果合适的话，可以将它们组合，也就是说，术语“或”包括每个所列出的单独备选方案以及它们的组合。例如，“所述菌种选自木醋杆菌、醋化醋杆菌、产醋醋杆菌、巴氏醋杆菌、气杆菌属(Aerobacter)、根瘤杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属、假单胞杆菌属、产碱杆菌属、八叠球菌属或动胶菌属。”表示生产细菌纤维素的菌种选自生产菌株可以是木醋杆菌、醋化醋杆菌、产醋醋杆菌、巴氏醋杆菌、气杆菌属(Aerobacter)、根瘤杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属、假单胞杆菌属、产碱杆菌属、八叠球菌属或动胶菌属之中的一种，也可以是其一种以上的组合。

在本发明的一些实施方式中，添加的纤维素酶溶液的方法为：用纯化水溶解纤维素酶成母液，用0.22μm孔径的无菌过滤膜将酶液进行过滤，然后将过滤后的无菌酶液添加到已灭菌放凉的种子液中。本发明中所指的添加纤维素酶的终浓度跟菌种的产膜能力有关，一般产膜能力越强的菌种需要添加纤维素酶的终浓度越高。纤维素酶的添加量只要能保证在培养过程中摇瓶内一直没有团状或块状纤维素产生即可，若添加纤维素酶的浓度过高，会影响后期静置培养成膜的韧性。

在种子培养过程中，产纤维素酶的菌株在繁殖菌体的同时会不断产生纤维素，在不添加纤维素酶的情况下，会看到不断增大的纤维素膜块，呈丝状或条状，大的会成团状，培养基溶液会逐渐变得澄清，主要原因就是纤维素膜会吸附培养基中的颗粒物质，将菌体或其他固形物聚集在一起。在种子培养基中添加一定量的纤维素酶后，可以阻止团状、块状或条状纤维素的产生，将菌种释放出来，从而可有效的提高菌体的浓度，一方面促使后期静置培养时产纤维素膜的速度加快，静态培养纤维素膜的周期也会大大缩短，可节约时间成本；另一方面，将包裹的菌种释放到溶液中再转接到发酵培养基时可以更容易混匀，使静态培养出来的纤维素膜更加平整光滑。

本发明在培养基中添加纤维素酶，可将种子扩培与产膜发酵明显的分成两个阶段，在不影响产膜干重的前提下使产膜周期缩短一半以上，接种量降低到不添加纤维素酶的工艺接种量的20％以下，大大的降低了生产成本。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种缩短细菌纤维素发酵周期的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1

培养基的配制：

配制摇瓶种子培养基100ml，配制种子罐培养基10L

其中种子摇瓶和种子罐的培养基配方是一致的，均为：Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，柠檬酸0.1％，葡萄糖0.5％，(NH₄)₂HPO₄ 0.2％g，玉米浆干粉2％。纯水溶解后用饱和柠檬酸调pH至5.0。种子摇瓶采用1L的三角瓶装液量100ml，种子罐采用15L机械搅拌发酵罐装液量10L。

配制静置发酵产纤维素培养基配方如下：KH₂PO₄ 0.2％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，柠檬酸0.2％，蔗糖4％，大豆蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，调pH至4.2。

将一支木醋杆菌试管斜面(试管规格：25mm×200mm)菌苔用接种铲全部接种到一瓶装有已灭菌的种子培养基摇瓶中，添加经过滤除菌的纤维素酶溶液至浓度为12U/ml，在30℃下以160rpm的转速培养3h使菌种复苏，再将种子摇瓶的菌液全部转接至种子罐中，种子罐中的通气量设为2vvm，罐压30kpa，搅拌速度100r/min，培养24h后溶氧降至0，将种子液停止发酵，转接至灭菌的静置发酵产纤维素培养基，接种量为2％，同时对种子菌液进行平板计数。在混合灌混匀后在无菌环境下罐注到浅盘中，浅盘厚度控制在1cm左右，培养2天观察，所有浅盘的纤维素膜厚度均接近1cm，此时所有培养基被利用完，收膜处理，同时随机留4-5个浅盘培养4天收膜。

收膜后处理方式：先用清水将膜表面的杂质洗干净，然后放到4％氢氧化钠溶液浸泡8h，再用冰醋酸调节至中性，最后用纯化水清洗，所得纤维素膜柔软光滑。

平板计数方法：将菌液用无菌水进行10倍梯度稀释，然后涂布固体种子平板培养基，30℃静置培养5天后计数，最后换算为单位体积菌液所含菌量。

实验结果见表1。

实施例2

培养基的配制：

种子培养基的配方：Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，柠檬酸0.2％，葡萄糖2％，(NH₄)₂HPO₄0.4％，玉米浆干粉2％，溶纯水中，八层纱布过滤，用饱和柠檬酸调pH至5.0。

种子摇瓶和种子罐的培养基配方是一样的。种子摇瓶采用1L的三角瓶装液量100ml，种子罐采用15L机械搅拌发酵罐装液量10L。

其中种子摇瓶和种子罐的培养基配方是一样的。种子摇瓶采用1L的三角瓶装液量100ml，种子罐采用15L机械搅拌发酵罐装液量10L。

配制静置发酵产纤维素培养基配方：KH₂PO₄ 0.2％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，柠檬酸0.2％，蔗糖4％，大豆蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，调pH至4.2。

将一支木醋杆菌试管斜面(试管规格：25mm×200mm)菌苔用接种铲全部接种到一瓶装有已灭菌的种子培养基摇瓶中，添加经过滤除菌的纤维素酶溶液至浓度为20U/ml，在30℃下以160rpm的转速培养3h使菌种复苏，再将种子摇瓶的菌液全部转接至种子罐中，种子罐中的通气量设为5vvm，罐压32kpa，搅拌速度120r/min，培养18h后溶氧降至30％，将种子液停止发酵，转接至灭菌的静置发酵产纤维素培养基，接种量为2％，同时对种子菌液进行平板计数。在混合灌混匀后在无菌环境下罐注到浅盘中，浅盘内培养液厚度控制在8±1mm，培养2天观察，所有浅盘的纤维素膜厚度均在8±1mm，此时所有培养基被利用完，收膜处理，同时随机留4-5个浅盘培养4天收膜。收膜后处理方式和平板计数方法：同实施例1。

检测结果见表1。

实施例3

培养基的配制：

其中种子摇瓶和种子罐的培养基配方是一样的。种子摇瓶采用1L的三角瓶装液量300ml，种子罐采用50L机械搅拌发酵罐装液量30L。

将三支木醋杆菌试管斜面(试管规格：25mm×200mm)菌苔用接种铲全部接种到上述一瓶已灭菌的种子摇瓶中，添加经过滤除菌的纤维素酶溶液至浓度为18U/ml，在30℃下以160rpm的转速培养3h使菌种复苏，再将种子摇瓶的菌液全部转接至种子罐中，种子罐中的通气量设为3vvm，罐压30kpa，搅拌速度100r/min，培养24h后溶氧降至0，将种子液停止发酵，转接至灭菌的静置发酵产纤维素培养基，接种量为2％，同时对种子菌液进行平板计数。在混合灌混匀后在无菌环境下罐注到浅盘中，浅盘厚度控制在8mm左右，培养2天收膜。所有浅盘的纤维素膜厚度均在8mm左右，此时所有培养基被利用完。收膜处理，同时随机留4-5个浅盘培养4天收膜。收膜后处理方式和平板计数方法：同实施例1。

实验结果见表1。

实施例4

培养基的配制：

将三支木醋杆菌试管斜面(试管规格：25mm×200mm)菌苔用接种铲全部接种到上述一瓶已灭菌的种子摇瓶中，添加经过滤除菌的纤维素酶溶液至浓度为20U/ml，在30℃下以160rpm的转速培养3h使菌种复苏，再将种子摇瓶的菌液全部转接至种子罐中，种子罐中的通气量设为3vvm，罐压30kpa，搅拌速度150r/min，培养20h后溶氧降至30％，将种子液停止发酵，转接至灭菌的静置发酵产纤维素培养基，接种量为2％，同时对种子菌液进行平板计数。在混合灌混匀后在无菌环境下罐注到浅盘中，浅盘厚度控制在1cm左右，培养2天收膜。所有浅盘的纤维素膜厚度均在1cm左右，此时所有培养基被利用完。收膜后处理方式和平板计数方法：同实施例1。

实验结果见表1。

对比例1

培养基的配制：

配制静置发酵产纤维素培养基配方如下：KH₂PO₄ 0.2％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，柠檬酸0.2％，蔗糖4％，大豆蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，纯水溶解，调pH至4.2。

将三支木醋杆菌试管斜面(试管规格：25mm×200mm)菌苔用接种铲全部接种到一瓶装有已灭菌的种子培养基摇瓶中，在30℃以160rpm的转速培养3h使菌种复苏，再将种子摇瓶的菌液全部转接至种子罐中，种子罐中的通气量设为3vvm，罐压30kpa，搅拌速度100r/min，培养24h后溶氧仍为100％左右，将种子液停止发酵，转接至装有灭菌的静置发酵产纤维素培养基的混合罐，接种量为2％，同时对种子菌液进行平板计数。在混合灌动态培养24h，动态培养条件与种子罐一样。之后在无菌环境下罐注到浅盘中，浅盘厚度控制在1cm左右，培养2天观察，所有浅盘的纤维素膜厚度均在0.6cm左右，剩余大量培养基液体，部分浅盘进行收膜处理；剩余浅盘继续培养至4天收膜观察，全部浅盘内基本没有培养基液体剩余，纤维素膜厚度在1cm左右。收膜后处理方式：同实施例1。

实验结果见表1。

表1培养过程中各项参数测试结果如下：

纤维素酶酶活采用滤纸酶活进行表示，具体测定方法参考《GBT 23881-2009饲用纤维素酶活性的测定滤纸法》。

Claims

1.一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法，包括种子扩培和静置发酵产膜两个阶段，其特征在于，在种子扩培阶段的种子培养基中添加纤维素酶。

2.根据权利要1所述的方法，其特征在于，所述的纤维素酶的最终浓度为0.12～0.20U/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述静置发酵产膜阶段，种子液接种到发酵产膜培养基的体积为发酵产膜培养基体积的2％。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述的种子扩培为先将斜面菌种接种于含纤维素酶培养基的摇瓶中培养，再将摇瓶培养后的菌液转接至种子罐中培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述摇瓶培养的振速为120～300rpm，温度为25～32℃，培养时间为2～5h。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的菌种选自木醋杆菌、醋化醋杆菌、产醋醋杆菌、巴氏醋杆菌、气杆菌属(Aerobacter)、根瘤杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属、假单胞杆菌属、产碱杆菌属、八叠球菌属或动胶菌属。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子罐中培养是在搅拌速度为100～200r/min，通气量为2-5vvm，罐压为28-32Kpa的条件下培养18～24h。