CN106190854A

CN106190854A - 一种荒漠拟孢囊菌和奥利万星中间体的制备方法

Info

Publication number: CN106190854A
Application number: CN201510214406.4A
Authority: CN
Inventors: 郑玲辉; 洪云; 邱海潇; 徐长安; 陈�峰; 熊正军; 白骅
Original assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2035-04-29
Also published as: CN106190854B

Abstract

本发明公开了一种荒漠拟孢囊菌和奥利万星中间体的制备方法。所述高产奥利万星中间体的菌株荒漠拟孢囊菌HS807-AN-2396(Kibdelosporangium aridum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10576。所述奥利万星中间体的制备方法为将所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576在发酵培养基中发酵，从发酵液中获得奥利万星中间体A82846B。该制备方法能够在60m³罐上实现奥利万星中间体发酵效价2315mg/L的高产量，有利于奥利万星的产业化生产。

Description

一种荒漠拟孢囊菌和奥利万星中间体的制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种荒漠拟孢囊菌和奥利万星中间体的制备方法。

背景技术

需氧革兰阳性球菌是细菌性感染的重要病原菌，自20世纪80年代末以来，该类细菌所致感染呈持续上升的趋势。然而革兰阳性球菌耐药性的日趋严重，给感染性疾病的治疗带来严峻挑战。替考拉宁和万古霉素是目前用于治疗耐药革兰阳性菌感染的常用糖肽类药物。但是，随着临床应用的日益广泛，世界各地亦相继出现了万古霉素耐药金葡菌(VISA、VRSA)以及万古霉素耐药肠球菌(VRE)。因此，替考拉宁和万古霉素已不能完全满足临床需要，有必要开发应用新的糖肽类抗生素药物。

2014年8月6日，美国FDA批准Medicines公司开发的奥利万星上市(Oritavancin，LY-333328)，商品名为Orbactiv，它是继替考拉宁和万古霉素后开发的第二代糖肽类抗生素。Orbactiv是美国FDA批准用于急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(ABSSSIs)治疗的首个和唯一的单剂量治疗方案的抗生素。Orbactiv注射剂用于革兰阳性菌敏感株导致的ABSSSIs成人患者的治疗，包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，甲氧西林敏感和甲氧西林耐药菌株)、化脓性链球菌(Mlicrococcus scarlatinae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、咽峡炎链球菌群(Streptococcus anginosus、Streptococcus intermedius和Streptococcusconstellatus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis，万古霉素敏感株)。

奥利万星的化学合成需要关键中间体A82846B，其由荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)发酵产生。目前，国内外对奥利万星药物活性进行了较多研究，而对中间体A82846B的研发和生产报道少。上世纪九十年代礼来公司获得的美国专利US5843437(授权日1998年12月1日)等对生产A82846B的菌种、发酵和提取工艺进行了描述，但其发酵效价低。而提高A82846B的发酵水平，对奥利万星产业化具有重要的应用价值。

ARTP(Atmospheric and Room Temperature Plasma)为常压室温等离子体，是近几年来发展起来的一种新的等离子体源，能够在常压(1atm)下产生温度在25～40℃之间的，具有高活性粒子(如处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH^-自由基等)浓度的等离子体射流。研究表明，等离子体中适当剂量的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁和细胞膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。与传统诱变方法相比，采用常压室温等离子体有效造成多样性的DNA损伤、突变率高、易获得遗传稳定性良好的突变株等优点；与分子操作手段或其他化学诱变手段相比，常压室温等离子体进行微生物诱变育种具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点。

NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)为微生物育种中常用的烷化剂，有超级诱变剂之称。烷化剂带有活性烷基，此基团能够转移到其它电子密度高的分子上去，使碱基许多位置上增加了烷基，从而在多方面改变氢键。依靠NTG诱发的突变主要是GC-AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前奥利万星中间体(A82846B)发酵效价低的缺陷，提供一种荒漠拟孢囊菌及其发酵获得A82846B的制备方法，所述的荒漠拟孢囊菌可以高产量生产奥利万星中间体，发酵效率高；所述的制备方法可以以较低成本获得大量的奥利万星中间体，有利于产业化生产。

本发明所述的A82846B的结构式如式(1)所示：

本发明人把ARTP和NTG这两种物理和化学的诱变手段结合起来进行复合诱变筛选，获得了发酵效价高、遗传性状稳定的产A82846B的突变的荒漠拟孢囊菌。并对荒漠拟孢囊菌发酵获得A82846B的方法的发酵培养基配方、工艺参数等进行优化。

本发明的技术方案之一是：一种荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangiumaridum)，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.10576。

从海地土壤样品中分离获得菌种A.orientalis A82846，经自然分离得到的菌株HS807-O-13，菌株HS807-O-13经诱变筛选后得到菌株HS807-A-639，所述菌株HS807-A-639经ARTP和NTG复合诱变筛选，获得具有高产A82846B的菌株CGMCC No.10576。对该菌株进行鉴定，结果为荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)，命名为HS807-AN-2396。该菌株已于2015年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并收到保藏中心登记入册编号CGMCC No.10576，其具有以下的微生物学特性：

1、形态学的特性

在显微镜下观察在固体培养基中培养的菌株时，该菌呈长短不一的丝状，菌丝直径为0.1-1.0μm，产白色孢子，革兰氏染色呈阳性。

2、培养学的特性

当在温度14～37℃、pH5.0～7.5下，菌落生长良好，超过该范围则会出现生长差或不生长的情况。

3、生理特性

可以很好地利用D-葡萄糖、麦芽糖、D-乳糖作为碳源，但不利用D-木糖、L-阿拉伯糖和甘氨酸。可以有效地利用铵盐类氮源；但是难以利用硝酸盐类氮源。可以在除腺嘌呤以外的降解物上生长良好；在降解方面，仅能够降解酪蛋白和酪氨酸。并且能够进行明胶液化并能够产生硫化氢。

本发明的技术方案之二是：一种制备奥利万星中间体A82846B的方法，将所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576在发酵培养基发酵，从发酵液中获得奥利万星中间体A82846B。

本发明所述发酵的时间为本领域常规的时间，较佳地为168～240小时，更佳地为192～212小时，最佳地为202～210小时。本发明所述发酵的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～34℃，更佳地为28～32℃。

所述发酵在摇瓶中进行，所述摇瓶的体积为本领域常规的体积，较佳地为250mL。转速为本领域常规的转速，较佳地为250rpm。所述振幅为本领域常规的振幅，较佳地为5cm。所述发酵的湿度为本领域常规的湿度，较佳地为40～60％。

所述发酵在小试发酵罐中进行，所述小试发酵罐的体积为本领域常规的体积，较佳地为50L。搅拌转速为本领域常规的转速，较佳地为200～600rpm。溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为30～50％，所述的百分比为本领域常规，较佳地为发酵罐中发酵液的含氧量占该温度下饱和含氧量的百分比。空气流量为本领域常规的空气流量，较佳地为0.5～1.0vvm。

所述发酵在中试发酵罐中进行，所述中试发酵罐的体积为本领域常规的体积，较佳地为5000L。搅拌转速为本领域常规的转速，较佳地为30～150rpm。溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为30～40％，所述的百分比为本领域常规，较佳地为发酵罐中发酵液的含氧量占该温度下饱和含氧量的百分比。空气流量为本领域常规的空气流量，较佳地为0.2～1.0vvm。

所述发酵在产业化发酵罐中进行，所述产业化发酵罐的体积为本领域常规的体积，较佳地为60m³。搅拌转速为本领域常规的转速，较佳地为30～120rpm。溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为30～35％，所述的百分比为本领域常规，较佳地为发酵罐中发酵液的含氧量占该温度下饱和含氧量的百分比。空气流量为本领域常规的空气流量，较佳地为0.1～0.8vvm。

所述发酵的种子液的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为10～12％，所述的百分比为体积百分比。所述种子液由包括如下的步骤的方法获得：将所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576在种子培养基中培养。

其中，所述培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为37～44小时，更佳地为41～43小时。所述培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为28～32℃。

所述培养在摇瓶中进行，所述摇瓶的体积为本领域常规的体积，较佳地为250mL。转速为本领域常规的转速，较佳地为250rpm。所述振幅为本领域常规的振幅，较佳地为5cm。所述发酵的湿度为本领域常规的湿度，较佳地为40～60％。

所述培养在小试种子罐中进行，所述小试种子罐的体积为本领域常规的体积，较佳地为15L。搅拌转速为本领域常规的转速，较佳地为200～600rpm。溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为30～50％，所述的百分比为本领域常规，较佳地为种子罐中种子培养基的含氧量占该温度下饱和含氧量的百分比。空气流量为本领域常规的空气流量，较佳地为0.5～1.5vvm。

所述培养在中试种子罐中进行，所述中试种子罐的体积为本领域常规的体积，较佳地为500L。搅拌转速为本领域常规的转速，较佳地为30～150rpm。溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为30～40％，所述的百分比为本领域常规，较佳地为种子罐中种子培养基的含氧量占该温度下饱和含氧量的百分比。空气流量为本领域常规的空气流量，较佳地为0.2～1.0vvm。

所述培养在产业化种子罐中进行，所述产业化种子罐的为本领域常规的体积，较佳地为15m³。搅拌转速为本领域常规的转速，较佳地为50～200rpm。溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为30～50％，所述的百分比为本领域常规，较佳地为种子罐中种子培养基的含氧量占该温度下饱和含氧量的百分比。空气流量为本领域常规的空气流量，较佳地为0.2～1.0vvm。

所述的种子培养基为本领域常规的种子培养基，较佳地，其包括如下的组成成分(g/L)：葡萄糖5.0～15.0、可溶性淀粉10.0～30.0、黄豆饼粉10.0～30.0、酵母抽提粉2.0～8.0、水解酪蛋白2.0～8.0、氯化钠0.1～0.5和碳酸钙0.9～1.5，pH6.8～7.5；更佳地包括如下的组成成分(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性淀粉20.0、黄豆饼粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化钠0.3和碳酸钙1.2，pH 7.2。

较佳地，所述发酵在小试发酵罐、中试发酵罐或产业化发酵罐中进行，其还包括如下的步骤：补加L-酪氨酸；和/或，补加L-缬氨酸。

其中，所述L-酪氨酸在所述发酵培养基的含量为0.0～30.0g/L，较佳地为4.0～6.0g/L。所述L-缬氨酸在所述发酵培养基的含量为0.0～20.0g/L，较佳地为2.0～4.0g/L。

本发明的技术方案之三是：一种用于发酵所述的荒漠拟孢囊菌CGMCCNo.10576获得奥利万星中间体A82846B的发酵培养基，其包括如下的组成成分(g/L)：有机碳源75.0～155.0、有机氮源24.0～58.0和无机盐1.9～6.3；所述的有机碳源为葡萄糖、麦芽糊精、蔗糖、糖蜜和玉米淀粉中的一种或多种；所述的有机氮源为黄豆饼粉、棉籽饼粉、水解酪蛋白、酵母抽提粉和蛋白胨中的一种或多种；所述的无机盐为氯化钠、碳酸钙中的一种或两种。

较佳地，所述的发酵培养基所述的发酵培养基还包括如下的组成成分(g/L)中的一种或多种：微量元素0.04～0.22、氨基酸0.0～50.0和/或消泡剂0.2～0.8。所述的微量元素为四水硫酸锰和六水氯化钴中的一种或两种。所述的氨基酸为L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸中的一种或多种，较佳地，所述的氨基酸为L-酪氨酸和L-缬氨酸中的一种或两种。所述的消泡剂为发酵用消泡剂，较佳地，所述的消泡剂为发酵用消泡剂THIX-298，购自烟台恒鑫化工科技有限公司。

所述的发酵培养基的pH为本领域常规的pH，较佳地为6.0～7.5，更佳地为6.5～7.8。

更佳地，所述的发酵培养基包括如下的组成成分(g/L)：葡萄糖10.0～30.0、麦芽糊精60.0～100.0、糖蜜5.0～25.0、水解酪蛋白2.0～10.0、L-酪氨酸0～30.0、L-缬氨酸0～20.0、酵母抽提粉2.0～8.0、棉籽饼粉20.0～40.0、氯化钠0.4～0.8、碳酸钙1.5～5.5、四水硫酸锰0.02～0.14、六水氯化钴0.02～0.08和消泡剂0.2～0.8，pH6.5～7.8；最佳地，所述的发酵培养基包括如下的组成成分(g/L)：葡萄糖20.0、麦芽糊精80.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-缬氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽饼粉30.0、氯化钠0.6、碳酸钙3.5、四水硫酸锰0.08、六水氯化钴0.05和THIX-2980.2，pH7.5。

本发明的技术方案之四是：一种获得所述的荒漠拟孢囊菌CGMCCNo.10576的方法，其包括以下的步骤，在培养基中培养所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576即可。

其中，所述的培养基为本领域常规的培养基，能够生长所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576即可，较佳地为ISP2、高氏一号、YMS或ISP9培养基，更佳地为本发明说明书所述的发酵培养基，最佳地为本发明说明书所述的种子培养基。所述培养的温度为本领域常规的温度，能够生长所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576即可，较佳地，为14～37℃，更佳地为25～34℃，最佳地为28～32℃。所述培养的pH为本领域常规的pH，能够生长所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576即可，较佳地为5.0～7.5，更佳地为6.0～7.5，最佳地为6.5～7.8。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供的ARTP与NTG复合诱变A82846B高产菌株CGMCC No.10576，遗传性状稳定，重现性好，放大易于实现，具有优良的工业化应用价值。本发明所述的发酵制造A82846B的方法，综合调整了发酵配方、发酵控制工艺，并且针对L-酪氨酸和L-缬氨酸进行补加和残留量控制，实现60m³罐上发酵效价2315mg/L的高产量，在规模上和技术水平上高于现有文献报道，有利于奥利万星的产业化生产。

生物材料保藏信息

本发明的HS807-AN-2396，已于2015年3月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10576，生物材料(株)为HS807-AN-2396，分类命名是Kibdelosporangium aridum。

附图说明

图1为荒漠拟孢囊菌HS807-AN-2396选育谱系，图1的数字表示该菌株相应的A82846B发酵效价。

图2为实施例1的发酵液HPLC图谱(A82846B的Rt为5.588)。

图3为实施例1的发酵液ESI/MS图谱。

图4为实施例15的60m³罐的发酵代谢曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1高产菌株荒漠拟孢囊菌HS807-AN-2396(Kibdelosporangiumaridum)的制备

从海地土壤样品中分离获得菌种A.orientalis A82846(菌种A.orientalisA82846参见：Oliver Puk，Petra Huber，Daniel Bischoff，etc.,GlycopeptideBiosynthesis in Amycolatopsis mediterranei DSM5908:Function of aHalogenase and a Haloperoxidase/Perhydrolase，Chemistry&Biology，Vol.9，225–235，February，2002)，然后自然分离得到HS807-O-13菌株，HS807-O-13菌株经诱变筛选后得到出发菌种HS807-A-639。制备HS807-A-639的菌悬液，并用滤纸过滤，镜检细胞分散度达到95％以上，确保大部分为单细胞，然后用于诱变处理。

ARTP诱变处理：调整等离子体发生气-氦气流量为12.5L/min；等离子体发射口与盛样品铁片之间的距离为2mm；等离子体的照射功率为100w，照射时间为30s，得ARTP照射过的菌悬液。

精确称取10.0mg的NTG溶于1mL丙酮，加入上述ARTP照射过的菌悬液使NTG的终浓度达到1.0mg/L。4℃缓慢震荡处理20min，离心弃上清，用无菌生理盐水打散，重复洗涤2次，使其终止反应。

吸取含有诱变过的液体培养基至含有750mg/L A82846B(从浙江海正药业股份有限公司处获得)的培养皿和含有2.0g/L的L-酪氨酸培养皿中进行涂布培养。培养温度28～32℃，培养周期为8d。计算结果显示复合诱变的致死率达到89％。

从复合诱变后的抗性平板上挑取单菌落，进种子瓶培养，其中种子培养基为(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性淀粉20.0、黄豆饼粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化钠0.3和碳酸钙1.2，pH 7.2，30℃培养3d，然后在250mL发酵摇瓶培养，其中，发酵培养基为(g/L)：葡萄糖20.0、麦芽糊精80.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-缬氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽饼粉30.0、氯化钠0.6、碳酸钙3.5、四水硫酸锰0.08、六水氯化钴0.05和THIX-2980.2，pH7.5。30℃发酵8d，HPLC检测A82846B含量。得到一株高产突变株HS807-AN-2396，摇瓶发酵效价为1325mg/L，复筛(即按照相同的条件再一次摇瓶，进行发酵培养)后摇瓶发酵效价1263mg/L，其HPLC图谱如图2所示。将发酵得到的发酵液进行分离提纯(分离提纯的步骤参见Tsuji N.；T.Kamigauchi,M.Kobayashi&Y.Terui:New glycopeptide antibiotics:II.The isolation and structures of chloroorienticins.J.Antibiotics 41:1506-1510,1988)，提纯后的A82846B的ESI/MS图谱如图3所示。

将出发菌种HS807-A-639，挑取单菌落，进种子瓶培养，其中种子培养基为(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性淀粉20.0、黄豆饼粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化钠0.3和碳酸钙1.2，pH 7.2，30℃培养3d，然后在250mL发酵摇瓶培养，其中，发酵培养基为(g/L)：葡萄糖20.0、麦芽糊精80.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-缬氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽饼粉30.0、氯化钠0.6、碳酸钙3.5、四水硫酸锰0.08、六水氯化钴0.05和THIX-2980.2，pH7.5。30℃发酵8d，HPLC检测A82846B含量。摇瓶发酵效价为683mg/L，复筛(即按照相同的条件再一次摇瓶，进行发酵培养)后摇瓶发酵效价为656mg/L。从发酵结果来看，高产突变株HS807-AN-2396的发酵效价比出发菌株HS807-A-639提高了93％。

将上述的高产突变株HS807-AN-2396，于2015年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，获得保藏编号为：CGMCC No.10576，生物材料(株)为HS807-AN-2396，分类命名是Kibdelosporangium aridum。

实施例2菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)的形态学和培养学特征

参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌系统鉴定手册》及《分子克隆实验指南》等书中的有关内容进行实验。

相关符号表示说明：0：无生长；1：生长很弱；2：能生长，有少量孢子；3：生长良好，有大量孢子；4：生长最好，有丰富孢子；+：阳性；-：阴性。

培养特征：采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、高氏一号、苹果酸钙、YMS和查氏九种培养基(从浙江海正药业股份有限公司处获得)，28℃培养6～8天后，观察菌丝体的颜色及色素情况。

表1菌株HS807-AN-2396在9种培养基上的培养特征

表1的结果说明，该改良菌种在ISP2、高氏一号、YMS上生长良好，并且在不同的培养基上，表现出不同的外观、色素及产孢情况。

实施例3菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)的生理生化特征

培养条件均为28℃培养6～8天。

a)碳源：采用ISP9作为基础培养基，各种碳源的终浓度均为1.0％，所述的百分比为质量百分比。

b)无机氮源：采用ISP9作为基础培养基，硝酸钾和硫酸铵的浓度均为0.1％。

碳源和无机氮源的利用情况见表2，表2的结果说明，菌株HS807-AN-2396对不同的碳源利用程度不同，可以很好地利用D-葡萄糖、麦芽糖、D-乳糖，但不利用D-木糖、L-阿拉伯糖和甘氨酸。可以有效地利用铵盐类氮源；但是难以利用硝酸盐类氮源。

表2菌株HS807-AN-2396的碳源和氮源的利用情况

碳源	生长情况	碳源	生长情况	无机氮源	生长情况
						D-葡萄糖	3	水杨苷	2	硫酸铵	+
D-棉子糖	2	D-乳糖	3	硝酸钾	-
						D-木糖	0	半乳糖	2
D-山梨醇	2	肌醇	2
						L-阿拉伯糖	0	甘露醇	2
甘油	2	甘氨酸	0
						麦芽糖	3	木聚糖	2
D-果糖	1	菊粉	2
						D-蔗糖	2	鼠李糖	2

c)降解试验：采用基础培养基为GYEA(pH6.8)，各种降解物的浓度见表3。表3说明除腺嘌呤外，菌株HS807-AN-2396能够在其他几种降解物上生长良好；在降解方面，菌株HS807-AN-2396仅能够降解酪蛋白和酪氨酸。表3中所述的百分比为质量百分比。

表3菌株HS807-AN-2396的降解试验结果

降解物	降解物浓度	结果	降解物	降解物浓度	结果
						腺嘌呤	0.5％	2，-	酪蛋白	1.0％	4，+
鸟嘌呤	0.5％	4，-	酪氨酸	1.0％	4，+
						木聚糖	0.4％	4，-	Tween-40	1.0％	4，-
次黄嘌呤	0.4％	4，-	Tween-60	1.0％	4，-
									Tween-80	1.0％	4，-

d)过氧化氢酶试验采用YMS培养基。

e)M.R和V-P实验采用《常见细菌系统鉴定手册》方法。表4说明，菌株HS807-AN-2396能进行明胶液化并能够产生硫化氢。

表4菌株HS807-AN-2396主要的生理生化特征

试验项目

结果

试验项目

结果

试验项目

结果

明胶液化	+	牛奶胨化	-	纤维素利用	-
						淀粉水解	-	硝酸盐还原	-	过氧化氢酶	-
牛奶凝固	-	硫化氢产生	+
						V.P实验	-	M.R实验	-

由实施例2～3的数据说明，所述荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576具有以下的微生物学特性：

1、形态学的特性

在显微镜下观察在固体培养基中培养的菌株时，细胞呈长短不一的丝状，大小为0.4-1.0μm，产白色孢子，革兰氏染色呈阳性。

2、培养学的特性

当在温度14～37℃、pH 5.0～7.5下，菌落生长良好，超过该范围则会出现生长差或不生长的情况。

3、生理特性

实施例4菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)的16S rDNA序列分析

16S rDNA序列分析：菌株HS807-AN-2396的16S rDNA序列及与GenBank中相关序列进行BLAST比较，结果见表5。

表5菌株HS807-AN-2396和相关菌株的同源性

通过菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)的表观特征试验，发现该菌株和荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)的分类相关参数非常接近，同时对菌株HS807-AN-2396进行16S rDNA测序，测序结果如序列表SEQ ID No.1所示。将如序列表SEQ ID No.1所示的菌株HS807-AN-2396的16S rDNA序列与荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)的16S rDNA序列进行比对，比对结果发现，菌株HS807-AN-2396和荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)的同源性最高可达98.9％：菌株Kibdelosporangium aridum strain DSM 43828与菌株HS807-AN-2396的进化亲源关系最为接近，两者的同源性为98.9％。故菌株HS807-AN-2396鉴定为荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)。

实施例5菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)在250mL摇瓶中无氨基酸培养基中的发酵

种子培养基(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性淀粉20.0、热榨黄豆饼粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化钠0.3和碳酸钙1.2，pH 7.2。

种子瓶中种子培养基的装量为20mL/250mL，培养温度32℃，培养湿度50～60％，摇床振幅5cm，摇床转速250rpm，培养周期39h。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20.0、麦芽糊精70.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、酵母抽提粉5.0、棉籽饼粉30.0、氯化钠0.6、碳酸钙3.5、四水硫酸锰0.08和六水氯化钴0.05，pH7.3。

种子瓶至发酵瓶的移种量为10％，所述的百分比为体积百分比。

发酵瓶中发酵培养基的装量为20mL/250mL，培养温度28℃，培养湿度40～50％，摇床振幅5cm，摇床转速250rpm，培养周期212h。

发酵结束后HPLC检测发酵效价，A82846B达到923mg/L。

实施例6菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)在250mL摇瓶中添加L-酪氨酸、L-缬氨酸培养基中的发酵。

种子瓶的装量为20ml/250ml，培养温度28℃，培养湿度40～50％，摇床振幅5cm，摇床转速250rpm，培养周期37h。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20.0、麦芽糊精70.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-缬氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽饼粉30.0、氯化钠0.6、碳酸钙3.5、四水硫酸锰0.08和六水氯化钴0.05，pH7.3。

发酵瓶中发酵培养基的装量为20mL/250mL，培养温度32℃，培养湿度50～60％，摇床振幅5cm，摇床转速250rpm，培养周期210h。

发酵结束后HPLC检测发酵效价，A82846B达到1210mg/L。

实施例7菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)在50L罐上的发酵小试工艺研究

以250ml摇瓶获得的工艺参数为基础，根据实施例1所述菌株HS807-AN-2396的特性，设计50L罐发酵工艺并进行优化，考察突变株生长代谢情况和A82846B的最佳产素能力。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性淀粉20.0、热榨黄豆饼粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化钠0.3、碳酸钙1.2、THIX-298(购自烟台恒鑫化工科技有限公司)0.2，pH 7.2。其中，种子罐中种子培养基的装量为10L/15L。

种子罐控制工艺：培养温度28～32℃，搅拌转速200～600rpm，溶氧30％～50％，空气流量0.5～1.5vvm，培养周期43h。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20.0、麦芽糊精70.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-缬氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽饼粉30.0、氯化钠0.6、碳酸钙3.5、四水硫酸锰0.08、六水氯化钴0.05、THIX-2980.6，pH7.3。

种子罐至发酵罐的移种量为12％，所述的百分比为体积百分比。

发酵罐中发酵培养基的装量为35L，培养温度28～32℃，搅拌转速200～600rpm，溶氧30～50％，空气流量0.5～1.0vvm，培养周期206h。

发酵补料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸残留量在4.0～6.0g/L。

发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌丝浓度及发酵效价等的检测。发酵结束后HPLC检测发酵效价，A82846B达到2156mg/L。

实施例8菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)在50L罐上的发酵小试工艺研究

种子培养基(g/L)：葡萄糖5.0、可溶性淀粉10.0、黄豆饼粉10.0、酵母抽提粉2.0、水解酪蛋白2.0、氯化钠0.1、碳酸钙0.9、THIX-2980.2，pH7.5。

种子罐控制工艺：培养温度28～32℃，搅拌转速200～600rpm，溶氧30％～50％，空气流量0.5～1.5vvm，培养周期41h。其中，种子罐中种子培养基的装量为10L/15L。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖10.0、玉米淀粉100.0、蔗糖5.0、水解酪蛋白2.0、L-谷氨酸30.0、L-亮氨酸20.0、酵母抽提粉2.0、黄豆饼粉20.0、碳酸钙5.5、四水硫酸锰0.02、THIX-2980.8，pH6.5。

发酵罐中发酵培养基的装量为35L，培养温度28～32℃，搅拌转速200～600rpm，溶氧30～50％，空气流量0.5～1.0vvm，培养周期168h。

发酵补料控制：流加L-缬氨酸，控制L-缬氨酸残留量在0.0～20.0g/L。

发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌丝浓度及发酵效价等的检测，上述的发酵条件能够发酵获得A82846B。发酵结束后HPLC检测发酵效价，A82846B达到2110mg/L。

实施例9菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)在50L罐上的发酵小试工艺研究

种子培养基(g/L)：葡萄糖15.0、可溶性淀粉30.0、黄豆饼粉30.0、酵母抽提粉8.0、水解酪蛋白8.0、氯化钠0.5、碳酸钙1.5、THIX-2980.2，pH6.8。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖30.0、麦芽糊精60.0、糖蜜25.0、水解酪蛋白10.0、酵母抽提粉8.0、棉籽饼粉40.0、氯化钠0.8、六水氯化钴0.02、THIX-2980.8，pH7.8。

发酵罐中发酵培养基的装量为35L，培养温度28～32℃，搅拌转速200～600rpm，溶氧30～50％，空气流量0.5～1.0vvm，培养周期240h。

发酵补料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸残留量在0.0～30.0g/L。

发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌丝浓度及发酵效价等的检测，上述的发酵条件能够发酵获得A82846B。发酵结束后HPLC检测发酵效价，A82846B达到1967mg/L。

实施例10菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)在50L罐上的发酵小试工艺研究

发酵培养基(g/L)：葡萄糖30.0、麦芽糊精100.0、糖蜜5.0、水解酪蛋白10.0、酵母抽提粉8.0、棉籽饼粉20.0、氯化钠0.4、碳酸钙1.5、四水硫酸锰0.14、六水氯化钴0.08，pH7.5。

发酵补料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸残留量0.0～30.0g/L。

发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌丝浓度及发酵效价等的检测，上述的发酵条件能够发酵获得A82846B。发酵结束后HPLC检测发酵效价，A82846B达到2016mg/L。

实施例11菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)在50L罐上的发酵小试工艺研究

发酵培养基(g/L)：葡萄糖30.0、麦芽糊精60.0、糖蜜25.0、水解酪蛋白10.0、酵母抽提粉8.0、棉籽饼粉40.0、氯化钠0.4、碳酸钙1.5，pH5.0。

发酵补料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸残留量在2.0～6.0g/L。

发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌丝浓度及发酵效价等的检测，上述的发酵条件能够发酵获得A82846B。发酵结束后HPLC检测发酵效价，A82846B达到1954mg/L。

实施例12菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)在50L罐上的发酵小试工艺研究

种子罐控制工艺：培养温度28～32℃，搅拌转速200～600rpm，溶氧30％～50％，空气流量0.5～1.5vvm，培养周期43h。其中，种子罐中种子培养基的装量为10L/15L。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20.0、麦芽糊精70.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸3.0、L-缬氨酸3.0、L-谷氨酸3.0、L-亮氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽饼粉30.0、氯化钠0.6、碳酸钙3.5、四水硫酸锰0.08、六水氯化钴0.05、THIX-2980.2，pH7.5。

发酵罐中发酵培养基的装量为35L，培养温度25℃，搅拌转速200～600rpm，溶氧30～50％，空气流量0.5～1.0vvm，培养周期206h。

发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌丝浓度及发酵效价等的检测。发酵结束后HPLC检测发酵效价，A82846B达到1791mg/L。

实施例13菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)在50L罐上的发酵小试工艺研究

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20.0、麦芽糊精70.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸30.0、L-缬氨酸20.0、蛋白胨5.0、棉籽饼粉30.0、氯化钠0.6、碳酸钙3.5、四水硫酸锰0.08、六水氯化钴0.05、THIX-2980.2，pH6.0。

发酵罐中发酵培养基的装量为35L，培养温度34℃，搅拌转速200～600rpm，溶氧30～50％，空气流量0.5～1.0vvm，培养周期206h。发酵补料控制：流加L-酪氨酸，控制L-酪氨酸残留量在4.0～6.0g/L。

发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌丝浓度及发酵效价等的检测。发酵结束后HPLC检测发酵效价，A82846B达到1563mg/L。

实施例14菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)在5000L罐上的发酵中试工艺研究

以50L发酵罐获得的工艺参数为基础，根据实施例1所述菌株HS807-AN-2396的特性，设计5000L罐发酵工艺并进行优化，考察突变株生长代谢情况和A82846B的最佳产素能力。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性淀粉20.0、热榨黄豆饼粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化钠0.3、碳酸钙1.2、THIX-2980.2，pH 7.2。

种子罐控制工艺：培养温度28～32℃，搅拌转速30～150rpm，溶氧30～40％，空气流量0.2～0.1vvm，培养周期41h。其中，种子罐中种子培养基的装量为300L/500L。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20.0、麦芽糊精80.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽饼粉30.0、氯化钠0.6、碳酸钙3.5、四水硫酸锰0.08、六水氯化钴0.05和消泡剂THIX-2980.4，pH7.5。

种子罐至发酵罐的移种量为10％，所述的百分比为体积百分比。发酵罐中发酵培养基的装量为3500L：培养温度28～32℃，搅拌转速30～150rpm，溶氧30～40％，空气流量0.2～1.0vvm，培养周期202h。

发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌丝浓度及发酵效价等的检测。发酵结束后HPLC检测发酵效价，A82846B达到2199mg/L。

实施例15菌株HS807-AN-2396(CGMCC No.10576)在60m³罐上的发酵产业化放大

以5000L发酵罐获得的工艺参数为基础，根据实施例1所述菌株HS807-AN-2396的特性，设计60m³罐发酵工艺并进行优化，考察突变株生长代谢情况和A82846B的最佳产素能力。

种子罐控制工艺：培养温度28～32℃，搅拌转速50～200rpm，溶氧30～50％，空气流量0.2～1.0vvm，培养周期41h。其中，种子罐中种子培养基的装量为5m³/15m³。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20.0、麦芽糊精80.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-缬氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽饼粉30.0、氯化钠0.6、碳酸钙3.5、四水硫酸锰0.08、六水氯化钴0.05、THIX-2980.2，pH7.5。

种子罐至发酵罐的移种量为12％，所述的百分比为体积百分比。发酵罐中发酵培养基的装量为42m³：培养温度28～32℃，搅拌转速30～120rpm，溶氧30～35％，空气流量0.1～0.8vvm，培养周期192h。

发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌丝浓度及发酵效价等的检测。60m³罐中按上述培养发酵条件发酵菌株HS807-AN-2396的发酵代谢曲线参见图4。发酵结束后HPLC检测发酵效价，A82846B达到2315mg/L。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)，其特征在于，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.10576。

2.一种制备奥利万星中间体A82846B的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576在发酵培养基中发酵，从发酵液中获得奥利万星中间体A82846B。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为168～240小时，较佳地为192～212小时，更佳地为202～210小时；和/或，所述发酵的温度为25～34℃，较佳地为28～32℃。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵在摇瓶中进行，转速为250rpm；振幅为5cm；和/或，所述发酵的湿度为40～60％。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵在小试发酵罐中进行；搅拌转速为200～600rpm；溶氧量为30～50％；和/或，空气流量为0.5～1.0vvm。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵在中试发酵罐中进行，搅拌转速为30～150rpm；溶氧量为30～40％；和/或，空气流量为0.2～1.0vvm。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵在产业化发酵罐中进行，搅拌转速为30～120rpm；溶氧量为30～35％；和/或，空气流量为0.1～0.8vvm。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵的种子液的接种量为10～12％，所述的百分比为体积百分比；所述发酵的种子液由包括如下的步骤的方法获得：将如权利要求1所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576在种子培养基中培养。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养的时间为37～44小时，较佳地为41～43小时；和/或，所述培养的温度为28～32℃。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养在摇瓶中进行，转速为250rpm；振幅为5cm；和/或，所述发酵的湿度为40～60％。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养在小试种子罐中进行，搅拌转速为200～600rpm；所述小试发酵罐的溶氧量为30～50％；和/或，空气流量为0.5～1.5vvm。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养在中试种子罐中进行，搅拌转速为30～150rpm；溶氧量为30～40％；和/或，空气流量为0.2～1.0vvm。

13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养在产业化种子罐中进行，搅拌转速为50～200rpm；溶氧量为30～50％；和/或，空气流量为0.2～1.0vvm。

14.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基包括如下的组成成分(g/L)：葡萄糖5.0～15.0、可溶性淀粉10.0～30.0、黄豆饼粉10.0～30.0、酵母抽提粉2.0～8.0、水解酪蛋白2.0～8.0、氯化钠0.1～0.5和碳酸钙0.9～1.5，pH6.8～7.5；更佳地包括如下的组成成分(g/L)：葡萄糖10.0、可溶性淀粉20.0、黄豆饼粉20.0、酵母抽提粉5.0、水解酪蛋白5.0、氯化钠0.3、碳酸钙1.2和发酵用消泡剂THIX-2980.2，pH 7.2。

15.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵在小试发酵罐、中试发酵罐或产业化发酵罐中进行，其还包括如下的步骤：

补加L-酪氨酸；和/或，补加L-缬氨酸。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述L-酪氨酸占所述发酵培养基的含量为0.0～30.0g/L，较佳地为4.0～6.0g/L；和/或，所述L-缬氨酸占所述发酵培养基的含量为0.0～20.0g/L，较佳地为2.0～4.0g/L。

17.一种用于发酵如权利要求1所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576获得奥利万星中间体A82846B的发酵培养基，其特征在于，其包括如下的组成成分(g/L)：有机碳源75.0～155.0、有机氮源24.0～58.0和无机盐1.9～6.3；所述的有机碳源为葡萄糖、麦芽糊精、蔗糖、糖蜜和玉米淀粉中的一种或多种；所述的有机氮源为黄豆饼粉、棉籽饼粉、水解酪蛋白、酵母抽提粉和蛋白胨中的一种或多种；所述的无机盐为氯化钠、碳酸钙中的一种或两种。

18.如权利要求17所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基还包括如下的组成成分(g/L)中的一种或多种：微量元素0.04～0.22、氨基酸0.0～50.0和/或消泡剂0.2～0.8；所述的微量元素为四水硫酸锰和六水氯化钴中的一种或两种；所述的氨基酸为L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸中的一种或多种，较佳地为L-酪氨酸和L-缬氨酸中的一种或两种；所述的消泡剂为发酵用消泡剂；所述的发酵培养基的pH为6.0～7.5，较佳地为6.5～7.8；和/或，所述的消泡剂为发酵用消泡剂THIX-298。

19.如权利要求18所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基包括如下的组成成分(g/L)：葡萄糖10.0～30.0、麦芽糊精60.0～100.0、糖蜜5.0～25.0、水解酪蛋白2.0～10.0、L-酪氨酸0～30.0、L-缬氨酸0～20.0、酵母抽提粉2.0～8.0、棉籽饼粉20.0～40.0、氯化钠0.4～0.8、碳酸钙1.5～5.5、四水硫酸锰0.02～0.14、六水氯化钴0.02～0.08和消泡剂0.2～0.8，pH6.5～7.8；较佳地，包括如下的组成成分(g/L)：葡萄糖20.0、麦芽糊精80.0、糖蜜15.0、水解酪蛋白6.0、L-酪氨酸12.0、L-缬氨酸3.0、酵母抽提粉5.0、棉籽饼粉30.0、氯化钠0.6、碳酸钙3.5、四水硫酸锰0.08、六水氯化钴0.05和THIX-2980.2，pH7.5。

20.一种获得如权利要求1所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576的方法，其特征在于，在培养基中培养如权利要求1所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576即可；较佳地，所述的培养基为如权利要求14所述的培养基。