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CN106119206A - 诱导性多能干细胞及其制备方法 - Google Patents

诱导性多能干细胞及其制备方法 Download PDF

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CN106119206A
CN106119206A CN201610490449.XA CN201610490449A CN106119206A CN 106119206 A CN106119206 A CN 106119206A CN 201610490449 A CN201610490449 A CN 201610490449A CN 106119206 A CN106119206 A CN 106119206A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rab32
cell
pluripotent stem
stem cells
preparation
Prior art date
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Pending
Application number
CN201610490449.XA
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Inventor
曾宪卓
唐熙
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ISTEM REGENERATIVE MEDICINE SCI-TECH Co Ltd
Original Assignee
ISTEM REGENERATIVE MEDICINE SCI-TECH Co Ltd
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Publication date
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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Abstract

本发明公开了一种诱导性多能干细胞及其制备方法，所述诱导性多能干细胞的制备方法包括：获取体细胞；构建Rab32过表达载体，并提供转录因子表达载体，其中，所述转录因子表达载体包括Oct4表达载体、Sox2表达载体、c‑Myc表达载体和Klf4表达载体；包装混合后的所述Rab32过表达载体和所述转录因子表达载体，而制得感染液；将所述感染液感染所述体细胞，而制得诱导性多能干细胞。本发明诱导性多能干细胞的制备方法简单、高效，提高了体细胞的重编程效率。

Description

诱导性多能干细胞及其制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种诱导性多能干细胞及其制备方法。
背景技术
诱导性多能干细胞技术是通过外源性导入特定的转录因子，将已分化的细胞重编程回归到胚胎细胞状态。Takahashik等通过大量试验，在多种转录因子中筛选得出Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc(简称SKOM)这4种转录因子，成功将小鼠皮肤成纤维细胞重编程回到类似胚胎干细胞的一种细胞类型，称为iPS细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，诱导性多能干细胞)。诱导性多能干细胞具有自我更新能力和分化潜能，其功能与ESCs(embryonicstem cells，胚胎干细胞)类似，因此无需制造胚胎，理论上从任何组织的体细胞都可制造出具有干细胞功能的细胞，在科研工作中避免了胚胎研究所面临的伦理学问题，成为生命科学领域的一次巨大革命。此类细胞在克隆形态、生长特性、表面标志物、基因表达模式、表观遗传学特征、拟胚体(EBs)形成、畸胎瘤形成和嵌合体形成(针对小鼠)等方面与胚胎干细胞非常相似。然而，现有的体细胞重编程为诱导性多能干细胞的效率不高，亟待改进。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种诱导性多能干细胞的制备方法，旨在提高将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的效率。
为实现上述目的，本发明提供一种诱导性多能干细胞的制备方法，包括步骤如下：
获取体细胞；
构建Rab32过表达载体，并提供转录因子表达载体，其中，所述转录因子表达载体包括Oct4表达载体、Sox2表达载体、c-Myc表达载体和Klf4表达载体；
包装混合后的所述Rab32过表达载体和所述转录因子表达载体，而制得感染液；
将所述感染液感染所述体细胞，而制得诱导性多能干细胞。
优选地，所述构建Rab32过表达载体的过程，包括以下步骤：
获取Rab32目的基因；
设计引物，PCR扩增所述Rab32目的基因；
将扩增后的Rab32目的基因定向连接至病毒质粒，而制得连接产物；
将所述连接产物转化为Rab32过表达质粒；
提取所述Rab32过表达质粒。
优选地，所述将扩增后的Rab32目的基因定向连接至病毒质粒的过程，包括以下步骤：
提供病毒质粒，并酶切所述病毒质粒，而获得线性化质粒；
酶切所述扩增后的Rab32目的基因；
定向连接所述线性化质粒和酶切后的Rab32目的基因。
优选地，所述病毒质粒为逆转录病毒质粒。
优选地，所述包装混合后的所述Rab32过表达载体和所述转录因子表达载体的过程，包括以下步骤：
将混合后的所述Rab32过表达载体和所述转录因子表达载体与转染试剂共混成转染工作液；
将所述转染工作液转染培养液中的真核细胞，并培养至少48h；
收集所述培养液后2～8℃800～1200rpm进行离心3～10min，并过滤收集离心后的培养液，而获得感染液。
优选地，所述将混合后的所述Rab32过表达载体和所述转录因子表达载体与转染试剂共混成转染工作液的过程，包括步骤如下：
采用培养基稀释混合后的所述Rab32过表达载体和所述转录因子表达载体；
提供转染试剂，并采用所述培养基稀释所述转染试剂；
将稀释好的载体和稀释好的转染试剂共混成转染工作液。
优选地，所述将所述感染液感染所述体细胞的过程，包括以下步骤：
提供(1～100)×104个所述体细胞；
使用1～10ml所述感染液感染所述体细胞，并加入聚凝胺，使所述聚凝胺的浓度为1～20ng/ml；
感染后的所述体细胞培养6～10h后更换培养所述体细胞所需的培养液；
每间隔12～36h重复更换所述培养液数次后，转移感染后的所述体细胞至iPS培养基中，并按时更换所述iPS培养基；
挑选、分离所述iPS培养基中出现的iPS细胞，并扩大培养。
优选地，所述挑选、分离所述iPS培养基中出现的iPS细胞，并扩大培养的过程，包括以下步骤：
将iPS细胞与所述体细胞分离，并切割成数块；
将切割后的iPS细胞接种于新的所述体细胞上，并移入培养箱内培养。
优选地，所述体细胞为成纤维细胞。
此外，为实现上述目的，本发明还提供一种如上所述的诱导性多能干细胞的制备方法制备的诱导性多能干细胞。
本发明技术方案，通过将Rab32过表达载体与四种转录因子表达载体共混成感染液感染体细胞而对体细胞进行重编程，制备得到诱导性多能干细胞，相对于现有的四因子重编程方法，提高了体细胞的重编程效率，且该方法简单、高效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的内容获得其他的附图。
图1A为本发明实施例1中小鼠原代成纤维细胞培养3d后的形态图；
图1B为本发明实施例1中小鼠原代成纤维细胞培养5d后的形态图；
图2为本发明实施例1中pMX质粒的基因结构示意图；
图3为本发明实施例1制备的细胞的碱性磷酸酶(AP)染色图；
图4为本发明实施例1制备的细胞的免疫荧光染色法检测ES多能性标记物的染色图；
图5为本发明实施例1制备的细胞的体外EB(拟胚体)分化检测的示意图；
图6为本发明实施例1和对比例2的AP阳性克隆数量统计图；
图7为本发明对比例1和对比例2的AP阳性克隆数量统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种诱导性多能干细胞的制备方法，包括步骤如下：
S1、获取体细胞；
S2、构建Rab32过表达载体，并提供转录因子表达载体，其中，该转录因子表达载体包括Oct4表达载体、Sox2表达载体、c-Myc表达载体和Klf4表达载体；
S3、包装混合后的该Rab32过表达载体和该转录因子表达载体，而制得感染液；
S4、将该感染液感染体细胞，而制得诱导性多能干细胞。
本发明诱导性多能干细胞的制备方法将Rab32过表达载体与四种转录因子表达载体(Oct4表达载体、Sox2表达载体、c-Myc表达载体和Klf4表达载体)共混成感染液感染体细胞而对体细胞进行重编程，制备得到诱导性多能干细胞，相对于现有的四因子重编程方法，提高了体细胞的重编程效率，且方法简单、高效。
需要说明的是，该体细胞可以是成纤维细胞、纤维细胞或者其他已分化组织细胞等等，该其他已分化组织细胞可以是单能干细胞或多能干细胞等等。该Rab32是Rab蛋白中的一种，而Rab蛋白是小分子GTP结合蛋白家族中最大的亚家族，作为囊泡运输的分子开关，在囊泡的形成、转运、粘附、错定、融合等过程中均发挥作用。该Rab32具有参与调控线粒体功能、自隆作用、脂类代谢、黑色素体形成等功能。Rab32过表达载体为携带Rab32目的基因的载体，该载体为真核过表达载体，可选自逆转录病毒载体或慢病毒载体，其中，逆转录病毒载体优选为pMX载体。另外，四转录因子(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)导入体细胞中可以重编程体细胞已为本领域技术人员所熟知，因而，其表达载体为真核表达载体，即常见的逆转录病毒载体或慢病毒载体等，其中，逆转录病毒载体优选为pMX载体。
进一步地，步骤S2中，该构建Rab32过表达载体的过程，具体包括步骤如下：
S20、获取Rab32目的基因；
S21、设计引物，PCR扩增该Rab32目的基因；
S22、将扩增后的Rab32目的基因定向连接至病毒质粒，而制得连接产物；
S23、将该连接产物转化为Rab32过表达质粒；
S24、提取该Rab32过表达质粒。
通过上述步骤将Rab32目的基因定向连接至病毒质粒的基因上，使病毒质粒可以过表达Rab32，进而可以与转录因子表达载体一起感染体细胞，实现体细胞重编程。其中，该病毒质粒是逆转录病毒或慢病毒以质粒的形式存在的，其本质是病毒。
需要说明的是，该Rab32目的基因的获取可以通过如下三种途径实现：1、从供体细胞的DNA中直接分离Rab32目的基因；2、以转录的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，再在酶的作用下合成双链DNA；3、根据Rab32蛋白质的氨基酸序列，推测出信使RNA序列，再推测出结构基因的核苷酸序列，然后用化学的方法以单核苷酸为原料合成。
进一步地，步骤S22具体包括步骤如下：
S220、提供病毒质粒，并酶切该病毒质粒，而获得线性化质粒；
S221、酶切该扩增后的Rab32目的基因；
S222、定向连接该线性化质粒和酶切后的Rab32目的基因。
通过限制性内切酶处理病毒质粒的基因而在其基因上形成酶切点，且采用相同的限制性内切酶处理Rab32目的基因而在Rab32目的基因上形成酶切点，最后通过酶切点的连接而将Rab32目的基因连接至病毒质粒的基因上，进而使该病毒质粒携带Rab32目的基因。
进一步地，步骤S3具体包括步骤如下：
S30、将混合后的Rab32过表达载体和转录因子表达载体与转染试剂共混成转染工作液；
S31、将转染工作液转染培养液中的真核细胞，并培养至少48h；
S32、收集培养液后2～8℃800～1200rpm进行离心3～10min，并过滤收集离心后的培养液，而获得感染液。
将转染制剂和载体共混成转染工作液，并采用转染工作液转染真核细胞，而获得感染液(病毒液)，进而可以通过感染液转染体细胞，实现重编程。
进一步地，步骤S30具体包括步骤如下：
S300、采用培养基稀释混合后的Rab32过表达载体和转录因子表达载体；
S301、提供转染试剂，并采用相同的培养基稀释转染试剂；
S302、将稀释好的载体和稀释好的转染试剂共混成转染工作液。
采用相同的培养基稀释载体和转染试剂，使载体和转染试剂共混后更加均匀，转染效果更好。
进一步地，步骤S4具体包括步骤如下：
S40、提供(1～100)×104个体细胞；
S41、使用1～10ml感染液感染体细胞，并加入聚凝胺，使聚凝胺的浓度为1～20ng/ml；
S42、感染后的体细胞培养6～10h后更换培养体细胞所需的培养液；
S43、每间隔12～36h重复更换该培养液数次后，将转移感染后的体细胞至iPS培养基中，并按时更换iPS培养基；
S44、挑选、分离iPS培养基中出现的iPS细胞，并扩大培养。
采用聚凝胺可以有效地提高体细胞的感染效率，从而可以保证诱导效率，避免因感染效率低而引起体细胞重编程失败。
进一步地，步骤S44具体包括步骤如下：
S440、将iPS细胞与体细胞分离，并切割成数块；
S441、将切割后的iPS细胞接种于新的体细胞上，并移入培养箱内培养。
将iPS细胞挑选、分离培养，便于将iPS细胞与饲养层细胞分离，提高培养的iPS细胞的纯度。
本发明还提供一种上述诱导性多能干细胞的制备方法制备的诱导性多能干细胞。
本发明建立一种高效制备诱导性多能干细胞的方法，为基础研究和临床应用提供一种全新高效的实验方法，同时该诱导性多能干细胞也为基础研究提供了应用。
现通过实施例对本发明诱导性多能干细胞及其制备方法做进一步解释，以详细说明其技术方案及带来的技术效果。
实施例1
一、小鼠成纤维细胞的获取与培养
1、原代成纤维细胞获取
将刚出生的小鼠处死，75％酒精浸泡消毒后，放入生物安全柜内进行如下操作：
先取其背部皮肤，放入75％酒精中浸泡消毒，以无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液漂洗皮肤。将皮肤剪成1mm2大小，均匀平贴于无菌平皿(8cm2大小)中，加入2ml含有10％胎牛血清的高糖DEME完全培养基，放置在37℃、5％CO2培养箱培养24h，使皮肤能够牢固平贴于平皿上。24h后再加入1ml DEME完全培养基继续培养，1周后将组织块去除，即可见原代成纤维细胞(标记为P0)生长。原代培养的细胞经显微镜观察发现组织块贴壁3天后就可在组织块周围看到明显的成纤维细胞的生长，此时游离出来的细胞呈纺锤形或者不规则三角形，胞核清晰，如图1A所示。培养第5天后，组织块周围有大量的成纤维细胞，成纤维细胞群开始向外分裂生长，此时细胞呈典型的长梭形，如图1B；
2、原代成纤维细胞传代
原代成纤维细胞生长密度接近至80％时，吸去旧培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液漂洗1次，加入1ml 0.05％胰蛋白酶，消化3min左右后，发现成纤维细胞变圆时，立即加入1ml的DEME完全培养基终止胰酶反应，将细胞悬液移入离心管，1200r/min离心8min，弃上清液后加入DEME完全培养液，吹散混匀按1∶2比例传代(P2)。
二、饲养层细胞的制备
P2代成纤维细胞长满后，每皿(培养皿规格为150mm)加8ml加入丝裂霉素的FM培养基处理2h。处理结束后的细胞经过DPBS缓冲液洗3遍，完全去除丝裂霉素C后，消化离心，用1％的明胶包被培养皿，细胞接种密度约为2.4×106/100mm培养皿，而获得用于重编程的小鼠成纤维细胞。
三、Rab32过表达载体的构建
1、获取Rab32目的基因，本实施例优选以信使RNA为模板，采用反转录法获得Rab32目的基因，由于该方法以为本领域技术人员所熟知，故在此不做赘述。
2、设计引物，扩增步骤1获得的Rab32目的基因；其中，引物序列如下：
Rab32正向引物序列：F-CGGGATCCCGATGGCGGGCGAGGGACTA；
Rab32反向引物序列：L-TTGCGGCCGCAATCAGCAGCACTGGGACCT；
然后，PCR扩增步骤1获得的Rab32目的基因，利用Fastpfu酶(transgen公司生产)进行克隆：
a)、Fastpfu酶的PCR扩增体系：
成分 体积
5×Fastpfu Buffer 10ul
2mM dNTPs 5ul
Rab32正向引物 1ul
Rab32反向引物 1ul
模板cDNA 1ul
Fastpfu 1ul
ddH2O 补至50ul
b)、PCR中设定的程序：
3、将步骤2获得的扩增后的Rab32目的基因定向连接至pMX(逆转录病毒，来源于Genome Institute of Singapore)质粒，制得连接产物，具体过程如下：
a)、按照如下酶切体系酶切处理pMX质粒和Rab32目的基因，其中，该pMX质粒的基因结构可参见图2：
酶切体系 量
pMX质粒/Rab32目的基因 2ug
限制性内切酶 1uL
10xBuffer 5uL
BSA 0.5nl
H2O 补至50ul
37℃酶切4h，而获得线性化质粒和目的基因酶切产物片段。
b)、对酶切后的Rab32目的基因进行电泳和切胶回收(酶切后的Rab32目的基因也可使用PCR纯化试剂盒进行回收)，同样对线性化质粒进行电泳和切胶回收。
c)、定向连接酶切后的Rab32目的基因与线性化质粒，而获得连接产物；其中，连接体系如下：
连接体系 量
线性化质粒 10ng
酶切后的Rab32目的基因 30ng
10xLigate buffer
T4Ligase buffer 0.3ul
ddH2O 补至10ul
将上述连接体系放置于16℃8～16h，即获得目的基因酶切产物片段与线性化质粒的连接产物。
4、质粒转化(将连接产物转化为Rab32过表达质粒)：
a)、提供感受态细胞，并置于冰上融化；
b)、将步骤3制得的待转化的12ul连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，并在冰上放置30min；
c)、将感受态细胞的EP管放置于42℃水浴锅中，90s后迅速置于冰上2min；
d)、向感受态细胞中加入800ul无抗液体LB培养基，37℃下震荡培养30～45min，而形成菌液；
e)、将菌液全部涂布在加有与pMX质粒抗性相对应的抗生素的固体LB培养基上；
f)、37℃培养12h左右，选择生长出来的单菌落进行扩增和后续步骤，进而将连接产物转化为Rab32过表达质粒。
5、质粒小提及鉴定(提取及鉴定Rab32过表达质粒)：
质粒小提按照试剂盒说明书所示程序进行：
a)、取2ml左右过夜培养的步骤f中的单菌落菌液，加入2ml离心管中，13000rpm离心2min收集菌体，尽量去掉上清；
b)、向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul的Buffer P1，用移液器或涡旋旋振荡器重悬沉淀并充分混匀；
c)、向离心管中加入250ul的Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4～6次，充分混匀使菌体裂解；
d)、向离心管中加入350nl的Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀4～6次，充分混匀，13000rpm离心10min而产生上清液，其中，N3加入后应立即混匀；
e)、将吸附柱装入收集管，并将步骤d)所得的上清液转移到吸附柱，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
f)、向吸附柱中加入750μl的Buffer PW(PW事先加入无水乙醇)，13000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液；
g)、将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm室温离心1min，倒掉废液，将吸附柱置于室温晾干5min；
h)、将吸附柱置于一个新的EP管中，向吸附膜的中间位置加入50ul的Buffer EB，室温放置5～10min，13000rpm室温离心1min，将Rab32过表达质粒溶液收集到EP管中，并保存于-20℃；
i)、利用酶切、PCR反应及测序对Rab32过表达质粒进行检测；经检测，质粒上正确连接了Rab32目的基因。
四、逆转录病毒包装
a)、以转染T75培养皿的Plat-E细胞(人源胚肾细胞)为例，将生长状态旺盛的Plat-E细胞进行传代，在细胞生长至60％～80％汇合度时换新鲜的MEF培养液12ml，1h～4h后开始转染；
b)、将3ug的Rab32过表达质粒取出解冻，并取出4ug转录因子表达质粒(由Invitrogen公司提供)，该转录因子表达质粒包括Oct4表达质粒、Sox2表达质粒、c-Myc表达质粒和Klf4表达质粒，且按比例为1：1：1：1制成混合质粒，以下简称OSKM表达质粒；
c)、将Rab32过表达质粒(3ug)+OSKM表达质粒(4ug)混合，并用Opti-MEM培养基稀释至400μl，混匀备用；
d)、提供转染试剂(罗氏FuGENE HD Transfection Reagent高效真核转染试剂)，将36μl转染试剂，用Opti-MEM培养基稀释至400μl，混匀，室温放置5min；
e)、将稀释好的转染试剂与稀释好的质粒加在一起成为转染工作液，轻轻混匀，室温放置20min；
f)、将转染工作液逐滴加入细胞培养皿中转染Plat-E细胞，轻轻混匀培养液；
g)、转染48h后收集培养皿中的培养液，并换入15ml新鲜的MEF培养液；将收集的培养液4℃1000rpm离心5min去除培养液中的细胞碎片，再用0.45μm的针头滤器过滤，进而收集到可用于感染体细胞的感染液(病毒液)，完成包装。
五、iPS细胞诱导体系的建立
提前24h准备步骤二制得的饲养层细胞，细胞总数为1×105个，使用2ml感染液感染成纤维细胞，并加入Polybrene增加感染效率，使Polybrene浓度为10ng/ml；8小时后换成新鲜培养液，24小时后重复一次，可重复3次。最后一次重复24小时后转移感染后细胞到MEFs，24小时后换成iPS培养液，之后每天更换iPS培养液，观察细胞形态变化并记录第一个克隆出现时间，直到第二十天iPS细胞足够大时挑选、分离iPS细胞并扩大培养。挑选、分离及扩大培养iPS细胞的具体操作如下：
在显微镜下，用注射器针头将iPS细胞与饲养层细胞剥离，即用200ul枪头轻轻将其逆向铲离饲养层和培养皿底，并切割为数块；然后，转种到新的饲养层上，移入培养箱内培养。次日大部分iPS细胞贴壁，随后每日换液并观察。
对比例1
一、小鼠成纤维细胞的获取与培养(请参见实施例1，与实施例1相同)。
二、饲养层细胞的制备(请参见实施例1，与实施例1相同)。
三、Rab32shRNA表达载体的构建
a)、设计Rab32shRNA引物，其引物序列为：
Rab32shRNA正向引物序列：F-CACCGTGGGATATCGCGGGTAAGA；
Rab32shRNA反向引物序列：L-AAACTCTTACCCGCGATATCCCAC。
b)、使用内切酶MuI(Takara公司提供)和Clal(Takara公司提供)对PLVTHM载体(shRNA表达载体，慢病毒，来源于Addgene)进行充分酶切，并纯化回收酶切载体产物；
c)、按照下述体系将Rab32shRNA引物合成DNA，并将合成的DNA用ddH2O溶解，DNA的浓度为50μM；
按照下面的体系和程序进行退火：
退火程序如下：
d)、按下表将合成DNA与酶切载体产物进行连接：
e)、室温连接3～4h后取10ul连接产物，进行热激转化，而获得菌落；
f)、挑取菌落中的单菌落，接种到3ml左右的培养基，37℃培养12h以上，而获得Rab32shRNA表达质粒；
g)、提取Rab32shRNA表达质粒；
h)、利用NheI(Takara公司提供)和ClaI(Takara公司提供)对Rab32shRNA表达质粒进行双酶切，酶切产物进行跑胶鉴定；并将酶切正确的Rab32shRNA表达质粒进行测序验证，以确认连接了目的片段。
四、逆转录病毒包装
a)、以转染T75培养皿的Plat-E细胞(人源胚肾细胞)为例，将生长状态旺盛的Plat-E细胞进行传代，在细胞生长至60％-80％汇合度时换新鲜的MEF培养液12ml，1h～4h后开始转染；
b)、将3ug Rab32shRNA表达质粒取出解冻，并取出4ug OSKM表达质粒；
c)、将Rab32shRNA表达质粒(3ug)+OSKM表达质粒(4ug)混合，并用Opti-MEM培养基稀释至400μl，混匀备用；
d)、提供转染试剂，将36μl转染试剂，用Opti-MEM培养基稀释至400μl，混匀，室温放置5min；
e)、将稀释好的转染试剂与稀释好的质粒加在一起成为转染工作液，轻轻混匀，室温放置20min；
f)、将转染工作液逐滴加入细胞培养皿中转染Plat-E细胞，轻轻混匀培养液；
g)、转染48h后收集培养皿中的培养液，并换入15ml新鲜的MEF培养液；将收集的培养液4℃1000rpm离心5min去除培养液中的细胞碎片，再用0.45μm的针头滤器过滤，而收集可用于感染细胞的感染液(病毒液)，完成包装。
五、iPS细胞诱导体系的建立(请参见实施例1，与实施例1相同)。
对比例2
一、小鼠成纤维细胞的获取与培养(请参见实施例1，与实施例1相同)。
二、饲养层细胞的制备(请参见实施例1，与实施例1相同)。
三、提供pMX空白质粒(未携带任何目的基因，由Invitrogen公司提供)。
四、逆转录病毒包装
a)、以转染T75培养皿的Plat-E细胞(人源胚肾细胞)为例，将生长状态旺盛的Plat-E细胞进行传代，在细胞生长至60％-80％汇合度时换新鲜的MEF培养液12ml，1h～4h后开始转染；
b)、将3ug pMX空白质粒取出解冻，并取出4ug OSKM表达质粒；
c)、将pMX空白质粒(3ug)+OSKM表达质粒(4ug)混合，并用Opti-MEM培养基稀释至400μl，混匀备用；
d)、提供转染试剂，将36μl转染试剂，用Opti-MEM培养基稀释至400μl，混匀，室温放置5min；
e)、将稀释好的转染试剂与稀释好的质粒加在一起成为转染工作液，轻轻混匀，室温放置20min；
f)、将转染工作液逐滴加入细胞培养皿中转染Plat-E细胞，轻轻混匀培养液；
g)、转染48h后收集培养皿中的培养液，并换入15ml新鲜的MEF培养液；将收集的培养液4℃1000rpm离心5min去除培养液中的细胞碎片，再用0.45μm的针头滤器过滤，而收集可用于感染细胞的感染液(病毒液)，完成包装。
五、iPS细胞诱导体系的建立(请参见实施例1，与实施例1相同)。
验证实验
一、本发明实施例1制备的诱导性多能干细胞的验证方法及验证结果：
1、原代iPS细胞碱性磷酸酶染色
染色的方法如下：
a)、4％的PFA固定2min，PBS洗3次；
b)、按比例配制染色液(A液:B液:水＝2:1:1)；
c)、将染色液加入到iPS细胞中，避光染色15min，肉眼看到细胞有着色后可停止；
d)、PBS洗2次，加PBS浸没细胞。用数码相化获取染色图像，如图3所示。
由图3可知，该染色图像显示了实施例1获得的细胞已产生碱性磷酸酶颗粒，进而证明该原代iPS细胞具有胚胎干细胞所特有的碱性磷酸酶颗粒。
2、免疫荧光染色法检测ES多能性标记物
a)、将实施例1获得的iPS细胞低密度培养于12孔板至第4d，PBS洗3次，4％多聚甲酵室温固定20min；
b)、弃去固定液，用DPBS漂洗3遍；
c)、加入1ml 0.2％TritonX-100，室温20min，用DPBS漂洗3遍；
d)、加入1ml 2％BSA+0.02％Tween20混合液，室温处理1h；
e)、吸去封闭液，加入一抗，4℃培育过夜，抗体的浓度如下：
SOX2(1：500)，
NANOG(1：500)，
SSEA1(1：500)，
OCT4(1：500)；
f)、弃一抗稀释液，再用DPBS漂洗3遍；
g)、加入二抗，室温避光孵育1h，各二抗均按1:500稀释；
h)、弃二抗稀释液，DPBS漂洗3遍；
i)、DAPI染色30S；
j)、荧光倒置显微镜下观察，如图4所示。
由图4可知，Sox2、Nanog、SSEA1、Oct4呈阳性表达，进而实施例1获得的细胞表达Sox2、Nanog、SSEA1、Oct4，具有ES多能性标记物，即实施例1获得的细胞具有类似胚胎干细胞的性能。
3、iPS细胞分化能力鉴定
a)、用胰酶将生长于饲养层上的iPS细胞消化成单细胞，1000rpm，5min，弃去上清；
b)、加入2ml EB形成培养基，重悬细胞沉淀，混匀后，移至35mm细菌培养板上，放置在摇床上(置于5％CO2培养箱内)，摇床转速约47rpm；
c)、隔天更换培养基：将细胞和培养基一同移至15ml离心管中，自然沉淀或者极低速度离心，吸去上边约2/3的培养基，加入适量新鲜培养基，移回35mm细菌培养板上；
d)、悬浮培养3d后，将Ebs移至铺了明胶的组织培养板上，换成普通MEF培养基培养，隔天换液；
e)、贴壁培养9d，进行三胚层标记免疫荧光染色，抗体浓度如下：
外胚层：NESTIN(1：500)，
中胚层：α-SMA(1：500)，
内化层：GATA6(1：500)。
免疫荧光染色在显微镜下观察得到图5，由图5可知，细胞体外EB分化检测，可以分化为三胚层的细胞，Gata6(内胚层)，Nestin(外胚层)及α-Smooth Muscle Actin(中胚层)。因此，实施例1获得的细胞经体外培养可以分化为三胚层的细胞，即该实施例1获得的细胞具有与胚胎干细胞类似的分化功能。
综上所示，本发明实施例1制备的细胞具有与胚胎干细胞类似的功能，即实施例1制备的细胞为诱导性多能干细胞。
二、本发明实施例1、对比例1和对比例2制备的诱导性多能干细胞诱导效果检测方法及结果
对实施例1、对比例1和对比例2获得的细胞，培养18d后进行AP染色，统计其AP阳性克隆数量用于比较重编程效率，如图6和图7。
图6为实施例1和对比例2的AP阳性克隆数量统计图，由图6可知，实施例1与对比例2相比，实施例1的阳性克隆数明显增加且显著高于对比例2的阳性克隆数，即Rab32与OSKM四因子组合的诱导效率显著提高；图7为对比例1和对比例2的AP阳性克隆数量统计图，由图7可知，对比例1与对比例2相比，对比例1的阳性克隆数明显减少，即Rab32敲除(Rab-32shRNA)质粒与OSKM四因子组合的诱导效率显著降低。因此，从正反两方面说明：Rab32与四因子组合可以显著提高体细胞的重编程效率，显著改善将体细胞诱导为诱导性多能干细胞的效率。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
获取体细胞；
构建Rab32过表达载体，并提供转录因子表达载体，其中，所述转录因子表达载体包括Oct4表达载体、Sox2表达载体、c-Myc表达载体和Klf4表达载体；
包装混合后的所述Rab32过表达载体和所述转录因子表达载体，而制得感染液；
将所述感染液感染所述体细胞，而制得诱导性多能干细胞。
2.如权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述构建Rab32过表达载体的过程，包括以下步骤：
获取Rab32目的基因；
设计引物，PCR扩增所述Rab32目的基因；
将扩增后的Rab32目的基因定向连接至病毒质粒，而制得连接产物；
将所述连接产物转化为Rab32过表达质粒；
提取所述Rab32过表达质粒。
3.如权利要求2所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述将扩增后的Rab32目的基因定向连接至病毒质粒的过程，包括以下步骤：
提供病毒质粒，并酶切所述病毒质粒，而获得线性化质粒；
酶切所述扩增后的Rab32目的基因；
定向连接所述线性化质粒和酶切后的Rab32目的基因。
4.如权利要求2或3所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述病毒质粒为逆转录病毒质粒。
5.如权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述包装混合后的所述Rab32过表达载体和所述转录因子表达载体的过程，包括以下步骤：
将混合后的所述Rab32过表达载体和所述转录因子表达载体与转染试剂共混成转染工作液；
将所述转染工作液转染培养液中的真核细胞，并培养至少48h；
收集所述培养液后2～8℃800～1200rpm进行离心3～10min，并过滤收集离心后的培养液，而获得感染液。
6.如权利要求5所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述将混合后的所述Rab32过表达载体和所述转录因子表达载体与转染试剂共混成转染工作液的过程，包括步骤如下：
采用培养基稀释混合后的所述Rab32过表达载体和所述转录因子表达载体；
提供转染试剂，并采用所述培养基稀释所述转染试剂；
将稀释好的载体和稀释好的转染试剂共混成转染工作液。
7.如权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述将所述感染液感染所述体细胞的过程，包括以下步骤：
提供(1～100)×104个所述体细胞；
使用1～10ml所述感染液感染所述体细胞，并加入聚凝胺，使所述聚凝胺的浓度为1～20ng/ml；
感染后的所述体细胞培养6～10h后更换培养所述体细胞所需的培养液；
每间隔12～36h重复更换所述培养液数次后，转移感染后的所述体细胞至iPS培养基中，并按时更换所述iPS培养基；
挑选、分离所述iPS培养基中出现的iPS细胞，并扩大培养。
8.如权利要求7所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述挑选、分离所述iPS培养基中出现的iPS细胞，并扩大培养的过程，包括以下步骤：
将iPS细胞与所述体细胞分离，并切割成数块；
将切割后的iPS细胞接种于新的所述体细胞上，并移入培养箱内培养。
9.如权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述体细胞为成纤维细胞。
10.一种如权利要求1至9任意一项所述的诱导性多能干细胞的制备方法制备的诱导性多能干细胞。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108048484A (zh) * 2017-11-14 2018-05-18 海南龄医疗产业发展有限公司 诱导性多能干细胞及其制备方法和应用
CN108330148A (zh) * 2017-01-19 2018-07-27 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种人结肠癌干细胞的制备方法及其应用
CN108384759A (zh) * 2018-01-16 2018-08-10 深圳市瑞亚再生医学科技有限责任公司 诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102144027A (zh) * 2008-07-07 2011-08-03 宝生物工程株式会社 生产多能干细胞的方法
CN102884188A (zh) * 2010-02-18 2013-01-16 国立大学法人大阪大学 诱导性多能干细胞的制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102144027A (zh) * 2008-07-07 2011-08-03 宝生物工程株式会社 生产多能干细胞的方法
CN102884188A (zh) * 2010-02-18 2013-01-16 国立大学法人大阪大学 诱导性多能干细胞的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YANGLI PEI等: "Improvement in Mouse iPSC induction by Rab32 Reveals the importance of lipid metabolism during reprogramming", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
裴杨莉: "Rab32通过促进脂类合成提高小鼠iPSCs的诱导效率", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108330148A (zh) * 2017-01-19 2018-07-27 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种人结肠癌干细胞的制备方法及其应用
CN108330148B (zh) * 2017-01-19 2020-11-10 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种人结肠癌干细胞的制备方法及其应用
CN108048484A (zh) * 2017-11-14 2018-05-18 海南龄医疗产业发展有限公司 诱导性多能干细胞及其制备方法和应用
CN108384759A (zh) * 2018-01-16 2018-08-10 深圳市瑞亚再生医学科技有限责任公司 诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法及其应用

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